專利名稱：一種荔枝果皮中根皮苷的提取和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種根皮苷的提取和純化方法，特別是涉及一種荔枝果皮中根皮苷的 提取和純化方法，屬于天然植物中化妝品原料開發(fā)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根皮素及其糖苷根皮苷屬于黃酮類中的二氫查耳酮，是國內(nèi)外新近研究開發(fā)的一 種新型皮膚美白劑和抗氧化劑。二氫查耳酮在自然界分布較少，根皮素及根皮苷存在于一 些植物的根莖和根皮中，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在蘋果中含量較多，且多以根皮苷的形式存在[1_2]。荔 枝Hitdii chinensis Sonn.)是中國嶺南地區(qū)盛產(chǎn)的特色水果，對荔枝果皮的研究初步 推斷其含有黃酮類物質(zhì)[3]。但在本課題研究前國內(nèi)外尚沒有從荔枝中發(fā)現(xiàn)根皮苷的文獻(xiàn)報(bào) 道。目前，國內(nèi)外在天然植物中提取根皮苷的方法主要是有機(jī)溶劑提取法、超聲波浸提法和 微波輔助法，分離純化的方法主要是高效液相色譜法、硅膠柱層析法和薄層層析法。

發(fā)明內(nèi)容
荔枝是中國嶺南地區(qū)產(chǎn)量較大的季節(jié)性特色水果，深受人們喜愛。如能從荔枝果 皮中提取根皮苷并作為一種具有美白和抗衰老活性的天然原料應(yīng)用于化妝品中，不僅來源 廣泛，而且變廢為寶，既可以帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，又可以促進(jìn)本地化妝品產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)的 發(fā)展。本發(fā)明的目的在于提供一種荔枝果皮中根皮苷的提取和純化方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。一種荔枝果皮中根皮苷的提取和純化方法，它包括以下步驟
1、粉碎新鮮荔枝果皮(連衣)陰干后，粉碎過40目篩；
2、提取粗提液準(zhǔn)確稱取荔枝果皮粉末10.0 g，加入70%乙醇150mL，超聲處理30分 鐘，功率100%;過濾后重復(fù)提取一次，合并濾液；濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至70 mL，加入 180 mL無水乙醇靜置，1 后以濾紙過濾；濾液減壓濃縮至乙醇全部揮發(fā)，然后加入雙蒸水 150mL，并以超聲輔助溶解，最后過濾后得到粗提液；
3、富集荔枝皮粗提液將上述粗提液上樣至大孔樹脂柱16g，上樣速度1 mL/min，然后 以450 mL雙蒸水淋洗至無色，再以70%乙醇50mL解吸附，流速lmL/min，得到荔枝皮提取 液，并予4°C避光保存；
4、固相萃取取上述荔枝皮提取液5mL以lmL/min流速通過活化后的固相萃取小柱，前 3mL流出液棄去，其余流出液收集；所述固相萃取小柱的活化需要先用IOmL甲醇通過固相 萃取小柱，再以IOmL雙蒸水洗去甲醇，速度均為lmL/min ；
5、純化所述純化采用高效液相色譜法進(jìn)行，它包括以下步驟
(1)高效液相色譜檢測根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品精密稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品0. 0050 g，溶于甲醇中， 配制成濃度0. 002 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過濾后作高效液相色譜，得到根 皮苷標(biāo)準(zhǔn)品保留時間21. 4Mmin，見圖1 ；(2)高效液相色譜檢測固相萃取后的收集液精密稱取固相萃取后的收集液0.0050g， 溶于甲醇中，配制成濃度0. 002 mg/mL溶液，經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過濾后作高效液相色譜， 得到該收集液保留時間21. 518min，見圖2。收集21. 518min流出液，由于此保留時間與標(biāo) 準(zhǔn)品的保留時間大致相同，所以此波峰很可能為目標(biāo)物質(zhì)根皮苷；
(3)將步驟(2)收集到的流出液用氮吹儀濃縮至120μ L，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾后 作高效液相色譜，顯示保留時間為21. 758min的單個波峰為純化后的單體化合物——根皮 苷；
