專利名稱：包含全長(zhǎng)抗體和單鏈Fab片段的多特異性抗體的制作方法
包含全長(zhǎng)抗體和單鏈Fab片段的多特異性抗體本發(fā)明涉及包含全長(zhǎng)抗體和單鏈Fab片段的多特異性抗體，特別地雙特異性抗體、生產(chǎn)其的方法、含有所述抗體的藥物組合物，及其用途。
背景技術(shù)：
最近，已經(jīng)研發(fā)了多種多特異性重組抗體格式，例如通過融合，例如，IgG 抗體格式和單鏈區(qū)域的四價(jià)雙特異性抗體(參見例如，Coloma, M. J.，等，Nature Biotech 15(1997)159-163 ；WO 2001/077342 ；和 Morrison， S.L. ， Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。也已經(jīng)研發(fā)了幾種能結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)抗原的其他新格式，例如雙、三鏈或四鏈抗體、微型抗體、幾種單鏈抗體(scFv，Bis-scFv)，其中不再保留抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA、IgD、 IgE、IgG 或 IgM)(Holliger, P.，等，Nature Biotech 23(2005) 1126-1136 ；Fischer, N.， Lege, 0. , Pathobiology 74(2007)3-14 ；Shen, J.等,Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74 ；ffu, C.等，Nature Biotech. 25(2007) 1290-1297) 所有此類格式都使用接頭，以將抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與其他結(jié)合蛋白質(zhì)(例如scFv)融合或者以融合例如兩個(gè)Fab片段或scFv (Fischer, N.，Leger, 0.， Pathobiology 74 Q007) 3_14)。應(yīng)當(dāng)注意，通過與天然存在的抗體保持高度的相似性，可以期望保留通過Fc受體結(jié)合介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，例如如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。在WO 2007/024715中報(bào)道了作為基因工程的多價(jià)和多特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的雙可變區(qū)免疫球蛋白。在US 6，897，044中報(bào)道了制備生物活性抗體二聚體的方法。在US 7，129，330中報(bào)道了通過肽接頭相互連接的具有至少四個(gè)可變區(qū)的多價(jià)Fv抗體構(gòu)建體。在 US 2005/0079170中報(bào)道了二聚和多聚抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。在US 6，511，663中報(bào)道了包含通過連接結(jié)構(gòu)共價(jià)地相互結(jié)合的三個(gè)或四個(gè)Fab片段的三價(jià)或四價(jià)單特異性抗原結(jié)合蛋白質(zhì)， 所述蛋白質(zhì)不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中報(bào)道了可以在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中有效表達(dá)的并可以用于治療和診斷方法的四價(jià)雙特異性抗體。在US 2005/0163782中報(bào)道了在包含兩種類型的多肽二聚體的混合物中，從不通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體分離或者優(yōu)選地合成通過至少一個(gè)鏈間二硫鍵連接的二聚體的方法。在US 5，959，083 中報(bào)道了雙特異性四價(jià)受體。在WO 2001/077342中報(bào)道了具有三個(gè)或多個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程化抗體。在WO 1997/001580中報(bào)道了多特異性和多價(jià)抗原結(jié)合多肽。WO 1992/004053報(bào)道了通過合成交聯(lián)共價(jià)連接的，一般制備自與相同的抗原決定簇結(jié)合的IgG型單克隆抗體的同型綴合物(homoconjugate)。WO 1991/06305中報(bào)道了對(duì)抗原具有高親和力的寡聚單克隆抗體，其中分泌的寡聚體，一般為IgG型，具有結(jié)合在一起的兩個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白單體，以形成四價(jià)或六價(jià)IgG分子。在US 6，350，860中報(bào)道了綿羊來源的抗體和工程化抗體構(gòu)建體，其可以用于治療疾病，其中干擾素Y活性是致病原因。在US 2005/0100543中報(bào)道了可靶向的構(gòu)建體，其是雙特異性抗體的多價(jià)運(yùn)載體，即，可以將每一分子的可靶向構(gòu)建體用作為兩個(gè)或多個(gè)雙特異性抗體的運(yùn)載體。在WO 1995/009917中報(bào)道了基因工程改造的雙特異性四價(jià)抗體。在WO 2007/109254中報(bào)道了包含穩(wěn)定化scFv或由穩(wěn)定化scFv組成的穩(wěn)定化結(jié)合分子。Muller, D.等，Handbook of Therapeutic antibodies, Part III，第 2 章， (2008) 345-378涉及雙特異性抗體，例如涉及通過肽接頭在重鏈的C末端與兩個(gè)scFv片段融合的全長(zhǎng)抗體(也參見 WO 1995/009917)。Hust, M.等，BMC Biotechnology (2007) 7 ^ 及單鏈Fab (scFab)片段。然而，鑒于多特異性抗體的不同問題和方面(如例如，藥物動(dòng)力學(xué)的和生物學(xué)的特性、穩(wěn)定性、聚集性、表達(dá)產(chǎn)率)，存在另外備選的多特異性抗體格式的需要。特別地，在 WO 1995/009917 和 Miiller，D.等，Handbookof Therapeutic antibodies，第 III 部分，第 2 章，(2008)345-378中報(bào)道的基因工程改造的雙特異性四價(jià)抗體顯示出僅非常低的表達(dá)產(chǎn)率。發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面是多特異性抗體，其包含a)與第一抗原特異結(jié)合的并由兩個(gè)抗體重鏈和兩個(gè)抗體輕鏈組成的全長(zhǎng)抗體； 和b)與一個(gè)至四個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的(優(yōu)選地與一個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的) 一個(gè)或多個(gè)單鏈Fab片段，其中，b)項(xiàng)的所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C或N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。本發(fā)明的優(yōu)選方面是多特異性抗體，其包含a)與第一抗原特異結(jié)合的并由兩個(gè)抗體重鏈和兩個(gè)抗體輕鏈組成的全長(zhǎng)抗體； 和b)與一個(gè)至四個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的(優(yōu)選地與一個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的) 一個(gè)至四個(gè)單鏈Fab片段，其中，b)項(xiàng)的所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C或N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。優(yōu)選地，所述多特異性抗體包含與第二抗原結(jié)合的一個(gè)或兩個(gè)單鏈Fab片段(雙特異性抗體)。優(yōu)選地，所述多特異性抗體包含與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)單鏈Fab片段(雙特異性抗體)。優(yōu)選地，所述多特異性抗體包含與第二抗原和第三抗原結(jié)合的兩個(gè)單鏈Fab片段 (三特異性抗體)。本發(fā)明的另外方面是編碼所述多特異性抗體的鏈的核酸分子，其中所述單鏈Fab 片段與所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C或N末端融合。本發(fā)明的另外方面是包含所述多特異性抗體的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體顯示出有價(jià)值的特性，例如高穩(wěn)定性、低聚集傾向 (參見例如實(shí)施例2 (例如，與通過肽接頭在重鏈的C末端與兩個(gè)scFv片段融合的全長(zhǎng)抗體比較(參見 WO I995AW99I7 或 MUller，D.等，Handbook of Therapeutic antibodies, 第III部分，第2章，0008)345-378)))。在一個(gè)方面，由于根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體與不同抗原結(jié)合，所以它們表現(xiàn)出新的特性，并且在另一方面，由于它們良好的穩(wěn)定性、低聚集性和有價(jià)值的藥物動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)特性，它們適合用于生產(chǎn)藥物制劑。由于它們的Ig核心，以及可以在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的能力，它們?nèi)员Ａ袅颂烊豢贵w的特性如ADCC和 CDC。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面是多特異性抗體，其包含a)與第一抗原特異結(jié)合的并由兩個(gè)抗體重鏈和兩個(gè)抗體輕鏈組成的全長(zhǎng)抗體； 和b)與一個(gè)至四個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的(優(yōu)選地與一個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的) 一個(gè)或多個(gè)單鏈Fab片段，其中，b)項(xiàng)的所述單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C 或N末端與a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體融合。本發(fā)明的優(yōu)選方面是多特異性抗體，其包含a)與第一抗原特異結(jié)合的并由兩個(gè)抗體重鏈和兩個(gè)抗體輕鏈組成的全長(zhǎng)抗體； 和b)與一個(gè)至四個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的(優(yōu)選地與一個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的) 一個(gè)至四個(gè)單鏈Fab片段，其中，b)項(xiàng)的所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C或N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，與第二抗原結(jié)合的一個(gè)或兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，與第二抗原結(jié)合的一個(gè)或兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，與第二抗原結(jié)合的一個(gè)或兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的輕鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的每一重鏈或輕鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的每一重鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的每一輕鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”指由兩個(gè)“全長(zhǎng)抗體重鏈”和兩個(gè)“全長(zhǎng)抗體輕鏈”組成的抗體 (參見

