專利名稱：一種黃腐酚和黃酮類化合物的萃取分離方法
一種黃腐酚和黃酮類化合物的萃取分離方法技術領域
本發(fā)明屬于黃酮類化合物的分離純化領域，尤其是一種黃腐酚和黃酮類化合物的 萃取分離方法。
背景技術：
啤酒花(Humulus lupulus L)又名忽布，屬于?？戚岵輰俣嗄晟荼局参?，是釀造 啤酒的主要原料之一，它能使啤酒具有獨特的香氣和苦味，以及防腐作用，與麥汁共沸時能 促進蛋白質(zhì)凝固，有利于麥汁的澄清，增強啤酒的非生物穩(wěn)定性和泡持性等。啤酒花也是一 種使用歷史悠久的藥食同源植物，酒花中含有樹脂、酒花油、多酚、黃酮等多種藥理成分，具 有抗菌，鎮(zhèn)靜，治療結(jié)核、神經(jīng)衰弱、麻風等藥理功能。
啤酒釀造中使用的酒花制品可以分為全酒花、酒花粉、顆粒酒花、酒花浸膏等。前 三種制品均含有大量的黃酮化合物，采用超臨界二氧化碳方法制備的酒花浸膏是將酒花中 的有效成分萃取出來而制成的濃縮了 5 10倍有效成分的樹脂浸膏，因黃酮類化合物有一 定的極性，不易被萃取，故采用超臨界二氧化碳法制備的酒花浸膏中基本不含有黃酮類化 合物，大量的黃酮等物質(zhì)存在于二氧化碳酒花浸膏萃余物中。研究表明，黃酮類化合物具有 抗氧化作用、保護心血管等多種活性作用；黃腐酚是一種存在于酒花中獨特的異戊二烯類 黃酮化合物，它不僅具有抗氧化、抗病毒和雌激素作用，而且還具有預防癌癥和抑制癌細胞 增殖的作用。此外，黃腐酚還具有預防、治療糖尿病和動脈粥樣硬化的作用。超臨界二氧化 碳酒花萃余物目前主要被用做飼料，大量的黃酮化合物沒有得到有效的利用，造成一定的 資源浪費。
目前，富集、純化酒花及其超臨界C02酒花浸膏萃余物中黃腐酚和其他黃酮類化 合物的方法多采用大孔吸附樹脂、柱色譜法等，但大多只注重黃腐酚的分離純化而忽略了 酒花中其他黃酮類化合物，造成了資源浪費，或提取純度不高，工藝復雜等問題，難以滿足 醫(yī)藥、保健品等行業(yè)對黃腐酚及黃酮類化合物純度要求較高的的需要。
據(jù)檢索，發(fā)現(xiàn)兩篇與專利相關的專利文獻，其中CN101337876公開了 “一種從啤酒 花中提取黃腐酚的方法”，包括如下步驟(1)將啤酒花粉碎；( 將IOOg粉碎的啤酒花用 800-2000mL石油醚回流提取，提取溫度60_65°C，提取時間0. 5-1小時，過濾除去石油醚溶 液，重復提取2-3次，得到脫脂啤酒花；(3)將上述脫脂啤酒花用800-2000mL體積濃度90 100%的乙醇進行超聲提取，超聲功率200W，提取溫度55-65°C，提取時間30-50分鐘，提取 液過濾，重復提取2-3次，合并濾液、減壓濃縮至稠膏；(4)在上述稠膏中加入250-350mL乙 酸乙酯，攪拌，溶解后加入150-250mL水進行分配，靜置分層，分離兩相，棄去水相，乙酸乙 酯相重復加水分配2-3次，而后乙酸乙酯相減壓濃縮，真空干燥，得黃腐酚粗提物；(5)將 上述黃腐酚粗提物進行第一步高速逆流色譜分離，分離溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲 醇-水，其體積比為5 4 4.8 4，上相為固定相，下相為流動相，按紫外檢測圖譜收集 目標流分；(6)將目標流分真空濃縮回收溶劑后，進行第二步高速逆流色譜分離，分離溶劑 體系為正己烷-正丁醇-甲醇-水，其體積比為3.6 1 1.8 3，上相為固定相，下相為流動相，按紫外檢測圖譜收集黃腐酚流分，真空濃縮、冷凍干燥得到粉末狀黃腐酚。