專利名稱：雙特異性抗原結(jié)合蛋白的制作方法
雙特異性抗原結(jié)合蛋白本發(fā)明涉及雙特異性抗原結(jié)合蛋白、其生成方法、含有所述抗體的藥物組合物、及其用途。
背景技術(shù)：
經(jīng)工程化改造的蛋白質(zhì)，諸如能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的雙或多特異性抗體是本領(lǐng)域中已知的。可以使用細(xì)胞融合、化學(xué)綴合、或重組DNA技術(shù)來(lái)生成此類多特異性結(jié)合蛋白。最近已經(jīng)開(kāi)發(fā)出極其多種重組多特異性抗體形式，例如通過(guò)融合例如IgG抗體形式和單鏈域得到的四價(jià)雙特異性抗體(參見(jiàn)例如Coloma，M.J.等， Nature Biotech. 15(1997) 159-163 ；WO 2001/077342 ； R Morrison, S. L. ， Nature Biotech. 25(2007) 1233-1234)。還有，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的數(shù)種其它不再保留抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的新形式，諸如雙抗體、三抗體或四抗體、微型抗體、數(shù)種單鏈形式(scFv、雙-scFv) (Holliger，P.等，Nature Biotech 23(2005) 1126-1136 ； Fischer, N.禾口 Leger，0.，Pathobiology 74(2007)3—14 ；Shen, J.等，J. Immunol. Methods 318(2007)65-74 ;Wu，C.等，NatureBiotech 25(2007) 1290-1297)。所有此類形式使用接頭來(lái)融合抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與別的結(jié)合蛋白(例如scFv)或者融合例如兩個(gè)Fab片段或scFv (Fischer，N.和L6ger，0.，Pathobiology 74(2007)3-14)。雖然接頭在工程化改造雙特異性抗體方面具有優(yōu)點(diǎn)是明顯的，但是它們還可以引起治療背景中的問(wèn)題。實(shí)際上，這些外來(lái)肽可以引發(fā)針對(duì)接頭自身或蛋白質(zhì)與接頭間的接合的免疫應(yīng)答。此外，這些肽的柔性性質(zhì)使它們更易于蛋白水解切割，這潛在地導(dǎo)致較差的抗體穩(wěn)定性、聚集和升高的免疫原性。另外，可能想要保留效應(yīng)器功能，諸如例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)，其是經(jīng)由Fc部分通過(guò)維持與天然存在的抗體的高度相似性來(lái)介導(dǎo)的。如此，理想地，應(yīng)當(dāng)旨在開(kāi)發(fā)在一般結(jié)構(gòu)上與天然存在的抗體(如IgA、IgD、IgE、 IgG或IgM)非常相似的雙特異性抗體，其與人序列具有最小的偏離。在一種方法中，已經(jīng)使用四源雜交瘤(quadroma)技術(shù)(參見(jiàn)Milstein，C.和 Cuello,A. C. ,Nature 305(1983)537-540)來(lái)生成與天然抗體非常類似的雙特異性抗體，所述四源雜交瘤技術(shù)基于兩種不同的表達(dá)具有期望的雙特異性抗體特異性的鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的體細(xì)胞融合。由于所得的雜合-雜交瘤(或四源雜交瘤)細(xì)胞系內(nèi)的兩種不同抗體重鏈和輕鏈的隨機(jī)配對(duì)，生成多達(dá)10種不同抗體種類，其中僅一種是期望的功能性雙特異性抗體。由于錯(cuò)配副產(chǎn)物的存在和顯著降低的生產(chǎn)產(chǎn)量，意味著需要復(fù)雜的純化規(guī)程(參見(jiàn)例如 Morrison，S. L.，Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234)。一般地，若使用重組表達(dá)技術(shù)，則仍存在相同的錯(cuò)配副產(chǎn)物問(wèn)題。一種避開(kāi)錯(cuò)配副產(chǎn)物問(wèn)題的方法(其稱為“隆突-入-穴(knob-into-hole)”) 旨在通過(guò)將突變引入CH3域中來(lái)修飾接觸界面，從而迫使兩種不同抗體重鏈配對(duì)。在一條鏈上，用具有較短側(cè)鏈的氨基酸替換體積大的氨基酸以創(chuàng)建“穴”。相反地，將具有較大側(cè)鏈的氨基酸引入另一種CH3域中，以創(chuàng)建“隆突”。通過(guò)共表達(dá)這兩種重鏈(和兩條相同的輕鏈，其必須適合于這兩種重鏈)，觀察到異二聚體形成(“隆突_穴”)相對(duì)于同二聚體形成 (“穴-穴”或“隆突 _ 隆突”)的高產(chǎn)量(Ridgway，J. B.，Protein Eng. 9 (1996) 617-621 ； 及TO96/027011)。可以通過(guò)使用噬菌體展示法來(lái)重建兩種CH3域的相互作用表面并引入二硫橋以穩(wěn)定化異二聚體來(lái)進(jìn)一步提高異二聚體的百分比(MerchantA. M等，Nature Biotech 16(1998)677-681 ；Atwel 1, S.等，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)。關(guān)于隆突-入-穴技術(shù)的新方法記載于例如EP 1870459A1。雖然此形式似乎非常有吸引力，但是目前不可獲得描述通向臨床的進(jìn)展的數(shù)據(jù)。此策略的一種重要的約束是兩種親本抗體的輕鏈必須相同，以阻止錯(cuò)配和無(wú)活性分子的形成。如此，此技術(shù)不適合于容易地開(kāi)發(fā)自針對(duì)第一和第二抗原的兩種抗體起始的針對(duì)兩種抗原的重組雙特異性抗體，因?yàn)檫@些抗體的重鏈和/或相同的輕鏈必須是優(yōu)化的。另一種避開(kāi)制備雙特異性抗體中的錯(cuò)配副產(chǎn)物的問(wèn)題的方法是通過(guò)使用特異性結(jié)合第一抗原并且已經(jīng)將特異性結(jié)合第二抗原的兩個(gè)融合的Fab片段與其重鏈N端融合的全長(zhǎng)抗體來(lái)從異二聚體轉(zhuǎn)變成同二聚體，如記載于例如W02001/077342的。此策略的一個(gè)重要的缺點(diǎn)是通過(guò)全長(zhǎng)抗體的輕鏈與Fab片段的CHl-VH域錯(cuò)配及通過(guò)Fab片段輕鏈與全長(zhǎng)抗體的CHl-VH域的錯(cuò)配形成不想要的無(wú)活性副產(chǎn)物。WO 2006/093794涉及異二聚蛋白結(jié)合組合物。