專利名稱：核蛋白的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及核蛋白的提取技術(shù)。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組測序的完成和后基因組時代的到來，尋找疾病相關(guān)基因和鑒定基 因的功能，已成為當(dāng)今首要任務(wù)。提取蛋白對研究其功能至關(guān)重要，如抗體制備，晶體結(jié)構(gòu)， 功能域分析等均需要設(shè)計蛋白的提取。核蛋白屬于結(jié)合蛋白質(zhì)中的一類，普遍存在于各種 生物的細(xì)胞核中的特殊形態(tài)的蛋白質(zhì)，由核酸，組蛋白及精蛋白等的堿性蛋白結(jié)合而成，為 細(xì)胞核的主要成分。根據(jù)核酸種類不同，可分為核糖核酸核蛋白和脫氧核糖核酸核蛋白，可 從細(xì)胞核中提取得到，能溶解于lmol/L NaCl溶液中。對提取核蛋白的要求是合理的效 率、速度、收率和純度，同時保留該提取純化蛋白的生物活性和化學(xué)完整性。核蛋白主要從細(xì)胞和組織中提取，其中從細(xì)胞蛋白中提取的具體步驟為 取一定量的細(xì)胞，在4°C，500 Xg條件下離心2 3分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸
干，收集細(xì)胞。用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。每20 μ 1細(xì)胞壓積中 加入200 μ 1冷的Buffer A，2 μ 1蛋白酶抑制劑混合物，高速渦旋振蕩15秒，置冰上10分 鐘。再次高速渦旋振蕩5秒，然后在4°C，離心，快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即 可得到胞漿蛋白，請置于冰上或-80°C冰箱保存?zhèn)溆?。在沉淀中加?00 μ L冷的Buffer B，2 μ L蛋白酶抑制劑混合物，高速渦旋振蕩15秒。置冰上40分鐘，每隔10分鐘高速渦旋 振蕩15秒；在4°C，16000 Xg條件下離心10分鐘，快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管， 即可得到核蛋白。從組織中提取核蛋白的步驟和從細(xì)胞中提取核蛋白的方法雷同，其區(qū)別 在于組織需經(jīng)勻漿處理，具體為取適量組織樣本剪碎，加冷PBS，用組織勻漿器勻漿至無 明顯肉眼可見固體(或用液氮研磨)，冰上靜置5分鐘，小心將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心 管。在4°C，500Xg條件下離心2 3分鐘，棄上清。但是，上述方法將大量的核蛋白隨DNA 一起沉淀而被丟棄，進而不能滿足諸如酵母雙雜交、免疫共沉淀和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，尤其新 近被廣泛推廣的串聯(lián)親和純化技術(shù)等，其研究核蛋白相互作用過程中對總蛋白制備的要求 更高。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種核蛋白的提取方法，該方法在細(xì)胞裂解液 處理的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用超聲裂解的方法，避免大量的核蛋白隨DNA —起沉淀而被丟棄，含 量和活性最大化的獲得總蛋白提取物及核蛋白。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為 核蛋白的提取方法，具體包括以下步驟
A核蛋白粗提液的制備在洗滌并去上清液的細(xì)胞或組織勻漿中加入裂解液，4°C條件 下緩慢旋轉(zhuǎn)裂解細(xì)胞或組織45飛0分鐘，得核蛋白粗提液；B核蛋白的制備將步驟A所得核蛋白粗提液冰浴超聲，靜置或離心后，取上清液，核 蛋白存在于所述上清液中。進一步，步驟A所述的裂解液由pH值為7. 5、濃度為50mM的三羥甲基氨基甲烷鹽 酸鹽，濃度為150mM的氯化鈉溶液，體積百分?jǐn)?shù)為5%的甘油，體積百分?jǐn)?shù)為1%的NP-40裂 解液，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 5%的脫氧膽酸鈉，濃度為50mM的氟化鈉溶液，濃度為ImM的原釩酸 鈉十二水溶液，濃度為ImM的乙二胺四乙酸溶液，濃度為ImM的二硫蘇糖醇溶液，濃度為ImM 的苯甲基磺酰氟溶液，濃度為5 μ g/mL的糜蛋白酶抑制素，濃度為5 μ g/mL的胃酶抑素a和 濃度為5 μ g/mL的亮抑蛋白酶肽和濃度為5 μ g/mL的抗蛋白酶素組成的混合液；
進一步，步驟A中，在洗滌并去上清液的細(xì)胞或組織勻漿中加入所述裂解液，其中每IO7 細(xì)胞中加入ImL裂解液，4°C緩慢旋轉(zhuǎn)裂解細(xì)胞1小時，得核蛋白粗提液；
進一步，步驟B中，將步驟A所得核蛋白粗提液冰浴超聲，40瓦功率條件下每10毫升體 積的核蛋白粗提液超聲5分鐘，IOOOOOXg離心1小時，取上清液，核蛋白存在于所述上清液 中；
進一步，所述核蛋白為非變性核蛋白。本發(fā)明的有益效果在于在細(xì)胞裂解液處理的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用超聲裂解的方法， 避免大量的核蛋白隨DNA —起沉淀而被丟棄，含量和活性最大化的獲得總蛋白提取物及核 蛋白，本方法操作簡單，適用于大規(guī)模提取。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細(xì)描述，其中
圖lSffestern Blotting凝膠圖，其中A為對照組提取的核蛋白，B為運用本申請所 述方法提取的核蛋白。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進 行詳細(xì)的描述。實施例1
一裂解液的配制
