專利名稱：Axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035和axmi-045: 來自蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供編碼殺病蟲害蛋白的新基因。這些蛋白質(zhì)以及編碼它們的核酸序列可以用于制備殺病蟲害制劑和轉(zhuǎn)基因抗病蟲害植物的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是一種革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢土壤細(xì)菌， 其特征是能夠產(chǎn)生晶狀包涵體，該晶狀包涵體對昆蟲的某些目和種具有特異性毒性，但是對植物和其它非靶生物體無害。因此，包含蘇云金芽孢桿菌菌株或其殺蟲蛋白的組合物能夠被用作環(huán)境可接受的殺蟲劑，以控制農(nóng)業(yè)昆蟲害或多種人或動物疾病的昆蟲媒介。來自蘇云金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白(δ -內(nèi)毒素)主要對鱗翅目 (L印idopteran)、雙翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)昆蟲的幼蟲具有強(qiáng)效殺蟲活性。這些蛋白對膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨目(Acari)的害蟲以及例如線形動物(Nemathelminthes)、扁形動物(Platyhelminthes)和肉足鞭毛動物(Sarcomastigorphora)等其它無脊椎動物目也顯不出活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc. ,New York，N. Y.)。這些蛋白起初主要牛艮據(jù)其殺蟲活性被分類為CryI至CryV。主要類別為鱗翅目特異的(I)、鱗翅目和雙翅目特異的 (II)、鞘翅目特異的(III)、雙翅目特異的(IV)、以及線蟲特異的(V)和(VI)。蛋白被進(jìn)一步劃分為亞家族；在每個(gè)家族中更為高度相關(guān)的蛋白被配給分部字母，例如Cry 1A、CrylB, CrylC等。在每一個(gè)分部中甚至更緊密相關(guān)的蛋白被命名為例如CrylCl，CrylC2等。最近，提出了一個(gè)針對Cry基因的新的命名系統(tǒng)，該命名系統(tǒng)基于氨基酸序列的同源性而不是基于昆蟲靶標(biāo)的特異性(Crickmore等(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 807-813)。在新的分類系統(tǒng)中，每種毒素被指定一個(gè)唯一名稱，該名稱由第一等級(一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)、第二等級(一個(gè)大寫字母)、第三等級(一個(gè)小寫字母)和第四等級(另一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)合并而成。在新的分類系統(tǒng)中，以阿拉伯?dāng)?shù)字取代了羅馬數(shù)字用于第一等級。 序列一致性低于45%的蛋白質(zhì)具有不同的第一等級，用于劃分第二和第三等級的標(biāo)準(zhǔn)分別為 78%和 95%。晶體蛋白在被昆蟲吞食并在昆蟲中腸中被溶解之前，不會顯示出殺蟲活性。被吞食的原毒素被昆蟲消化道中的蛋白酶水解為活性毒素分子(HSfte和Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53 :242-255)。該毒素結(jié)合到靶幼蟲中腸中的頂端刷狀緣受體上，并插入到頂端膜中形成離子通道或孔，從而導(dǎo)致幼蟲死亡。δ-內(nèi)毒素通常具有5個(gè)保守的序列區(qū)域和3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(見，例如de Maagd 等QOOlKrends Genetics 17:193-199)。第一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域由7個(gè)α螺旋組成，它涉及膜的插入和孔的形成。結(jié)構(gòu)域II由排列成希臘鑰匙構(gòu)型的3個(gè)β折疊組成，結(jié)構(gòu)域III 由呈“果凍卷”形狀的兩個(gè)反平行β折疊組成(de Maagd等，2001，supra)。結(jié)構(gòu)域II和
4III涉及受體的識別和結(jié)合，因此被認(rèn)為是毒素特異性的決定因素。除了 δ-內(nèi)毒素以外，還有7種其它已知的殺病蟲害蛋白毒素類別。VIP1/VIP2毒素(見，例如美國專利5，770，696)是二元?dú)⒉∠x害毒素，該毒素通過據(jù)認(rèn)為涉及受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用及隨后的細(xì)胞毒性化的機(jī)制(這和其它二元(“Α/Β”)毒素的作用模式類似)， 而對昆蟲顯示出強(qiáng)烈的活性。諸如VIP、C2、CDT、CST、或炭疽芽孢桿菌(B. anthracis)水腫和致死毒素等A/B毒素最初通過“B”組分以單體形式的特異的、受體介導(dǎo)的結(jié)合，與靶細(xì)胞相互作用。這些單體隨后形成同源七聚體?！癇”七聚體-受體復(fù)合物隨后起到一個(gè)對接平臺的作用，該平臺隨后結(jié)合酶性“A”組分，并通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將“A”組分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞溶質(zhì)中。一旦進(jìn)入到細(xì)胞溶質(zhì)中，“A”組分就會通過，例如G-肌動蛋白的ADP-核糖基化、或增加胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)的水平，來抑制正常的細(xì)胞功能。見Barth等(2004)Microbiol Mol Biol Rev 68 :373_402。對基于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲劑的密集應(yīng)用已經(jīng)導(dǎo)致在菜蛾(Plutella xylostella)的田間種群中出現(xiàn)了抗性(Ferr 和 Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47 501-53 ?？剐宰钇毡榈臋C(jī)制是毒素與其特異的中腸受體的結(jié)合減弱。這也可以賦予對共有相同受體的其它毒素的交叉抗性(Ferr 和Van Rie (2002) )0發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子抗病蟲害抗性的組合物和方法。組合物包括編碼S-內(nèi)毒素多肽序列的核酸分子、包含這些核酸分子的載體、以及包含這些載體的宿主細(xì)胞。組合物還包括該內(nèi)毒素的多肽序列、以及抗該多肽的抗體。核苷酸序列可以被用于DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中，用于在生物體(包括微生物和植物)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和表達(dá)。核苷酸或氨基酸序列可以是已經(jīng)被設(shè)計(jì)成用于在生物體(包括，但不限于微生物或植物)中進(jìn)行表達(dá)的合成序列。組合物也包括轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。本發(fā)明尤其提供了分離的、與δ -內(nèi)毒素的核酸序列對應(yīng)的核酸分子。此外，還包括該多核苷酸對應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明尤其提供了分離的核酸分子以及其變體和片段， 其中該核酸分子包括編碼SEQ ID NO :6-11之任一所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或SEQ ID NO :1-5或12- 之任一所示的核苷酸序列。本發(fā)明也包括與本發(fā)明的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、或與本發(fā)明的序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的組合物和方法可以用于具有殺病蟲害抗性的生物體(尤其是細(xì)菌和植物)的生產(chǎn)。這些生物體和來源于它們的組合物是農(nóng)業(yè)上所需要的。本發(fā)明的組合物還可以用于產(chǎn)生改變了的或改進(jìn)了的、具有殺病蟲害活性的S -內(nèi)毒素蛋白，或用于檢測產(chǎn)品或生物體中S-內(nèi)毒素蛋白或核酸的存在。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)生物體(尤其是植物或植物細(xì)胞)中的病害蟲抗性的組合物和方法。該方法包括以編碼本發(fā)明S-內(nèi)毒素蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化生物體。尤其是，本發(fā)明的核苷酸序列可以用于產(chǎn)生具有殺病蟲害活性的植物和微生物。因此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。組合物為蘇云金芽孢桿菌的S-內(nèi)毒素核酸和蛋白質(zhì)。這些序列可以用于構(gòu)建表達(dá)載體，用于隨后轉(zhuǎn)化目的生物體，作為探針用于分離其它S-內(nèi)毒素基因，以及用于通過本領(lǐng)域中已知的方法(例如結(jié)構(gòu)域互換或DNA改組等)產(chǎn)生改變了的殺病蟲害蛋白。這些蛋白可以用于控制或滅殺鱗翅類、鞘翅類、和線蟲類害蟲群體，以及用于生產(chǎn)具有殺病蟲害活性的組合組?！?δ -內(nèi)毒素”是指來源于蘇云金芽孢桿菌的毒素蛋白或與該毒素蛋白具有同源性的蛋白，其中該毒素蛋白對一種或多種蟲害具有有毒活性，所述蟲害包括但不限于鱗翅目、 雙翅目和鞘翅目的成員或線形動物門的成員。在某些情況下，S-內(nèi)毒素蛋白已經(jīng)從其它生物，包括雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)和日本甲蟲芽孢桿菌(Paenibacillus popilliae)中被分離出來。δ -內(nèi)毒素蛋白包括從本文公開的全長核苷酸序列推導(dǎo)出來的氨基酸序列、以及由于使用了可變下游起始位點(diǎn)或由于加工而比全長序列短的氨基酸序列，其中所述短氨基酸序列產(chǎn)生具有殺病蟲害活性的較短蛋白。加工可以發(fā)生在表達(dá)該蛋白的生物體內(nèi)，或發(fā)生在吞食了該蛋白的害蟲體內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，本文公開的序列與δ-內(nèi)毒素蛋白具有同源性。δ-內(nèi)毒素包括鑒別為cryl至cry53、cytl和cyt2、以及Cyt樣毒素的蛋白質(zhì)。目前有超過250種已知的S-內(nèi)毒素，它們具有廣泛的特異性和毒性。其擴(kuò)展性列表見Crickmore等(1998)， Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807_813，其定期的更新見 Crickmore 等(2003) “蘇云金芽抱桿菌毒素命名系統(tǒng)，，，www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index。在其它實(shí)施方案中，本文涵蓋的序列為MTX樣序列。術(shù)語“MTX”在本領(lǐng)域中用于表示由球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)產(chǎn)生的一系列殺病蟲害蛋白。這些蛋白中的第一個(gè)蛋白，在本領(lǐng)域通常被稱為MTX1，是作為對蚊子具有毒性的伴孢晶體合成的。該晶體的主要成分為兩個(gè)51和42kDa的蛋白。由于這兩個(gè)蛋白的存在都是毒性所必需的，MTXl 被視為“二元，，毒素(Baumann 等(1991)Microbiol. Rev. 55 :425-436)。通過分析對不同球形芽孢桿菌菌株具有不同毒性，鑒別出了兩類新MTX毒素。 MTX2和MTX3代表兩類獨(dú)立但相關(guān)的顯示殺病蟲害活性的殺病蟲害毒素。見，例如Baumarm 等(1991)Microbiol. Rev. 55 :425_436，就其全部內(nèi)容并入本文作為參考。MTX2是100-kDa 的毒素。最近，MTX3被鑒別為一種不同的毒素，盡管來源于球形芽孢桿菌的MTX3的氨基酸序列與球形芽孢桿菌SSII-I的MTX2毒素具有38%的相同性(Liu，等(1996)Appl. Environ. Microbiol. 62 :2174-2176)。Mtx毒素可用于提高球形芽孢桿菌菌株的殺蟲活性、 以及控制蚊子群體中抗Bin毒素抗性的進(jìn)化。本發(fā)明提供了賦予殺病蟲害活性的新的分離的核苷酸序列。還提供了 δ -內(nèi)毒素蛋白的氨基酸序列。來自該基因翻譯的蛋白質(zhì)允許細(xì)胞控制或殺死吞食它的病蟲害。分離的核酸分子及其變體和片段本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的或重組的核酸分子，它包括編碼δ -內(nèi)毒素蛋白和多肽或其生物學(xué)活性部分的核苷酸序列；以及涉及足以用作雜交探針來鑒別編碼S-內(nèi)毒素的核酸的核酸分子。本文所使用的術(shù)語“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，重組DNA、 eDNA或基因組DNA) ,RNA分子(例如mRNA)以及利用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是優(yōu)選地為雙鏈DNA。本文所使用的“分離的”核酸序列(或DNA)是指不再存在于其天然環(huán)境中、而存在于例如體外或重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中的核酸序列(或DNA)。在一些實(shí)施方案中，“分離的”核酸不含在該核酸來源的生物體的基因組DNA中天然地位于該核酸側(cè)翼的序列(即，位于該核酸的5'和3'端的序列)(優(yōu)選地為蛋白質(zhì)編碼序列)。就本發(fā)明而言，“分離的”，當(dāng)用于指核酸分子時(shí)，不包括分離的染色體。例如，在一些實(shí)施方案中，分離的編碼S-內(nèi)毒素的核酸分子可以包含短于約51Λ、41Λ、31Λ、21Λ、11Λ、0. 51Λ或0. Ikb的、在該核酸來源的細(xì)胞的基因組DNA中天然地位于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列。基本上不包含細(xì)胞物質(zhì)的S-內(nèi)毒素蛋白包括其中非δ-內(nèi)毒素蛋白(在本文中也被稱為“污染蛋白質(zhì)”)少于約 30^^20^^10%或5% (以干重計(jì)算)的蛋白質(zhì)制品。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括SEQ ID NO 1_5所示的序列及其變體、片段和互補(bǔ)體。“互補(bǔ)體”是指與給定的核酸序列足夠互補(bǔ)從而能夠與該給定的核苷酸序列雜交而由此形成穩(wěn)定的雙鏈體的核酸序列。核苷酸序列編碼的S-內(nèi)毒素蛋白的相應(yīng)氨基酸序列如SEQ ID NO 6-11所示。本發(fā)明也包括是編碼δ -內(nèi)毒素的核苷酸序列的片段的核酸分子?！捌巍笔侵妇幋aS-內(nèi)毒素蛋白的核苷酸序列的部分。核苷酸序列片段可編碼δ-內(nèi)毒素蛋白的生物學(xué)活性部分，或者它可以是能夠在下面公開的方法中用作雜交探針或PCR引物的片段。 為S -內(nèi)毒素核苷酸序列的片段的核酸分子可以包含至少約50、100、200、300、400、500、 600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、 1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、 2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、 3100、3150、3200、3250、3300、3350個(gè)連續(xù)核苷酸，或多達(dá)存在于本文所公開的編碼δ -內(nèi)毒素的全長核苷酸序列中的核苷酸數(shù)，這取決于預(yù)期的用途?！斑B續(xù)”核苷酸是指彼此緊鄰的核苷酸殘基。本發(fā)明的核苷酸序列的片段可以編碼保留了 S-內(nèi)毒素蛋白的生物學(xué)活性、并由此保留了殺病蟲害活性的蛋白質(zhì)片段。“保留活性”是指片段將具有S-內(nèi)毒素蛋白的至少30 %、至少50 %、至少70 %、80 %、90 %、95 %或更高的殺病蟲害活性。確定殺病蟲害活性的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。見，例如Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83 :2480-2485 ；和 Andrews 等(1988) Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78 :290-293 ；和美國專利號5，743，477，所有文獻(xiàn)就其全部內(nèi)容并入本文作為參考。編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分的、編碼δ -內(nèi)毒素的核苷酸序列的片段將編碼至少約 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、 650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100個(gè)連續(xù)氨基酸，或數(shù)目多達(dá)本發(fā)明的全長