WO 99/37791描述了多用途抗體衍生物。Morrison，S.，L.等 the J. Immunolog，160 (1998) 2802-2808 指出可變區(qū)域交換對(duì) IgG功能特性的影響。發(fā)明概述本發(fā)明包含雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其包含a)抗體的兩條輕鏈和兩條重鏈，所述抗體特異性結(jié)合第一抗原并包含兩個(gè)Fab片段；b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的兩個(gè)額外的Fab片段，其中所述額外的Fab片段經(jīng)由肽連接頭在a)的重鏈或輕鏈的C或N端融合；且其中在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，或者在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，禾口/ 或恒定域CL和CHl彼此替換，ii)在a)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，及恒定域CL和CHl彼此替換，且在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，或恒定域CL和CHl彼此替換，
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iii)在a)的兩個(gè)Fab片段中，
可變域VL和VH彼此替換，或恒定域CL和CHl彼此替換，且在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，及恒定域CL和CHl彼此替換，iv)在a)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，且在b)的兩個(gè)Fab片段中，恒定域CL和CHl彼此替換，或ν)在a)的兩個(gè)Fab片段中，恒定域CL和CHl彼此替換，且在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是一種用于制備依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的方法，包括下列步驟a)用包含編碼依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，b)在容許所述抗體分子合成的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；并c)自所述培養(yǎng)物回收所述抗體分子。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是宿主細(xì)胞，其包含包含編碼依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的核酸分子的載體。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是藥物組合物，其包含依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白和至少一種藥學(xué)可接受賦形劑。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是一種用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于對(duì)所述患者施用治療有效量的依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白。依照本發(fā)明，可以通過(guò)替換a)特異性結(jié)合第一抗原的全長(zhǎng)抗體的Fab片段中和/ 或b)兩個(gè)額外的融合的Fab片段中的某些域來(lái)改善想要的雙特異性抗原結(jié)合蛋白與不想要的副產(chǎn)物相比的比率。這樣，可以降低輕鏈與錯(cuò)誤的CHl-VH域的不想要的錯(cuò)配。發(fā)明詳述本發(fā)明包含雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其包含a)抗體的兩條輕鏈和兩條重鏈，所述抗體特異性結(jié)合第一抗原并包含兩個(gè)Fab片段；
b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的兩個(gè)額外的Fab片段，其中所述額外的Fab片段經(jīng)由肽連接頭與a)的重鏈的C或N端融合；且其中在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，或者在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，和 / 或恒定域CL和CHl彼此替換，ii)在a)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，及恒定域CL和CHl彼此替換，且在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，或恒定域CL和CHl彼此替換，iii)在a)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，或恒定域CL和CHl彼此替換，且在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，及恒定域CL和CHl彼此替換，iv)在a)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，且在b)的兩個(gè)Fab片段中，恒定域CL和CHl彼此替換，或ν)在a)的兩個(gè)Fab片段中，恒定域CL和CHl彼此替換，且在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于所述額外的Fab片段經(jīng)由肽連接頭與a)的重鏈的C端，或a)的重鏈的N端融合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于