專利 申請CN101492357公開了 “一種二氧化碳萃取酒花殘渣中黃腐酚的富集方法”，該方法包括 以下步驟(1)用40 60%的低級醇或丙酮溶液浸提二氧化碳萃取后的酒花殘渣，使其中 含有黃腐酚的黃酮類化合物充分溶解；( 浸提后過濾收集溶液，減壓蒸餾回收低級醇或 丙酮；(3)將水溶液用吸附樹脂處理，含有黃腐酚的黃酮類化合物被吸附樹脂吸附，雜質(zhì)成 分用水沖洗出吸附柱后，用有機溶劑洗脫劑將含有黃腐酚的黃酮類化合物從吸附柱上洗脫 下來，洗脫劑采用50% 99%的甲醇、乙醇或丙酮水溶液；(4)洗脫液真空蒸餾回收有機溶 劑，濃縮后的水溶液經(jīng)噴霧干燥，得到富集了黃腐酚的黃色粉末。
經(jīng)過比較，本專利的第一個專利的主要區(qū)別是(1)CN101337876專利主要采用高 速逆流色譜分離，要進行二次分離才能達到分離，較為繁瑣；而用大孔吸附樹脂法較為簡 單，并采用液滴收集器進行收集，通過全波長掃描和TLC分析來提高分離度，只需要一次 分離即可達到效果；( 不采用石油醚、甲醇等有毒的有機試劑，主要采用工業(yè)乙醇溶液， 毒性和成本都比較低，更有利用黃腐酚的工業(yè)化生產(chǎn)。本專利的第二個專利的主要區(qū)別 是(1)本專利在裝柱之前進行一定的除雜，通過離心、過有機濾膜等除去部分雜質(zhì)；(2) CN101492357專利雖采用大孔吸附樹脂，但流出液沒有通過一些定性手段如全波長掃描和 TLC分析，導致分離度不高，雜質(zhì)較多，黃腐酚和總黃酮含量較低，不能滿足醫(yī)藥、保健品等 行業(yè)的需要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種純度高、提取工藝簡單的一種 黃腐酚和其他黃酮化合物的萃取分離方法，本方法采用大孔吸附樹脂提取酒花及其超臨界 CO2萃余物中黃腐酚和其他黃酮類化合物。
本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術方案如下
一種黃腐酚和黃酮類化合物的萃取分離方法，步驟如下
(1)用3-5倍原料重量的60% -100%的乙醇水溶液浸提酒花及其超臨界CO2萃余 物兩次，浸提溫度為50-10(TC，每次1-1.證，合并濾液后過濾，減壓蒸餾濃縮并收集濾液；
(2)將濃縮液在3500r/min下離心lOmin，取上清液，將上清液重復2_3次，離心， 最終用0. 45 μ L膜過濾，除去濾渣，留濾液；
(3)將預處理過的大孔吸附樹脂裝入層析柱，將濾液加至層析柱上部，流速為 l-3mL/min，先用水洗脫將部分雜質(zhì)，50% -70% -100%三個梯度的乙醇溶液，所有量為柱 體積的2-4倍，洗脫流速為1. 5mL/min ；
(4)每管收集柱體積的_2%，用薄層色譜法和顏色方法確定其中是否含有黃 酮類物質(zhì)，并經(jīng)全波長掃描確定哪些流分中含有黃腐酚；
(5)合并洗脫液，真空蒸餾并回收有機試劑，濃縮后的水溶液經(jīng)冷凍干燥，得到黃 色的黃腐酚和黃酮類化合物粉末。
而且，所述大孔吸附樹脂為非極性樹脂X-5、非極性樹脂ADS-8、弱極性樹脂AB_8、 中極性樹脂ADS-17或極性較大樹脂ADS-F8。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果是