圖1)。“全長(zhǎng)抗體重鏈”是以N末端至C末端方向由抗體重鏈可變區(qū)(VH)、抗體重鏈恒定區(qū)1 (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)(HR)、抗體重鏈恒定區(qū)2 (CH2)和抗體重鏈恒定區(qū)3 (CH3)，縮寫為 VH-CH1-HR-CH2-CH3 ；和任選地，在IgE抗體亞類的情況下，抗體重鏈恒定區(qū)4 (CH4)組成的多肽。優(yōu)選地，“全長(zhǎng)抗體重鏈”是以N末端至C末端方向由VH、CH1、HR、CH2和CH3組成的多肽?！叭L(zhǎng)抗體輕鏈”是以N末端至C末端方向由抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體輕鏈恒定區(qū) (CL)，縮寫為VL-CL組成的多肽?？贵w輕鏈恒定區(qū)(CL)可以是κ (kappa)或λ (lambda) 0 通過CL區(qū)和CHl區(qū)之間和全長(zhǎng)抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的鏈間二硫鍵，將兩個(gè)全長(zhǎng)抗體鏈連接在一起。一般的全長(zhǎng)抗體的實(shí)例是天然抗體如IgG (例如IgG 1和IgG^、IgM, IgA, IgD 和IgE。根據(jù)本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體可以來自單一的物種例如人類，或者它們是嵌合的或人源化的抗體。根據(jù)本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體包含每一個(gè)都由VH和VL對(duì)形成的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，其都與相同的抗原特異地結(jié)合。所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C末端指在所述重鏈或輕鏈的 C末端的最后一個(gè)氨基酸。所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的N末端指所述重鏈或輕鏈的N末端的最后一個(gè)氨基酸?！皢捂淔ab片段”(參見圖2)是由抗體重鏈可變區(qū)(VH)、抗體恒定區(qū)1 (CHl)、抗體輕鏈可變區(qū)(VL)、抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)和接頭組成的多肽，其中所述抗體區(qū)和所述接頭具有以N末端至C末端方向的以下順序之一 a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CHl， c) VH-CL-接頭-VL-CHl或d) VL-CHl-接頭-VH-CL ；其中所述接頭是至少30個(gè)氨基酸，優(yōu)選地32至50個(gè)氨基酸之間的多肽。所述單鏈Fab片段a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CHl，c) VH-CL-接頭-VL-CHl 或 d) VL-CHl-接頭-VH-CL，通過 CL 區(qū)和 CHl 區(qū)之間的天然二硫鍵穩(wěn)定。術(shù)語(yǔ)“N末端”指N末端的最后一個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“C末端”指C末端的最后一個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述單鏈Fab片段中，所述抗體區(qū)和所述接頭具有以N末端至C末端方向的以下順序之一a) VH-CHl-接頭-VL-CL，或 b) VL-CL-接頭-VH-CH1，更優(yōu)選 VL-CL-接頭-VH-CH1。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述單鏈Fab片段中，所述抗體區(qū)和所述接頭具有以N末端至C末端方向的以下順序之一a) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 b) VL-CHl-接頭-VH-CL。任選地，在所述單鏈Fab片段中，除CL區(qū)和CHl區(qū)之間的天然二硫鍵外，通過引入以下位置之間的二硫鍵，也通過二硫化物穩(wěn)定抗體重鏈可變區(qū)(VH)和抗體輕鏈可變區(qū) (VL)i)重鏈可變區(qū)位置44與輕鏈可變區(qū)位置100，ii)重鏈可變區(qū)位置105與輕鏈可變區(qū)位置43，或iii)重鏈可變區(qū)位置101與輕鏈可變區(qū)位置100(通常根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào))。通過在單鏈Fab片段的可變區(qū)VH和VL之間引入二硫鍵，實(shí)現(xiàn)單鏈Fab片段的此類另外的二硫化物穩(wěn)定(disulfide stabilization)。對(duì)單鏈Fv引入用于穩(wěn)定的非天然二硫鍵的方法描述于，例如 WO 94/029350, Rajagopal, V.等，Prot. Engin. 10(1997) 1453-59 ； Kobayashi，H.等，Nuclear Medicine & Biology，第 25 卷(1998) 387-393 ；或 khmidt， Μ.等，Oncogene 18 (1999) 1711-1721中。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在根據(jù)本發(fā)明的抗體中的在單鏈Fab片段的可變區(qū)之間的任選的二硫鍵在重鏈可變區(qū)位置44和輕鏈可變區(qū)位置 100之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在根據(jù)本發(fā)明的抗體中的在單鏈Fab片段的可變區(qū)之間的任選的二硫鍵在重鏈可變區(qū)位置105和輕鏈可變區(qū)位置43之間(通常根據(jù)Kabat的EU 索引編號(hào))。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的是在所述單鏈Fab片段的可變區(qū)VH和VL之間沒有所述任選的二硫化物穩(wěn)定的單鏈Fab片段。如本發(fā)明中所用，術(shù)語(yǔ)“肽連接體”指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地是合成來源
6的。根據(jù)本發(fā)明的這些肽連接體用于將單鏈Fab片段與全長(zhǎng)抗體的C或N末端融合以形成根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體。優(yōu)選地，b)項(xiàng)的所述肽連接體是具有至少5個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的， 優(yōu)選地具有5個(gè)至100個(gè)，更優(yōu)選地10個(gè)至50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽連接體是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，并且(χ = 3，n = 3、4、5 或 6，和 m = 0、1、2 或 3)或者(x = 4,η = 2、3、4 或 5 和 m = 0、1、2 或 3)，優(yōu)選地x = 4和n = 2或3，更優(yōu)選地，其中χ = 4，n = 2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽連接體是(G4S)20如在本發(fā)明中所用，術(shù)語(yǔ)“接頭”指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地是合成來源的。 根據(jù)本發(fā)明的這些肽用于連接a) VH-CHl至VL-CL，b) VL-CL至VH-CHl，c) VH-CL至VL-CHl 或d) VL-CHl至VH-CL以形成根據(jù)本發(fā)明的以下單鏈Fab片段a) VH-CHl-接頭-VL-CL，b) VL-CL-接頭-VH-CHl，c) VH-CL-接頭-VL-CHl 或 d) VL-CHl-接頭-VH-CL。在單鏈 Fab 片段內(nèi)的所述接頭是具有至少30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，優(yōu)選地具有32至50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸序列的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭是(focS)n，其中G =甘氨酸，S =絲氨酸(χ = 3,η = 8、9或10和m = 0、1、2或3)或(x = 4和η = 6、7或8和m = 0、1、2或3)，優(yōu)選地，其中 χ = 4，11 = 6或7和111 = 0、1、2或3，更優(yōu)選地，其中1 = 4，n = 7*m=2。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭是( #2。對(duì)于所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的每一 C或N末端，只有一個(gè)來自b)項(xiàng)的單鏈 Fab片段可以在同一時(shí)間融合。因此，可以與所述全長(zhǎng)抗體融合多達(dá)八個(gè)單鏈Fab片段。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體包含一個(gè)至四個(gè)單鏈Fab片段。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體包含兩個(gè)相同的單鏈Fab片段(優(yōu)選VL-CL-接頭-VH-CH1)，其都與a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體的兩條重鏈的兩個(gè)C末端或者兩條輕鏈的兩個(gè)C末端融合。該融合導(dǎo)致兩個(gè)相同的融合肽(或者i)重鏈和單鏈Fab片段或者ii)輕鏈和單鏈Fab片段)，其與全長(zhǎng)抗體的或者i)輕鏈或者重鏈共表達(dá)，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體(參見圖3、4和5)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體包含兩個(gè)相同的單鏈Fab 片段(優(yōu)選VH-CHl-接頭-VL-CL)，其都與a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體的兩條重鏈的兩個(gè)N末端或者兩條輕鏈的兩個(gè)N末端融合。該融合導(dǎo)致兩個(gè)相同的融合肽(或者i)重鏈和單鏈Fab 片段或者ii)輕鏈和單鏈Fab片段)，其與全長(zhǎng)抗體的或者i)輕鏈或者重鏈共表達(dá)，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體。根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的兩部分都包含抗原結(jié)合位點(diǎn)(根據(jù)本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體包含兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且每一單鏈Fab片段包含一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合位點(diǎn)，，或“抗原結(jié)合位點(diǎn)，，指與各個(gè)抗原實(shí)際特異結(jié)合的根據(jù)本發(fā)明的所述多特異性抗體的區(qū)域。通過由抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)組成的對(duì)，形成了每一在全長(zhǎng)抗體中或者在單鏈Fab片段中的抗原結(jié)合位點(diǎn)。與期望的抗原(例如EGFR)特異結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以來源于a)抗原的已知抗體(例如抗EGFR抗體)或b)通過使用尤其是抗原蛋白質(zhì)或核酸或者它們片段的重新產(chǎn)生的免疫方法或者通過噬菌體展示獲得的新抗體或抗體片段。本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含六個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其不同程度地有助于結(jié)合位點(diǎn)與抗原的親和力。其具有三個(gè)重鏈可變區(qū)⑶R(⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3)和3個(gè)輕鏈可變區(qū)⑶R (⑶RLl、⑶RL2和⑶RU)。通過比較氨基酸序列的編譯數(shù)據(jù)庫(kù)確定⑶R和構(gòu)架區(qū)(FR)的程度，其中已經(jīng)根據(jù)序列之間的變異性定義了這些區(qū)域?？贵w特異性指抗體對(duì)抗原的特定表位的選擇性識(shí)別。例如天然抗體是單特異性的。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“多特異性”指具有兩個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，其中至少兩個(gè)結(jié)合不同的抗原或者相同抗原的不同表位。根據(jù)本發(fā)明，“雙特異性抗體”是具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。本發(fā)明的抗體是例如對(duì)至少兩個(gè)不同的抗原(即作為第一抗原的EGFR和作為第二抗原的IGF-1R)是多特異性的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體是雙特異性的。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體是三特異性的。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“單特異性”抗體指具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體，其中每一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合相同抗原的相同表位。如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)“價(jià)”指在抗體分子中存在的結(jié)合位點(diǎn)的具體數(shù)目。例如天然抗體或根據(jù)本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且是二價(jià)的。