所述額外的Fab片段經(jīng)由肽連接頭與a)的重鏈的C端融合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于所述額外的Fab片段經(jīng)由肽連接頭與a)的重鏈的N端融合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，或者在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，禾口 / 或恒定域CL和CHl彼此替換。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，禾P/或恒定域CL和CHl彼此替換。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，恒定域CL和CHl彼此替換。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在b)的兩個(gè)Fab片段中，可變域VL和VH彼此替換，禾口/ 或恒定域CL和CHl彼此替換。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在b)的兩個(gè)Fab片段中，恒定域CL和CHl彼此替換。依照本發(fā)明，可以通過(guò)替換a)特異性結(jié)合第一抗原的全長(zhǎng)抗體的Fab片段中和/ 或b)兩個(gè)額外的融合的Fab片段中的某些域來(lái)降低想要的雙特異性抗原結(jié)合蛋白與不想要的副產(chǎn)物(由于輕鏈與錯(cuò)誤的CHl-VH域的錯(cuò)配所致)相比的比率。在此背景中的錯(cuò)配意指i)a)下的全長(zhǎng)抗體的輕鏈與b)下的Fab片段的CHl-VH域；或ii)b)下的Fab片段的輕鏈與a)下的全長(zhǎng)抗體的CHl-VH域的結(jié)合(參見(jiàn)圖3)，這導(dǎo)致不想要的無(wú)活性或沒(méi)有完整功能的副產(chǎn)物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”意指由兩條抗體重鏈和兩條抗體輕鏈組成的全長(zhǎng)抗體(參見(jiàn)

圖1)。全長(zhǎng)抗體的重鏈?zhǔn)且訬端至C端方向由抗體重鏈可變域(VH)、抗體重鏈恒定域I(CHl)、抗體鉸鏈區(qū)(HR)、抗體重鏈恒定區(qū)2 (CH2)、和抗體重鏈恒定域3 (CH3)(縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3)；和任選地抗體重鏈恒定域4 (CH4)(在亞類IgE的抗體的情況中)
9組成的多肽。優(yōu)選地，全長(zhǎng)抗體的重鏈?zhǔn)且訬端至C端方向由VH、CH1、HR、CH2和CH3組成的多肽。全長(zhǎng)抗體的輕鏈?zhǔn)且訬端至C端方向由抗體輕鏈可變域(VL)、和抗體輕鏈恒定域 (CL)組成的多肽，縮寫為VL-CL。抗體輕鏈恒定域(CL)可以是κ (卡帕)或λ (拉姆達(dá))。 抗體鏈經(jīng)由CL域與CHl域間(S卩，輕鏈與重鏈間)及全長(zhǎng)抗體重鏈的鉸鏈區(qū)間的多肽間二硫鍵連接在一起。典型的全長(zhǎng)抗體的例子是天然抗體，如IgG(例如IgGl和IgG2)、IgM、 IgA、IgD、和IgE)。依照本發(fā)明的抗體可以來(lái)自單一物種，例如人，或者它們可以是嵌合的或人源化的抗體。依照本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體包含兩個(gè)各自通過(guò)一對(duì)VH和VL形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)，它們都特異性結(jié)合同一(第一)抗原。所述全長(zhǎng)抗體的重鏈或輕鏈的C端表示所述重鏈或輕鏈的C端的最后一個(gè)氨基酸。所述抗體包含兩個(gè)相同的Fab片段，其由重鏈的VH 和CHl域和輕鏈的VL和CL域組成。(參見(jiàn)圖1和圖2)。 特異性結(jié)合第二抗原的抗體的“額外的Fab片段”(參見(jiàn)圖2)指由所述第二抗體的重鏈的VH和CHl域和輕鏈的VL和CL域組成的別的Fab片段。額外的Fab片段經(jīng)由重鏈部分(CHl或VH域)以其未修飾的形式(參見(jiàn)圖3)與特異性結(jié)合第一抗原的抗體的重鏈或輕鏈的C或N端融合。 如本發(fā)明內(nèi)所使用的，術(shù)語(yǔ)“肽連接頭”意指具有氨基酸序列的肽，其優(yōu)選地是合成起源的。使用依照本發(fā)明的這些肽連接頭來(lái)將抗原結(jié)合肽與全長(zhǎng)和/或經(jīng)修飾的全長(zhǎng)抗體鏈的C或N端融合以形成依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白。優(yōu)選地，c)下的所述肽連接頭是具有氨基酸序列的肽，具有至少5個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，優(yōu)選地具有5至100，更優(yōu)選地10至50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽連接頭是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G =甘氨酸，S =絲氨酸，且(χ = 3，n = 3、4、5或6，且m = 0、1、2或3)或(χ = 4，η = 2、3、4或5且m = 0、1、2或3)，優(yōu)選地χ = 4禾口 η = 2或3，更優(yōu)選地，其中χ = 4，η = 2。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽連接頭是(G4S)2。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合位點(diǎn)，，或“抗原結(jié)合位點(diǎn)，，意指依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白中實(shí)際上與配體(例如，抗原或其抗原片段)結(jié)合并且自抗體分子或其片段(例如Fab片段)衍生的區(qū)域。依照本發(fā)明的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含抗體重鏈可變域(VH)和抗體輕鏈可變域(VL)。特異性結(jié)合想要的抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)(即，VH/VL對(duì))可以a)自針對(duì)抗原的已知抗體或者b)自通過(guò)使用抗原蛋白或核酸或其片段等通過(guò)重新免疫方法或者通過(guò)噬菌體展示獲得的新抗體或抗體片段衍生。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)含有6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其以不同程度促成結(jié)合位點(diǎn)對(duì)抗原的親和力。存在著3個(gè)重鏈可變域⑶R(⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3)和 3個(gè)輕鏈可變域⑶R(⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3)。通過(guò)與匯編的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較來(lái)確定 CDR和框架區(qū)(FR)的范圍，在所述數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)依照序列間的可變性限定那些區(qū)域。