結(jié)構(gòu)鑒定精密稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品0. 0050 g，溶于甲醇中，配制成濃度0.005 mg/mL標(biāo) 準(zhǔn)品溶液。將此標(biāo)準(zhǔn)品溶液和純化后的單體化合物分別作質(zhì)譜檢測。根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品主要質(zhì) 譜峰(見圖4)和荔枝果皮提取液純化后的單體化合物主要質(zhì)譜峰(見圖5) —致。高效液相色譜是在經(jīng)典的液體柱色譜法基礎(chǔ)上，采用高壓泵、高效固定相和高靈 敏度檢測器，引入氣相色譜理論后發(fā)展起來的色譜技術(shù)。其原理是利用每種物質(zhì)在固定相 中的保留時間不同而達(dá)到分離的目的。高效液相色譜法具有以下特點(diǎn)(1)色譜柱可反復(fù) 使用，流動相選擇范圍寬，流出組分容易收集；(2)分離效率高，分析速度快，靈敏度高，操 作自動化。植物的萃取液進(jìn)樣后，很快就可以在檢測器上看到在不同保留時間點(diǎn)上出現(xiàn)的 不同波峰，每一種波峰為一種化合物，波峰下面積即為此化合物的含量，因此，這是一種既 可以純化物質(zhì)又可以進(jìn)行定量分析的方法。另外，高效液相色譜不僅能夠分離復(fù)雜樣品，并 在定量分析方面具有優(yōu)越性，而且本實(shí)驗(yàn)中使用的Agilent 1100高效液相色譜儀帶有光 電二極管陣列(PDAD)紫外光度檢測器，可以提供紫外波譜掃描，初步鑒定流出組分的化學(xué) 結(jié)構(gòu)。即使同一樣物質(zhì)和同一個色譜條件，每次通過高效液相色譜儀后的保留時間也不
可能完全一致，允許有一定誤差。本發(fā)明的方法突破性的發(fā)現(xiàn)了荔枝中存在根皮苷，并將其從荔枝果皮中提純出來 作為一種具有美白和抗衰老活性的天然原料應(yīng)用于化妝品中，荔枝果皮在中國嶺南地區(qū)不 僅來源廣泛，而且變廢為寶，既可以帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，又可以促進(jìn)本地化妝品產(chǎn)業(yè)核心 技術(shù)的發(fā)展。


圖1是根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(濃度0. 002 mg/ml) HPLC圖譜，保留時間=21. 444 min ； 圖2是荔枝果皮提取液HPLC圖譜，保留時間=21. 518min處可見色譜峰；
圖3是荔枝果皮提取液經(jīng)純化后的單體化合物HPLC圖譜，保留時間=21. 758min ； 圖4是根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(濃度0. 005 mg/mL)質(zhì)譜圖； 圖5是荔枝果皮提取液純化后的單體化合物質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。一、準(zhǔn)備主要儀器、試劑和材料
Agilent 1100高效液相色譜儀(光電二極管陣列檢測器)、Ultimate C18柱 (250X4. 6mm, 5 μ m), Dikma C18 固相萃取小柱(500 mg，3mL)。
API 4000 QTrap液相色譜一三重四極桿/線性離子質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國應(yīng)用生物系 統(tǒng)公司)，數(shù)據(jù)自動關(guān)聯(lián)一增強(qiáng)子離子掃描，鎖定435.4 m/z，碰撞能量一 15V、一 30V、一 45V 三者疊加，掃描范圍50 - 500 m/z。KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器，功率100W。HGC-12氮吹儀(天津恒奧公司)，溫度50 V。DlOl大孔樹脂(天津南開和成公司)。根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司，純度彡99. 0%。流動相所用甲醇為色譜純(Dikma公司)，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。其余試劑均為分 析純。荔枝品種為桂味，采自廣州增城船坑果園。二、高效液相色譜條件
流動相A為甲醇，流動相B為0. 1%乙酸(ν ν，ρΗ3· 20)，進(jìn)樣量20 μ L,柱溫35 V，檢測 波長觀6 nm。流動相梯度及流速見表1。表1流動相比例及流速
i#!