因此，術(shù)語(yǔ)“二價(jià)的”、“三價(jià)的”、“四價(jià)的”、“五價(jià)的”和“六價(jià)的”指在抗體分子中分別存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)、三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)、四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)、五個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和六個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體至少是“三價(jià)的”。優(yōu)選地，它們是“三價(jià)的”、“四價(jià)的”、“五價(jià)的”或“六價(jià)的”，更優(yōu)選地它們是“三價(jià)的”或“四價(jià)的”。本發(fā)明的抗體具有三個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且是多特異性的，優(yōu)選地雙特異性的或三特異性的。甚至在存在多于三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(即抗體是四價(jià)的、五價(jià)的或六價(jià)的或者多價(jià)的)的情況下，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體也可以是雙特異性的。對(duì)于具有多于兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，一些結(jié)合位點(diǎn)可以是相同的，只要該蛋白質(zhì)對(duì)兩種不同的抗原具有結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是多特異性抗體，其包含a)全長(zhǎng)抗體，其與第一抗原特異結(jié)合，并包含aa)由以N末端至C末端方向的抗體重鏈可變區(qū)(VH)、抗體重鏈恒定區(qū)1 (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)(HR)、抗體重鏈恒定區(qū)2 (Cffi)和抗體重鏈恒定區(qū)3 (OK)組成的兩個(gè)相同的抗體重鏈；和ab)由以N末端至C末端方向的抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體輕鏈恒定區(qū)(CL) (VL-CL)組成的兩個(gè)相同的抗體輕鏈；和b)與一個(gè)至四個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的(優(yōu)選地與一個(gè)另外的抗原特異結(jié)合的)一個(gè)至四個(gè)單鏈Fab片段，其中單鏈Fab片段由抗體重鏈可變區(qū)(VH)和抗體恒定區(qū) 1 (CHl)、抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)和接頭組成，并且其中所述抗體區(qū)和所述接頭具有以N末端至C末端方向的以下順序ba) VH-CHl-接頭-VL-CL，bb) VL-CL-接頭-VH-CH1，be) VH-CL-接頭-VL-CH1 或 bd) VL-CHl-接頭-VH-CL ；其中所述接頭是至少30個(gè)氨基酸，優(yōu)選地32個(gè)至50個(gè)氨基酸之間的肽；并且，其中b)項(xiàng)的所述單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C末端或N末端與a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體融合；其中所述肽連接體是至少5個(gè)氨基酸，優(yōu)選地10個(gè)至50個(gè)氨基酸之間的肽。在該實(shí)施方案中，與第二抗原特異結(jié)合的，優(yōu)選一個(gè)或兩個(gè)，更優(yōu)選兩個(gè)單鏈Fab片段 ba) VH-CHl-接頭-VL-CL 或 bb) VL-CL-接頭-VH-CH1，優(yōu)選 bb) VL-CL-接頭-VH-CH1， 通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合，并且該單鏈Fab片段未被二硫化物穩(wěn)定。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的一個(gè)或兩個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合 (雙特異性抗體)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的多特異性抗體包含與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段，所述兩個(gè)相同的單鏈Fab片段或者都與重鏈或者都與輕鏈C或N末端融合(雙特異性抗體)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段VL-CL-接頭-VH-CHl或VH-CHl-接頭-VL-CL，優(yōu)選VL-CL-接頭-VH-CH1，用它們的N末端通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的兩條重鏈的兩個(gè)C末端或者在兩條輕鏈的兩個(gè)C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合(四價(jià)、雙特異性抗體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的所述多特異性抗體(優(yōu)選所述四價(jià)、雙特異性抗體)包含全長(zhǎng)IgG和如上所述的根據(jù)本發(fā)明的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段，并特異結(jié)合人IGF-IR以及人EGFR。這些分子優(yōu)選地基于人抗 IGF-IR 抗體 <IGF-lR>HUMABClone 18 (DSM ACC 2587 ；WO 2005/005635, 簡(jiǎn)稱為 <IGF-lR>Clonel8 或 <IGF_1R>AK18)和人源化的 <EGFR>ICR62 (W0 2006/082515 簡(jiǎn)稱為<EGFR>ICR62)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這些分子同時(shí)靶向并干擾在腫瘤細(xì)胞上的兩種受體酪氨酸激酶的作用。與僅干擾這些受體的一種的抗體比較，該雙活性造成了明顯改進(jìn)的抗腫瘤活性。實(shí)施例1-6中顯示了此類分子的設(shè)計(jì)、組成、產(chǎn)生和特征。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于i)與IGFlR特異結(jié)合，并且在重鏈可變區(qū)中包含SEQ ID NO 1的CDR3區(qū)、SEQ ID NO 2的⑶R2區(qū)和SEQ ID NO 3的⑶Rl區(qū)，且在輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID NO 4的⑶R3 區(qū)、SEQ ID NO 5的⑶R2區(qū)和SEQ ID NO 6的⑶Rl區(qū)的所述全長(zhǎng)抗體；和ii)與EGFR特異結(jié)合，并且在重鏈可變區(qū)中包含SEQ ID NO 9的CDR3區(qū)、SEQ ID NO 10的⑶R2區(qū)和SEQ ID NO 11的⑶Rl區(qū)，且在輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID NO: 12的⑶R3 區(qū)、SEQ ID NO 13的CDR2區(qū)和SEQ ID NO 14的CDRl區(qū)的所述單鏈Fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的該多特異性抗體的特征在于i)與IGF-IR特異結(jié)合，并且包含作為重鏈可變區(qū)的SEQ ID NO 7和作為輕鏈可變區(qū)的SEQ ID NO 8的所述全長(zhǎng)抗體，和ii)與EGFR特異結(jié)合，并且包含作為重鏈可變區(qū)的SEQ ID NO 15和作為輕鏈可變區(qū)的SEQ ID NO 16的所述單鏈Fab片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的該多特異性抗體的特征在于i)與EGFR特異結(jié)合，并且在重鏈可變區(qū)中包含SEQ ID NO 9的⑶R3區(qū)、SEQ ID NO 10的⑶R2區(qū)和SEQ ID NO :11的⑶Rl區(qū)，且在輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0:12的⑶R3 區(qū)、SEQ ID NO 13的CDR2區(qū)和SEQ ID NO 14的CDRl區(qū)的所述全長(zhǎng)抗體；和ii)與IGF-IR特異結(jié)合，并且在重鏈可變區(qū)中包含SEQ ID NO 1的⑶R3區(qū)、SEQ ID NO :2的⑶R2區(qū)和SEQ ID NO :3的⑶Rl區(qū)，且在輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0:4的⑶R3 區(qū)、SEQ ID NO 5的CDR2區(qū)和SEQ ID NO 6的CDRl區(qū)的所述單鏈Fab片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的該多特異性抗體的特征在于i)與EGFR特異結(jié)合，并且包含作為重鏈可變區(qū)的SEQ ID NO 15和作為輕鏈可變區(qū)的SEQ ID NO 16的所述全長(zhǎng)抗體，和ii)與IGFlR特異結(jié)合，并且包含作為重鏈可變區(qū)的SEQ ID NO 7和作為輕鏈可變區(qū)的SEQ ID NO 8的所述單鏈Fab片段。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)相同單鏈Fab片段VL-CL-接頭-VH-CHl或VH-CHl-接頭-VL-CL，優(yōu)選VL-CL-接頭-VH-CH1，以它們的C末端通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的兩條重鏈的兩個(gè)N末端或在兩條輕鏈的兩個(gè)N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的一個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的一條重鏈或一條輕鏈的C或N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的一個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的一條重鏈或一條輕鏈的N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的一個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的一條重鏈或一條輕鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合(參見例如圖6)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體包含與第二抗原和第三抗原結(jié)合的兩個(gè)單鏈 Fab片段(三特異性抗體)(參見例如圖7)。在本發(fā)明的另一方面中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體包含a)與第一抗原結(jié)合的由兩條相同的抗體重鏈VH-CH1-HR-CH2-CH3和兩條相同的抗體輕鏈VL-CL組成的全長(zhǎng)抗體；和b)與一個(gè)至四個(gè)另外的抗原結(jié)合的一個(gè)至四個(gè)單鏈Fab片段ki)VH-CHl-接頭-VL-CL或ΙΛ) VL-CL-接頭-VH-CHl，其中所述單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈和輕鏈的C或N末端與所述全長(zhǎng)抗體連接。本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體包含一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白類型的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白類型包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同種型，以及在IgG和IgA情況下它們的亞型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體具有IgG型抗體的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一氨基酸組成的抗體分子的制備物。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指包含來自一種來源或物種的可變區(qū)即結(jié)合區(qū)，以及至少一部分來源于不同來源或物種的恒定區(qū)的抗體，通常通過重組DNA技術(shù)制備。優(yōu)選包含鼠源可變區(qū)和人源恒定區(qū)的嵌合抗體。由本發(fā)明包括的“嵌合抗體”的其他優(yōu)選形式是其中恒定區(qū)已經(jīng)從原始抗體的恒定區(qū)得以修飾或改變，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的那些嵌合抗體。此類嵌合抗體也稱為“類別轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段的免疫球蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法涉及本領(lǐng)域熟知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染方法。