抗體特異性指抗體或抗原結(jié)合蛋白對(duì)抗原的特定表位的選擇性識(shí)別。例如，天然抗體是單特異性的。雙特異性抗體是具有兩種不同抗原結(jié)合特異性的抗體。在抗體具有超過(guò)一種特異性的情況中，識(shí)別的表位可以與單一抗原或者與超過(guò)一種抗原有關(guān)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“單特異性”抗體或抗原結(jié)合蛋白意指具有一個(gè)或多個(gè)各自結(jié)合同一抗原的同一表位的結(jié)合位點(diǎn)的抗體或抗原結(jié)合蛋白。如本申請(qǐng)內(nèi)所使用的，術(shù)語(yǔ)“價(jià)”意指抗體分子中存在規(guī)定數(shù)目的結(jié)合位點(diǎn)。例如天然抗體或依照本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且是二價(jià)的。術(shù)語(yǔ)“四價(jià)”意指抗原結(jié)合蛋白中存在四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“四價(jià)、雙特異性”意指具有四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且其中兩個(gè)結(jié)合另一種抗原(或抗原的另一種表位)的依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白具有四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且是四價(jià)的。本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體包含一種或多種免疫球蛋白類別的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白類別包括IgG、IgM、IgA、IgDjP IgE同種型及在IgG和IgA的情況中包括其亞型。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的全長(zhǎng)抗體具有IgG型抗體的恒定域結(jié)構(gòu)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指單一氨基酸組成的抗體制備物或抗體或抗原結(jié)合蛋白分子。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指包含來(lái)自一種來(lái)源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)和至少自不同來(lái)源或物種衍生的恒定區(qū)的一部分的抗體，其通常通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)制備。包含鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體是優(yōu)選的。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是那些其中的恒定區(qū)已經(jīng)自初始抗體的恒定區(qū)修飾或改變以生成依照本發(fā)明的特性(特別地關(guān)于Clq結(jié)合/或Fc受體(FcR)結(jié)合)的。此類嵌合抗體又稱為“類別轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段的表達(dá)免疫球蛋白基因的產(chǎn)物。用于生成嵌合抗體的方法牽涉常規(guī)的重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，其是本領(lǐng)域中公知的。參見(jiàn)例如 Morrison，S.，L.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)6851-6855; US 5，202，238 和 US 5,204,244。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指其中的框架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(OTR)已經(jīng)進(jìn)行過(guò)修飾以包含與親本免疫球蛋白的特異性相比不同特異性的免疫球蛋白CDR的抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將鼠CDR嫁接入人抗體的框架區(qū)中以制備“人源化抗體”。參見(jiàn)例如Riechmarm， L.等，Nature 332 (1988) 323-327 ；及 Neuberger，Μ· S.等，Nature 314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDR對(duì)應(yīng)于那些代表識(shí)別上文關(guān)于嵌合抗體所記錄的抗原的序列的。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是那些其中的恒定區(qū)已經(jīng)另外自初始抗體的恒定區(qū)進(jìn)行過(guò)修飾或改變以生成依照本發(fā)明的特性(特別地關(guān)于Clq結(jié)合/或Fc受體(FcR)結(jié)合)的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“人抗體”意圖包括具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk,Μ. Α.和van de Winkel, J.G·，Curr.Opin.Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。還可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中生成人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在免疫后能夠在沒(méi)有內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況中生成人抗體的完整全集或選集。在此類種系突變體小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列會(huì)導(dǎo)致抗原考驗(yàn)后人抗體的生成(參見(jiàn)例如Jakobovits，Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555 Jakobovits, Α.