專利名稱：一種檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒。

背景技術(shù)：
狂犬病又名恐水癥，是一種侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性病毒性傳染病，多由患病的動物咬人而得，一旦發(fā)病死亡率高達(dá)100%。目前國內(nèi)外預(yù)防狂犬病的主要手段是對暴露人群注射狂犬病疫苗。世界衛(wèi)生組織建議，狂犬病毒的中和抗體滴度達(dá)到0. 5IU/ml時具有保護力。對于已注射疫苗的人血清中抗狂犬病毒抗體滴度的評價，可以作為臨床評估該疫苗有效性的指標(biāo)。目前常用的檢測狂犬病毒抗體的檢測方法有熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)、快速熒光斑點抑制試驗(RFFIT)、小鼠中和試驗(MNT)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。其中酶聯(lián)免疫吸附試驗操作安全，靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確性強，得到普遍的認(rèn)可。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括1)包被有0. 05 μ g/ml 0. 1 μ g/ml重組狂犬病病毒G蛋白的酶標(biāo)板；2)樣品稀釋液含有0. 5%0 1%。酪蛋白鈉鹽的磷酸鹽緩沖液；3)洗滌液含有0. 5%0 1%。吐溫的磷酸鹽緩沖液；4)酶標(biāo)記物用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgGFc片段單克隆抗體；5)顯色劑A 含有0. 4%。 0. 6%。過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩沖液；6)顯色劑B 含有0. 2%。 0. 25%。四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液；7)終止液1. 5mol/L 2mol/L硫酸溶液；8)陰性對照正常人血清；9)陽性對照含有狂犬病毒抗體的人血清。前述的試劑盒，所述重組狂犬病病毒G蛋白按照下述方法制備，包括步驟1)以編碼狂犬病病毒G蛋白的堿基序列作為目的基因片段根據(jù)NCBI上公布的數(shù)據(jù)以及親/疏水性程序軟件分析，選取狂犬病病毒G蛋白全序列從149位502位的共354 個氨基酸殘基所對應(yīng)的堿基序列作為目的基因片段，合成共1062個堿基(bp)的目的基因片段；2)將該目的基因片段通過表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，篩選得到表達(dá)狂犬病病毒G蛋白的工程細(xì)胞；3)培養(yǎng)工程細(xì)胞，得到包涵體；4)破碎細(xì)胞，純化，得到重組狂犬病病毒G蛋白。前述的試劑盒，所述表達(dá)載體為pET系列質(zhì)粒(pET_5a)。
前述的試劑盒，所述宿主細(xì)胞為E. coli BL21 (DE3)。本發(fā)明還提供上述檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，包括如下步驟1)加樣取包 被好的酶聯(lián)板，每次實驗設(shè)空白對照孔、陰性血清對照孔、陽性血清對照孔和樣品孔，在各孔先加樣品稀釋液ΙΟΟμ 1，再依次向各對應(yīng)孔中加入陰性血清、陽性血清和樣品各ΙΟμΙ，混勻?？瞻讓φ湛字患訕悠废♂屢害│?1。貼上不干膠條，置于37°C 溫育20min。2)洗板倒扣掉酶聯(lián)板中的液體，并向各孔加入洗滌液300 μ 1，靜置30s后，扣掉酶聯(lián)板中的液體，反復(fù)洗滌5次，最后一次要將液體拍干。3)加二抗向各孔中加入二抗酶標(biāo)記物100μ 1，空白對照孔不加，貼上不干膠條， 置于37°C溫育20min。4)洗板，同步驟2)。5)顯色依次向各孔加顯色劑A和顯色劑B各50μ1，混勻，置于37°C溫育15min。6)終止依次向各孔加入終止液50 μ 1，混勻。7)測定用酶聯(lián)儀對空白孔調(diào)零，測定各孔的光吸收值(0D值)。8)判定結(jié)果根據(jù)測定OD值與臨界值(cut-off值)的比值判斷。若比值大于1， 則該血清為陽性，說明其中含有狂犬病毒抗體，疫苗具有保護效力；若比值小于1，則該血清為陰性，說明其中不含抗體。臨界值的確定用注射過狂犬病毒疫苗的人血清對小鼠進(jìn)行腦內(nèi)中和試驗，并測定中和抗體效價，將未注射過狂犬疫苗的人血清稀釋至0.5IU/ml。對1000份上述血清按照步驟1)-7)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗，測得的OD值求平均(又)以及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，cut-offiti +3SD。本發(fā)明提供的檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，用于在注射過狂犬病毒疫苗后，檢測血清中是否存在相應(yīng)抗體，以評價免疫效果。本發(fā)明是利用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測狂犬病毒抗體的試劑盒，以抗體滴度為0. 5IU/ml的內(nèi)部質(zhì)控血清測定值作為臨界值 (cut-off值)，具有高靈敏度和特異性。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備本發(fā)明的檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括1)包被有0. 1 μ g/ml重組狂犬病病毒G蛋白的酶標(biāo)板；2)樣品稀釋液含有1%。酪蛋白鈉鹽的磷酸鹽緩沖液；3)洗滌液含有1%。吐溫的磷酸鹽緩沖液；4)酶標(biāo)記物用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgGFc片段單克隆抗體；5)顯色劑A 含有0. 6%。過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩沖液；6)顯色劑B 含有0. 25%。四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液；7)終止液2mol/L硫酸溶液；8)陰性對照正常人血清；