參見，例如，Morrison，S. L.等，Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984)6851-6855; 美國(guó)專利 No. 5，202，238 和 5，204，244。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指這樣的抗體，其中框架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(OTR)已經(jīng)被修飾，以包含與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性的免疫球蛋白的CDR。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將鼠CDR移植至人抗體的框架區(qū)，以制備“人源化抗體”。參見例如，Riechmarm，L.等， Nature 332 (1988) 323-327 ；以及 Neuberger，Μ· S.等，Nature 314(1985068-270。特別優(yōu)選的CDR對(duì)應(yīng)于提供這樣序列的CDR，所述序列識(shí)別上述嵌合抗體的抗原。由本發(fā)明包括的 “人源化抗體”的其他形式是其中恒定區(qū)已經(jīng)從原始抗體的恒定區(qū)得以修飾或改變，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的那些人源化抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“人抗體”旨在包括具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。人抗體在本領(lǐng)域是眾所周知的(van Dijk, Μ. Α.和van de Winkel, J. G.， Curr. Opin.Chem. Biol. 5(2001)368-374)。人抗體也可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)中生產(chǎn)， 所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)免疫后能夠生產(chǎn)全部或選擇的人抗體，而無內(nèi)源免疫球蛋白生產(chǎn)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這樣的種系突變小鼠中導(dǎo)致在抗原刺激時(shí)生產(chǎn)人抗體(參見例如 Jakobovits，Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, Α.等，Nature 362(1993)255-258 ；Bruggemann, Μ.等，Yearlmmunol. 7 (1993) 33-40)。 人抗體也可以在噬菌體展示文庫(kù)中生產(chǎn)(Hoogenboom，H. R.和Winter，G.，J. Mol. Biol. 227(1992)381-388 ；Marks, J. D.等，J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。還可以利用 Cole等及Boerner等的技術(shù)制備人單克隆抗體(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, (1985)77 ；和Boerner，P.等，J. Immunol. 147(1991)86—95)。 如已經(jīng)提及的根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體，如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“人抗體”也包含其中例如通過“類別轉(zhuǎn)換”(即改變或突變Fc部分，例如從IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4 的突變)修飾恒定區(qū)，以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR) 結(jié)合的此類抗體。在根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體包含產(chǎn)生異二聚融合肽的一個(gè)或三個(gè)單鏈Fab 片段的情況下(或者在兩個(gè)不相同的單鏈片段都連接在重鏈或輕鏈的C末端或N末端的情況下)，根據(jù)本發(fā)明的所述全長(zhǎng)抗體的CH3區(qū)可以通過在例如WO 96/027011， Ridgway, J. B.等，Protein Eng 9(1996)617—621 ；禾口 Merchant，Α. Μ.等，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中用幾個(gè)實(shí)施例詳細(xì)描述的“杵臼結(jié)構(gòu)(knob-into-hole)"方法改變。在該方法中，改變兩個(gè)CH3區(qū)的相互作用表面以增加含有這兩個(gè)CH3區(qū)的兩重鏈的異二聚化。(兩重鏈的)兩個(gè)CH3區(qū)的每一個(gè)可以是“杵狀結(jié)構(gòu)(knob)”，而另一個(gè)是“臼狀結(jié)構(gòu)(hole)”。二硫鍵的引入穩(wěn)定了異二聚體(Merchant，A.M.等，Nature Biotech 16(1998)677-681 ；Atwel 1, S.等，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)并增加了產(chǎn)率。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，根據(jù)本發(fā)明的所述多特異性抗體包含僅一個(gè)單鏈 Fab片段，并且其另外的特征在于一條重鏈的CH3區(qū)和另一條重鏈的CH3區(qū)在包含抗體CH3區(qū)之間的原始界面處各自接觸；其中，改變所述界面以促進(jìn)二價(jià)雙特異性抗體的形成，其中該改變的特征在于a)改變一條重鏈的CH3區(qū)，以使在接觸二價(jià)雙特異性抗體內(nèi)另一條重鏈CH3區(qū)的原始界面的一條重鏈的CH3 區(qū)原始界面內(nèi)，用具有更大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代氨基酸殘基，從而產(chǎn)生該條重鏈的CH3區(qū)的界面內(nèi)的突出部分，其可定位于另一條重鏈的CH3區(qū)的界面內(nèi)的腔中禾口b)改變另一條重鏈的CH3區(qū)，以使在接觸三價(jià)雙特異性抗體內(nèi)第一 CH3區(qū)的原始界面的第二 CH3區(qū)的原始界用具有更小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基取代氨基酸殘基，從而產(chǎn)生在第二 CH3區(qū)的界面內(nèi)的腔，其中位于第一 CH3區(qū)的界面內(nèi)的突出部分可以定位于其中。優(yōu)選地，具有更大側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。優(yōu)選地，具有更小側(cè)鏈體積的所述氨基酸選自丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸 (T)、纈氨酸(V)0在本發(fā)明的一個(gè)方面中，通過引入半胱氨酸(C)作為每一 CH3區(qū)對(duì)應(yīng)位置的氨基酸來進(jìn)一步改變兩個(gè)CH3區(qū)，以使兩個(gè)CH3區(qū)之間可以形成二硫鍵。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多特異性抗體包含僅一個(gè)單鏈Fab片段，且其是三價(jià)雙特異性抗體。所述三價(jià)雙特異性抗體包含“杵狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)中T366W突變和“臼狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)中T366S、L368AJ407V突變。例如，通過將Y349C突變引入“杵狀結(jié)構(gòu)鏈” 的CH3區(qū)，并將E356C突變或S354C突變引入“臼狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)，也可以使用CH3區(qū)之間的其他鏈間二硫鍵(Merchant，A. M 等，Nature Biotech 16(1998)677-681)。因此，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述三價(jià)雙特異性抗體包含在兩個(gè)CH3區(qū)之一中的TO49C、T366W 突變和在兩個(gè)CH3區(qū)的另一個(gè)中的E356C、T366S、L368A、 07V突變或者所述三價(jià)雙特異性抗體包含在兩個(gè)CH3區(qū)之一中的TO49C、T366W突變和在兩個(gè)CH3區(qū)的另一個(gè)中的S3MC、 T366S、L368A、Y407V突變(在一個(gè)CH3區(qū)中另外的TO49C突變和在另一個(gè)CH3區(qū)中另外的 E356C或S354C突變形成了鏈間二硫鍵)(通常根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào))。但也可以備選地或另外地使用如由EP 1870459A1描述的其他杵白結(jié)構(gòu)方法。所述三價(jià)雙特異性抗體的優(yōu)選實(shí)例是在“杵狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)中的R409D ；K370E突變和在“臼狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3 區(qū)中的D399K ；E357K突變(通常根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào))。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述三價(jià)雙特異性抗體(包含僅一個(gè)單鏈Fab片段的多特異性抗體)包含在“杵狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)中的T366W突變和在“臼狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3 區(qū)中的T366S、L368AJ407V突變，并且另外地，在“杵狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)中的R409D ；K370E 突變和在“臼狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)中的D399K ；E357K突變。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述三價(jià)雙特異性抗體(包含僅一個(gè)單鏈Fab片段的多特異性抗體)包含在兩個(gè)CH3區(qū)之一中的TO49C、T366W突變和在兩個(gè)CH3區(qū)的另一個(gè)中的S3MC、T366S、L368A、Y407V突變或者所述三價(jià)雙特異性抗體包含在兩個(gè)CH3區(qū)之一中的Y349C、T366W突變和在兩個(gè)CH3區(qū)的另一個(gè)中的S3MC、T366S、L368A、Y407V突變和另外地，在“杵狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)中的R409D ；K370E突變和在“臼狀結(jié)構(gòu)鏈”的CH3區(qū)中的 D399K ；E357K 突變。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的一個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的一條重鏈或一條輕鏈的C末端或N 末端(優(yōu)選一條重鏈的C末端)與所述全長(zhǎng)抗體融合，其中全長(zhǎng)抗體包含在兩個(gè)CH3區(qū)之