等，Nature 362(1993)255-258 ；Brueggemann, Μ.等，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。還可以在噬菌體展示文庫(kù)中生成人抗體 (Hoogenboom, H. R.和 Winter，G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.等，J. Mol. Biol. 222(1991)581-597)。Cole等及Boerner等的技術(shù)還可用于制備人單克隆抗體(Cole， S. , P. , C.等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985) 77-96 ； 及Boerner，P.等，J. Immunol. 147(1991)86-95)。如已經(jīng)關(guān)于依照本發(fā)明的嵌合的和人源化的抗體所提及的，如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“人抗體”還包含此類如下的抗體，其在恒定區(qū)中進(jìn)行修飾以生成依照本發(fā)明的特性(特別地關(guān)于Clq結(jié)合/或FcR結(jié)合)，例如通過(guò)“類別轉(zhuǎn)換”，即Fc部分的變化或突變(例如自IgGl至IgG4和/或IgGl/IgG4突變)來(lái)實(shí)現(xiàn)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”意圖包括通過(guò)重組手段制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的所有人抗體，諸如自宿主細(xì)胞諸如NSO或CHO細(xì)胞或自人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)分離的抗體或使用轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。此類重組人抗體具有重排形式的可變區(qū)和恒定區(qū)。依照本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)進(jìn)行過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞高突變。如此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是如下的序列，其盡管自人種系VH 和VL序列衍生和與之相關(guān)，但是可以不在體內(nèi)的人抗體種系全集內(nèi)天然存在。如本文中所使用的，“可變域”(輕鏈可變域(VL)、重鏈可變域(VH))意指直接牽涉抗體對(duì)抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈。人輕鏈和重鏈可變域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，并且每個(gè)域包含通過(guò)3個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)連接的4個(gè)序列廣泛保守的框架(FR)區(qū)。 框架區(qū)采用β-片層構(gòu)象，而⑶R可以形成連接β-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的⑶R通過(guò)框架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)，并且與來(lái)自另一條鏈的CDR—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在依照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中發(fā)揮特別重要的作用，并且因此提供本發(fā)明的又一個(gè)目的。術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”在本文中使用時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基?！翱蚣堋被颉癋R”區(qū)是那些與如本文中定義的高變區(qū)殘基不同的可變域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈包含N至C 端的域FR1、⑶R1、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、和FR4。每條鏈上的⑶R被此類框架氨基酸分開(kāi)。 特別地，重鏈的⑶R3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域。依照Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義來(lái)確定CDR和FR區(qū)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指在體外測(cè)定法中，優(yōu)選地在使用純化的野生型抗原的等離振子共振測(cè)定法(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 中抗體對(duì)抗原表位的結(jié)合。通過(guò)術(shù)語(yǔ)ka(來(lái)自抗體/抗原復(fù)合物的抗體(或抗體或抗原結(jié)合蛋白)的結(jié)合速率常數(shù))、kD(解離常數(shù))、和KD(kD/ka)來(lái)限定結(jié)合親和力。結(jié)合或特異性結(jié)合意指10_8mol/l或更小，優(yōu)選地10_9M至10_13mol/l的結(jié)合親和力(Kd)。如此，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白以10_8mol/l或更小，優(yōu)選地10_9M至10_13mol/l的結(jié)合親和力(Kd)特異性結(jié)合其對(duì)之特異性的每種抗原?？梢酝ㄟ^(guò)BIAcore 測(cè)定法(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)來(lái)調(diào)查抗體對(duì) FcyRIII的結(jié)合。通過(guò)術(shù)語(yǔ)ka(來(lái)自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的結(jié)合速率常數(shù))、kD(解離常數(shù))、和KD(kD/ka)來(lái)限定結(jié)合親和力。