專利名稱：一種提取分離桿菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從桿菌肽發(fā)酵中分離提取桿菌肽的方法，具體地說，涉及一種從 5 20W/V%的桿菌肽發(fā)酵液中分離提取桿菌肽的方法。
背景技術(shù)：
桿菌肽(Bacitracin，CAS1405_87_4)是一種白色或淺黃灰色粉末，無臭、味苦。 在水、甲醇、丙酮、氯仿中幾乎不溶，而易溶于吡啶中，在乙醚中微溶。該物質(zhì)由多種氨基酸結(jié)合而成的不穩(wěn)定的多肽，含有A、Ap B、C等至少9種組分組成的混合物，其中桿菌肽A為主要活性組分。1943年被美國的B. H. Johnson第一次發(fā)現(xiàn)，可以從枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)和B類地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發(fā)酵液中提取分離制得，廣泛用于治療深部真菌、皮膚和粘膜真菌等疾病。桿菌肽主要通過發(fā)酵法制備，從發(fā)酵液提取分離桿菌肽的方法很多，主要有離子交換法、有機(jī)溶劑萃取法等方法，美國專利US2776240和US^15432公開了用離子交換吸附法提取分離桿菌肽的方法，這些方法的不足之處是收率低、工藝復(fù)雜。美國專利US2498165 和US26093M公開了用有機(jī)溶劑萃取提取分離桿菌肽的方法，這些方法使用的有機(jī)溶劑通常為醇類或各種酯類，工藝較為簡單，但由于大量使用有機(jī)溶劑，對溶劑的選擇性和再生能力提出了較高要求，而且這種有毒、易爆、易揮發(fā)溶劑的使用，對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染，給操作也帶來不便。同時有機(jī)溶劑價格昂貴，其易揮發(fā)的特性也使得工業(yè)運(yùn)行的成本大幅度提尚ο因此，桿菌肽的提取分離方法已經(jīng)不少，但是，這些方法運(yùn)用在工業(yè)生產(chǎn)中，都存在不少困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取分離桿菌肽的方法，該方法具有效率高、設(shè)備簡單、 經(jīng)濟(jì)性好、分離系數(shù)大、選擇性高、能耗低、無二次污染、可在常溫下連續(xù)操作等特點(diǎn)。本發(fā)明是通過如下步驟實(shí)現(xiàn)的1)、超濾提取分離桿菌肽濃縮液桿菌肽發(fā)酵液經(jīng)過經(jīng)過酸化，如鹽酸、硫酸、草酸，震動篩過濾或離心去除菌體后，超濾去除菌體和大分子雜質(zhì)、樹脂吸附脫除無機(jī)鹽、真空蒸發(fā)濃縮得到桿菌肽濃縮液；2)、桿菌肽濃縮液制備桿菌肽結(jié)晶體桿菌肽濃縮液經(jīng)過溶劑萃取、脫色、納濾、結(jié)晶分離、干燥、粉碎、篩分、檢驗、成品包裝等生產(chǎn)步驟得到合格的桿菌肽。具體步驟如下(1)將桿菌肽發(fā)酵液經(jīng)過酸化，如鹽酸、硫酸、草酸，震動篩過濾或抽濾或泵入離心機(jī)中分離，將分離后的清液輸入貯罐中。(2)將經(jīng)過分離菌體后的桿菌肽發(fā)酵液清液再經(jīng)超濾過濾除去殘余菌絲體、蛋白質(zhì)、糖、色素等生物大分子，并用1 5倍的水洗滌菌渣中殘留的桿菌肽，邊清洗，邊超濾以獲得高的產(chǎn)品收率。超濾所用的膜組件為無機(jī)膜組件，主要由1根、3根、7根、19根、37根多通道、管式、平板式、蜂窩體等膜元件組成，膜材料為截留分子量5000 200000的陶瓷膜、 沸石膜、玻璃膜。(3)桿菌肽發(fā)酵液也可以直接經(jīng)過超濾過濾除去殘余菌絲體、蛋白質(zhì)、糖、色素等生物大分子，并用1 5倍的水洗滌菌渣中殘留的桿菌肽，邊清洗，邊超濾以獲得高的產(chǎn)品收率。超濾所用的膜組件為無機(jī)膜組件，主要由1根、3根、7根、19根、37根多通道、管式、 平板式、蜂窩體等膜元件組成，膜材料為截留分子量5000 200000的陶瓷膜、沸石膜、玻璃膜。(4)將經(jīng)超濾去雜質(zhì)所得的桿菌肽發(fā)酵液的超濾透析液和殘余菌液洗滌水超濾透析液合并，用陽離子交換樹脂靜態(tài)吸附，如Amberlite IRC-50、Duolite C-20，樹脂洗脫劑選用親水性的低級醇類，如甲醇、乙醇；洗脫劑濃度為5% 45%，收集高含量部分洗脫液。(5)將桿菌肽洗脫液加入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在10 40Kpa、30 60°C條件下減壓蒸發(fā)去除洗脫劑及部分水，得到效價大于3000u/ml桿菌肽濃縮液。