12一中的T366W突變和在兩個(gè)CH3區(qū)的另一個(gè)中的T366S、L368AJ407V突變。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的一個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的一條重鏈或一條輕鏈的C末端或N末端(優(yōu)選一條重鏈的C末端)與所述全長(zhǎng)抗體融合，其中全長(zhǎng)抗體包含在兩個(gè)CH3區(qū)之一中的TO49C、T366W突變和在兩個(gè)CH3區(qū)的另一個(gè)中的S3MC、T366S、L368A、Y407V突變(參見例如圖6)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體，其中與第二抗原結(jié)合的一個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的一條重鏈或一條輕鏈的C末端或N末端(優(yōu)選一條重鏈的 C末端)與所述全長(zhǎng)抗體融合，其中全長(zhǎng)抗體包含在兩個(gè)CH3區(qū)之一中的TO49C、T366W突變和在兩個(gè)CH3區(qū)的另一個(gè)中的S3MC、T366S、L368A、Y407V突變。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”旨在包括通過重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的所有人抗體，例如，從宿主細(xì)胞例如NSO或CHO細(xì)胞或者從轉(zhuǎn)基因人免疫球蛋白基因的動(dòng)物 (例如小鼠)中分離的抗體或利用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。此類重組人抗體具有以重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。可以將根據(jù)本發(fā)明的重組人抗體進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞高度突變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是在體內(nèi)人抗體種系所有組成成分內(nèi)并不天然存在的序列，盡管其來源于并與人種系VH和VL序列有關(guān)。如本文所用的“可變區(qū)”(輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈可變區(qū)(VH))表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每一對(duì)輕鏈和重鏈。人輕鏈和重鏈可變區(qū)具有相同的一般結(jié)構(gòu)，并且每一區(qū)域包含由三個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)連接的序列廣泛保守的四個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)。該構(gòu)架區(qū)采用β折疊構(gòu)象，并且⑶R可以形成連接β折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每一鏈中的⑶R通過構(gòu)架區(qū)固定在其三維結(jié)構(gòu)中并與來自其他鏈的CDR—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中起著特殊的重要作用，并因此提供了本發(fā)明的另外目的。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR” 區(qū)是非如本文中定義的高變區(qū)殘基的這些可變區(qū)區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈從N末端到C末端包含區(qū)域FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3和FR4。在每一鏈上的⑶R由此類構(gòu)架氨基酸分開。特別地，重鏈的⑶R3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。⑶R和FR根據(jù)Kabat等， Seq uences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義確定。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”或“特異結(jié)合”指用純化的野生型抗原，在體外測(cè)定中，優(yōu)選地在等離振子共振測(cè)定(plasmon resonance assay) (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中，抗體與抗原的表位的結(jié)合。結(jié)合的親和力由術(shù)語(yǔ)ka (抗體/抗原復(fù)合物的抗體結(jié)合的速率常數(shù))、kD (解離常數(shù))和KD(kD/ka)定義。結(jié)合或特異結(jié)合指IO-8Hiol/ 1或更低，優(yōu)選10_1至10_13!1101/1的結(jié)合親和力(Kd)。因此，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體與每一抗原特異結(jié)合，對(duì)于所述多特異性抗體，其具體10_8mol/l或更低，優(yōu)選地KTi3M至 10_13mOl/l的結(jié)合親和力(Kd)。通過BIAcore測(cè)定(GE-HealthcareUppsala，瑞典)，可以研究抗體與Fc γ RIII 的結(jié)合。通過術(shù)語(yǔ)ka (抗體/抗原復(fù)合物的抗體結(jié)合的速率常數(shù))、kD (解離常數(shù))和KD(kD/ ka)定義了結(jié)合的親和力。
術(shù)語(yǔ)“表位”包括能與抗體特異結(jié)合的任一多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺?；?，在某些實(shí)施方案中，可以具有特殊三維結(jié)構(gòu)特征和或特殊電荷特征。表位是抗原結(jié)合抗體的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，在蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中，當(dāng)抗體優(yōu)先識(shí)別其靶抗原時(shí)，認(rèn)為該抗體特異地結(jié)合抗原。如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)“恒定區(qū)”指抗體非可變區(qū)的區(qū)域的總和。恒定區(qū)并不直接參與結(jié)合抗原，但顯示出多種效應(yīng)子功能。取決于抗體的重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列， 將抗體分為IgA型、IgD型、IgE型、IgG型和IgM型，并且可以將這些的幾種進(jìn)一步分成亞型，例如IgGU IgG2、IgG3和IgG4、IgAl和IgA2。與抗體的不同型對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、Y和μ?？梢栽谌课宸N抗體類型中發(fā)現(xiàn)的輕鏈恒定區(qū)稱為κ (kappa) 禾口 λ (lambda)。如在本申請(qǐng)中所用，術(shù)語(yǔ)“來源于人類來源的恒定區(qū)”指人抗體的亞型IgGl、 IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恒定區(qū)和/或κ或者λ輕鏈恒定區(qū)。此類恒定區(qū)在本領(lǐng)域是熟知的，并例如由 Kabat，Ε.Α.，(參見例如 Johnson，G.和 Wu，Τ. Τ.，Nucleic Acids Res. 28(2000)214-218 ；Kabat, Ε. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(1975)2785-2788)描述。盡管IgG4亞型的抗體顯示出降低的Fc受體(Fe YRIIIa)結(jié)合，但其他IgG亞型的抗體顯示出強(qiáng)的結(jié)合。然而，如果改變Pro238、Asp265, Asp270、Asn297 (缺失Fc糖類)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、 Asn434和His435，那么這些殘基也提供降低的Fc受體結(jié)合(Shields, R. L.等，J.Biol. Chem. 276(2001)6591-6604 ；Lund, J.等，F(xiàn)ASEB J. 9 (1995) 115-119 ；Morgan, Α.等， Immunology 86(1995)319-324 ；EP 0307434)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體與IgGl抗體比較，具有降低的FcR結(jié)合， 并且關(guān)于IgG4亞型的FcR結(jié)合或IgGl或IgG2亞型的FcR結(jié)合，全長(zhǎng)親本抗體具有S2^、 L234、L235和/或D265突變，和/或含有PVA236突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)親本抗體中的突變是S2^P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)親本抗體中的突變是IgG4中S228P和IgGl中L234A和L235A。重鏈恒定區(qū)顯示于SEQ ID NO 17和18中。在一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)親本抗體的重鏈恒定區(qū)是具有突變L234A和L235A的 SEQ ID NO 17。在另一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)親本抗體的重鏈恒定區(qū)是具有突變S228P的SEQ ID N0:18。在另一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)親本抗體的輕鏈恒定區(qū)是SEQ ID N0:19的κ輕鏈區(qū)或λ輕鏈區(qū)。優(yōu)選地全長(zhǎng)親本抗體的重鏈恒定區(qū)是具有S228P突變的SEQ ID Ν0:17或 SEQ ID NO :18ο抗體的恒定區(qū)直接參與ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和 ⑶c(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性)。補(bǔ)體活化(⑶C)通過補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞型的恒定區(qū)結(jié)合引發(fā)。Clq與抗體的結(jié)合通過在稱為結(jié)合位點(diǎn)的確定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生。此類恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)在本領(lǐng)域是已知的，并例如由 Lukas, T. J.等，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ；Brunhouse, R.禾口 Cebra，J. J.， Mol. Immunol. 16 (1979)907-917 ；Burton, D. R.等，Nature 288 (1980) 338-344 ； Thommesen, J. Ε.等，Mo 1 · Immuno 1 · 37 (2000) 995-1004 ； I dusogi e，Ε· Ε·等，J. Immunol. 164(2000)4178-4184 ；Hezareh, Μ.等，J. Virol. 75(2001) 12161-12168 ； Morgan, Α.等，Immunology 86 (1995) 319-324 ；和 EP 0307434 描述。此類恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)， 例如，以氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 P329 為特征(根據(jù) Kabat 的EU索引編號(hào))。術(shù)語(yǔ)“抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC) ”指在效應(yīng)細(xì)胞存在的情況下，通過根據(jù)本發(fā)明的抗體裂解人靶細(xì)胞。優(yōu)選地通過在效應(yīng)細(xì)胞例如新鮮分離的PBMC或從暗黃覆蓋層純化的效應(yīng)細(xì)胞，如單核細(xì)胞或天然殺傷(NK)細(xì)胞或者永久生長(zhǎng)的NK細(xì)胞系存在的情況下，用根據(jù)本發(fā)明的抗體處理表達(dá)抗原的細(xì)胞的制備物測(cè)量ADCC。術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C) ”指通過補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞型的 Fc部分結(jié)合引發(fā)的過程。Clq與抗體的結(jié)合通過在稱為結(jié)合位點(diǎn)的確定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生。此類Fc部分結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(參見上述)。此類Fc部分結(jié)合位點(diǎn)，例如，以氨基酸L2;34、L235、D270、擬97、E318、K320、K322、P331和P329為特征(根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào))。IgGl、IgG2和IgG3亞型的抗體通常顯示出包括Clq和C3結(jié)合的補(bǔ)體活化，而IgG4并不活化補(bǔ)體系統(tǒng)并且不結(jié)合Clq和/或C3。在另外的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于，所述全長(zhǎng)抗體是人IgGl亞型或具有突變L234A和L235A的人IgGl亞型。在另外的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于，所述全長(zhǎng)抗體是人IgG2亞型。在另外的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于，所述全長(zhǎng)抗體是人IgG3亞型。在另外的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于，所述全長(zhǎng)抗體是人IgG4亞型或具有另外的突變的人IgG4亞型。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于，所述全長(zhǎng)抗體是人IgGl亞型、 具有另外的突變的人IgG4亞型。在另外的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于，以增加針對(duì)人 Fcy受體IIIa的親和力的方式修飾(或者通過在Fc區(qū)突變或者通過glycoengineering) 所述全長(zhǎng)抗體，以增加其介導(dǎo)ADCC的能力。通過降低巖藻糖的量增強(qiáng)抗體的ADCC的方法描述于例如 WO 2005/018572、WO 2006/116260, WO 2006/114700、WO 2004/065540, WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、 US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739Niwa, R.