S-內(nèi)毒素蛋白中存在的氨基酸總數(shù)。在一些實(shí)施方案中，該片段是蛋白水解切割片段。例如，蛋白水解切割片段可以，與SEQ ID NO :6-11相比，在N-端或C-端有至少約100個(gè)氨基酸、約120、約130、約140、約150或約160個(gè)氨基酸被截去。在一些實(shí)施方案中，本文包括的片段緣于C-端結(jié)晶結(jié)構(gòu)域的去除(例如，通過蛋白水解、或通過在編碼序列中插入終止密碼子)。本發(fā)明優(yōu)選的δ-內(nèi)毒素蛋白由與SEQ ID NO :1_5的核苷酸序列足夠相同的核苷酸序列編碼?！白銐蛳嗤笔侵甘褂帽疚乃枋龅谋葘Τ绦蛑?，采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，與參考序列相比較，具有至少約60%或65%的序列一致性、約70%或75%的序列一致性、約80%或 85% 的序列一致性、約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性的氨基酸或核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，考慮到密碼子的簡并性、氨基酸的相似性、閱讀框的位置效應(yīng)等，這些值可以被適當(dāng)?shù)卣{(diào)整，以確定由兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)的一致性。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核苷酸序列的百分比一致性，對序列進(jìn)行比對以得到最佳的比較。兩個(gè)序列之間的百分比一致性是序列所共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù) (即，百分比一致性=相同位置的數(shù)量/位置總數(shù)(例如，重疊的位置)X 100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列的長度相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，比較是跨參考序列的全長來進(jìn)行的 (例如，跨SEQ ID NO :1-5之一的全長，或跨SEQ ID NO :6_11之一的全長)。兩個(gè)序列之間百分比一致性可以用與下面所描述的方法類似的方法來確定，其中可以允許或不允許空位。在計(jì)算百分比一致性時(shí)，典型地是計(jì)數(shù)精確匹配數(shù)。可以使用數(shù)學(xué)算法來確定兩個(gè)序列之間的百分比一致性。用于兩個(gè)序列比較的數(shù)學(xué)算法的非限定性例子有Karlin和 Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2洸4 的算法，該算法在 Karlin 和 Altschul (199 Proc. Natl. Acad. ki. USA 90 :5873-5877 中改進(jìn)。該算法被整合進(jìn) Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403 的 BLASTN 和 BLASTX 程序中?？梢圆捎肂LASTN程序(分值=100、字長=12)進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以得到與本發(fā)明的S-內(nèi)毒素樣核酸分子同源的核苷酸序列?？梢圆捎肂LASTX程序(分值=50、字長= 3)進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以得到與本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素蛋白分子同源的氨基酸序列。為獲得空位比對以進(jìn)行比較，可以采用Altschul等(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389中所描述的GappedBLAST (在BLAST 2. 0中)?？蛇x擇的是，可以采用PSI-Blast進(jìn)行檢測分子間距離關(guān)系的迭代搜索。見Altschul等(1997)同上引文。當(dāng)采用BLAST、Gapped BLAST 和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用各程序(例如BLASTX和BLASTN)的默認(rèn)參數(shù)。比對也可以通過目測的方式人工進(jìn)行。另一個(gè)用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的非限定性例子是ClustalW算法(Higgins等 (1994) Nucleic Acids Res. 22 :4673-4680)。ClustalW 比較序列并對氨基酸或 DNA 序列的整體進(jìn)行比對，由此能提供關(guān)于整個(gè)氨基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法被用于幾個(gè)可商業(yè)獲取的DNA/氨基酸分析軟件包中，例如Vector NTI程序包的ALIGNX模塊 (Invitrogen公司，Carlskid，CA)。在利用ClustalW進(jìn)行氨基酸序列比對后，可以評估氨基酸百分比一致性。一個(gè)用于分析ClustalW比對的軟件程序的非限定性例子是GENED0C 。 GENED0C (Karl Nicholas)允許估計(jì)多個(gè)蛋白質(zhì)之間氨基酸(或DNA)的相似性和一致性。 另一個(gè)用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的非限定性例子是Myers和Miller (1988) CABI0S4 :11-17 的算法。該算法被整合進(jìn)ALIGN程序版)中，該程序是GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包 (Wisconsin Genetics Software Package)第 10 版(從 Accelrys, Inc. , 9685Scranton Rd. , San Diego，CA，USA獲取)中的組件。當(dāng)采用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以使用 PAMl20殘基權(quán)重表、空位長度罰分為12、以及空位罰分為4來進(jìn)行。除非另有說明，使用GAP(版本10) (GAP(版本10)采用了 Needleman和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 (3) :443-453中的算法)，采用如下參數(shù)，確定序列一致性或相似性使用空位權(quán)重50、長度權(quán)重3、以及nwsgapdna. cmp打分矩陣來確定核苷酸序列的百分比一致性和相似性；使用空位權(quán)重8、長度權(quán)重2、以及BL0SUM62打分程序來確定氨基酸序列的百分比一致性或相似性。也可以使用與此相當(dāng)?shù)某绦??！跋喈?dāng)?shù)某绦颉笔侵溉缦氯魏涡蛄斜容^程序，該程序?qū)τ谌魏蝺蓚€(gè)需進(jìn)行比較的序列產(chǎn)生比對，該比對當(dāng)與由 GAP(版本10)產(chǎn)生的相應(yīng)比對進(jìn)行比較時(shí)具有相同的核苷酸殘基匹配和相同的百分比序
8列一致性。本發(fā)明也包括變體核酸分子。編碼S-內(nèi)毒素的核苷酸序列的“變體”包括編碼本文公開的δ-內(nèi)毒素蛋白但由于遺傳密碼簡并性而存在保守差異的序列，以及如上所討論的足夠相同的序列。自然發(fā)生的等位基因變體可以利用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)，例如以下所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)，被鑒別出來。變體核苷酸序列也包括合成來源的核苷酸序列，該序列如下所討論的通過例如采用定點(diǎn)誘變而產(chǎn)生，但仍然編碼本發(fā)明公開的S-內(nèi)毒素蛋白。本發(fā)明包括的變體蛋白是具有生物學(xué)活性的，S卩，它們?nèi)匀粨碛兴璧奶烊坏鞍椎纳飳W(xué)活性，即，保留了殺病蟲害活性?！氨Ａ艋钚浴笔侵缸凅w將具有天然蛋白的至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%的殺病蟲害活性。用于測定殺病蟲害活性的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。見，例如Czapla和Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83 :2480-2485 ；和 Andrews 等(1988) Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78 :四0_四3 ；以及美國專利號5，743，477，所有文獻(xiàn)就其全部內(nèi)容并入本文作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會理解，可以通過對本發(fā)明的核苷酸序列進(jìn)行突變而引入改變，由此導(dǎo)致編碼的S-內(nèi)毒素蛋白的氨基酸序列的改變，而不改變蛋白的生物學(xué)活性。因此，可以在本文公開的相應(yīng)的核苷酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、添加或缺失，從而在編碼的蛋白質(zhì)中引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、添加或缺失，由此產(chǎn)生分離的變體核酸分子?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入突變，這些技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。本發(fā)明也包括這些變體核苷酸序列。例如，可以對一個(gè)或多個(gè)預(yù)測的非必需氨基酸殘基進(jìn)行保守的氨基酸替換?！胺潜匦琛卑被釟埢铅?內(nèi)毒素蛋白的野生型序列中能夠被改變而不改變生物學(xué)活性的殘基， 而“必需”氨基酸殘基是生物活性所需要的?！氨Ｊ氐陌被崽鎿Q”是指氨基酸殘基被具有與其相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基所取代。本領(lǐng)域定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。 這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、 谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、 半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。δ -內(nèi)毒素通常具有5個(gè)保守的序列區(qū)域和3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(見例如，de Maagd 等QOOlKrends Genetics 17:193-199)。第一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域由7個(gè)α螺旋組成，它涉及膜的插入和孔的形成。結(jié)構(gòu)域II由排列成希臘鑰匙構(gòu)型的3個(gè)β折疊組成，結(jié)構(gòu)域III 由呈“果凍卷”形狀的兩個(gè)反平行β折疊組成(de Maagd等，2001，同上引文)。結(jié)構(gòu)域II 和III涉及受體的識別和結(jié)合，因此被認(rèn)為是毒素特異性的決定因素?？梢栽诜潜Ｊ貐^(qū)域進(jìn)行保留功能的氨基酸替換。通常，不對保守的氨基酸殘基、或?qū)ξ挥诒Ｊ鼗?此處的殘基對蛋白質(zhì)活性是必需的)內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行此替換。保守的且可能為蛋白質(zhì)活性所必需的殘基的例子包括，例如，在本發(fā)明的氨基酸序列與已知的S-內(nèi)毒素序列的比對中在包含的所有蛋白質(zhì)之間相同的殘基。保守的但是可以允許保守氨基酸替換而仍然保留活性的殘基的例子包括，例如，在本發(fā)明的氨基酸序列與已知的 S-內(nèi)毒素序列的比對中在包括的所有蛋白質(zhì)之間只具有保守替換的殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，具有功能的變體可以在保守殘基中具有微小的保守或非保守的改變。
可選擇的是，可以通過在全部或部分編碼序列中隨機(jī)地引入突變(例如通過飽和突變)來產(chǎn)生變體核酸序列，可以針對賦予S -內(nèi)毒素活性的能力來篩選所得的突變體，以鑒別保留了活性的突變體。進(jìn)行突變以后，可以對所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行重組表達(dá)，并可采用標(biāo)準(zhǔn)的分析技術(shù)確定蛋白質(zhì)的活性。采用例如PCR、雜交等方法，可以鑒別出相應(yīng)的δ-內(nèi)毒素序列，該序列與本發(fā)明的序列具有實(shí)質(zhì)上的一致性。見，例如Sambrook和Russell (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 以及 Innis，等(1990)PCR Protocols :A Guide to Methods 禾口 Applications (Academic Press, NY)。在雜交方法中，可以用δ -內(nèi)毒素核苷酸序列的全部或部分篩選cDNA或基因組文庫。構(gòu)建這種cDNA和基因組文庫的方法在本領(lǐng)域中廣為所知，并在Sambrook和Russell， 2001，supra中得到了公開。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段、 或其它寡核苷酸，可以利用例如32P等可檢測的基團(tuán)對其進(jìn)行標(biāo)記，或利用例如其它放射性同位素、熒光化合物、酶、或酶的輔助因子等任何其它可檢測的標(biāo)記物對其進(jìn)行標(biāo)記。用于雜交的探針可以根據(jù)本文所公開的已知的S -內(nèi)毒素編碼核苷酸序列，通過標(biāo)記合成的寡核苷酸來制備。還可以使用基于核苷酸序列或編碼的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸殘基而設(shè)計(jì)的簡并引物。探針典型地包含一個(gè)核苷酸序列區(qū)域，該核苷酸序列區(qū)域在嚴(yán)緊條件下，與本發(fā)明編碼S -內(nèi)毒素的核苷酸序列或其片段或其變體中至少約12個(gè)、至少約25個(gè)、至少約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、或400個(gè)連續(xù)的核苷酸雜交。 制備用于雜交的探針的方法在本領(lǐng)域中廣為所知，并在Sambrook和Russell，2001，supra 中得到了公開，在此并入本文作為參考。例如，本文公開的整個(gè)δ -內(nèi)毒素序列或其一個(gè)或多個(gè)部分可以被用作能夠特異地與相應(yīng)的δ -內(nèi)毒素樣序列和信使RNA雜交的探針。為了在各種條件下實(shí)現(xiàn)特異性雜交， 探針包括獨(dú)特的、優(yōu)選地至少長約10個(gè)核苷酸、或至少約20個(gè)核苷酸的序列。探針可以被用于從所選擇的生物體中以PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的δ-內(nèi)毒素序列。該技術(shù)可以被用于從期望的生物體中分離額外的編碼序列，或用作診斷分析來確定一個(gè)生物體中編碼序列的存在。 雜交技術(shù)包括對涂板的DNA文庫(噬菌斑或集落)的雜交篩選；見例如Sambrook等(1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。序列的雜交可以在嚴(yán)緊條件下進(jìn)行?！皣?yán)緊條件”或“嚴(yán)緊雜交條件”是指在該條件下，探針與其靶序列雜交比與其它序列雜交具有可檢測的更大程度(例如，至少2倍于背景)。嚴(yán)緊條件是序列依賴的且將隨環(huán)境的不同而不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)緊性，與探針百分之百互補(bǔ)的靶序列可以被鑒別出來(同源探測)?？蛇x擇的是，可以對嚴(yán)緊條件進(jìn)行調(diào)整以允許序列中一些錯(cuò)配，這樣可以檢測較低程度的相似性(異源探測)。 通常，探針在長度上不超過約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選地長度小于500個(gè)核苷酸。典型地，嚴(yán)緊條件是在pH值7. O至8. 3、鹽濃度低于約1. 5M鈉離子、典型地為約0. 