術(shù)語(yǔ)“表位”包括能夠與抗體特異性結(jié)合的任何多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中， 表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面聚組，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；?、或磺?；⑶以谀承?shí)施方案中可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和/或特定的電荷特征。表位是抗原中被抗體結(jié)合的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，在抗體優(yōu)先識(shí)別其在蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中的靶抗原時(shí)，其被說(shuō)成特異性結(jié)合抗原。在又一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于所述全長(zhǎng)抗體是人IgGl亞類的，或具有突變L234A和L235A的人IgGl亞類的。
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在又一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于所述全長(zhǎng)抗體是人IgG2亞類的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于所述全長(zhǎng)抗體是人IgG3亞類的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于所述全長(zhǎng)抗體是人IgG4亞類的，或具有額外的突變S228P的人IgG4亞類的。優(yōu)選地，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的特征在于所述全長(zhǎng)抗體是人IgGl 亞類的，具有額外的突變S228P的人IgG4亞類的?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白具有改善的特征，諸如生物學(xué)或藥理學(xué)活性、藥動(dòng)學(xué)特性或毒性。它們可以例如用于治療疾病諸如癌癥。如本申請(qǐng)內(nèi)所使用的，術(shù)語(yǔ)“恒定區(qū)”意指抗體中與可變區(qū)不同的域的總和。恒定區(qū)不直接牽涉抗原的結(jié)合，但是展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體分成類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些中的數(shù)種可以進(jìn)一步分成亞類，諸如 IgGU IgG2、IgG3、和IgG4、IgAl和IgA2。與不同類別的抗體對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作 α、δ、ε、Y、和μ?？梢栽谒?種抗體類別中都找到的輕鏈恒定區(qū)(CL)稱作κ (卡帕)和λ (拉姆達(dá))。如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“自人起源衍生的恒定區(qū)”意指亞類IgGl、IgG2、 IgG3、或IgG4的人抗體的重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈κ或λ恒定區(qū)。此類恒定區(qū)是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如由Kabat，Ε. Α.(參見(jiàn)例如Johnson，G.和Wu，Τ. Τ.，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ；Kabat, Ε. Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(1975)2785-2788)描述。雖然IgG4亞類的抗體顯示降低的Fc受體(FcgRIIIa)結(jié)合，但是其它IgG亞類的抗體顯示強(qiáng)的結(jié)合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(喪失Fc碳水化合物)、 Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、 Asn434、和His435是在改變時(shí)也提供降低的Fc受體結(jié)合的殘基(Shields，R. L.等， J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ；Lund, J.等，F(xiàn)ASEB J. 9 (1995) 115-119 ；Morgan, Α.等， Immunology 86(1995)319-324 ；EP 0 307 434)。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白與IgGl抗體相比具有降低的FcR 結(jié)合，而全長(zhǎng)親本抗體就FcR結(jié)合而言是IgG4亞類的或具有S228、L234、L235和/或D265 中的突變的IgGl或IgG2亞類的，和/或含有PVA236突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)親本抗體中的突變是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)親本抗體中的突變?cè)贗gG4S228P中及在IgGlL234A和L235A中?？贵w的恒定區(qū)直接牽涉ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和CDC(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)。補(bǔ)體激活(⑶C)通過(guò)補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的恒定區(qū)的結(jié)合來(lái)啟動(dòng)。通過(guò)在所謂的結(jié)合位點(diǎn)處限定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用引起Clq與抗體的結(jié)合。此類恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并且例如由 Lukas, T. J.等，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ；Brunhouse, R.禾口 Cebra，J.， J.，Mol. Immunol. 16(1979)907-917 ；Burton, D. R.等，Nature 288(1980)338-344 ； Thommesen, J.，Ε.等，Mol. Immunol. 37 (2000)995-1004 ；Idusogie, Ε.，Ε.等，