等，J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 ；Shinkawa, Τ.等，J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473 ；WO 03/055993 或 US 2005/0M9722中。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于，所述全長(zhǎng)抗體是去巖藻糖基化(afucosylated)的IgGl或IgG3同種型，其中在 Asn297，巖藻糖的量是寡糖(糖)的總量的60%或更少(這意味著在Asn297處Fc區(qū)的至少40%或更多的寡糖是去巖藻糖基化的)。根據(jù)本發(fā)明的抗體通過重組手段生產(chǎn)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的核酸，且進(jìn)一步的方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的所述核酸的細(xì)胞。用于重組產(chǎn)生的方法在本領(lǐng)域廣為人知，并且包括在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，隨后分離抗體多肽，并通常純化至可藥用的純度。為在宿主細(xì)胞中表達(dá)如前所述的抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)方法將各自編碼修飾的輕鏈和重鏈的核酸插入表達(dá)載體中。在合適的原核或真核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、PER. C6細(xì)胞、酵母或大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從細(xì)胞(裂解后的上清液或細(xì)胞)中回收抗體。用于抗體的重組生產(chǎn)的一般方法在本領(lǐng)域眾所周知，并描述于例如Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse，S.等，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 的綜述文章中?？梢酝ㄟ^常規(guī)的免疫球蛋白純化方法例如，如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)胤蛛x根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體。編碼單克隆抗體的DNA和RNA利用常規(guī)方法很容易分離，并進(jìn)行測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可用作為此類 DNA和RNA的來源。DNA —經(jīng)分離，即可將DNA插入到表達(dá)載體中，隨之轉(zhuǎn)染到否則將不生產(chǎn)免疫球蛋白的宿主細(xì)胞例如HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞中重組單克隆抗體的合成。通過將合適的核苷酸改變引入到抗體DNA中，或者通過核苷酸合成制備多特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)?？梢赃M(jìn)行此類修飾，然而，僅以非常有限的范圍，例如，如上所述。例如，修飾并不改變上述的抗體特征，例如IgG同種型和抗原結(jié)合，但可以改進(jìn)重組產(chǎn)物的產(chǎn)率、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或有助于純化。如在本申請(qǐng)中所有，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指可以工程改造以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的抗體的任一類型的細(xì)胞系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞用作為宿主細(xì)胞。如本文所用，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系，，和“細(xì)胞培養(yǎng)物，，互換使用，且所有這樣命名包括子代。因此，措辭“轉(zhuǎn)化株”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括最早的受試細(xì)胞和由之獲得的培養(yǎng)物， 而不考慮轉(zhuǎn)移次數(shù)。也應(yīng)當(dāng)理解，由于故意或無意的突變，所有的子代在DNA內(nèi)容方面可能并不精確相同。具有在原始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中所篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變體子代包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在需要特定指明的情況下，從上下文中可以清晰地得知。在NSO 細(xì)胞中表達(dá)由例如，Barnes, L. Μ.等，Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ； Barnes, L. Μ.等，Biotech. Bioeng. 73 Q001)洸1_270 描述。瞬時(shí)表達(dá)由例如，Durocher, Y.等，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 描述。可變區(qū)的克隆由 Orlandi，R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289 ；和 Norderhaug，L.等，J. Immunol. Methods 204(1997)77-87 描述。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(HEK 293)由 khlaeger，Ε. -J.，and Christensen, K.， 在 Cytotechnology 30(1999)71-83 中禾口由 Schlaeger, E.-J.，在 J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199 中描述。適合于原核生物的控制序列，例如，包括啟動(dòng)子，備選的操縱序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。真核細(xì)胞已知利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和多聚腺苷化作用信號(hào)。當(dāng)核酸與另一核酸序列處于功能關(guān)聯(lián)狀態(tài)時(shí)，其“有效連接”。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與多肽的DNA的連接表達(dá)為參與所述多肽分泌的前蛋白，則他們有效連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的連接影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則他們有效連接；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列的排置有利于翻譯，則他們有效連接。通常，“有效連接”表示連接的 DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)序列的情況下是相鄰且同讀框連接的。不過，增強(qiáng)子不必相鄰。連接通過便利的限制性位點(diǎn)處的連接實(shí)現(xiàn)。如果不存在這樣的位點(diǎn)，則按照常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸適配體(adaptor)或接頭。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括本領(lǐng)域眾所周知的堿/SDS處理、氯化銫分帶(CsClbanding)、 柱層析、瓊脂糖凝膠電泳等等進(jìn)行抗體的純化，以除去其他細(xì)胞組分或其他雜質(zhì)，如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)(參見Ausubel，F(xiàn).等編輯Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987))。已經(jīng)建立了不同的方法并廣泛用于蛋白質(zhì)純化，例如使用微生物蛋白質(zhì)的親和層析(例如A蛋白或G蛋白親和層析)、離子交換層析(例如陽(yáng)離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式交換)、親硫吸附(例如用β -巰基乙醇和其他SH配體)、疏水作用或芳族吸附層析(例如用苯基瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸 (m-aminophenylboronic acid))、金屬螯合親和層析(例如用Ni(II)和Cu(II)親和材料)大小排阻層析和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93—102)。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指將載體/核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的方法。如果將沒有堅(jiān)固的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞用作為宿主細(xì)胞，例如通過如Graham，F(xiàn). L.，和van der Eb, A.J.，Virology 52 (1973) 456-467所述的磷酸鈣沉淀方法實(shí)施轉(zhuǎn)染。然而，也可以使用將DNA引入細(xì)胞的其他方法，例如通過核注射或通過原生質(zhì)體融合。如果使用含有堅(jiān)固的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的原核細(xì)胞或細(xì)胞，例如，轉(zhuǎn)染的一種方法是使用如由Cohen，S.N.等， PNAS. 69 (1972) 2110-2114所述的氯化鈣的鈣處理。如本文中所用，“表達(dá)”指核酸轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程和/或所述轉(zhuǎn)錄的mRNA (也稱為轉(zhuǎn)錄物)隨后翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和編碼的多肽都稱為基因產(chǎn)物。如果多核苷酸來源于基因組DNA，那么在真核細(xì)胞中表達(dá)包括mRNA的剪接?！拜d體”是將核酸分子插入到宿主細(xì)胞中和/或之間的，特別是自復(fù)制的核酸分子。 該術(shù)語(yǔ)包括主要用于將DNA或RNA插入到細(xì)胞中(例如，染色體整合)的載體，載體的復(fù)制主要用于DNA或RNA的復(fù)制，以及用于DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的表達(dá)載體。也包括提供一個(gè)以上的如上所述功能的載體?！氨磉_(dá)載體”是當(dāng)將其引入到合適的宿主細(xì)胞時(shí)，能轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的多核苷酸。“表達(dá)系統(tǒng)”通常指包含可以用于產(chǎn)生想要的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體的合適宿主細(xì)胞。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體具有改進(jìn)的特征，例如生物學(xué)或藥理學(xué)活性、藥物動(dòng)力學(xué)特性或毒性。可以將它們用于例如治療疾病如癌癥。本發(fā)明的一個(gè)方面是包含根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面是根據(jù)本發(fā)明的抗體用于生產(chǎn)藥物組合物的用途。本發(fā)明的另外方面是用于生產(chǎn)包含根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物的方法。在另一方面，本發(fā)明提供含有與藥物運(yùn)載體一起配制的根據(jù)本發(fā)明的抗體的組合物，例如藥物組合物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是用于治療癌癥的根據(jù)本發(fā)明的多特異性，優(yōu)選雙特異性抗體。本發(fā)明的另一方面是用于治療癌癥的所述藥物組合物。本發(fā)明的另一方面是根據(jù)本發(fā)明的抗體用于生產(chǎn)用于治療癌癥的藥物的用途。本發(fā)明的另一方面是通過將根據(jù)本發(fā)明的抗體施用給需要該治療的患者，治療患癌癥的患者的方法。如本文中所用，“藥物載體”包括生理上相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、 抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。優(yōu)選載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊錐(spinal)或表皮給藥(例如通過注射或輸注)。本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域公知的多種方法給藥。