1、本發(fā)明的分離原理為依靠大孔吸附樹脂和被吸附的分子(吸附質(zhì))之間的范德華引力，通過它巨大的比表面進行物理吸附而工作，使有機化合物根據(jù)吸附力及其分子 量大小經(jīng)溶劑的洗脫而分開，達到分離、純化、除雜、濃縮等目的，本發(fā)明分離得到黃腐酚純 度在90%以上，其他黃酮化合物的含量在30%左右，可滿足分析、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)的需 要，其他黃酮化合物也能基本滿足分析、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)的需要。
2、本發(fā)明的原料為酒花及其超臨界(X)2萃余物等，尤其是將酒花制品加工過程中 的廢料-超臨界(X)2酒花浸膏萃余物作為主要原料，不但將有主要功效且難以分離的的黃 腐酚單獨提取出來，而且將酒花廢料富含的其他黃酮類化合物也一并提取出來，對不能用 于啤酒釀造中的酒花也提供了一種開發(fā)途徑，提高酒花資源利用率和附加值，延長酒花產(chǎn) 業(yè)鏈具有重要意義。
3、本發(fā)明在大孔吸附樹脂分離過程中采用不同濃度的乙醇梯度洗脫方法，不僅有 效的節(jié)約資源，而且有效地提高了黃酮化合物的洗脫率，使提取更加充分。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明思想為將酒花及其超臨界C02萃余物在一定的溶劑體系下提取，旋蒸；提 取液離心，過膜，旋蒸；將一定量的提取物裝入到大孔吸附樹脂中，采用不同洗脫劑進行梯 度洗脫，按照一定劑量依次收集洗脫液，經(jīng)全掃描波長初步檢測，收集相應部分洗脫液，旋 蒸，得到需要的黃腐酚和其他黃酮類化合物。
本發(fā)明根據(jù)大孔吸附樹脂是以苯乙烯和丙酸酯為單體，加入乙烯苯為交聯(lián)劑，甲 苯、二甲苯為致孔劑，它們相互交聯(lián)聚合形成了多孔骨架結(jié)構(gòu)，其分離原理即依靠它和被吸 附的分子(吸附質(zhì))之間的范德華引力，通過它巨大的比表面進行物理吸附而工作，使有機 化合物根據(jù)有吸附力及其分子量大小可以經(jīng)一定溶劑洗脫分開而達到分離、純化、除雜、濃 縮等目的。
一種黃腐酚和黃酮類化合物的萃取分離方法，尤其是一種從酒花及其超臨界CO2 萃余物中分離純化黃腐酚和其他黃酮化合物方法，步驟如下
1、酒花及其超臨界(X)2萃余物的提取稱取50g酒花及其超臨界C02萃余物原 料，加入到IOOOmL的30 % -60 %的乙醇溶液中，在70°C水浴中攪拌下加熱90min，冷卻、 0. 45 μ L有機膜抽濾；按上述步驟再提取一次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮；
2、除雜質(zhì)將濃縮液在3500r/min下離心lOmin，取上層溶液；將上層溶液按照上 述步驟，再次離心，取上層溶液，經(jīng)0. 45 μ 1膜過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)液濃縮；
3、裝柱取50_150g大孔吸附樹脂，將其浸泡在95%的乙醇溶液中，攪拌，使其充 分溶脹，在層析柱底部預先放入脫脂棉，加入20mL蒸餾水，將溶脹的大孔吸附度樹脂緩慢 傾入，待其自然沉降完全；
其中大孔吸附樹脂為非極性樹脂如X-5和ADS-8、弱極性樹脂AB-8、中等極性樹脂 ADS-17和極性較大樹脂ADS-F8。