裂解液為PH值為7. 5、濃度為50mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，濃度為150mM/L的 氯化鈉溶液，體積百分?jǐn)?shù)為5%的甘油，體積百分?jǐn)?shù)為1%的NP-40裂解液，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為 0. 5%的脫氧膽酸鈉，濃度為50mM的氟化鈉溶液，濃度為ImM的原釩酸鈉十二水溶液，濃度 為ImM的乙二胺四乙酸溶液，濃度為ImM的二硫蘇糖醇溶液，濃度為ImM的苯甲基磺酰氟 溶液和 15mL/片 Complete, Mini, EDTA-free 組成的混合液，商品名為 Complete, Mini, EDTA-free的片劑中每片含有糜蛋白酶抑制素、胃酶抑素a和亮抑蛋白酶肽和抗蛋白酶素 各 5 μ g/mLο二核蛋白的制備
取IOX IO6個轉(zhuǎn)染了帶SBP-tag標(biāo)簽的靶核蛋白的H印G2細(xì)胞株，在4°C，500 X g條件 下離心2 3分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。在洗滌并去上清液的細(xì)胞或組織勻漿中加入所述裂解液，其中以 每107細(xì)胞中加入ImL裂解液的比例加入裂解液，4°C緩慢旋轉(zhuǎn)裂解細(xì)胞1小時，得核蛋白粗 提液。將步驟A所得核蛋白粗提液冰浴超聲10分鐘，離心后，取上清液，上清液為核蛋白。三提取效果比較
1、收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了帶SBP-tag標(biāo)簽的靶核蛋白的!fepG2細(xì)胞株2 X 10 7個分成等份兩 管；《一#身褒分析哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的事麼么方茲》(“An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nature methods. Dec 2006;3(12): 1013-1019，，一文介紹蛋 照組，和本發(fā)明方法分別進行處理，收獲非變性總蛋白。2, Western Blotting檢測核蛋白提取量
用等量與SBP-tag結(jié)合的珠子分別與非變性總蛋白孵育，4°C結(jié)合1小時，取未結(jié)合的 上清50 μ L ；用靶核蛋白的抗體對總蛋白和未結(jié)合部分做Western Blotting檢測，其中所 有樣本上樣量及方法相同。圖1顯示，同一組內(nèi)，總蛋白均比未結(jié)合部分條帶要濃，顯示兩 方法都能提取有活性的核蛋白；兩組間比較，本發(fā)明(圖1-B)提取的總蛋白條帶明顯濃于 對照組(圖1-A)，顯示本發(fā)明方法能夠提取更多的有活性的核蛋白。運用本方法從組織中提取總蛋白和核蛋白，可以實現(xiàn)同樣的提取效果。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.核蛋白的提取方法，其特征在于，具體包括以下步驟A核蛋白粗提液的制備在洗滌并去上清液的細(xì)胞或組織勻漿中加入裂解液，4°C條件 下緩慢旋轉(zhuǎn)裂解細(xì)胞或組織45飛0分鐘，得核蛋白粗提液；B核蛋白的制備將步驟A所得核蛋白粗提液冰浴超聲，靜置或離心后，取上清液，核 蛋白存在于所述上清液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核蛋白的提取方法，其特征在于步驟A所述的裂解液由pH 值為7. 5、濃度為50mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，濃度為150mM的氯化鈉溶液，體積百分 數(shù)為5%的甘油，體積百分?jǐn)?shù)為1%的NP-40裂解液，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 5%的脫氧膽酸鈉，濃度 為50mM的氟化鈉溶液，濃度為ImM的原釩酸鈉十二水溶液，濃度為ImM的乙二胺四乙酸溶 液，濃度為ImM的二硫蘇糖醇溶液，濃度為ImM/L的苯甲基磺酰氟溶液，濃度為5 μ g/mL的 糜蛋白酶抑制素，濃度為5 μ g/mL的胃酶抑素a和濃度為5 μ g/mL的亮抑蛋白酶肽和濃度 為5 μ g/mL的抗蛋白酶素組成的混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核蛋白的提取方法，其特征在于步驟A中，在洗滌并去上清 液的細(xì)胞或組織勻漿中加入所述裂解液，其中每IO7細(xì)胞中加入ImL裂解液，4°C緩慢旋轉(zhuǎn) 裂解細(xì)胞1小時，得核蛋白粗提液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核蛋白的提取方法，其特征在于步驟B中，將步驟A所 得核蛋白粗提液冰浴超聲，40瓦功率條件下每10毫升體積的核蛋白粗提液超聲5分鐘， IOOOOOXg離心1小時，取上清液，核蛋白存在于所述上清液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項所述的核蛋白的提取方法，其特征在于所述核蛋白為 非變性核蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及核蛋白的提取方法，具體包括以下步驟在洗滌并去上清液的細(xì)胞或組織勻漿中加入裂解液，4℃條件下緩慢旋轉(zhuǎn)裂解細(xì)胞或組織45-60分鐘，得核蛋白粗提液；將步驟A所得核蛋白粗提液冰浴超聲，靜置或離心后，取上清液，核蛋白存在于所述上清液中；本方法在細(xì)胞裂解液處理的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用超聲裂解的方法，避免大量的核蛋白隨DNA一起沉淀而被丟棄，含量和活性最大化的獲得總蛋白提取物及核蛋白，本方法操作簡單，適用于大規(guī)模提取。
文檔編號C07K1/14GK102146118SQ20101061814
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者倪兵, 吳玉章, 黃澤民 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)