專利名稱：一種抗Cry1Ac晶體蛋白兔單克隆抗體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗CrylAc晶體蛋白抗體，尤其涉及一種抗CrylAc晶體蛋白兔單克隆 抗體的制備方法。
背景技術：
據(jù)農(nóng)業(yè)生物技術應用國際服務組織(ISAAA)報道，全球共有144項轉(zhuǎn)基因項目， 代表M種作物得到了世界范圍的認可，截止到2008年，全世界已經(jīng)有25個國家種植轉(zhuǎn)基 因作物，同時另有30個國家允許進口轉(zhuǎn)基因作物作為食品和種子。轉(zhuǎn)基因作物中，尤以對 Bt-Cry轉(zhuǎn)基因蛋白的研究最多，CrylAc蛋白是Bt-Cry系列蛋白中的一種。Bt基因是目前 研究應用最為廣泛的一種抗蟲基因，在防治害蟲方面的作用越來越重要。據(jù)報道，目前已知 的Bt抗蟲基因已達70種，Bt抗蟲作物的研究和應用正在高速發(fā)展。轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展與進步推動了生物學的發(fā)展，也促進了先進科學生產(chǎn)力的發(fā) 展。轉(zhuǎn)基因食品雖然能夠滿足人們對食品營養(yǎng)、產(chǎn)量、抗蟲性、甚至藥用價值等方面的要求， 但同時也對人類的生活帶來了一些潛在的威脅，如某些基因?qū)胨拗髦髸故称樊a(chǎn)生毒 性，轉(zhuǎn)基因食物產(chǎn)生過敏原，使人產(chǎn)生抗藥性，食品的營養(yǎng)價值發(fā)生改變等。在進行轉(zhuǎn)基因 食品研究開發(fā)和商業(yè)化的同時，為了對轉(zhuǎn)基因食品的安全性給予綜合評估，使消費者能夠 快速區(qū)分轉(zhuǎn)基因食品與天然食品，建立合適的方法對轉(zhuǎn)基因食品中轉(zhuǎn)基因成分進行鑒定與 檢測，能夠促進農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理，保障人和動物以及微生物的安全，同時能夠保護 生態(tài)環(huán)境，促進農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物技術的進一步研究。為了對轉(zhuǎn)基因作物或者其衍生物中 CrylAc蛋白進行快速的定量或定性分析，研究并得到一株抗CrylAc蛋白的單克隆抗體具 有非常大的意義。兔單克隆抗體較常規(guī)的鼠單克隆抗體具有更多優(yōu)點。首先，兔比鼠能識別更多免 疫抗原的表位抗原決定簇。其次，由于兔脾臟較大，可以進行更多的細胞融合實驗，使得高 通量篩選陽性融合細胞成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種抗CrylAc晶體蛋白的兔單克隆 抗體的制備方法。抗CrylAc晶體蛋白的兔單克隆抗體的制備方法，的步驟如下
1)兔子免疫
將40(Γ600μβ的免疫抗原CrylAc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采 用背部皮下3飛點注射2 3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用 15(T250mg的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；
2)細胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，8 10天后取無菌 脾臟，制備單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞相融合，質(zhì)量百分比為48% 52%的聚乙二醇為融合劑，體積 百分比為189Γ22%的HAT作為選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為 0. 8 X 10_6 1. 2X10_6mol/L的次黃嘌呤，A是濃度為3. 5X10—9 4. 5X10_9mol/L的氨基蝶呤， T是濃度為1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷； 3)雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后第壙12天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進 行預篩，確定是否需要更換細胞培養(yǎng)液；第15 19天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進行初篩，初 步確定是陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周； 第2216天通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定3飛株生長狀態(tài) 最好且表達特異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存， 經(jīng)重組獲得的細胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)， Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。本發(fā)明制備的抗CrylAc晶體蛋白兔單克隆抗體可用于ELISAJestern Blotting 等免疫學手段對CrylAc蛋白的定性或定量研究。具體的實施方式 實施例1
1)兔子免疫
將400μβ的免疫抗原CrylAc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部 皮下3點注射2只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用15(T250mg的 免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；
2)細胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，8天后取無菌脾臟，制備 單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細胞與處于對數(shù)生長期的骨 髓瘤細胞相融合，質(zhì)量百分比為48%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為18%的HAT作為選 擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為0. 8X 10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃度 為3. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 4X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后第8天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進行預 篩，確定是否需要更換細胞培養(yǎng)液；第15天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周；第22天 通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定3株生長狀態(tài)最好且表達特 異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存，經(jīng)重組獲得的細 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。經(jīng)分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對CrylAc蛋白的親和常數(shù)為2. 58 X ΚΛΤ1，其分子量為150KDa.