(6)向桿菌肽濃縮液中加入1 4倍的萃取劑，如甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁醇，分離去除水相，再經(jīng)過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫除萃取劑，向有機(jī)相中加入1 3W/V%的活性炭脫色，調(diào)節(jié)pH至3. 5 6. 5，攪拌，過濾，得到桿菌肽脫色液。(7)將桿菌肽脫色液用納慮濃縮脫鹽，濃縮至效價大于5000u/ml，電導(dǎo)小于 2000μ s/cm。除菌過濾，噴霧干燥，得到效價大于65U/mg的桿菌肽。納濾所用的膜組件為板式膜組件、管式膜組件和卷式膜組件，納濾膜材料為截留分子量200 500的醋酸纖維膜、 聚醚砜膜、聚酰胺膜。與已有的方法比較，本發(fā)明所采用的技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、通過超濾、樹脂吸附和納濾三步分離技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，直接從桿菌肽發(fā)酵液中分離得到桿菌肽，提高了桿菌肽產(chǎn)品的收率。2、桿菌肽是一種不穩(wěn)定的生化產(chǎn)品，而膜分離是一種無相變低溫操作的工藝過程，前端工藝采用陶瓷膜等無機(jī)膜超濾，后端工藝采用醋酸纖維膜等納濾，可有效保護(hù)桿菌肽產(chǎn)品結(jié)構(gòu)不被破壞。3、采用超濾、樹脂吸附和納濾三步分離，再結(jié)合真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，精制的桿菌肽溶液被高度濃縮，使萃取步驟所用的萃取劑用量大幅降低，因而在收率上也將大大超過其它工藝方法。4、利用超濾、樹脂吸附和納濾三步分離法去除菌絲、菌體、色素、鹽類等雜質(zhì)，可獲得高質(zhì)量、高純度的桿菌肽產(chǎn)品。5、本發(fā)明分離提取所得的桿菌肽產(chǎn)品工藝穩(wěn)定、操作簡便，是一種高效低成本的分離提取桿菌肽的技術(shù)，特別適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一1、過濾離心將經(jīng)過過濾的桿菌肽發(fā)酵液泵入離心機(jī)中分離，將離心液輸入中轉(zhuǎn)貯罐作為下步超濾的原料。(該步收率大于98% )。2、超濾將100L離心液泵入管式超濾系統(tǒng)超濾過濾，并不斷加入純水稀釋沖洗濃縮液，得到除去殘余菌絲體、蛋白質(zhì)、糖、色素等生物大分子超濾透析液和含有殘余菌絲體、 蛋白質(zhì)、糖、色素等生物大分子的150L超濾濃縮液。超濾所用的膜材料為截留分子量5000 的陶瓷膜，工作條件為常溫，進(jìn)壓3. 5bar,出壓2. Obar。3、樹脂吸附與解析在150L超濾濃縮液中加入樹脂靜態(tài)吸附，飽和的樹脂用 15 %乙醇水溶液洗滌，再用30 %乙醇溶液解析，得到62L解析液；所用樹脂為Amberlite IRC-50。4、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮將62L桿菌肽解析液加入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在10 40Kpa、30 60°C條件下減壓蒸發(fā)去除乙醇，得到14L效價為3300u/ml桿菌肽濃縮液，所得乙醇再進(jìn)行提純，循環(huán)使用。5、萃取向14L桿菌肽濃縮液中加入15L乙酸乙酯提取分層，分離去除水相，再經(jīng)過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫除乙酸乙酯，向有機(jī)相中加入2W/V%的活性炭脫色，用5%鹽酸調(diào)節(jié) PH = 5. 0，攪拌，過濾，得到桿菌肽脫色液12L。6、精制將12L桿菌肽脫色液用納濾濃縮脫鹽，納濾膜選用醋酸纖維膜 (MWC0500)，濃縮至效價大于5000u/ml，電導(dǎo)小于2000 μ s/cm。除菌過濾，噴霧干燥，得到 685g效價大于65U/mg的桿菌肽。實(shí)施例二1、過濾離心與實(shí)施例一相同。2、超濾將IOOL離心液泵入管式超濾系統(tǒng)超濾過濾，并不斷加入純水稀釋沖洗濃縮液，得到除去殘余菌絲體、蛋白質(zhì)、糖、色素等生物大分子超濾透析液和含有殘余菌絲體、 蛋白質(zhì)、糖、色素等生物大分子的150L超濾濃縮液。超濾所用的膜材料為截留分子量10000 的陶瓷膜，工作條件為常溫，進(jìn)壓4. 