01至1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)、以及針對短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)溫度為至少約30°C和針對長探針(例如，多于50個(gè)核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴(yán)緊條件也可以通過添加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來獲得。示例性的低嚴(yán)緊條件包括用含有30%至35%的甲酰胺、IM NaClU % SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖液在37°C雜交，以及用IX至2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)在50至55°C洗滌。示例性的中等嚴(yán)緊條件包括在40 %至45 %的甲酰胺、1. OM NaCl、1 % SDS中在37°C雜交，以及在0. 5X至IX SSC中在55至60°C洗滌。示例性的高嚴(yán)緊條件包括在50%的甲酰胺、IM NaCl、1 % SDS中在37°C 雜交，以及在0. IX SSC中在60至65°C洗滌?？蛇x擇的是，洗滌緩沖液可以含有約0. 1 %至約的SDS。雜交持續(xù)時(shí)間通常少于約M小時(shí)，通常約4至約12小時(shí)。特異性典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于 DNA-DNA 雜交體，可以根據(jù) Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267-284 中的等式估計(jì) Tm 值=Tm = 81. 5°C +16. 6 (IogM) +0. 41(% GC) -0. 61(% form) -500/L ；其中 M 為單價(jià)陽離子的體積摩爾濃度，％ GC為DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，^form 為雜交液中甲酰胺的百分比，L為以堿基對計(jì)的雜交體的長度。Tm為50%的互補(bǔ)靶序列和完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和PH下)。每的錯(cuò)配，Tm值減去約 1°C ；因此，為和具有期望的一致性的序列雜交，可以調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件。例如，如果要尋找一致性> 90%的序列，Tm可以降低10°C。通常，嚴(yán)緊條件被選擇為對特定的序列及其互補(bǔ)序列，在規(guī)定的離子強(qiáng)度和PH值下，比熱熔點(diǎn)(Tm)低約5°C。然而，嚴(yán)格的嚴(yán)緊條件可以采用在低于熱熔點(diǎn)(^1)1、2、3或41進(jìn)行雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)緊條件可以采用在低于熱熔點(diǎn)(Tm)6、7、8、9或10°C下進(jìn)行雜交和/或洗滌；低嚴(yán)緊條件可以采用在低于熱熔點(diǎn)(Tm)ll、12、13、14、15或20°C下進(jìn)行雜交和/或洗滌。利用該公式、雜交和洗滌的組成以及期望的Tm，普通技術(shù)人員將理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)緊性的變化是被固有地描述的。如果期望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致Tm值低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC的濃度，借此可以使用較高的溫度。關(guān)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)見TijSSen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry 禾口 Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2 (Elsevier, New York)；以及 Ausubel 等，eds. (1995)Current Protocols in Molecular Biology, Chapter2(Greene Publishing 禾口 Wiley-InterscienceiNew York)。見Sambrook等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring HarboriNew York)。分離的蛋白質(zhì)及其變體和片段本發(fā)明也包括δ -內(nèi)毒素蛋白?！?δ -內(nèi)毒素蛋白”是指具有如SEQ IDNO :6_11所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也提供其片段、生物學(xué)活性部分、和變體，它們可以用于實(shí)施本發(fā)明的方法?！胺蛛x的蛋白質(zhì)”用于指不再在其天然環(huán)境中存在的蛋白質(zhì)，例如存在于體外或在重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中?！捌巍被颉吧飳W(xué)活性部分”包括包含與SEQ ID NO :6_11之任一所示的氨基酸序列足夠相同的氨基酸序列并顯示出殺病蟲害活性的肽片段。S-內(nèi)毒素蛋白的生物學(xué)活性部分可以是例如長10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸的多肽。該生物學(xué)活性部分可以通過重組技術(shù)來制備，并對其殺病蟲害活性進(jìn)行評估。用于測定殺病蟲害活性的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。見例如，Czapla 禾口 Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83 :2480-2485 ；禾口 Andrews 等(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等(1985)J. of Economic Entomology 78: 290-293 ；以及美國專利號5，743，477，所有文獻(xiàn)就其全部內(nèi)容并入本文進(jìn)行參考。如此所用，片段包含SEQ ID NO :6-11的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸。然而，本發(fā)明還包括其它片段，例
11如蛋白質(zhì)中長度大于約 10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250 或 1300 個(gè)氨基酸
的任何片段?！白凅w”是指該蛋白質(zhì)或多肽具有與SEQ ID NO :6_11之任一的氨基酸序列約60%、 65%、約 70%、75%、約 80%、85%、約 90 %、91 %、92 %、93 %、94%、95 %、96 %、97 %、98 % 或99%相同的氨基酸序列。變體也包括在嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO :1-5所示的核酸分子或其互補(bǔ)體雜交的核酸分子所編碼的多肽。變體包括由于突變而導(dǎo)致氨基酸序列不同的多肽。本發(fā)明包括的變體蛋白具有生物學(xué)活性，即它們?nèi)匀粨碛兴璧奶烊坏鞍椎纳飳W(xué)活性，即保留了殺病蟲害活性。在一些實(shí)施方案中，變體具有改進(jìn)的活性。用于測定殺病蟲害活性的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。見例如Czapla和Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83 2480-2485 ；Andrews等(1988)Biochem. J. 252:199-206 ；Marrone等(1985)J. of Economic Entomology 78 :290-293 ；以及美國專利號5，743，477，所有文獻(xiàn)就其全部內(nèi)容并入本文進(jìn)行參考。細(xì)菌基因，例如本發(fā)明的axmi基因，在開放閱讀框起點(diǎn)附近往往具有多個(gè)甲硫氨酸起始密碼子。通常，在這些起始密碼子中的一個(gè)或多個(gè)處的翻譯起始導(dǎo)致功能性蛋白質(zhì)產(chǎn)生。這些起始密碼子包括ATG密碼子。然而，諸如芽孢桿菌等細(xì)菌也將密碼子GTG識別為起始密碼子，在GTG密碼子起始翻譯的蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸為甲硫氨酸。此外，這些密碼子中的哪個(gè)會被細(xì)菌天然利用，常不是先驗(yàn)確定的。因此，可以理解，可選甲硫氨酸密碼子之一的使用也可能導(dǎo)致產(chǎn)生編碼殺病蟲害活性的S-內(nèi)毒素蛋白。這些δ-內(nèi)毒素蛋白包含在本發(fā)明中并可以被用于本發(fā)明的方法中。本發(fā)明也包括本發(fā)明的多肽或其變體或片段的抗體。制備抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(見例如，Harlow 禾口 Lane (1988) Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ；美國專利號 4, 196, 265)。改變的或改進(jìn)的變體公認(rèn)的，可以利用各種方法改變δ -內(nèi)毒素的DNA序列，這些改變可以導(dǎo)致DNA序列編碼的蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列異于本發(fā)明的S-內(nèi)毒素編碼的氨基酸序列。蛋白質(zhì)可以用各種方法進(jìn)行改變，包括對SEQ IDNO 6-11所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行氨基酸的替換、缺失、截去和插入，包括多達(dá)約2個(gè)、約3個(gè)、約4個(gè)、約5個(gè)、約6個(gè)、約7個(gè)、約8個(gè)、約 9個(gè)、約10個(gè)、約15個(gè)、約20個(gè)、約25個(gè)、約30個(gè)、約35個(gè)、約40個(gè)、約45個(gè)、約50個(gè)、 約55個(gè)、約60個(gè)、約65個(gè)、約70個(gè)、約75個(gè)、約80個(gè)、約85個(gè)、約90個(gè)、約100個(gè)、約105 個(gè)、約110個(gè)、約115個(gè)、約120個(gè)、約125個(gè)、約130或更多個(gè)氨基酸的替換、缺失或插入。這種操作方法在本領(lǐng)域廣為所知。例如，δ-內(nèi)毒素蛋白的氨基酸序列變體可以通過DNA的突變而制備。也可以通過幾種誘變形式之一和/或定向進(jìn)化來實(shí)現(xiàn)。在某些方面，編碼在氨基酸序列中的改變不實(shí)質(zhì)性地影響蛋白的功能。這種變體將擁有期望的殺病蟲害活性。然而，可以理解，δ-內(nèi)毒素賦予殺病蟲害活性的能力可以通過將此類技術(shù)應(yīng)用于本發(fā)明的組合物上而得到提高。例如，可以在諸如XL-IRed (Stratagene)等在DNA復(fù)制過程中表現(xiàn)出高比率堿基錯(cuò)誤摻入的宿主細(xì)胞中，表達(dá)S-內(nèi)毒素。在該菌株增殖后，可以分離S -內(nèi)毒素DNA (例如，通過提取質(zhì)粒DNA、或通過PCR擴(kuò)增以及將所得PCR片段克隆到載體中)，在非誘變菌株中培養(yǎng)S-內(nèi)毒素突變，并鑒定具有殺病蟲害活性的突變了的δ-內(nèi)毒素基因，例如通過進(jìn)行測試殺病蟲害活性的試驗(yàn)。通常，蛋白質(zhì)被混合并用于飼喂試驗(yàn)。 見例如，Marrone 等(1985) J. of Economic Entomology 78 :290_293。該試驗(yàn)包括使植物與一種或多種病蟲害接觸并測定植物存活和/或造成病蟲害死亡的能力。導(dǎo)致毒性增加的突變的例子見 SchMpf 等(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :775_806?？蛇x擇的是，可以對許多蛋白質(zhì)的蛋白序列在其氨基或羧基端進(jìn)行序列變更而不實(shí)質(zhì)性地影響活性。這可以包括利用現(xiàn)代分子方法引入的插入、缺失、或變更，這些方法例如PCR，包括通過在用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸中包含氨基酸編碼序列來改變或延長蛋白質(zhì)的編碼序列的PCR擴(kuò)增?？蛇x擇的是，添加的蛋白質(zhì)序列可以包括整個(gè)蛋白編碼序列，例如在本領(lǐng)域經(jīng)常被用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)融合物的那些序列。這樣的融合蛋白通常被用于(1)增強(qiáng)目的蛋白的表達(dá))；(2)引入結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酶活性、或表位以利于蛋白純化、蛋白檢測、或本領(lǐng)域已知的其它實(shí)驗(yàn)用途；(3)引導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌或翻譯到亞細(xì)胞器中，例如革蘭氏陰性菌的周質(zhì)間隙、或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其中后一種情況通常會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的糖基化。本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列也包括來自誘變和重組程序例如DNA改組的序列。在該程序中，一個(gè)或多個(gè)不同的S-內(nèi)毒素蛋白編碼區(qū)可以被用于產(chǎn)生具有所需特性的新的S-內(nèi)毒素蛋白。采用該方式，可以從一群相關(guān)序列多核苷酸產(chǎn)生重組多核苷酸文庫，其中該群相關(guān)序列多核苷酸包含具有實(shí)質(zhì)性序列一致性并可以進(jìn)行體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)域。例如，利用該方法，可以對編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序在本發(fā)明的S-內(nèi)毒素基因和其它已知的S-內(nèi)毒素基因之間進(jìn)行改組，以得到編碼具有改進(jìn)目的性狀(例如增強(qiáng)的殺蟲活性)的蛋白質(zhì)的新基因。用于該DNA改組的策略為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。見例如，Stemmer (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ；Stemmer (1994)Nature 370 :389-391 ；Crameri 等(I997)Nature Biotech. 15:436-438 ；Moore 等(I997)J-Mol. Biol. 272 :336-347 ；Zhang 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :4504-4509 ；Crameri 等 (1998)Nature 391 :288-291 ；以及美國專利號 5，605，793 和 5，837，458。結(jié)構(gòu)域交換或改組是另一種產(chǎn)生改變的δ-內(nèi)毒素蛋白的機(jī)制。可以在δ-內(nèi)毒素蛋白之間進(jìn)行結(jié)構(gòu)域II和III的交換，從而產(chǎn)生具有改良的殺病蟲害活性或靶譜的雜合體或嵌合體毒素。產(chǎn)生重組蛋白以及對其進(jìn)行殺病蟲害活性測試的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(見例如，Naimov 等(2001)Appl. Environ. Microbiol. 67 :5328-5330 ；de Maagd 等(1996)Appl. Environ. Microbiol. 62 :1537-1543 ；Ge 等(1991)J. Biol. Chem. 266 17954-17958 ；Schnepf 等(1990)J. Biol. Chem. 265 :20923-20930 ；Rang 等 91999)Appl. Environ. Microbiol. 65 :2918-2925)。載體本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素序列可以以用于在目的植物中進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)盒形式提供。 “植物表達(dá)盒”是指可以在植物細(xì)胞中導(dǎo)致蛋白質(zhì)從開放閱讀框表達(dá)的DNA構(gòu)建體。典型地，其包含啟動子和編碼序列。通常，該構(gòu)建體也將包含3’非翻譯區(qū)。該構(gòu)建體可以包含 “信號序列”或“引導(dǎo)序列”以便利于肽的共翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)到某些細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)中，例如轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體(或其它質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中。