正如技術(shù)人員將會(huì)理解的那樣，給藥路徑和/或方式將隨期望的結(jié)果而變動(dòng)。為通過某些給藥路徑給藥本發(fā)明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料對(duì)其進(jìn)行包衣，或化合物與之共給藥。例如，可以向受試者給藥處于適宜載體例如脂質(zhì)體或稀釋劑中的化合物?？伤幱孟♂寗┌}溶液和水性緩沖溶液?？伤幱幂d體包括無菌水性溶液或分散液，以及用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散液的無菌粉劑。此類介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。如本文所用的短語(yǔ)“腸胃外給藥”和“經(jīng)腸胃外給藥”，表示不同于腸和局部給藥的給藥方式，通常是通過注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)癌癥指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、非小細(xì)胞肺(NSCL)癌、細(xì)支氣管細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸的癌、皮的或眼內(nèi)的黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)的癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、 結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管的癌、子宮內(nèi)膜的癌、子宮頸的癌、陰道的癌、外陰的癌、霍奇金病、食管的癌、小腸的癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌、甲狀腺的癌、甲狀旁腺的癌、腎上腺的癌、軟組織的肉瘤、尿道的癌、陰莖的癌、前列腺癌、膀胱的癌、腎或輸尿管的癌、腎細(xì)胞癌、腎盂的癌、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的瘤、脊椎軸腫瘤(spinal axis tumor)、 腦干膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星細(xì)胞瘤、斯萬細(xì)胞瘤、室管膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細(xì)胞癌、垂體腺瘤和尤文肉瘤，包括任一上述癌的難治類型或者一種或多種上述癌的組合。這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。通過前述滅菌操作，以及通過納入多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，均可以確保防止微生物的存在。還可能期望在組合物中納入等滲劑，如糖、氯化鈉等。另外，可注射藥物形式的延遲吸收可以通過納入延遲吸收的藥劑如單硬脂酸鋁和明膠來實(shí)現(xiàn)。無論所選的施用路徑如何，可以以適宜水合物形式使用的本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法配制為可藥用劑型。根據(jù)本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可有變動(dòng)，以獲得有效量的活性成分，從而對(duì)于特定的患者、組合物和給藥方式實(shí)現(xiàn)期望的治療反應(yīng)，而對(duì)患者沒有毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明特定組合物的活性、給藥路徑、給藥時(shí)間、所采用特定化合物的排泄速率、與所采用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、病情、總體健康和既往病史、 以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類似因素。組合物必需是無菌和流動(dòng)的，從而組合物可以通過注射器遞送。除了水之外，載體還可以是等滲緩沖鹽溶液。8
例如，可以通過使用包衣如卵磷脂，分散劑的情況下通過維持所需的顆粒大小，通過使用表面活性劑，來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中納入等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化鈉。提供如下實(shí)施例、序列列表和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍闡釋在所附權(quán)利要求書中。應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)所示的操作進(jìn)行改動(dòng)而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神。氨基酸序列的說明SEQ ID NO 1 重鏈 CDR3，<IGF-lR>HUMAB_Clone 18SEQ ID NO :2 重鏈 CDR2，<IGF-lR>HUMAB_Clone 18SEQ ID NO :3 重鏈 CDR1，<IGF-lR>HUMAB_Clone 18SEQ ID NO :4 輕鏈 CDR3，<IGF-lR>HUMAB-Clone 18SEQ ID NO :5 輕鏈 CDR2，<IGF-lR>HUMAB-Clone 18SEQ ID NO :6 輕鏈 CDR1，<IGF-lR>HUMAB_Clone 18SEQ ID NO :7 重鏈可變區(qū)，<IGF-lR>HUMAB_Clone 18SEQ ID NO :8 輕鏈可變區(qū)，<IGF-lR>HUMAB_Clone 18SEQ ID NO 9 重鏈 CDR3,人源化 <EGFR>ICR62SEQ ID NO 10 重鏈 CDR2,人源化 <EGFR>ICR62SEQ ID NO 11 重鏈 CDRl，人源化 <EGFR>ICR62SEQ ID NO :12 輕鏈 CDR3,人源化 <EGFR>ICR62SEQ ID NO :13 輕鏈 CDR2,人源化 <EGFR>ICR62SEQ ID NO 14 輕鏈 CDRl，人源化 <EGFR>ICR62SEQ ID NO :15 重鏈可變區(qū)，人源化 <EGFR>ICR62-I_HHDSEQ ID NO :16 輕鏈可變區(qū)，人源化 <EGFR>ICR62-I_KCSEQ ID NO :17來源于IgGl的人重鏈恒定區(qū)SEQ ID NO 18來源于IgG4的人重鏈恒定區(qū)SEQ ID NO 19 κ 輕鏈恒定區(qū)附圖描述圖1與第一抗原1特異結(jié)合的，具有以一般順序包含可變區(qū)和恒定區(qū)的兩對(duì)重鏈和輕鏈的、沒有CH4區(qū)的全長(zhǎng)抗體的示意性結(jié)構(gòu)。圖2例如與第二抗原2特異結(jié)合的4個(gè)可能的單鏈Fab片段的示意性結(jié)構(gòu)。圖3包含與第一抗原1特異結(jié)合的全長(zhǎng)抗體和與第二抗原2特異結(jié)合的兩個(gè)單鏈 Fab的根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的示意性結(jié)構(gòu)-雙特異性四價(jià)實(shí)例。圖4包含與IGF-IR特異結(jié)合的全長(zhǎng)抗體和與EGFR特異結(jié)合的兩個(gè)相同單鏈Fab 的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體-ScFab-XGFRl分子Α、B、C和D以及純化后表達(dá)水平A 與重鏈的C末端融合的scFab (VH-CH1-接頭-VL-CL)B 與重鏈的C末端融合的scFab(VH-CHl_接頭-VL-CL，含有額外的VH44-VL100 二硫鍵)。C 與輕鏈的C末端融合的scFab (VH-CHl-接頭-VL-CL)。D 與輕鏈的C末端融合的scFab(VH-CHl_接頭-VL-CL，含有額外的VH44-VL100 二硫鍵)。
圖5包含與EGFR特異結(jié)合的全長(zhǎng)抗體和與IGF-1R特異結(jié)合的兩個(gè)相同的單鏈 Fab的根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體-ScFab-XGFR2分子A、B、C和DA 與重鏈的C末端融合的scFab (VH-CH1-接頭-VL-CL)B 與重鏈的C末端融合的scFab(VH-CHl_接頭-VL-CL，含有額外的VH44-VL100 二硫鍵)。C 與輕鏈的C末端融合的scFab (VH-CHl-接頭-VL-CL)。D 與輕鏈的C末端融合的scFab(VH-CHl_接頭-VL-CL，含有額外的VH44-VL100 二硫鍵)。圖6包含與第一抗原1特異結(jié)合的全長(zhǎng)抗體和與第二抗原2特異結(jié)合的一個(gè)單鏈 Fab的根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的示意性結(jié)構(gòu)-具有杵狀結(jié)構(gòu)和白狀結(jié)構(gòu)的雙特異性三價(jià)實(shí)例。圖7包含與第一抗原1特異結(jié)合的全長(zhǎng)抗體和與第二抗原2特異結(jié)合的一個(gè)單鏈 Fab以及與第三抗原3特異結(jié)合的一個(gè)單鏈Fab的的根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的示意性結(jié)構(gòu)-具有杵狀結(jié)構(gòu)和白狀結(jié)構(gòu)的三特異性四價(jià)實(shí)例圖8SDS-PAGE分析含有單鏈Fab的雙特異性抗體衍生物scFab-XGFRl1 scFab-XGFR14720 (非還原的)2 :scFab-XGFR14721 (非還原的)3 scFab-XGFR14720 (還原的)4 :scFab-XGFR14721 (還原的)圖9HP-SEC分析含有scFab的雙特異性抗體衍生物scFab-XGFRl圖 9a :scFab-XGFRl-4720 ；7. 7%聚合物(標(biāo)記在框內(nèi))圖 9b :scFab-XGFRl-4721 ；3. 5%聚合物(標(biāo)記在框內(nèi))圖 IOscFab-XGFRl 和 scFab_XGFR2 與 EGFR 和 IGFlR 的結(jié)合圖 IOa =Biacore 圖-scFab_XGFR12720 與 EGFR 的結(jié)合，KD = 2nM圖 IOb =Biacore 圖-scFab_XGFR12720 與 IGF-IR 的結(jié)合，KD = 2nM圖 IOc =Biacore 圖-scFab_XGFR22720 與 EGFR 的結(jié)合，KD = 0. 5nM圖 IOd =Biacore 圖-scFab_XGFR22720 與 IGF-IR 的結(jié)合，KD = IlnM圖11圖解-通過FACS競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，用以下一般方法分析scFab-XGFR與細(xì)胞的結(jié)合—平行加入用Alexa647標(biāo)記的<IGFlR>Mab(1 μ g/mL) +未標(biāo)記的 scFab-XGFR(100 μ g/mL-0,001μ g/mL)-冰上孵育45分鐘，洗滌&除去未結(jié)合的抗體—用1 % HCHO 固定，然后 FACS圖12通過FACS競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定分析scFab-XGFR 2721和親本<IGFlR>Clonel8對(duì)細(xì)胞的結(jié)合圖 12a 比較 <IGF_lR>Clonel8 (0,18 μ g/ml)和 scFab_XGFR_2721 (0,15 μ g/ml) 的IC50值圖12b :<IGF-lR>Clonel8(拐點(diǎn) 0，11μ g/ml)的結(jié)合曲線 _y 軸=RLU ;x 軸抗體濃度(μ g/ml)圖12c :scFab-XGFR_2721 (拐點(diǎn) 0，10 μ g/ml)的結(jié)合曲線 _y 軸=RLU ；χ 軸抗體濃