5bar,出壓2. ^ar。3、樹脂吸附與解析在150L超濾濃縮液中加入樹脂靜態(tài)吸附，飽和的樹脂用20% 甲醇水溶液洗滌，再用30%甲醇溶液解析，得到60L解析液；所用樹脂為Duolite C-20。4、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮將60L桿菌肽解析液加入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在10 40Kpa、30 55°C條件下減壓蒸發(fā)去除甲醇，得到15L效價為3300u/ml桿菌肽濃縮液，所得甲醇再進(jìn)行提純，循環(huán)使用。5、萃取向15L桿菌肽濃縮液中加入30L乙酸乙酯提取分層，分離去除水相，再經(jīng)過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫除乙酸乙酯，向有機(jī)相中加入2W/V%的活性炭脫色，用5%鹽酸調(diào)節(jié) PH = 5. 0，攪拌，過濾，得到桿菌肽脫色液12L。6、精制將12L桿菌肽脫色液用納濾濃縮脫鹽，納濾膜選用醋酸纖維膜 (MWC0500)，濃縮至效價大于5000u/ml，電導(dǎo)小于2000 μ s/cm。除菌過濾，噴霧干燥，得到 680g效價大于65U/mg的桿菌肽。實(shí)施例三1、過濾離心與實(shí)施例一相同。2、超濾與實(shí)施例二相同。3、樹脂吸附與解析在150L超濾濃縮液中加入樹脂靜態(tài)吸附，飽和的樹脂20%甲醇水溶液洗滌，再用30%甲醇溶液解析，得到60L解析液；所用樹脂為D113。4、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮將64L桿菌肽解析液加入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在10 40Kpa、30 60°C條件下減壓蒸發(fā)去除乙醇，得到15L效價為3300u/ml桿菌肽濃縮液，所得
5甲醇再進(jìn)行提純，循環(huán)使用。5、萃取向15L桿菌肽濃縮液中加入30L正丁醇提取分層，分離去除水相，再經(jīng)過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫除正丁醇，向有機(jī)相中加入2W/V%的活性炭脫色，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH = 5. 0，攪拌，過濾，得到桿菌肽脫色液15L。6、精制將14L桿菌肽脫色液用納濾濃縮脫鹽，納濾膜選用聚醚砜膜(MWC0500)， 濃縮至效價大于5000u/ml，電導(dǎo)小于2000 μ s/cm。除菌過濾，噴霧干燥，得到688g效價大于65U/mg的桿菌肽。實(shí)施例四1、過濾離心與實(shí)施例一相同。2、超濾與實(shí)施例一相同。3、樹脂吸附與解析在150L超濾濃縮液中加入樹脂靜態(tài)吸附，飽和的樹脂用15% 乙醇水溶液洗滌，再用30%乙醇溶液解析，得到62L解析液；所用樹脂為D152。4、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮將62L桿菌肽解析液加入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在10 40Kpa、30 60°C條件下減壓蒸發(fā)去除乙醇，得到15L效價為3300u/ml桿菌肽濃縮液，所得乙醇再進(jìn)行提純，循環(huán)使用。5、萃取向15L桿菌肽濃縮液中加入45L正丁醇提取分層，分離去除水相，再經(jīng)過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫除正丁醇，向有機(jī)相中加入2W/V%的活性炭脫色，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH = 5. 0，攪拌，過濾，得到桿菌肽脫色液12L。6、精制將12L桿菌肽脫色液用納濾濃縮脫鹽，納濾膜選用聚酰胺膜(MWC0500)， 濃縮至效價大于5000u/ml，電導(dǎo)小于2000 μ s/cm。除菌過濾，噴霧干燥，得到690g效價大于65U/mg的桿菌肽。本發(fā)明通過上面的實(shí)施例進(jìn)行舉例說明，但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這里所描述的特殊實(shí)例和實(shí)施方案。在這里包含這些特殊實(shí)例和實(shí)施方案的目的在于幫助本領(lǐng)域中的技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。任何本領(lǐng)域中的技術(shù)人員很容易在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)和完善，因此，本發(fā)明只受到本發(fā)明權(quán)利要求的內(nèi)容和范圍的限制，其意圖涵蓋所有權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的備選方案和等同方案。