“信號序列”是指已知或被猜測可以導(dǎo)致共翻譯或翻譯后跨細(xì)胞膜的肽轉(zhuǎn)運(yùn)的序列。在真核生物中，這典型地涉及分泌到高爾基體中，和由此發(fā)生的一些糖基化?！耙龑?dǎo)序列”是指其翻譯后產(chǎn)生的氨基酸序列足以引起肽鏈的共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)至亞細(xì)胞器中的任何序列。因此，它包括通過運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中、運(yùn)至液泡、質(zhì)體(包括葉綠體、線粒體等)而導(dǎo)致靶向轉(zhuǎn)運(yùn)和/或糖基化的引導(dǎo)序列。“植物轉(zhuǎn)化載體”是指有效轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞所必需的DNA分子。該分子可以由一個(gè)或多個(gè)植物表達(dá)盒組成，并可以組織成不止一個(gè)“載體”DNA分子。例如，雙元載體是植物轉(zhuǎn)化載體，它利用兩個(gè)非連續(xù)的DNA載體來編碼植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化所必需的所有順式和反式功能 (Hellens 和 MullineauxUOOO)iTrends in Plant Science 5:446-451)?！拜d體”指被設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞之間實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_(dá)載體”指能夠在外源細(xì)胞中摻入、 整合和表達(dá)異源DNA序列或片段的載體。表達(dá)盒可以包括可操作地連接到本發(fā)明序列上的 5'和3'調(diào)控序列?！翱刹僮鞯剡B接”是指啟動子和第二序列之間的功能性連接，其中啟動子序列啟動并介導(dǎo)該第二序列所對應(yīng)的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通常，可操作地連接是指，所連接的核酸序列成為連續(xù)的，并且在需要連接兩個(gè)蛋白編碼序列時(shí)，是連續(xù)且在相同的閱讀框中的。表達(dá)盒還可以包括至少一個(gè)待共轉(zhuǎn)化到生物體中的額外基因?？蛇x擇的是，該額外基因可以在多個(gè)表達(dá)盒中提供?！皢幼印敝钙鹬笇?dǎo)下游編碼序列轉(zhuǎn)錄的作用的核酸序列。啟動子和其它轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控核酸序列(也被稱為“控制序列”)一起為目的DNA序列的表達(dá)所必需。表達(dá)盒可以提供有多個(gè)限制性位點(diǎn)用于將δ -內(nèi)毒素序列插入以置于調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。表達(dá)盒可以以5'至3'轉(zhuǎn)錄方向包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動子)、本發(fā)明的 DNA序列、以及在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止子區(qū)域)。啟動子可以相對植物宿主和/或本發(fā)明的DNA序列來說是天生的或同源的、或外來的或異源的。此外，啟動子既可以是天然序列也可以是合成序列。啟動子相對于植物宿主來說是“天生的”或“同源的”，意思是啟動子存在于其待導(dǎo)入的該天然植物中。啟動子相對本發(fā)明的DNA序列來說是 “外來的”或“異源的”，意思是啟動子對于該可操作地連接的本發(fā)明DNA序列不是天生的或天然存在的啟動子。終止區(qū)可以是天生與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)一起的，可以是天生與該可操作地連接的目的 DNA序列一起的，可以是植物宿主天生的、或可以源于其它來源(即，相對于啟動子、目的 DNA序列、植物宿主、或其任何組合來說是外來或異源的)。方便的終止區(qū)可以獲自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶的終止區(qū)。也見Guerineau等(1991)Mol. Gen.Genet. 262 :141-144 ；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674 ；Sanfacon 等(1991)Genes Dev. 5 :141-149 ;Mogen 等(1990)Plant Cell 2 :1洸1_1272 ;Munroe 等(1990)Gene 91: 151-158 ；Ballas 等(1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891-7903 ；和 Joshi 等(1987)Nucleic Acid Res. 15 :9627_9639?；蚩梢宰们楸粌?yōu)化以增強(qiáng)其在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。即，可以使用宿主細(xì)胞偏好的密碼子合成基因以提高其表達(dá)，或可以以宿主偏好密碼子使用頻率來使用密碼子進(jìn)行基因合成。通?；虻腉C含量將會增加。宿主偏好密碼子使用的討論見例如， Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol. 92 =I-Il0在本領(lǐng)域中可以獲得合成植物偏好的基因的方法。見例如，美國專利號5，380，831，和5，436，391，以及Murray等(1989)Nucleic Acids Res. 17 :477_498，在此引入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，δ -內(nèi)毒素靶向葉綠體進(jìn)行表達(dá)。以該方式，當(dāng)δ -內(nèi)毒素不直接插入到葉綠體中時(shí)，表達(dá)盒可以額外包含編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸，以引導(dǎo)S -內(nèi)毒素達(dá)到葉綠體。這類轉(zhuǎn)運(yùn)肽為本領(lǐng)域所知。見例如，Von Heijne等(1991)Plant Mol. Biol. Rep. 9 104-126 ；Clark 等(1989)J.Biol. Chem. 264 :17544-17550 ；Della-Cioppa 等(1987)Plant Physiol. 84 :965-968 ；Romer 等(1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 :1414-1421 ；禾口 Shah 等(1986)Science 233:478-481?？梢愿鶕?jù)植物細(xì)胞核和葉綠體細(xì)胞器之間在密碼子使用上的差異，對待定位到葉綠體的S-內(nèi)毒素基因進(jìn)行優(yōu)化以在葉綠體中表達(dá)。在該方法中，可以使用葉綠體偏好密碼子合成目的核酸。見例如，美國專利號5，380，831，在此引入作為參考。植物轉(zhuǎn)化本發(fā)明的方法涉及將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入到植物中?！皩?dǎo)入”是指以核苷酸構(gòu)建體可以進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部的方式向植物呈送核苷酸構(gòu)建體。本發(fā)明的方法不需要使用向植物導(dǎo)入核苷酸構(gòu)建體的特殊方法，只需要核苷酸構(gòu)建體進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。用于向植物導(dǎo)入核苷酸構(gòu)建體的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法、和病毒介導(dǎo)的方法?！爸参铩笔侵刚麄€(gè)植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚及其后代。植物細(xì)胞可以是分化的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、 葉細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)?！稗D(zhuǎn)基因植物”或“轉(zhuǎn)化的植物”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”植物或細(xì)胞或組織是指，該植物已經(jīng)在植物細(xì)胞中摻入或整合了外來核酸序列或DNA片段。該核酸序列包括外源的或在未轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中不存在的核酸序列，以及可以是內(nèi)源的或存在于未轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的核酸序列。“異源的”通常是指核酸序列并非包含其的細(xì)胞或天然基因組的一部分所內(nèi)生的、其是通過感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、微粒發(fā)射等而已經(jīng)加入到細(xì)胞中的。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)本文公開的一個(gè)或多個(gè)殺病蟲害序列。在各實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物還包含一個(gè)或多個(gè)額外的抗蟲基因，例如，一個(gè)或多個(gè)控制鞘翅目昆蟲、鱗翅目昆蟲、異翅目昆蟲、或線蟲類害蟲的額外基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，轉(zhuǎn)基因植物可以包含賦予感興趣的農(nóng)藝性狀的任何基因?？梢岳帽绢I(lǐng)域幾種已知的技術(shù)之一進(jìn)行植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化?？梢詫Ρ景l(fā)明的 S-內(nèi)毒素基因進(jìn)行修飾以獲得或增強(qiáng)在植物細(xì)胞中的表達(dá)。典型地，表達(dá)該蛋白的構(gòu)建體包含驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的啟動子、以及允許轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的3'非翻譯區(qū)。組裝這類構(gòu)建體的方法為本領(lǐng)域所熟知。在某些情況下，可能有用的是，對基因進(jìn)行改造以使所得肽是可以分泌的，或以其它方式在植物細(xì)胞中靶向。例如，可以對基因進(jìn)行改造使其包含促進(jìn)肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移的信號肽。也可以優(yōu)選地對植物表達(dá)盒進(jìn)行改造使其包含內(nèi)含子，以便內(nèi)含子的mRNA加工為表達(dá)所需。典型地，“植物表達(dá)盒”將被插入到“植物轉(zhuǎn)化載體”中。該植物轉(zhuǎn)化載體可以由一個(gè)或多個(gè)實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化所需的DNA載體組成。例如，在本領(lǐng)域中的常規(guī)實(shí)踐是利用由一個(gè)以上的連續(xù)DNA片段構(gòu)成的植物轉(zhuǎn)化載體。在本領(lǐng)域中這些載體通常被稱為“雙元載體”。 雙元載體以及載體和輔助質(zhì)粒被最常用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中需要實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化的 DNA區(qū)段非常長、復(fù)雜性非常高，因而，使功能分開在分開的不同DNA分子上是有利的。雙元載體典型地包含含有T-DNA轉(zhuǎn)移所需的順式作用序列(例如左邊界和右邊界)、選擇標(biāo)記(經(jīng)工程化后能夠在植物細(xì)胞中表達(dá))、以及“目的基因”(經(jīng)工程化后能夠在需要由其產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞中表達(dá)的基因)的質(zhì)粒載體。該質(zhì)粒載體上也存在細(xì)菌復(fù)制所需的序列。順式作用序列以允許向植物細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)移并在植物中表達(dá)的方式被排布。例如， 將選擇標(biāo)記基因和S-內(nèi)毒素置于左右邊界之間。通常，第二質(zhì)粒載體包含介導(dǎo)T-DNA從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的反式作用因子。該質(zhì)粒通常包含毒力功能(Vir基因)，這允許農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞、并通過在邊界序列進(jìn)行切割和vir介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移而實(shí)現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)移， 如在本領(lǐng)域所知的(Hellens 禾口 Mullineaux (2000) Trends in Plant Science5 :446-451)。 有幾類農(nóng)桿菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHAlOl、EHA105等)可以被用于植物轉(zhuǎn)化。在采用例如微粒發(fā)射、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等其它方法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化時(shí)，不需要該第二質(zhì)粒載體。通常，植物轉(zhuǎn)化方法包括將異源DNA轉(zhuǎn)移到靶植物細(xì)胞(例如，未成熟或成熟胚、 懸浮培養(yǎng)物、未分化愈傷組織、原生質(zhì)體等)中去，隨后進(jìn)行最大閾值水平的合適選擇(取決于選擇標(biāo)記基因)，以從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體中回收轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞。外植體通常被轉(zhuǎn)移到新鮮提供的相同培養(yǎng)基上按常規(guī)方法培養(yǎng)。其后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在添加有最大閾值水平的篩選試劑的再生培養(yǎng)基上分化成芽。然后將芽轉(zhuǎn)移到選擇性生根培養(yǎng)基，使其再生成帶根的芽或小植株。轉(zhuǎn)基因小植株隨后生長至成熟植株并產(chǎn)生可育的種子(例如Hiei等(1994) The Plant Journal 6 :271-282 ；Ishida ^ (1996)Nature Biotechnology 14 :745_750)。 外植體通常被轉(zhuǎn)移到新鮮提供的相同培養(yǎng)基上按常規(guī)方法培養(yǎng)。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般說明見 Ayres 和 Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239 和 Bommineni 和 Jauhar (1997)Maydica 42 :107_120。由于轉(zhuǎn)化的材料包含許多細(xì)胞；轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞都存在于任何一塊受試目標(biāo)愈傷組織或組織或細(xì)胞團(tuán)中。殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞并允許轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖的能力將導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。常常，除去非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力是快速回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和成功再生轉(zhuǎn)基因植株中的限制因素。轉(zhuǎn)化的程序及用于將核苷酸序列導(dǎo)入植物中的程序可因轉(zhuǎn)化所靶向的植物或植物細(xì)胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)而不同。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生可以用以下幾種方法之一來進(jìn)行，包括但不限于顯微注射、電穿孔、直接基因轉(zhuǎn)移、利用農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞中導(dǎo)入異源DNA(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、以附著于微粒上的異源外來DNA轟擊植物細(xì)胞、彈道微粒加速、氣溶膠束轉(zhuǎn)化(美國公布申請?zhí)?0010(^6941 ；美國專利號4，945，050 ；國際公布號WO 91/00915 ；美國公布申請?zhí)?002015066)、Lecl轉(zhuǎn)化、以及各種其它非粒子直接介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移DNA的方法。葉綠體轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域所知。見例如，Svab等(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :913-917 ；Svab 和Maliga(1993)EMBO J. 12 :601_606。該方法依賴基因槍遞送包含選擇標(biāo)記的DNA以及通過同源重組使該DNA靶向質(zhì)體的基因組。此外，質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以通過組織偏好地表達(dá)核編碼的質(zhì)體定向的RNA聚合酶來反式激活質(zhì)粒所攜帶的沉默的轉(zhuǎn)基因而進(jìn)行。該系統(tǒng)已于 McBride 等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :7301-7305 中被報(bào)道。在異源的外來DNA整合進(jìn)植物細(xì)胞中以后，在培養(yǎng)基中應(yīng)用最大閾值水平的適當(dāng)篩選殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞、分離并通過定期向新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)移來增殖在該篩選處理下存活的推定轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。通過繼續(xù)傳代和施加適當(dāng)?shù)暮Y選進(jìn)行攻擊，從而鑒別并增殖轉(zhuǎn)化有