B<
Λ
應(yīng)I
三、本實(shí)施例的一種荔枝果皮中根皮苷的提取和純化方法，它包括以下步驟
一種荔枝果皮中根皮苷的提取和純化方法，它包括以下步驟
1、粉碎新鮮荔枝果皮(連衣)陰干后，粉碎過40目篩；
2、提取粗提液準(zhǔn)確稱取荔枝果皮粉末10.0 g，加入70%乙醇150mL，超聲處理30分 鐘，功率100%;過濾后重復(fù)提取一次，合并濾液；濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至70 mL，加入 180 mL無水乙醇靜置，1 后以濾紙過濾；濾液減壓濃縮至乙醇全部揮發(fā)，然后加入雙蒸水 150mL，并以超聲輔助溶解，最后過濾后得到粗提液；
3、富集荔枝皮粗提液將上述粗提液上樣至大孔樹脂柱16g，上樣速度1 mL/min，然后 以450 mL雙蒸水淋洗至無色，再以70%乙醇50mL解吸附，流速lmL/min，得到荔枝皮提取 液，并予4°C避光保存；
4、固相萃取取上述荔枝皮提取液5mL以lmL/min流速通過活化后的固相萃取小柱，前 3mL流出液棄去，其余流出液收集；所述固相萃取小柱的活化需要先用IOmL甲醇通過固相 萃取小柱，再以IOmL雙蒸水洗去甲醇，速度均為lmL/min ；
5、純化所述純化采用高效液相色譜法進(jìn)行，它包括以下步驟
a)高效液相色譜檢測根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品精密稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品0.0050g，溶于甲醇中， 配制成濃度0. 002 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過濾后作高效液相色譜，得到根 皮苷標(biāo)準(zhǔn)品保留時間21. 4Mmin，見圖1 ；
b)高效液相色譜檢測固相萃取后的收集液精密稱取固相萃取后的收集液0.0050g， 溶于甲醇中，配制成濃度0. 002 mg/mL溶液，經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過濾后作高效液相色譜， 得到該收集液保留時間21. 518min，見圖2。收集21. 518min流出液，由于此保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間大致相同，所以此波峰很可能為目標(biāo)物質(zhì)根皮苷；
c)將步驟b)收集到的流出液用氮吹儀濃縮至120 μ L，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾后 作高效液相色譜，顯示保留時間為21. 758min的單個波峰為純化后的單體化合物——根皮 苷；
6、結(jié)構(gòu)鑒定精密稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品0. 0050 g，溶于甲醇中，配制成濃度0. 005 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將此標(biāo)準(zhǔn)品溶液和純化后的單體化合物分別作質(zhì)譜檢測。根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品主要 質(zhì)譜峰(見圖4)和荔枝果皮提取液純化后的單體化合物主要質(zhì)譜峰(見圖5) —致，證實(shí)了 用本發(fā)明的方法提取和純化后的物質(zhì)就是根皮苷。
權(quán)利要求
1. 一種荔枝果皮中根皮苷的提取和純化方法，其特征在于它包括以下步驟 粉碎新鮮荔枝果皮(連衣)陰干后，粉碎過40目篩；提取粗提液準(zhǔn)確稱取荔枝果皮粉末10. 0 g，加入70%乙醇150mL，超聲處理30分鐘， 功率100% ；過濾后重復(fù)提取一次，合并濾液；濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至70 mL，加入 180 mL無水乙醇靜置，1 后以濾紙過濾；濾液減壓濃縮至乙醇全部揮發(fā)，然后加入雙蒸水 150mL，并以超聲輔助溶解，最后過濾后得到粗提液；富集荔枝皮粗提液將上述粗提液上樣至大孔樹脂柱16 g，上樣速度1 mL/min，然后以 450 mL雙蒸水淋洗至無色，再以70%乙醇50mL解吸附，流速lmL/min，得到荔枝皮提取液， 并予4°C避光保存；固相萃取取上述荔枝皮提取液5mL以lmL/min流速通過活化后的固相萃取小柱，前 3mL流出液棄去，其余流出液收集；所述固相萃取小柱的活化需要先用IOmL甲醇通過固相 萃取小柱，再以IOmL雙蒸水洗去甲醇，速度均為lmL/min ； 純化所述純化采用高效液相色譜法進(jìn)行，包括以下步驟高效液相色譜檢測根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品精密稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品0.0050 g，溶于甲醇中，配制 成濃度0. 002 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過濾后作高效液相色譜，得到根皮苷 標(biāo)準(zhǔn)品保留時間21. 444min ；高效液相色譜檢測固相萃取后的收集液精密稱取固相萃取后的收集液0. 0050 g，溶 于甲醇中，配制成濃度0. 002 mg/mL溶液，經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過濾后作高效液相色譜，得 到該收集液保留時間21. 518min,收集21. 518min流出液；將步驟b)收集到的流出液用氮吹儀濃縮至120 μ L，經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾后作高 效液相色譜，顯示保留時間為21. 758min的單個波峰為純化后的單體化合物——根皮苷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種荔枝果皮中根皮苷的提取和純化方法，屬于天然植物中化妝品原料開發(fā)領(lǐng)域，它包括以下步驟粉碎——提取粗提液——富集荔枝皮粗提液——固相萃取——純化。本發(fā)明突破性的發(fā)現(xiàn)了荔枝中存在根皮苷，并將其從荔枝果皮中提純出來作為一種具有美白和抗衰老活性的天然原料應(yīng)用于化妝品中，荔枝果皮在中國嶺南地區(qū)不僅來源廣泛，而且變廢為寶。
文檔編號C07H15/203GK102086220SQ20101061772
公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者賴維 申請人:廣州市天吻嬌顏化妝品有限公司