13J. Immunol. 164(2000)4178-4184 ；Hezareh, Μ.等，J. Virol. 75(2001) 12161-12168 ； Morgan, Α.等，Immunology 86 (1995) 319-324 ；及 EP 0 307 434 描述。此類恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)例如以氨基酸 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、和 P329 (依照 Kabat 的 EU 索引編號(hào))為特征。術(shù)語(yǔ)“抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC) ”指在存在效應(yīng)細(xì)胞的情況中通過(guò)依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白來(lái)裂解人靶細(xì)胞。優(yōu)選地，通過(guò)在存在效應(yīng)細(xì)胞，諸如新鮮分離的PBMC或來(lái)自血沉棕黃層的純化的效應(yīng)細(xì)胞，如單核細(xì)胞或天然殺傷(NK)細(xì)胞或永久生長(zhǎng)NK細(xì)胞系的情況中用依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白來(lái)處理抗原表達(dá)細(xì)胞的制備物來(lái)測(cè)量 ADCC0術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C) ”意指通過(guò)補(bǔ)體因子Clq與大多數(shù)IgG抗體亞類的Fc部分的結(jié)合啟動(dòng)的過(guò)程。通過(guò)在所謂的結(jié)合位點(diǎn)處限定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用引起Clq與抗體的結(jié)合。此類Fc部分結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(參見(jiàn)上文)。此類Fc 部分結(jié)合位點(diǎn)例如以氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、和P329 (依照 Kabat的EU索引編號(hào))為特征。亞類IgGl、IgG2、和IgG3的抗體通常顯示包括Clq和C3 結(jié)合的補(bǔ)體激活，而IgG4不激活補(bǔ)體系統(tǒng)，而且不結(jié)合Clq和/或C3。單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)器功能可以通過(guò)工程化改造其寡糖組分來(lái)增強(qiáng)， 如記載于 Umana，P.等，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180，及 US6, 602，684 的。IgGl 型抗體(最常使用的治療性抗體)是在每個(gè)CH2域中具有Asn297處的保守的N連接的糖基化位點(diǎn)的糖蛋白。兩個(gè)附著于Asn297的復(fù)合雙觸角寡糖掩埋于CH2域間，這形成與多肽主鏈的廣泛接觸，并且其存在對(duì)于抗體介導(dǎo)效應(yīng)器功能諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)是至關(guān)重要的(Lifely，Μ.，R.等，Glycobiology 5(1995)813-822 ； Jefferis, R.等，Immunol. Rev. 163(1998)59—76 ；Wright, Α.禾口 Morrison，S. , L. , Trends Biotechnol. 15(1997)26-32)。Umana，P.等 Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 和 W099/54342顯示了 β (1，4)_Ν_乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III ( “GnTIII ”)(即一種催化兩分型寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)顯著提高抗體的體外ADCC活性。Asn297碳水化合物的組成改變或其消除還影響與Fc γ R和Clq的結(jié) ^ (Umana, P.等，Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 ；Davies, J.等，Biotechnol. Bioeng. 74(2001) 288-294 ；Mimura, Y.等，J. Biol. Chem. 276 (2001)45539-45547 ； Radaev, S.等，J. Biol. Chem. 276(2001) 16478—16483 ；Shields, R.，L.等，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ；Shields, R.，L.等，J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 ； Simmons, L. , C.等，J. Immunol. Methods 263(2002) 133-147)。例如在WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、W02004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966, WO 1997/028267、US2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894,WO 2003/035835,W02000/061739中報(bào)告了增強(qiáng)單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效