16質(zhì)粒載體的細(xì)胞。然后，可以利用分子和生物學(xué)方法確認(rèn)目的異源基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因植物的基因組中?？梢园凑粘Ｒ?guī)方法將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞培養(yǎng)成植株。見例如，McCormick等(1986) Plant Cell Reports 5:81-84。然后可以對這些植株進(jìn)行種植，以相同的轉(zhuǎn)化株或不同株系進(jìn)行授粉，并鑒別組成型表達(dá)該期望表型特征的雜交種?？梢陨L兩代或更多代以保證該期望表型特征的表達(dá)得到穩(wěn)定的維持和遺傳，隨后收獲種子以確保已經(jīng)獲得了期望表型特征的表達(dá)。通過該方法，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化的種子(也被稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，該種子含有穩(wěn)定整合到其基因組中的本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體(例如本發(fā)明的表達(dá)盒)。植物轉(zhuǎn)化的評估在異源的外來DNA導(dǎo)入到植物細(xì)胞中后，可以用各種方法對異源基因的轉(zhuǎn)化和在植物基因組中的整合進(jìn)行驗(yàn)證，這些方法例如對與整合基因相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)和代謝物的分析。PCR分析是在移栽至土壤中前在較早期篩選存在整合基因的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或芽的一種快速方法(Sambrook 禾口 Russell (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。使用對目的基因或農(nóng)桿菌載體背景等特異的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR。植物轉(zhuǎn)化可以通過對基因組DNA的southern印跡分析來進(jìn)行驗(yàn)證(Sambrook和 Russell, 2001, supra)。通常，從轉(zhuǎn)化體中提取總DNA，以合適的限制性酶進(jìn)行消化，以瓊脂糖凝膠進(jìn)行分級分離后向硝酸纖維素膜或尼龍膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移。然后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook 和Russell，2001，supra)，膜或“印跡”用例如放射性同位素32P標(biāo)記的目標(biāo)DNA片段探測， 從而對所導(dǎo)入的基因在植物基因組中的整合進(jìn)行驗(yàn)證。在Northern印跡分析中，按照本領(lǐng)域常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)程序(Sambrook和Russell， 2001, supra)，從轉(zhuǎn)化體的特定組織提取RNA，以甲醛瓊脂糖凝膠進(jìn)行分級分離，并印跡到尼龍濾膜上。以本領(lǐng)域已知的方法(Sambrook和Russell，2001，supra)，通過將濾膜與來源于S-內(nèi)毒素的放射性探針雜交，對δ-內(nèi)毒素編碼RNA的表達(dá)進(jìn)行檢測?？梢詫D(zhuǎn)基因植物進(jìn)行Western印跡、生物化學(xué)分析等，利用與存在于δ -內(nèi)毒素蛋白中的一個(gè)或多個(gè)表位相結(jié)合的抗體，按照標(biāo)準(zhǔn)的程序(Sambrook和Russell，2001， supra)來確認(rèn)δ -內(nèi)毒素基因編碼的蛋白質(zhì)的存在。在植物中的殺病蟲害活性在本發(fā)明的另一方面，可以產(chǎn)生表達(dá)具有殺病蟲害活性的δ-內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因植物。例如上述方法可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，然而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法不是本發(fā)明的關(guān)鍵所在。例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物轟擊轉(zhuǎn)化、以及非粒子介導(dǎo)的方法等在本領(lǐng)域已知或被描述的方法都可以被實(shí)驗(yàn)者任意選擇使用。可以利用例如愈傷組織的轉(zhuǎn)化、篩選轉(zhuǎn)化了的愈傷組織、以及從轉(zhuǎn)基因愈傷組織再生可育植株等本領(lǐng)域所描述的普通方法，分離表達(dá)S-內(nèi)毒素的植株。在此過程中，可以利用任何基因作為選擇標(biāo)記，只要其在植物細(xì)胞中的表達(dá)可以賦予鑒別或選擇轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞的能力。許多標(biāo)記已經(jīng)被開發(fā)用于植物細(xì)胞，例如對氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。其它所編碼的產(chǎn)物涉及葉綠體新陳代謝的基因也可以被用作選擇標(biāo)記。例如，對草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮等植物除草劑提供抗性的基因可以特別有用。這些基因已被報(bào)道(Stalker等(1985) J. Biol. Chem. 263 :6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；以及 Sathasivan 等(1990) Nucl. Acids Res. 18 :2188 (AHAS 咪唑啉酮抗性基因)。此外，本文所公開的基因可被用作評估細(xì)菌或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)記。檢測植物、植物器官(例如，葉、莖、 根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、以及胚或其后代中轉(zhuǎn)基因的存在的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過測試殺病蟲害活性來檢測轉(zhuǎn)基因的存在?？梢詫Ρ磉_(dá)δ -內(nèi)毒素的可育植株進(jìn)行殺病蟲害活性的測試，選擇表現(xiàn)最佳活性的植株用于進(jìn)一步的繁殖。在本領(lǐng)域可以獲得分析對病蟲害的活性的方法。通常，將蛋白質(zhì)混合并用于飼喂試驗(yàn)中。見例如Marrone等(1985) J. of Economic Entomology 78: 290493。本發(fā)明可被用于任何植物物種的轉(zhuǎn)化，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。 目的植物的例子包括但不限于玉米、高粱、小麥、向日葵、西紅柿、十字花科植物、辣椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜、蕓薹屬植物、苜蓿、黑麥、粟、紅花、花生、 甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑桔樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、澳洲堅(jiān)果、杏、燕麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。蔬菜包括但不限于西紅柿、萵苣、青豆、利馬豆、豌豆，以及黃瓜、哈密瓜和甜瓜等甜瓜屬(Curcumis)的植物。觀賞植物包括但不限于杜鵑花、繡球?qū)僦参?、木槿、玫瑰、郁金香、黃水仙、矮牽牛、康乃馨、一品紅和菊花。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物為作物(例如，玉米、 高粱、小麥、向日葵、西紅柿、十字花科植物、辣椒、土豆、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等)。在病蟲害控制中的應(yīng)用利用包含本發(fā)明的核苷酸序列或其變體的株系進(jìn)行殺病蟲害控制或?qū)⑵渌矬w改造為殺病蟲害劑的常規(guī)方法為本領(lǐng)域所知。見例如美國專利號5，039，523和EP 0480762A2。包含本發(fā)明的核苷酸序列或其變體的芽孢桿菌菌株、或經(jīng)遺傳修飾后包含殺病蟲害基因和蛋白的微生物可以被用于防止農(nóng)作物和其產(chǎn)品遭受病蟲害。在本發(fā)明的一個(gè)方面，產(chǎn)毒素(殺病蟲害劑)的生物體的完整(即未裂解的)細(xì)胞，用在細(xì)胞被施用到目標(biāo)病害蟲環(huán)境中時(shí)能夠延長細(xì)胞中產(chǎn)生的毒素的活性的試劑，進(jìn)行處理?？蛇x擇的是，通過向細(xì)胞宿主中導(dǎo)入δ -內(nèi)毒素基因來產(chǎn)生殺病蟲害劑。δ -內(nèi)毒素基因的表達(dá)直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)殺病蟲害劑的產(chǎn)生和維持。在本發(fā)明的一個(gè)方面， 隨后于在細(xì)胞被施用到目標(biāo)病害蟲環(huán)境中時(shí)能夠延長細(xì)胞中產(chǎn)生的毒素的活性的條件下， 處理這些細(xì)胞。所得到的產(chǎn)物保持毒素的毒性。可以將這些自然囊化的殺病蟲害劑按照常規(guī)技術(shù)制劑化，以施用于目標(biāo)病害蟲棲息的環(huán)境中，例如土壤、水以及植物的葉片。見例如 EPA 0192319及其中引用的參考文獻(xiàn)?？蛇x擇的是，可以將表達(dá)本發(fā)明的基因的細(xì)胞制劑化以允許所獲得的材料可被用作殺病蟲害劑。殺病蟲害組合物本發(fā)明的活性成分通常以組合物的形式來施用，并可以聯(lián)合其它化合物同時(shí)地或依次地被施用到需要進(jìn)行處理的作物區(qū)域或植物。這些化合物可以是肥料、除草劑、冷凍保護(hù)劑、表面活性劑、洗滌劑、殺病蟲害皂、休眠油、高分子材料、和/或允許在單次施用制劑后實(shí)現(xiàn)向目標(biāo)區(qū)域的長期給藥的緩釋或可生物降解的載體制劑。它們也可以是選擇性除草劑、化學(xué)殺病蟲害劑、殺病毒劑、殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺害蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或這些制劑中的幾種的混合物，如果需要的話，聯(lián)合在制劑領(lǐng)域中通常使用的其它農(nóng)用可接受的載體、表面活性劑或促進(jìn)施用的輔助劑。合適的載體和輔助劑可以是固態(tài)的或液態(tài)的，對應(yīng)于通常用于制劑工藝中的物質(zhì)，例如，自然或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、濕潤劑、增粘劑、黏合劑或肥料。同樣，這些制劑也可以被制作成可食用的“誘餌”或被制作成病害蟲的“誘捕器”以使殺病蟲害制劑可以被目標(biāo)病害蟲進(jìn)食或攝食。本發(fā)明的活性組分或包含至少一種本發(fā)明細(xì)菌菌株所產(chǎn)生的殺病蟲害蛋白的本發(fā)明農(nóng)用化學(xué)組合物的施用方法包括，葉施用、種衣和土壤施用。施用次數(shù)和施用頻率取決于相應(yīng)害蟲的侵襲強(qiáng)度。組合物可以被配制成粉(powder)、粉末(dust)、小球(pellete)、顆粒(granule)、 噴劑、乳劑、膠體、溶液等，并可以通過常規(guī)方法例如脫水、凍干、勻漿、提取、過濾、離心、沉淀、或濃縮，處理包含多肽的細(xì)胞的培養(yǎng)物來制備。在所有這類包含至少一種該殺病蟲害多肽的組合物中，多肽可以以按重量計(jì)約1 %到約99 %的濃度存在。使用本發(fā)明的方法可以在給定區(qū)域內(nèi)殺滅殺鱗翅目、鞘翅目或線蟲類病蟲害或減少病蟲害的數(shù)量，或者可以預(yù)防性應(yīng)用到環(huán)境區(qū)域以防止易感病蟲害的侵襲。優(yōu)選地，病蟲害吞食或接觸殺病蟲害有效量的多肽?！皻⒉∠x害有效量”是指能夠?qū)е轮辽僖环N病蟲害死亡或明顯降低病害蟲的生長、攝食或正常的生理發(fā)育的殺病蟲害劑的量。該量是變化的，取決于因素例如需被控制的具體目標(biāo)病蟲害，需進(jìn)行處理的具體環(huán)境、地點(diǎn)、植物、作物或農(nóng)業(yè)場所，環(huán)境條件，具殺病蟲害效應(yīng)的多肽組合物的施用方法、頻率、濃度、穩(wěn)定性和量。制劑也可依氣候條件、環(huán)境因素、和/或施用頻率和/或病害蟲侵襲的嚴(yán)重度的不同而變化。所描述的殺病蟲害組合物可以通過用期望的農(nóng)業(yè)可接受的載體配制細(xì)菌細(xì)胞、晶體和/或孢子懸液、或分離的蛋白質(zhì)組分而制成?？梢栽谑┯们耙赃m當(dāng)?shù)姆椒ㄅ渲平M合物， 例如凍干、冷凍干燥、脫水，或于水性載體、介質(zhì)、或合適稀釋劑如鹽水或其它緩沖液中。所配制的組合物的形式可以是粉末或粒狀材料、或懸浮于油(植物油或礦物油)或水或油/ 水乳狀液中、或是可濕性粉劑、或與任何其它適于農(nóng)用的載體材料組合。合適的農(nóng)用載體可以是固態(tài)或液體的，為本領(lǐng)域所熟知。術(shù)語“農(nóng)業(yè)可接受的載體”包括常用于殺病蟲害制劑技術(shù)中的所有輔助劑、惰性組分、分散劑、表面活性劑、增粘劑、黏合劑等；這些都為殺病蟲害制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。制劑可以和一種或多種固體或液體輔助劑混合，可以用各種方法來進(jìn)行制備，例如用常規(guī)的配制技術(shù)，將殺病蟲害組合物和合適的輔助劑均勻地混合、摻混和/或研磨。合適的制劑和施用方法見美國專利號6，468，523，在此并入本文作為參考。也可以用一種或多種化學(xué)組合物處理植物，包括一種或多種除草劑、殺蟲劑或殺真菌劑。代表件的化學(xué)組合物包括水果/蔬菜除草劑阿特拉津(Atrazine)、除草定 (Bromacil)、敵草隆(Diuron)、草甘膦(Glyphosate)、利谷隆(Linuron)、嗪草酮 (Metribuzin)、西瑪津(Simazine)、氟樂靈(Trifluralin)、吡氟禾草靈(Fluazifop)、草銨膦(Glufosinate)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron, Gowan)、百草枯(Paraquat)、戊炔草胺 (Propyzamide)、稀禾定(Sethoxydim)、氟丙嘧草酯(Butafenacil)、氯吡嘧磺隆 (Halosulfuron)、Indaziflam 水果/蔬菜殺蟲劑涕滅威(Aldicarb)、蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuriengiensis) > 甲 * 1 (Carbaryl) > 3 H 11 (Carbofuran) > & ！