權(quán)利要求
1.一種提取分離桿菌肽的方法。其特征步驟如下(1)超濾提取分離桿菌肽濃縮液桿菌肽發(fā)酵液經(jīng)過經(jīng)過酸化，如鹽酸、硫酸、草酸，震動篩過濾或離心去除菌體后，超濾去除菌體和大分子雜質(zhì)、樹脂吸附脫除無機(jī)鹽、真空蒸發(fā)濃縮得到桿菌肽濃縮液；(2)桿菌肽濃縮液制備桿菌肽結(jié)晶體桿菌肽濃縮液經(jīng)過溶劑萃取、脫色、納濾、結(jié)晶分離、干燥、粉碎、篩分、檢驗、成品包裝等生產(chǎn)步驟得到合格的桿菌肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離桿菌肽的方法，其特征在于所述的超濾去除雜質(zhì)是將桿菌肽發(fā)酵液直接用超濾膜過濾去除殘余的菌絲體、蛋白質(zhì)、糖、色素等生物大分子物質(zhì)，并用1 5倍的水洗滌菌渣中殘留的桿菌肽，再進(jìn)行超濾，合并桿菌肽發(fā)酵液和殘余菌渣洗水兩部分超濾液，超濾所用的膜組件為無機(jī)膜組件，主要由1根、3根、7根、19根、37 根無機(jī)膜組成的多通道、管式、平板式、蜂窩體等膜元件組成，膜材料為截留分子量5000 200000的陶瓷膜、沸石膜、玻璃膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離桿菌肽的方法，其特征在于所述的樹脂吸附所用的樹脂為弱酸陽離子大孔吸附樹脂，將桿菌肽超濾液用陽離子交換樹脂靜態(tài)吸附，樹脂選用 Amberlite IRC-50,Duolite C_20、LewatitCNP80、D113、D152，樹脂洗脫劑選用親水性的低級醇類，如甲醇、乙醇；洗脫劑濃度為5% 45%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離桿菌肽的方法，其特征在于所述的真空蒸發(fā)濃縮是在10 40Kpa、30 60°C條件下減壓蒸發(fā)去除洗脫劑及部分水，得到桿菌肽含量大于 3000u/ml桿菌肽濃縮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離桿菌肽的方法，其特征在于所述的溶劑萃取所選擇的溶劑為低級脂肪酸酯類或低級脂肪醇類，如甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丁醇，向桿菌肽濃縮液中加入1 4倍的萃取劑，并向有機(jī)相中加入1 3W/V%的活性炭脫色，調(diào)節(jié)pH至3. 5 6. 5，攪拌，過濾，得到桿菌肽脫色液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取分離桿菌肽的方法，其特征在于所述的桿菌肽脫色液納慮濃縮脫鹽，是將桿菌肽脫色液濃縮至效價大于5000u/ml，電導(dǎo)小于2000μ s/cm。除菌過濾，噴霧干燥，得到效價大于65U/mg的桿菌肽。
全文摘要
一種提取分離桿菌肽的方法，其特征步驟如為(1)超濾提取分離桿菌肽濃縮液桿菌肽發(fā)酵液經(jīng)過經(jīng)過酸化，震動篩過濾或離心去除菌體后，超濾去除菌體和大分子雜質(zhì)、樹脂吸附脫除無機(jī)鹽、真空蒸發(fā)濃縮得到桿菌肽濃縮液；(2)桿菌肽濃縮液制備桿菌肽結(jié)晶體桿菌肽濃縮液經(jīng)過溶劑萃取、脫色、納濾、結(jié)晶分離、干燥、粉碎、篩分、檢驗、成品包裝等生產(chǎn)步驟得到合格的桿菌肽產(chǎn)品。本發(fā)明具有效率高、設(shè)備簡單、經(jīng)濟(jì)性好、分離系數(shù)大、選擇性高、能耗低、無二次污染、可在常溫下連續(xù)操作等特點(diǎn)，特別適合桿菌肽的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/34GK102153633SQ20101060658
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月27日
發(fā)明者孫立文, 李軍, 楊宏, 陳軍 申請人:江蘇九陽生物制藥有限公司