4、洗脫將大孔吸附樹脂中多余的水排出，直到接近液面1cm，將5mL 0. 3g/mL濃 度(濃度指的是酒花粗提物粉末和水溶液液體的比例，即g/ml)的樣品，用滴管滴加到柱 內(nèi)，先用水洗脫，再用50% -100%的溶劑體系作為洗脫劑洗脫，流速為l-2mL/min，主要采用50% -70% -100%三個梯度的乙醇溶液，所有量為柱體積的2-4倍。
5、收集每5mL收集一管，每管樣品先用全波長掃描確認是否含有黃腐酚，若無再 定性確定是否為黃酮類化合物，合并濾液，真空蒸餾并回收有機試劑，濃縮后的水溶液經(jīng)冷 凍干燥，得到黃色具有特殊香味的黃腐酚和其他的黃酮化合物粉末。用液相色譜檢測黃腐 酚組分，計算黃腐酚純度為91. 3% ；用亞硝酸鈉-硝酸鋁法檢測總黃酮的含量，計算其他黃 酮類化合物純度為33.6%。
本發(fā)明中涉及的黃酮類化合物主要包括槲皮素、山奈酚及其蘆丁等。
權利要求
1.一種黃腐酚和黃酮類化合物的萃取分離方法，其特征在于步驟如下(1)用3-5倍原料重量的60%-100%的乙醇水溶液浸提酒花及其超臨界CO2萃余物兩 或三次，浸提溫度為50-10(TC，每次1-1.證，合并濾液后過濾，減壓蒸餾濃縮并收集濾液；(2)將濃縮液在3500r/min下離心，取上清液，將上清液重復2_3次，離心，最終用 0. 45 μ L膜過濾，除去濾渣，留濾液；(3)將預處理過的大孔吸附樹脂裝入層析柱，將濾液加至層析柱上部，流速為l_3mL/ min，先用水洗脫將部分雜質(zhì)，50% -70% -100%三個梯度的乙醇溶液，所有量為柱體積的 2-4倍，洗脫流速為1. 5mL/min ；(4)每管收集柱體積的_2%，用薄層色譜法和顏色方法確定其中是否含有黃酮類 物質(zhì)，并經(jīng)全波長掃描確定哪些流分中含有黃腐酚；(5)合并洗脫液，真空蒸餾并回收有機試劑，濃縮后的水溶液經(jīng)冷凍干燥，得到黃色的 黃腐酚和黃酮類化合物粉末。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種黃腐酚和黃酮類化合物的萃取分離方法，其特征在于 所述大孔吸附樹脂為非極性樹脂X-5、非極性樹脂ADS-8、弱極性樹脂AB-8、中極性樹脂 ADS-17或極性較大樹脂ADS-F8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃腐酚和黃酮類化合物的萃取分離方法，步驟如下用乙醇的溶液浸提酒花及其超臨界CO2萃余物，使其中黃酮類化合物尤其是黃腐酚充分溶出；浸提后過濾得濾液，將其減壓蒸餾得濃縮液；將濃縮液離心后，取上清液，用0.45μL有機膜過濾，除去部分雜質(zhì)，用洗脫劑將黃酮類化合物從大孔吸附樹脂上洗脫下來，收集流出液，濃縮，冷凍干燥，得黃色粉末。本發(fā)明的原料為酒花及其超臨界CO2萃余物等，尤其是將酒花制品加工過程中的廢料-超臨界CO2酒花浸膏萃余物作為主要原料，不但將有主要功效且難以分離的的黃腐酚單獨提取出來，而且將酒花廢料富含的其他黃酮類化合物也一并提取出來，對不能用于啤酒釀造中的酒花也提供了一種開發(fā)途徑，提高酒花資源利用率和附加值，延長酒花產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義。
文檔編號C07C49/84GK102040500SQ20101056492
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權日2010年11月29日
發(fā)明者李專, 李亞迪, 王昌祿, 祁鑫 申請人:天津科技大學