^(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、二嗪農(nóng) (Diazinon)、馬拉硫磷(Malathion)、阿維菌素(Abamectin)、氟氯氰菊酯/ β -氟氯氰菊酯 (Cyfluthrin/beta-cyfluthrin)、高氰戊菊酯(Esfenvalerate)、 λ -氯氟氰菊酯 (Lambda-cyhalothrin)、滅螨醌(Acequinocyl)、聯(lián)苯胼酯(Bifenazate)、甲氧苯酰胼 (Methoxyfenozide)、雙苯氟脲(Novaluron)、環(huán)蟲酰胼(Chromafenozide)、噻蟲啉 (Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinotefuran)、嘧螨酯(Fluacrypyrim)、唑蟲酰胺 (Tolfenpyrad)、噻蟲胺(Clothianidin)、螺螨酯(Spirodiclofen)、Y _ 氯氟氰菊酯 (Gamma-cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、艾克敵(Spinosad)、氯蟲酰胺 (Rynaxypyr)、Cyazypyr> Spinoteram、殺鈴服(Triflumuron)、螺蟲乙酉旨(Spirotetramat)、 吡蟲啉amidacloprid)、氟蟲雙酰胺(Flubendiamide)、硫雙威(Thiodicarb)、氰氟蟲腙 (Metaflumizone)、氟啶蟲胺腈(Sulfoxaflor)、丁氟螨酯(Cyflumetofen) > Cyanopyrafen、 口比蟲啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、Spinotoram、硫雙威(Thiodicarb)、氟啶蟲酰胺(Flonicamid)、甲硫威(Methiocarb)、因滅汀 (Emamectin-benzoate)、弗蟲威(Indoxacarb)、Fozthiazate、克線憐(Fenamiphos)、硫線磷(Cadusaphos)、吡丙醚(Pyriproxifen)、殺螨錫(Fenbutatin-oxid)、噻螨酮 (Hexthiazox)、滅多威(Methomyl)、4_[ [ (6_ 氯吡啶 _3_ 基)甲基](2，2_ 二氟乙基)氨基] 呋喃-2(5H)_酮水果/蔬菜殺真菌劑多菌靈(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、 EBDCs(Sulphur)、甲基硫菌靈(Thiophanate-methyl)、嘧菌酉旨(Azoxystrobin)、霜脲氰(Cymoxanil)、氟啶胺(Fluazinam)、乙磷鋁(Fosetyl)、異菌脲(Iprodione)、醚菌酯 (Kresoxim-methyl)、甲霜靈(Metalaxy 1/mefenoxam)、月虧菌酉旨(Trifloxystrobin)、噻唑菌胺(Ethaboxam)、異丙菌威(Iprovalicarb)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、環(huán)酰菌胺 (Fenhexamid)、惡咪唑延胡索酸酯(Oxpoconazole fumarate)、氰霜唑(Cyazofamid)、咪唑菌酮(Fenamidone)、苯酰菌胺(Zoxamide)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、唑菌胺酯 (Pyraclostrobin)、環(huán)菌胺(Cyflufenamid)、吡菌酰胺(Boscalid))谷類作物除草劑異丙隆(Isoproturon)、溴苯腈(Bromoxynil)、碘草腈(Ioxynil)、Phenoxies,氯磺隆 (Chlorsulfuron)、炔草酯(Clodinafop)、禾草靈(Diclofop)、吡氟草胺(Diflufenican)、 精惡唑禾草靈(Fenoxaprop)、雙氟磺草胺(Florasulam)、氯氟吡氧乙酸(Fluroxypyr)、甲磺隆(Metsulfuron)、醚苯磺隆(Triasulfuron)、氟酮磺隆(Flucarbazone)、碘甲磺隆 (Iodosulfuron)、丙苯石黃隆(Propoxycarbazone)、氣口比草月安(Picolinafen) >甲石黃月安石黃隆 (Mesosulfuron)、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、草吡唑(Pinoxaden)、酰嘧磺隆 (Amidosulfuron)、甲噻磺隆(Thifensulfuron)、苯磺隆(Tribenuron)、氟啶嘧磺隆 (Flupyrsulfuron)、磺酰磺隆(Sulfosulfuron)、磺酰草吡唑(Pyrasulfotole)、甲氧磺草胺(Pyroxsulam)、氟噻草胺(Flufenacet)、肟草酮(Tralkoxydim)、Pyroxasulfon 谷類作物殺真菌齊 :多菌靈(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、 環(huán)唑醇(Cyproconazole)、嘧菌環(huán)胺(Cyprodinil)、丁苯嗎啉(i^enpropimorph)、氟環(huán)唑 (Epoxiconazole)、醚菌酉旨(Kresoxim-methyl),喹氧靈(Quinoxyfen)、戊唑醇 (Tebuconazole)、肟菌酯 CTrifloxystrobin)、硅氟唑(Simeconazole)、啶氧菌酉旨 (Picoxystrobin)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin) > 甲氧菌平(Dimoxystrobin)、丙硫L 菌唑 (Prothioconazole)、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)谷類作物殺蟲齊 樂果(Dimethoate)、入-氯氟氰菊酯(Lambda-cyhalothrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、α -氯氰菊酯 (alpha-Cypermethrin)、β -氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)、聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin)JttS 啉(Liiidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉 (Thiacloprid)、唆蟲脈(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、Clorphyriphos、甲胺磷 (Metamidophos)、亞砜吸磷(Oxidemethon-methyl)、抗蚜威(Pirimicarb)、甲硫威 (Methiocarb)玉米除草劑阿特拉津(Atrazine)、甲草胺(Alachlor)、溴苯睛 (Bromoxynil)、乙草胺(Acetochlor)、麥草畏(Dicamba)、氯草啶(Clopyralid)、S-噻吩草胺(S-Dimethenamid)、草銨膦(Glufosinate)、草甘膦(Glyphosate)、異惡唑草酮 (Isoxaflutole)、精異丙甲草胺(S-Metolachlor)、甲基磺草酮(Mesotrione)、煙嘧磺隆 (Nicosulfuron)、氟嘧磺隆(Primisulfuron)、玉嘧磺隆(Rimsulfuron)、磺草酮 (Sulcotrione) > ^11:1 !!! (Foramsulfuron)、口比草石黃(Topramezone)、Tembotrione、啼唆月虧草醚(Saflufenacil)、酮脲磺草吩酯(Thiencarbazone)、氟噻草胺(Flufenacet)、 Pyroxasulfon 玉米殺蟲劑克百威(Carbofuran)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、聯(lián)苯菊酯 (Bifenthrin)、氟蟲腈(Fipronil)、吡蟲啉(Imidacloprid)、λ-氯氟氰菊酯 (Lambda-Cyhalothrin)、七氟菊酯(Tefluthrin)、特丁 硫磷(Terbufos)、噻蟲嗪 (Thiamethoxam)、可尼丁 (Clothianidin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、氟蟲雙酰胺 (Flubendiamide)、殺鈴脲(Triflumuron)、氯蟲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰菊酯 (Deltamethrin)、硫雙威(Thiodicarb)、β -氟氯氰菊酯(β -Cyf luthrin)、氯氰菊酯 (Cypermethrin)、聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin)、虱螨脲(Lufenuron)、殺鈴脲(Triflumoron)、七氟菊酯 CTefluthrin)、丁基嘧啶磷(Tebupirimphos)、乙蟲清(Ethiprole)、Cyazypyr、噻蟲啉(Thiacloprid)、啶蟲脈(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、阿維菌素 (Avermectin)、甲硫威(Methiocarb)、螺螨酯(Spirodiclofen)、螺蟲乙酯 (Spirotetramat)玉米殺真菌劑種衣酯O^enitropan)、福美雙(Thiram)、丙硫菌唑 (Prothioconazole)、戊唑醇(Tebuconazole)、月虧菌酯(Trifloxystrobin))水稻除草劑 丁草胺(Butachlor)、敵稗(ftOpanil)、四唑嘧磺隆(Azimsulfuron)、芐嘧磺隆 (Bensulfuron)、氰氟草酯(Cyhalofop)、香草隆(Daimuron)、四唑酰草胺(Fentrazamide)、 唑吡嘧磺隆(Imazosulfuron)、苯噻草胺(Mefenacet)、去稗安(Oxaziclomefone)JtI^tit 隆(Pyrazosulfuron)、稗草畏(Pyributicarb)、二氯喹啉酸(Quinclorac)、殺草丹 (Thiobencarb)、茚草酮 Qndanofan)、氟噻草胺(Flufenacet)、四唑酰草胺 (Fentrazamide)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron)、去稗安(Oxaziclomefone)、苯并雙環(huán)酮 (Benzobicyclon)、環(huán)酯草醚(Pyriftalid)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、雙草醚 (Bispyribac)、炔惡草酮(Oxadiargyl)、乙氧磺隆(Ethoxysulfuron)、丙草胺 (Pretilachlor)、甲基磺草酮(Mesotrione)、Tefuryltrione、惡草酮(Oxadiazone)、精惡唑禾草靈(Fenoxaprop)、Pyrimisulfan 水稻殺蟲劑二嗪農(nóng)(Diazinon)、殺螟硫磷 (Fenitrothion)、仲丁威(Fenobucarb)、久效磷(Monocrotophos)、丙硫克百威 (Benfuracarb)、噻嗪酮(Buprofezin)、呋蟲胺(Dinotefuran)、氟蟲腈(Fipronil)、吡蟲啉 (Imidacloprid),異丙威(Isoprocarb)、噻蟲啉(Thiacloprid)、環(huán)蟲酰胼 (Chromafenozide)、噻蟲啉(Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinotefuran)、可尼丁 (Clothianidin)、乙蟲清 ^thiprole)、氟蟲雙酰胺(Flubendiamide)、氯蟲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、啶蟲脒(Acetamiprid)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、 Cyazypyr> 艾克舌夂(Spinosad)、Spinotoram、因滅汀(Emamectin-Benzoate)、氯氰菊酉旨 (Cypermethrin)、毒死蜱(Chlorpyriphos)、殺螟丹(Cartap)、甲胺磷(Methamidophos)、醚菊酯 ^tofenprox)、三唑磷(Triazophos)、4_[ [ (6_ 氯吡啶-3-基)甲基](2，2_ 二氟乙基) 氨基]呋喃-2 (5H)-酮、克百威(Carbofuran)、丙硫克百威(Benfuracarb)水稻殺真菌劑 甲基硫菌靈(Thiophanate-methyl)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、環(huán)丙酰菌胺(Carpropamid)、 敵瘟磷(Edifenphos)、嘧菌腙(i^erimzone)、異稻瘟凈(Iprobenfos)、稻瘟靈 (Isoprothiolane)、戊菌隆(Pencycuron)、@菌靈(Probenazole)、P各(||麗(Pyroquilon) > 三環(huán)唑(Tricyclazole) J虧菌酯(Trifloxystrobin)、雙氯氰菌胺(Diclocymet)、氰菌胺 (Fenoxanil)、硅氟唑(Simeconazole)、噻酰菌胺(Tiadinil)；棉花除草劑敵草隆 (Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、甲基胂酸鈉(MSMA)、乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、撲草凈 (Prometryn)、氟樂靈(Trifluralin)、氟唑草酮(Carfentrazone)、烯草酮(Clethodim)、丁基吡氟禾草靈(Fluazifop-butyl)、草甘膦(Glyphosate)、氟草敏(Norflurazon)、二甲戊樂靈(Pendimethalin)、嘧草硫醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟啶磺隆 (Trifloxysulfuron)、得殺草(Tepraloxydim)、草銨膦(Glufosinate)、丙炔氟草胺 (Flumioxazin)、賽苯隆(Thidiazuron)棉花殺蟲劑乙酰甲胺磷(Ac印hate)、涕滅威 (Aldicarb)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯 (Deltamethrin) > 馬才立 ρτ ￠^ (Malathion) > X ^C ￠^ (Monocrotophos) > M M % (Abamectin) > Pg ^ 月米(Acetamiprid) > HjTctT (Emamectin Benzoate) > 口比 & 1# (Imidacloprid)、弗蟲威(Indoxacarb)、λ 氯氟氰菊酉旨(Lambda-CyhaIothriη)、艾克敵 (Spinosad)、硫雙威(Thiodicarb)、γ 氟氯氰菊酯(Gamma-Cyhalothrin)、螺甲螨酯 (Spiromesifen)、啶蟲丙醚(Pyridalyl)、氟啶蟲酰胺(Flonicamid)、氟蟲雙酰胺 (Flubendiamide)、殺鈴脲(Triflumuron)、氯蟲酰胺(Rynaxypyr)、β 氟氯氰菊酯 (Beta-Cyfluthrin)、螺蟲乙酯(Spirotetramat)、可尼丁 (Clothianidin)、噻蟲嗪 (Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、氟蟲雙酰胺 (Flubendiamide)、Cyazypyr> 艾克舌夂(Spinosad)、Spinotoram、γ 氟氯氰菊酉旨(gamma Cyhal0thrin)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃_2(5Η)_酮、硫雙威(Thiodicarb)、阿維菌素(Avermectin)、氟啶蟲酰胺(Flonicamid)、啶蟲丙醚 (Pyridalyl)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、氟啶蟲胺腈(Sulfoxaflor)、丙溴磷 (Profenophos)、三唑磷(Thriazophos)、硫丹(Endosulfan))棉花殺真菌劑氯嗶靈 (Etridiazole)、甲霜靈(Metalaxyl)、五氯硝基苯(Quintozene))大豆除草劑甲草胺 (Alachlor)、滅草松(Bentazone)、氟樂靈(Trifluralin)、氯嘧磺隆 (Chlorimuron-Ethyl)、氯酯磺草胺(Cloransulam-Methyl)、精惡唑禾草靈(Fenoxaprop)、 氟黃胺草醚(Fomesafen)、吡氟禾草靈(Fluazifop)、草甘膦(Glyphosate)、甲氧咪 (Imazamox)、滅草喹(Imazaquin)、咪草煙(Imazethapyr)、精異丙甲草胺 (S-Metolachlor)、嗪草酮(Metribuzin)、二甲戊樂靈(Pendimethalin)、得殺草 (Tepraloxydim),草銨膦(Glufosinate)大豆殺蟲劑λ氯氟氰菊酯 (Lambda-cyhalothrin)、滅多威(Methomyl)、對硫磷(Parathion)、硫雙滅多威 (Thiocarb)、吡蟲啉(Liiidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、啶蟲脒(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、氟蟲雙酰胺 (Flubendiamide)、氯蟲酉先胺(Rynaxypyr) > Cyazypyr、艾克舌夂(Spinosad)、Spinotoram、因滅汀(Emamectin-Benzoate)、氟蟲腈(Fipronil)、乙蟲清(Ethiprole)、溴氰菊酯 (Deltamethrin)、β 氟氯氰菊酯(β-Cyf luthrin)、γ-和 λ-氟氯氰菊酯(gamma and lambda Cyhalothrin)、4_[ [ (6_ 氯吡啶 _3_ 基)甲基](2，2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5H)-酮、螺蟲乙酯(Spirotetramat)、螺螨酯(Spinodiclofen)、殺鈴脲 (Triflumuron)、氟啶蟲酰胺(Flonicamid)、硫雙威(Thiodicarb)、β -氟氯氰菊酯 (beta-CyfIuthrin))大豆殺真菌劑嘧菌酉旨(Azoxystrobin)、環(huán)唾醇(Cyproconazole)、 氟環(huán)唑(Epoxiconazole)、粉唑醇(Flutriafol)、唑菌胺酯(Pyraclostrobin)、戊唑醇 (Tebuconazole)、月虧菌酉旨 CTrifloxystrobin)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、氟醚唑 (Tetraconazole))甜菜除草劑氯草敏(Chloridazon)、甜菜安(Desmedipham)、乙氧呋草黃(Ethofumesate)、甜安寧(Phenmedipham)、野麥畏(Triallate)、氯草啶(Clopyralid)、 吡氟禾草靈(Fluazifop)、環(huán)草定(Lenacil)、苯嗪草酮(Metamitron)、氯甲喹啉酸 (Quinmerac)、噻草酮(Cycloxydim)、氟胺磺隆(Triflusulfuron)、得殺草 (T印raloxydim)、精喹禾靈(Quizalofop)甜菜殺蟲劑吡蟲瞅(Liiidacloprid)、可尼丁 (Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、啶蟲脈(Acetamiprid)、 呋蟲胺(Dinetofuran)、溴氰菊脂(Deltamethrin)、β 氟氯氰菊酯(β -Cyfluthrin) ,γ/λ 三氟氯氰菊酯(gamma/lambda Cyhalothrin)、4_[ [ (6_ 氯吡啶 _3_ 基)甲基](2，2_ 二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5H)-酮、七氟菊酯(Tefluthrin)、氯蟲酰胺(Rynaxypyr)、Cyaxypyr、氟蟲腈(Fipronil)、克百威(Carbofuran)油菜除草劑二氯吡啶酸(Clopyralid)、禾草靈 (Diclofop)、吡氟禾草靈(Fluazifop)、草銨膦(Glufosinate)、草甘膦(Glyphosate)、氯吡草胺(Metazachlor)、氟樂靈(Trifluralin)、胺苯磺隆(Ethametsulfuron)、氯甲喹啉酸 (Quinmerac)、精喹禾靈(Quizalofop)、烯草酮(Clethodim)、得殺草(I^praloxydim))；廸菜殺真菌劑嘧菌酷(Azoxystrobin)、多菌靈(Carbendazim)、咯菌腈(Fludioxonil)、異菌脲(Iprodione)、咪鮮安(Prochloraz)、乙烯菌核利(Vinclozolin))油菜殺蟲劑克百威 (Carbofuran)、有機(jī)磷酸酯(Organophosphates)、擬除蟲菊酯(Pyrethroids)、噻蟲啉 (Thiacloprid)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、吡蟲啉(Imidacloprid)、可尼丁 (Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、啶蟲脈(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、 β -氟氯氰菊酯(β β -Cyfluthrin), Y / λ三氟氯氰菊酯、氟胺氰菊酯 (tau-Fluvaleriate)、乙蟲清(Ethiprole)、艾克敵(Spinosad)、Spinotoram、氟蟲雙酉先胺 (Flubendiamide)、氯蟲酰胺(Rynaxypyr)、Cyazypyr、4_[ [ (6_ 氯吡啶 _3_ 基)甲基](2， 2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)_酮。“病蟲害”(pest)包括但不限于昆蟲、真菌、細(xì)菌、線蟲、螨、蜱等。昆蟲害包括選自以下目的昆蟲鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(L印idoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、 虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特別是鞘翅目 (Coleoptera)、鱗翅目(I^pidoptera)和雙翅目(Diptera)。鞘翅目(Coleoptera)包括肉食亞目(Ad印haga)和多食亞目(Polyphaga)。肉食亞目(Adephaga)包括步甲總科(Caraboidea)和豉甲總科(Gyrinoidea)，多食亞目(Polyphaga)包括水龜甲總科(Hydrophiloidea)、隱翅甲總科(Staphylinoidea)、 花螢總科(Cantharoidea)、郭公甲總科(Cleroidea)、叩甲總科(Elateroidea)、 花甲總科(Dascilloidea)、泥甲總科(Dryopoidea)、丸甲總科(Byrrhoidea)、扁甲總科(Cucujoidea)、芫菁總科(Meloidea)、花蚤總科(Mordelloidea)、擬步甲總科 (Tenebrionoidea)、長蠢總禾斗(Bostrichoidea)、金龜子總禾斗(Scarabaeoidea)、天牛總禾斗 (Cerambycoidea)、葉甲總科(Chrysomeloidea)、和象甲總科(Curculionoidea)。步甲總科 (Caraboidea)包括虎甲科(Cicindelidae)，步甲科(Carabidae)和龍虱科(Dytiscidae)。 豉甲總科(Gyrinoidea)包括豉蟲科(Gyrinidae)。水龜甲總科(Hydrophiloidea)包括水龜甲科(Hydrophilidae)。隱翅甲總科(Staphylinoidea)包括葬甲科(Silphidae) 和隱翅甲科(Staphylinidae) 花螢總科(Cantharoidea)包括花螢科(Cantharidae) 和螢科(Lampyridae)。郭公甲總科(Cleroidea)包括郭公甲科(Cleridae)和皮蠢科(Dermestidae)。叩甲總科(Elateroidea)包括叩甲科(Elateridae)和吉丁甲科(Buprestidae)。扁甲總科(Cucujoidea)包括瓢蟲科(Coccinellidae)。芫菁總科(Meloidea)包括芫菁科(Meloidae)。擬步甲總科(Tenebrionoidea)包括擬步甲科 (Tenebrionidae)。金龜子總科(Scarabaeoidea)包括黑蜣科(Passalidae)和金龜子科 (Scarabaeidae)0天牛總禾斗(Cerambycoidea)包括天牛禾斗(Cerambycidae)0 葉甲總禾斗 (Chrysomeloidea)包括葉甲科(Chrysomelidae)。象甲總科(Curculionoidea)包括象甲禾斗(Curculionidae)禾口小蠹禾斗(Scolytidae)0雙翅目(Diptera)包括長角亞目(Nematocera)、短角亞目(Brachycera)和環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)。長角亞目(Nematocera)包括大蚊科(Tipulidae)、蛾蚋科 (Psychodidae)、4 禾斗(Culicidae) > (Ceratopogonidae) > M K (Chironomidae) > 蚋科(Simuliidae)、毛蚋科(Bibionidae)和癭蚋科(Cecidomyiidae)。短角亞目 (Brachycera)包括水虻科(Stratiomyidae)、it科(Tabanidae)、劍虻科(Therevidae)、 食蟲虻科(Asilidae)、擬蜂虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和長足虻科 (Dolichopodidae)。環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)包括無縫組(Aschiza)和有縫組 (Schizophora)。無縫組(Aschiza)包括蚤蠅科(Phoridae)、食蚜蠅科(Syrphidae)和眼蠅科(Conopidae)。有縫組(Schizophora)包括無瓣類(Acalyptratae)和有瓣類 (Calyptratae)。無瓣類(Acalyptratae)包括斑蠅科(Otitidae)、實(shí)蠅科(Tephritidae), 潛蠅科(Agromyzidae)和果蠅科(Drosophilidae)。有瓣類(Calyptratae)包括虱蠅科 (Hippoboscidae)、狂妮禾斗(Oestridae)、寄妮禾斗(Tachinidae)、花妮禾斗(Anthomyiidae)、家蠅科(Muscidae)、麗蠅科(Calliphoridae)和肉蠅科(Sarcophagidae)。鱗翅目(L印idoptera)包括鳳蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科 (Lycaenidae)、蛺蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科 (Hesperiidae)、天蛾禾斗(Sphingidae)、大香蛾禾斗(Saturniidae)、尺蛾禾斗(Geometridae)、 燈蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae) 和谷蛾科(Tineidae)。線蟲類包括例如根結(jié)、胞囊、和根腐線蟲等寄生線蟲，包括異皮線蟲屬 (Heterodera spp. )、*艮結(jié)線蟲屬(Meloidogyne spp.)、禾口球異皮線蟲屬(GloboderaSPP.)；尤其是各種胞囊類線蟲成員，包括但不限于大豆異皮線蟲(Heterodera glycines, soybean cyst nematode)(Heterodera schachtii，舌甘胃·
囊線蟲beet cyst nematode)、燕麥異皮線蟲(Heterodera avenae，燕麥胞囊線蟲cereal cyst nematode)、馬鈴暮金線蟲(Globodera rostochiensis)禾口馬鈴暮白線蟲(Globodera pailida,potato cyst nematodes)。豐艮冑舌失豆禾中(Pratylenchus spp.)。
針對主要作物的本發(fā)明昆蟲害包括玉米歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis， European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon，black cutworm)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea， corn earworm)；草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda， fall armyworm)；西南玉米桿草蟲冥(Diatraea grandiosella，southwestern corn borer)； 南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer)；小蔴螟 (Diatraea saccharalis, surgarcane borer) 5(Diabrotica virgifera,
western corn rootworm)；北部玉米根蟲(Diabrotica longicornis barberi, northern corn rootworm)；南部玉米根蟲(Diabrotica undecimpunctata howardi, southern corn rootworm)；梳爪口口頭蟲(Melanotus spp.，wireworms)；北方圓頭犀金龜(鱭贈) (Cyclocephala borealis，northern masked chafer) (white grub)；南方圓頭犀金龜(擠贈)(Cyclocephala immaculata，southern masked chafer) (white grub)；日本 HI3 金龜 (Popillia japonica, Japanese beetle) ；1 ^甲(Chaetocnema pulicaria, corn flea beetle)；玉米谷象(Sphenophorus maidis,maize billbug)；玉米溢管蟲牙(Rhopalosiphum maidis，corn leaf aphid)；玉米根蟲牙(Anuraphis maidiradicis，corn root aphid)； 麥長蟲舂(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；赤腳蚱蟲孟(Melanoplus femurrubrum，redlegged grasshopper)；遷移蚱蟲孟(Melanoplus sanguinipes，migratory grasshopper)；玉米禾中蟲黽(Hylemya platura，seedcorn maggot)；玉米斑潛蟲黽(Agromyza parvicornis, corn blot leafminer)；玉米黃呆 J馬(Anaphothrips obscrurus, grass thrips)；竊蟲義(Solenopsis milesta，thief ant) ；二斑葉螨(Tetranychus urticae， twospotted spider mite)高梁(斑禾草螟(ChiIo partellus，sorghum borer)；草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda，fall armyworm)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea, corn earworm)；南美玉米苗斑蟲冥(Elasmopalpus lignosellus， lesser cornstalk borer)；粒膚地老虎(Feltia subterranea，granulate cutworm)；擠贈(Phyllophaga crinita，white grub) ；Eleodes、ConoderusΛ 禾口 Aeolus spp. (wireworms)；禮足負(fù)泥蟲(OuIema melanopus， cereal leaf beetle)；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria， corn flea beetle)；玉米谷象(Sphenophorus maidis, maize billbug)；玉米溢管蟲牙(Rhopalosiphum maidis, corn leaf aphid)；蔴黃偽毛蟲牙(Sipha flava, yellow sugarcane aphid)；麥長蟲春(Blissus leucopterus leucopterus, chinch bug) ； 1岐(Contarinia sorghicola，sorghum midge)；朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus， carmine spider mite) ；二斑葉螨(Tetranychus urticae, twospotted spider mite)；企麥粘蟲(Pseudaletia unipunctata，army worm)；草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda， fall armyworm)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus，lesser cornstalk borer) ；Agrotis orthogonia，western cutworm ；南美玉米苗斑蟲冥(Elasmopalpus lignosellus， lesser cornstalk borer)；禮足負(fù)泥蟲(OuIema melanopus， cerealleaf beetle)；車軸草葉象蟲(Hypera punctata，clover leaf weevil)；南部玉米根蟲(Diabrotica undecimpunctata howardi, southern corn rootworm)；俄羅斯小麥蟲牙蟲(Russian wheat aphid)；麥二盆蟲牙(Schizaphis graminum，greenbug)；麥長管蟲牙 (Macrosiphum avenae，English grain aphid)；赤腳蚱蟲孟(Melanoplus femurrubrum， redlegged grasshopper)；長客頁負(fù)蟲皇(Melanoplus differentialis, differential grasshopper)；遷移炸蟲孟(Melanoplus sanguinipes，migratory grasshopper) ； M 森癭蚊(Mayetiola destructor，Hessian fly)；麥紅吸楽蟲(Sitodiplosis mosellana， wheat midge)；美洲麥禾干蟲黽(Meromyza