實施例2 1)兔子免疫
將600μβ的免疫抗原CrylAc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部皮下6點注射3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用250mg的免疫 抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；
2)細胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，10天后取無菌脾臟，制 備單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細胞與處于對數(shù)生長期的 骨髓瘤細胞相融合，質(zhì)量百分比為52%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為2 的HAT作為 選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為1. 2X 10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃 度為4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后第12天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進行預 篩，確定是否需要更換細胞培養(yǎng)液；第19天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周；第26天 通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定5株生長狀態(tài)最好且表達特 異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存，經(jīng)重組獲得的細 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。經(jīng)分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對CrylAc蛋白的親和常數(shù)為2. 46 X ΚΛΤ1，其分子量為150KDa.
實施例3
1)兔子免疫
將500μβ的免疫抗原CrylAc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部 皮下5點注射3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用200mg的免疫 抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；
2)細胞融合
選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，10天后取無菌脾臟，制 備單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細胞與處于對數(shù)生長期的 骨髓瘤細胞相融合，質(zhì)量百分比為50%的聚乙二醇為融合劑，體積百分比為20%的HAT作為 選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為1.0X10_6mOl/L的次黃嘌呤，A是濃 度為4. OX 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是濃度為1. 6X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；
3)雜交瘤細胞的篩選
細胞融合后第10天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進行預 篩，確定是否需要更換細胞培養(yǎng)液；第17天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進行初篩，初步確定是 陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周；第M天 通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定3株生長狀態(tài)最好且表達特 異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存，經(jīng)重組獲得的細 胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)，Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。經(jīng)分析測定，該方法制備的單克隆抗體的免疫學類型為IgG，該方法制備的單克隆 抗體對CrylAc蛋白的親和常數(shù)為2. 69 X ΚΛΤ1，其分子量為150KDa。
權利要求
1.1. 一株抗CrylAc晶體蛋白的兔單克隆抗體的制備方法，其特征在于它的步驟如下1)兔子免疫將40(Γ600μβ的免疫抗原CrylAc蛋白與等量弗氏不完全佐劑混合，完全乳化后， 采用背部皮下3飛點注射2 3只新西蘭大白兔，在開始免疫后的第三、五、七、九周，分別用 15(T250mg的免疫抗原蛋白與弗氏不完全佐劑混合后以同樣的方法進行免疫；2)細胞融合選擇第五次免疫之后血清效價高的兔子先進行一次加強免疫，8 10天后取無菌 脾臟，制備單細胞懸浮液，融合當天選擇生長旺盛、處于對數(shù)生長期的脾細胞與處于對 數(shù)生長期的骨髓瘤細胞相融合，質(zhì)量百分比為48% 52%的聚乙二醇為融合劑，體積 百分比為189Γ22%的HAT作為選擇性培養(yǎng)基，鋪于40塊96孔板中，其中H是濃度為 0. 8 X 10_6 1. 2Χ lO—mol/L的次黃嘌呤，A是濃度為3. 5X10^4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤， T是濃度為1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；3)雜交瘤細胞的篩選細胞融合后第壙12天隨機選擇40板中的2塊板對克隆子通過間接酶聯(lián)免疫吸附進 行預篩，確定是否需要更換細胞培養(yǎng)液；第15 19天通過間接酶聯(lián)免疫吸附進行初篩，初 步確定是陽性的克隆子，并將對應的雜交瘤細胞細胞轉(zhuǎn)移到M孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)一周； 第2216天通過間接酶聯(lián)免疫吸附法進行復篩，篩選出陽性克隆，并確定3飛株生長狀態(tài) 最好且表達特異性抗體能力最強的細胞株進入重組載體的構建，其他克隆子_20°C凍存， 經(jīng)重組獲得的細胞株選擇一株親和力和分泌抗體能力強，特異性高的克隆子經(jīng)體外培養(yǎng)， Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化并得到目標單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗Cry1Ac晶體蛋白兔單克隆抗體的制備方法。它包括高純度Cry1Ac晶體蛋白作為免疫抗原免疫兔子、多抗血清效價的測定、兔子B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合、以選擇性培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)，經(jīng)預篩、初篩、復篩過程選擇陽性克隆子并大量擴增，構建重組載體并體外培養(yǎng)，分離并純化獲得單克隆抗體。本發(fā)明可用于ELISA，WesternBlotting等免疫學手段對Cry1Ac蛋白的定性或定量檢測。
文檔編號C07K16/18GK102120770SQ20101060112
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者倪庚, 馮勁松, 劉娜, 沈金兒, 鄭曉冬, 陸蕾 申請人:浙江大學