20度(μ g/ml)圖13用不同的scFab-XGFR變體(IOOnM)孵育M小時(shí)后，H322M細(xì)胞上的IGFl-R 下調(diào)。圖14用不同的scFab-XGFR變體(IOOnM)孵育M小時(shí)后，H322M細(xì)胞上的EGFR下調(diào)。圖15用不同的scFab-XGFR變體(IOOnM)抑制H322M細(xì)胞的增值實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)施例材料& 一般方法對(duì)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的一般信息給出在Kabat，Ε. Α.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)中。根據(jù)EU編號(hào)對(duì)抗體鏈的氨基酸編號(hào)并以此提及(Edelman, G. M.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1969)78-85 ；Kabat, Ε. Α.等， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。重組DNA技術(shù)用于操縱DNA的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述于Sambrook，J.等，Molecular cloning :A laboratory manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor,紐約， 1989中。根據(jù)廠商說明使用分子生物學(xué)試劑?；蚝铣上胍幕騾^(qū)段制備自通過化學(xué)合成制備的寡核苷酸。通過退火和連接寡核苷酸組裝其兩側(cè)具有單獨(dú)限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的600-1800bp長(zhǎng)的基因區(qū)段，包括PCR擴(kuò)增和隨后通過指定的限制性位點(diǎn)例如BamHI/BstEII、BamHI/BsiWI、BstEII/NotI或BsiWI/ NotI克隆到基于pUC克隆載體的pcDNA 3. l/Zeo(+) (Invitrogen)中。通過DNA測(cè)序確認(rèn)亞克隆基因片段的DNA序列。根據(jù)給定的說明書在Geneart (Regensburg，德國(guó))訂購(gòu)基因合成片段。DNA序列測(cè)定通過在kquiserve GmbH(Vaterstetten，德國(guó))進(jìn)行的雙鏈測(cè)序測(cè)定DNA序列。DNA和蛋白質(zhì)序列分析和序列數(shù)據(jù)管理將版本 10. 2 的 GCG' s (Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)軟件包和版本9.1 Whvitrogens Vector NTlAdvance套件用于序列創(chuàng)建、作圖、分析、注釋和說明。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)所用的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)描述于Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S. , Dasso, Μ. , Harford, J. B. , Lippincott-Schwartz, J.禾口 Yamada, K. Μ., (編輯)，John Wiley & Sons, Inc 中。在HEK293F細(xì)胞中免疫球蛋白變體的瞬時(shí)表達(dá)根據(jù)廠商說明書(Invitrogen，美國(guó))使用Fre必tyle 293表達(dá)系統(tǒng)，通過人胚腎293-F細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)多特異性抗體。簡(jiǎn)言之，在37°C /8% C02，將懸浮Fre必tyle ^3-F細(xì)胞培養(yǎng)于Fre必tyle 293表達(dá)培養(yǎng)基中，并在轉(zhuǎn)染當(dāng)天將細(xì)胞以1-2X106活細(xì)胞/ml接種于新鮮培養(yǎng)基中。使用333 μ 1的^3fectin (Invitrogen，德國(guó))和1 1摩爾比的250 μ g的重鏈和輕鏈質(zhì)粒DNA，在Opti-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó))中制備250ml終轉(zhuǎn)染體積的DNA-293feCtinTM復(fù)合物。轉(zhuǎn)染7天后，通過在14000g離心30分鐘，澄清含雙特異性抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并通過無菌過濾器(0. 22 μ m)過濾。將上清儲(chǔ)存于-20°C直到純化。蛋白質(zhì)測(cè)定根據(jù)Pace，C.N.等，Protein Science，4 (1995) 2411-2423，使用基于氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)，通過測(cè)定在^Onm處的光密度(OD)和在320nm處作為背景校正的0D， 測(cè)定純化的抗體和衍生物的蛋白質(zhì)濃度。在上清液中測(cè)定抗體濃度通過親和HPLC層析測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體和衍生物的濃度。簡(jiǎn)言之，在 UltiMate 3000HPLC系統(tǒng)(Dionex)上，將含結(jié)合A蛋白的抗體和衍生物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液應(yīng)用于 200mM KH2P04、IOOmM 檸檬酸鈉，pH7. 4 中的 Applied Biosystems Poros A/20 柱， 并用200mM NaCl UOOmM檸檬酸，pH 2. 5從基質(zhì)洗脫。通過UV吸收和峰面積的整合定量洗脫的蛋白質(zhì)。將純化的標(biāo)準(zhǔn)IgGl抗體用作為標(biāo)準(zhǔn)。蛋白質(zhì)純化通過使用A蛋白-瓊脂糖 (GE Healthcare,瑞典)的親和層析和SuperdeX200 大小排阻層析，以兩步純化來自上清液的分泌抗體。簡(jiǎn)言之，將含雙特異性和三特異性抗體的澄清培養(yǎng)上清液應(yīng)用在用PBS緩沖液(IOmM Na2HPO4UmM KH2PO4U37mM NaCl和2. 7mM KCl，pH 7.4)平衡的HiTrap ProteinA HP(5ml)柱上。用平衡緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用0. IM檸檬酸，pH 2. 8緩沖液洗脫雙特異性抗體，并用0. ImllMTris, pH 8. 5中和含蛋白質(zhì)的組分。然后，收集洗脫的蛋白質(zhì)組分，用Amicon Ultra離心過濾裝置(MWC0 30K,Millipore)濃縮至 3ml 的體積并上樣在用 20mM Histidin、140mM NaCl，pH6. O 平衡的 Superdex200HiLoad 120ml 16/60 凝膠過濾柱(GE Healthcare，瑞典)上。收集、速凍單體的抗體組分，并儲(chǔ)存于-80°C。提供部分樣品用于后續(xù)的蛋白質(zhì)分析和表征。分析純化的蛋白質(zhì)使用基于氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)，通過測(cè)量在280nm處的光密度(OD) 測(cè)定純化的蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)濃度。在存在或不存在還原劑(5mM 1，4-二硫蘇糖醇) 的情況下，通過SDS-PAGE分析雙特異性抗體的純度，并用考馬斯亮藍(lán)染色。根據(jù)廠商說明 (4-20% Tris-甘氨酸凝膠)使用NllPAGE I^re-Cast 凝膠系統(tǒng)(Invitrogen，美國(guó))。 在25°C，使用在200mM KH2PO4,250mM KCl.pH 7. O運(yùn)行緩沖液中的Superdex 200分析的大小排阻柱(GE Healthcare，Sweden)，通過高性能 SEC，在 UltiMate3000HPLC 系統(tǒng)(Dionex) 上分析雙特異性抗體樣品的聚集含量。以0. 5ml/分鐘的流速，將25 μ g蛋白質(zhì)注射在柱上，并等度洗脫50分鐘以上。對(duì)于穩(wěn)定性分析，制備0. lmg/mlUmg/ml和3mg/ml濃度的純化蛋白質(zhì)并在4°C、37°C孵育7天，并然后通過高性能SEC評(píng)價(jià)。通過用肽-N-糖苷酶 F(Peptide-N-Glycosidase F) (Roche Molecular Biochemicals)酶處理除去N-聚糖后，通過NanoElectrospray Q-TOF質(zhì)譜法驗(yàn)證還原的雙特異抗體輕鏈和重鏈氨基酸骨架的完整性。實(shí)施例1識(shí)別人IGFl受體以及人EGF受體的根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體分子的設(shè)計(jì)在以下作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，舉例說明了包含與第一抗原(IGF-1R或 EGFR)結(jié)合的全長(zhǎng)抗體和兩個(gè)單鏈Fab片段的四價(jià)雙特異性抗體，所述兩個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體與全長(zhǎng)抗體(兩個(gè)單鏈Fab片段都在重鏈的兩個(gè)C末端或輕鏈的兩個(gè)C末端) 連接，并與第二不同抗原(IGF-1R或EGFR的另一個(gè))結(jié)合。在所述單鏈Fab片段中抗體區(qū)和連接體具有以下以N末端至C末端方向的順序=VL-CL-接頭-VH-CHl。作為用于<IGF_1R>抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈可變區(qū)VH，使用SEQ ID NO :15。作為用于<IGF-1R>抗原結(jié)合位點(diǎn)的輕鏈可變區(qū)VL，使用SEQ ID NO :16。作為用于<EGFR>抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈可變區(qū)VH，使用SEQ ID NO :7。作為用于 <EGFR>抗原結(jié)合位點(diǎn)的輕鏈可變區(qū)VL，使用SEQ ID NO :8。通過基因合成和重組分子生物學(xué)方法，通過甘氨酸絲氨酸(G4S)n單鏈接頭連接包含VH和VL的分別抗原結(jié)合位點(diǎn)的VL-CL和VH-CHl，以產(chǎn)生單鏈Fab片段VL-CL-接頭-VH-CHl，其使用(G4S) η接頭連接于抗體重鏈或輕鏈的C末端。任選地，根據(jù)如先前所述的方法(例如WO 94/029350 ； Re iter，Y.等，Nature biotechnology 14(1996) 1239-1245 ；Young, N. Μ.等，F(xiàn)EBS Letters377(1995) 135-139 ；或 Rajagopal, V.等，Protein Engineering 10 (1997) 1453-59)，將半胱氨酸殘基引入到單鏈 Fab片段的VH(包括Kabat位置44)和VL(包括Kabat位置100)區(qū)中。重組地產(chǎn)生、純化和表征所有這些分子，并評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)表達(dá)、穩(wěn)定性和生物學(xué)活性。在表1中給出了應(yīng)用于產(chǎn)生四價(jià)雙特異性<EGFR-IGF-1R>、<IGF-1R-EGFR>抗體的多特異性抗體設(shè)計(jì)的總結(jié)。對(duì)于該研究，我們使用術(shù)語(yǔ)‘scFab-Ab’以描述多種四價(jià)蛋白質(zhì)實(shí)體。設(shè)計(jì)格式的描述顯示于圖4和5中并在表1中列出。表1-具有C末端單鏈Fab片段連接的不同雙特異性抗IGFlR和抗EGFR四價(jià)抗體格式和對(duì)應(yīng)的scFab-Ab-命名。
權(quán)利要求
1.多特異性抗體，其包含a)全長(zhǎng)抗體，其與第一抗原特異結(jié)合并由兩個(gè)抗體重鏈和兩個(gè)抗體輕鏈組成；和b)一個(gè)或多個(gè)單鏈Fab片段，其與一個(gè)或多個(gè)另外的抗原結(jié)合，其中b)項(xiàng)的所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的 C或N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多特異性抗體，其包含a)全長(zhǎng)抗體，其與第一抗原特異結(jié)合并由兩個(gè)抗體重鏈和兩個(gè)抗體輕鏈組成；和b)一個(gè)至四個(gè)單鏈Fab片段，其與一個(gè)至四個(gè)另外的抗原結(jié)合，其中b)項(xiàng)的所述單鏈Fab片段通過肽連接體在a)項(xiàng)的所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的 C或N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多特異性抗體，其中所述與第二抗原結(jié)合的一個(gè)或兩個(gè)單鏈Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的重鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多特異性抗體，其中所述與第二抗原結(jié)合的一個(gè)單鏈 Fab片段通過肽連接體在所述全長(zhǎng)抗體的一條重鏈或一條輕鏈的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融I=I ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多特異性抗體，其中所述與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段VL-CL-接頭-VH-CHl或VH-CHl-接頭-VL-CL用它們的N末端與所述全長(zhǎng)抗體融合，其中所述N末端通過肽連接體融合在所述全長(zhǎng)抗體的兩條重鏈的兩個(gè)C末端或兩條輕鏈的兩個(gè)C末端。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多特異性抗體，其中所述與第二抗原結(jié)合的兩個(gè)相同的單鏈Fab片段VL-CL-接頭-VH-CHl或VH-CHl-接頭-VL-CL用它們的C末端與所述全長(zhǎng)抗體融合，其中所述C末端通過肽連接體融合在所述全長(zhǎng)抗體的兩條重鏈的兩個(gè)N末端或兩條輕鏈的兩個(gè)N末端。
7.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的抗體。
8.核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的多特異性抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含全長(zhǎng)抗體和單鏈Fab片段的多特異性抗體，特別地雙特異性抗體、生產(chǎn)其的方法、含有所述抗體的藥物組合物，及其用途。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102369215SQ201080015592
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者C·克萊因, E·科佩茨基, E·默斯納, J·M·尚策, J·O·施特拉克, J·T·雷古拉, P·烏馬納, P·布魯恩克爾, R·克羅斯代爾, U·布林克曼 申請(qǐng)人:羅切格利卡特公司