9)陽性對照含有狂犬病毒抗體的人血清。 其中，重組狂犬病病毒G蛋白按照下述方法制備，包括步驟1)目的基因的獲得選取狂犬病病毒G蛋白全序列從149位502位的共354個氨基酸殘基所對應(yīng)的堿基序列作為目的基因片段，合成共1062個堿基(bp)的目的基因片段。2)重組將所述目的基因片段和質(zhì)粒pET_5a用限制性內(nèi)切酶Bgl II和BamH I 雙酶切，并利用T4連接酶將目的基因片段重組于質(zhì)粒。3)轉(zhuǎn)化采用氯化鈣-丙三醇法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21，并對菌體進(jìn)行復(fù)蘇。4)驗證將轉(zhuǎn)化子涂布于含25 μ g/ml 50 μ g/ml氨芐霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 18小時。挑取白色菌落提質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和雙酶切，并根據(jù)SDS-PAGE電泳條帶的分析對比確定質(zhì)粒是否發(fā)生重組。5)表達(dá)挑取1個重組質(zhì)粒的克隆，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_值為0. 3 0. 5 時加入0. 05mmol/L 0. lmmol/LIPTG,大約3. 5小時后蛋白表達(dá)量最大。6)純化對菌液進(jìn)行超聲破碎菌體，4000rpm離心，取上清液，用4B凝膠層析柱純化并測定蛋白含量，確定蛋白濃度。實驗例檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒的應(yīng)用及檢測效果上述實施例制得的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，包括如下步驟1)加樣取包被好的酶聯(lián)板，每次實驗設(shè)空白對照孔、陰性血清對照孔、陽性血清對照孔和樣品孔，在各孔先加樣品稀釋液100μ 1，再依次向各對應(yīng)孔中加入陰性血清、陽性血清和樣品各ΙΟμΙ，混勻?？瞻讓φ湛字患訕悠废♂屢?00 μ 1。貼上不干膠條，置于37°C 溫育20min。2)洗板倒扣掉酶聯(lián)板中的液體，并向各孔加入洗滌液300 μ 1，靜置30s后，扣掉酶聯(lián)板中的液體，反復(fù)洗滌5次，最后一次要將液體拍干。3)加二抗向各孔中加入二抗酶標(biāo)記物100μ 1，空白對照孔不加，貼上不干膠條， 置于37°C溫育20min。4)洗板，同步驟2)。5)顯色依次向各孔加顯色劑A和顯色劑B各50μ1，混勻，置于37°C溫育15min。6)終止依次向各孔加入終止液50 μ 1，混勻。7)測定用酶聯(lián)儀對空白孔調(diào)零，測定各孔的光吸收值(0D值)。8)判定結(jié)果根據(jù)測定OD值與臨界值(cut-off值)的比值判斷。若比值大于1， 則該血清為陽性，說明其中含有狂犬病毒抗體，疫苗具有保護效力；若比值小于1，則該血清為陰性，說明其中不含抗體。臨界值的確定用注射過狂犬病毒疫苗的人血清對小鼠進(jìn)行腦內(nèi)中和試驗，并測定中和抗體效價，將未注射過狂犬疫苗的人血清稀釋至0.5IU/ml。對1000份上述血清按照步驟1)-7)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗，測得的OD值求平均(又)以及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，cut-offlK +3SD。將本發(fā)明試劑盒和寧波天潤生物制品有限公司生產(chǎn)的試劑盒(國號準(zhǔn)字 S2006008)分別對進(jìn)口狂犬病毒疫苗與國產(chǎn)狂犬病毒疫苗免疫后人群、免疫與非免疫人群進(jìn)行狂犬病毒抗體檢測，結(jié)果如表1和表2所示。表1進(jìn)口苗與國產(chǎn)苗全程免疫后抗體陽轉(zhuǎn)情況比較
權(quán)利要求
1.一種檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，其包括1)包被有0.05 μ g/ml 0. 1 μ g/ml重組狂犬病病毒G蛋白的酶標(biāo)板；2)樣品稀釋液含有0.5%。 1%。酪蛋白鈉鹽的磷酸鹽緩沖液；3)洗滌液含有0.5%0 1%。吐溫的磷酸鹽緩沖液；4)酶標(biāo)記物用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgGFc片段單克隆抗體；5)顯色劑A含有0. 4%。 0. 6%。過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩沖液；6)顯色劑B含有0. 2%0 0. 25%。四甲基聯(lián)苯胺的檸檬酸鹽緩沖液； 7)終止液1.5mol/L 2mol/L硫酸溶液；8)陰性對照正常人血清；9)陽性對照含有狂犬病毒抗體的人血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述重組狂犬病病毒G蛋白按照下述方法制備，包括步驟1)根據(jù)NCBI上公布的數(shù)據(jù)以及親/疏水性程序軟件分析，選取狂犬病病毒G蛋白全序列從149位502位的共354個氨基酸殘基所對應(yīng)的堿基序列作為目的基因片段，合成共 1062個堿基的目的基因片段；2)將該目的基因片段通過表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，篩選得到表達(dá)狂犬病病毒G蛋白的工程細(xì)胞；3)培養(yǎng)工程細(xì)胞，得到包涵體；4)破碎細(xì)胞，純化，得到重組狂犬病病毒G蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述表達(dá)載體為pET-5a質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為E.coli BL21。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測狂犬病毒抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒、其制備方法及檢測方法。該試劑盒是將重組狂犬病毒G蛋白作為抗原包被在酶聯(lián)板上，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgG Fc片段單克隆抗體作為酶標(biāo)記物。所述試劑盒還包括顯色劑A、顯色劑B、終止液、樣品稀釋液、陰性對照為正常人血清、陽性對照為含有狂犬病毒抗體的血清。本試劑盒靈敏度高，準(zhǔn)確度高，操作安全，方便快捷。
文檔編號C07K14/145GK102175867SQ20101062067
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者何佳琦, 王婷婷, 韓菲, 魏文進(jìn) 申請人:北京民海生物科技有限公司