americana，wheat stem maggot)；冬作禾中蟲黽 (Hylemya coarctata， wheat bulb fly)；煙草薊馬(Frankliniella fusca， tobacco thrips)；麥蓮蜂(Cephus cinctus，wheat stem sawfly)；有P金香瘤癭螨(Aceria tulipae， wheat curl mite):向曰葵:Suleima helianthana，sunflower bud moth ；向日葵斑螟 (Homoeosoma electellum，sunflower moth)；向日奏葉甲(zygogramma exclamationis, sunflower beetle)；胡蘿卜金龜(Bothyrus gibbosus，carrot beetle)；向日葵籽癭蚊 (Neolasioptera murtfeldtiana，sunflower seed midge)棉花煙芽夜蛾(Heliothis virescens，cotton budworm)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea，cotton bo 11 worm)；舌甘菜夜娥(Spodoptera exigua，beet armyworm)；棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella, pink bo 11 worm)；棉鈴象甲(Anthonomus grandis，boll weevil)；棉蟲牙(Aphis gossypii, cotton aphid)；棉跳盲蟲舂(Pseudatomoscelis seriatus，cotton fleahopper)；結(jié)翅粉風(fēng)(Trialeurodes abutilonea, bandedwinged whitefly)；牧草盲蟲舂(Lygus lineolaris， tarnished plant bug)；赤I^Pi^M (Melanoplus femurrubrum, redlegged grasshopper)； 長客頁負(fù)蟲皇(Melanoplus differentialis，differential grasshopper)；棉薊馬(Thrips tabaci, onion thrips)；煙草薊馬(Franklinkiella fusca, tobacco thrips)；朱砂葉螨 (Tetranychus cinnabarinus，carmine spider mite) ；二斑葉螨(Tetranychus urticae， twospotted spider mite)水禾因小鹿蟲冥(Diatraea saccharalis，sugarcane borer)；草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda, fall armyworm)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea, corn earworm)；葡萄銷卩十甲(Colaspis brunnea, grape colaspis)；稻象甲(Lissorhoptrus oryzophilus, rice water weevil)；米象(Sitophilus oryzae, rice weevil) ； M 尾葉蝶(Nephotettix nigropictus，rice leafhopper)；麥長蟲舂(Blissus leucopterus leucopterus，chinch bug)；喜綠椿(Acrosternum hilare，green stink bug)大豆大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens，soybean looper)；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis， velvet bean caterpillar)；苜猜綠夜蛾(Plathypena scabra，green cloverworm)；歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis，European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon， black cutworm)；舌甘菜夜蛾(Spodoptera exigua, beet armyworm)；煙芽夜蛾(Heliothis virescens, cotton budworm)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea, cotton bo 11 worm)；墨西哥豆票瓜蟲(Epilachna varivestis, Mexican bean beetle)；桃蟲牙(Myzus persicae， green peach aphid)；香豆小綠葉蝶(Empoasca fabae，potato leafhopper)；喜綠椿(Acrosternum hilare, green stink bug)；赤腳蚱蟲孟(Melanoplus femurrubrum， redlegged grasshopper)；長客頁負(fù)蟲皇(Melanoplus differentialis, differential grasshopper)；玉米禾中蟲黽(Hylemya platura，seedcorn maggot)；大豆薊馬(Sericothripsvariabilis, soybean thrips) ；^0^1 (Thrips tabaci, onion thrips) ；土耳gJifiB 卩十蟲菌(Tetranychus turkestani, strawberry spider mite) ；二斑卩十蟲菌(Tetranychus urticae, twospotted spider mite)大麥歐該十|玉米蟲冥(Ostrinia nubilalis, European corn borer)；小地老虎(Agrotis ipsilon, black cutworm)；麥二盆蟲牙(Schizaphis graminum, greenbug)；麥長蟲春(Blissus leucopterus leucopterus, chinch bug)；喜綠椿(Acrosternum hilare, green stink bug)；褐臭蟲春(Euschistus servus, brown stink bug) ^ftfeftM (Delia platura, seedcorn maggot) ； 11: (Mayetiola destructor, Hessian fly)；麥巖螨(Petrobia Iatens,brown wheat mite)油菜甘藍(lán)蟲牙(Brevicoryne brassicae, cabbage aphid) ；甲(Phyllotreta cruciferae, Flea beetle) ；^ _ Jil (Mamestra configurata, Bertha armyworm) ； zj、胃 _ (Plutella xylostella, Diamond-back moth)；根蛆(Root maggots),地禾中蠅屬(Delia ssp.)。用于提高植物產(chǎn)量的方法本發(fā)明提供了用于提高植物產(chǎn)量的方法。該方法包括提供表達(dá)編碼本文公開的殺病蟲害多肽序列的多核苷酸的植物或植物細(xì)胞，以及在受病蟲害侵襲的田地中種植該植物或其種子，其中所述多肽對所述病害蟲具有殺病蟲害活性。在一些實(shí)施方案中，多肽具有抗鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目、或線蟲類害蟲的殺病蟲害活性，且所述田地被鱗翅目、半翅目、鞘翅目、雙翅目或線蟲類害蟲侵襲。本文所定義的植物的“產(chǎn)量”是指植物所生產(chǎn)的生物質(zhì)的質(zhì)量和/或數(shù)量?！吧镔|(zhì)”是指任何測量的植物產(chǎn)物。生物質(zhì)生產(chǎn)的增加是在所測量的植物產(chǎn)物的產(chǎn)量上的任何提高。提高植物產(chǎn)量具有幾種商業(yè)用途。例如，增加植物葉生物質(zhì)可以提高用于人類或動物食用的葉類蔬菜的產(chǎn)量。此外，增加植物葉生物質(zhì)可以被用于提高植物來源的醫(yī)藥或工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量。產(chǎn)量的提高可以包括任何統(tǒng)計(jì)上顯著的增加，包括但不限于，比不表達(dá)該殺病蟲害序列的植物，產(chǎn)量增加至少1%、至少3%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、 至少50%、至少70%、至少100%或更多。在特定的方法中，由于表達(dá)本文所公開的殺病蟲害蛋白的植物的病害蟲抗性增強(qiáng)而使植物的產(chǎn)量得到了提高。殺病蟲害蛋白的表達(dá)導(dǎo)致病害蟲侵襲或采食植物的能力降低，因此提高了植物的產(chǎn)量。本文提供了以下實(shí)施例，這些實(shí)施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行舉例說明而不是旨在對其進(jìn)行限制。
實(shí)施例實(shí)施例1、新基因的鑒別使用諸如以下的方法，叢描述的細(xì)菌菌株中鑒定新的殺病蟲害基因。方法一-從包含典型地?cái)y帶δ-內(nèi)毒素基因的質(zhì)粒的菌株中制備染色體外DNA-機(jī)械切割染色體外DNA以產(chǎn)生不同大小分布的片段-克隆約2Kb至約IOKb的染色體外DNA片段-生長出該染色體外DNA的約1500個(gè)克隆-使用對克隆載體特異的引物，對該1500個(gè)克隆進(jìn)行部分測序(末端讀序(end
2權(quán)利要求
1.一種重組核酸分子，該重組核酸分子包含編碼具有殺病蟲害活性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自a)SEQ ID NO :2，1，3，4或5之任一所示的核苷酸序列；b)編碼包含SEQID NO :7,6,8,9,10或11之任一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及c)編碼包含與SEQID NO :7-11之任一的氨基酸序列具有至少95%的序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列是已經(jīng)被設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的合成序列。
3.權(quán)利要求2的重組核酸分子，其中所述序列如SEQID NO :12- 之任一所示。
4.權(quán)利要求1的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列被可操作地連接到能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)所述核苷酸序列表達(dá)的啟動子上。
5.包含權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
6.權(quán)利要求5的載體，該載體還包含編碼異源多肽的核酸分子。
7.包含權(quán)利要求5的載體的宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為細(xì)菌宿主細(xì)胞。
9.權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
10.包含權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。
11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、高粱、小麥、甘藍(lán)、向日葵、西紅柿、十字花科植物、辣椒、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。
12.包含權(quán)利要求1的核酸分子的轉(zhuǎn)基因種子。
13.具有殺病蟲害活性的重組多肽，其選自a)包含SEQID NO :7，6，8，9，10或11之任一的氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQID NO :7-11之任一的氨基酸序列具有至少95%的序列一致性的氨基酸序列的多肽；以及c)由SEQID NO :2，1，3，4或5之任一編碼的多肽。
14.權(quán)利要求13的多肽，該多肽還包含異源氨基酸序列。
15.包含權(quán)利要求13的重組多肽的組合物。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述組合物選自粉、粉末、小球、顆粒、噴劑、乳劑、膠體、以及溶液。
17.權(quán)利要求15的組合物，其中所述組合物通過對細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行脫水、凍干、勻漿、提取、過濾、離心、沉淀或濃縮來制備。
18.權(quán)利要求15的組合物，該組合物包含以重量計(jì)約至99%的所述多肽。
19.控制鱗翅目、鞘翅目、異翅目、線蟲類、或雙翅目害蟲群體的方法，包括以權(quán)利要求 13的多肽的有效殺病蟲害量接觸所述群體。
20.滅殺鱗翅目、鞘翅目、異翅目、線蟲類、或雙翅目害蟲的方法，包括以權(quán)利要求13的多肽的有效殺病蟲害量接觸所述害蟲或飼喂所述害蟲。
21.生產(chǎn)具殺病蟲害活性的多肽的方法，包括在編碼多肽的核酸分子表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞。
22.具有穩(wěn)定整合到其基因組中的DNA構(gòu)建體的植物，其中的DNA構(gòu)建體包含編碼具有殺病蟲害活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自a)SEQ ID NO :2，1，3，4，或5之任一所示的核苷酸序列;b)編碼包含SEQID NO :7，6，8，9，10，或11之任一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及c)編碼包含與SEQID NO :7-11之任一的氨基酸序列具有至少95%的序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；其中所述核苷酸序列被可操作地連接到在植物細(xì)胞中驅(qū)動編碼序列表達(dá)的啟動子上。
23.權(quán)利要求22的植物，其中所述植物為植物細(xì)胞。
24.用于植物防病蟲害的方法，包括在植物或其細(xì)胞中表達(dá)編碼殺病蟲害多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自a)SEQ ID NO :2，1，3，4，或5之任一所示的核苷酸序列;b)編碼包含SEQID NO :7，6，8，9，10，或11之任一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及c)編碼包含與SEQID NO :7-11之任一的氨基酸序列具有至少95%的序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述植物產(chǎn)生對鱗翅目、鞘翅目、異翅目、線蟲類、或雙翅目害蟲具有殺病蟲害活性的殺病蟲害多肽。
26.提高植物產(chǎn)量的方法，包括在田地中種植具有穩(wěn)定整合到其基因組的DNA構(gòu)建體的植物或該植物的種子，其中的DNA構(gòu)建體包含編碼具有殺病蟲害活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自a)SEQ ID NO :2，1，3，4，或5之任一所示的核苷酸序列；b)編碼包含SEQID N0:7，6，8，9，10，或11之任一的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及c)編碼包含與SEQID NO :7-11之任一的氨基酸序列具有至少95%的序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；其中所述田地被病蟲害侵襲，其中所述多肽對該病蟲害具有殺病蟲害活性。
全文摘要
本發(fā)明提供賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子殺病蟲害活性的組合物和方法。提供包含δ-內(nèi)毒素多肽的編碼序列的組合物。該編碼序列可以用于DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中以在植物和細(xì)菌中轉(zhuǎn)化和表達(dá)。組合物也包含轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。本發(fā)明尤其提供了分離的δ-內(nèi)毒素核酸分子。此外，本發(fā)明還涵蓋該多核苷酸對應(yīng)的氨基酸序列、以及特異地結(jié)合到這些氨基酸序列上的抗體。本發(fā)明尤其提供了分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼SEQ ID NO6-11所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或SEQ ID NO1-5所示的核苷酸序列、以及它們的變體和片段。
文檔編號C07K14/325GK102421792SQ201080020476
公開日2012年4月18日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者C·L·彼得斯, D·J·湯姆索, M·G·科茲爾, N·B·達(dá)克, N·卡羅茲, R·德特爾, S·L·沃爾拉斯, T·哈吉斯 申請人:阿森尼克斯公司