應(yīng)器功能的方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙特異性抗原結(jié)合蛋白是在Asn297處用糖鏈糖基化的(若它包含IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類，優(yōu)選地IgGl或IgG3亞類的Fc部分)，其中所述糖鏈內(nèi)的巖藻糖量是65%或更低(依照Kabat編號(hào))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述糖鏈內(nèi)的巖藻糖量是在5%和65%之間，優(yōu)選地在20%和40%之間。依照本發(fā)明的“Asn297”意指位于Fc區(qū)中的約第297位的氨基酸天冬酰胺?；诳贵w的次要序列變化， Asn297還可以位于第297位上游或下游的一些氨基酸(通常不超過(guò)士 3個(gè)氨基酸)，即在第 294位和第300位之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的糖基化抗原結(jié)合蛋白IgG亞類是人IgGl亞類的、具有突變L234A和L235A的人IgGl亞類的或IgG3亞類的。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在所述糖鏈內(nèi)N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)的量是或更小和/或N端α-1，3-半乳糖的量是或更小。優(yōu)選地，糖鏈顯示附著于CHO細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體的Asn297的 N連接的聚糖的特征。術(shù)語(yǔ)“糖鏈顯示附著于CHO細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體的Asn297的N連接的聚糖的特征”意指依照本發(fā)明的全長(zhǎng)親本抗體的Asn297處的糖鏈與未修飾的CHO細(xì)胞中表達(dá)的相同抗體的糖鏈，例如與WO 2006/103100中所報(bào)告的那些糖鏈具有相同的結(jié)構(gòu)和糖殘基序列 (除巖藻糖殘基外)。如本申請(qǐng)內(nèi)所使用的，術(shù)語(yǔ)“NGNA”意指糖殘基N-羥乙酰神經(jīng)氨酸。在Asn297處發(fā)生人IgGl或IgG3的糖基化，作為核心巖藻糖化雙觸角復(fù)合寡糖糖基化以多至兩個(gè)Gal殘基為末端。Kabat，E.，A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)及 Brueggemann, Μ.等，J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361 ； Love, Τ.，W.等，Methods Enzymo 1. 178 (1989) 515-527 詳細(xì)報(bào)告了 IgGl 或 IgG3 亞類的人重鏈恒定區(qū)。根據(jù)末端Gal殘基的量，這些結(jié)構(gòu)稱為G0、Gl(a-l，6-或α _1，3_)、或G2聚糖殘基(Raju，T.，S.，Bioprocess Int. 1 (2003)44-53)?？贵w Fc 部分的 CHO 型糖基化例如由 Routier, F.，H.，Glycoconjugate J. 14(1997)201-207 描述。在非糖修飾的 CHO 宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體在Asn297處通常以至少85%的量進(jìn)行巖藻糖化。全長(zhǎng)親本抗體的經(jīng)修飾的寡糖可以是雜合的或復(fù)合的。優(yōu)選地，兩分型、還原的/非巖藻糖化的寡糖是雜合的。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩分型、還原的/非巖藻糖化的寡糖是復(fù)合的。依照本發(fā)明，“巖藻糖的量”意指通過(guò)MALDI-T0F質(zhì)譜術(shù)測(cè)量的，并以平均值計(jì)算的，Asn297處糖鏈內(nèi)所述糖相對(duì)于附著于Asn297的所有糖結(jié)構(gòu)(例如復(fù)合的、雜合的和高甘露糖結(jié)構(gòu))的總和的量。巖藻糖的相對(duì)量是通過(guò)MALDI-T0F，含有巖藻糖的結(jié)構(gòu)相對(duì)于經(jīng) N-糖苷酶F處理的樣品中鑒定的所有糖結(jié)構(gòu)(例如分別為復(fù)合的、雜合的及寡和高甘露糖結(jié)構(gòu))的百分比。通過(guò)重組手段來(lái)生成依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白。如此，本發(fā)明的一方面是編碼依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的核酸，而又一方面是包含所述編碼依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的核酸的細(xì)胞。用于重組生成的方法是現(xiàn)有技術(shù)中普遍已知的，并且包括在原核和真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)，隨后分離抗原結(jié)合蛋白，并且通常純化至藥學(xué)可接受純度。對(duì)于在宿主細(xì)胞中如前述那樣表達(dá)抗體，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法將編碼各經(jīng)修飾的輕鏈和重鏈的核酸插入表達(dá)載體中。在合適的原核或真核宿主細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、PER. C6細(xì)胞、酵母、或大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)施表達(dá)，并且自細(xì)胞(上清液或裂解后的細(xì)胞)回收抗原結(jié)合蛋白。用于重組生成抗體的通用方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，并且例如記載于綜述文章Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ；Geisse, S.等，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J.，Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160 ；Werner, R. G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880。
通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和層析來(lái)自培養(yǎng)液適當(dāng)?shù)胤蛛x依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白。容易使用常規(guī)規(guī)程將編碼單克隆抗體的DNA或RNA分離并測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可以充當(dāng)此類 DNA和RNA的來(lái)源。一旦分離，可以將DNA插入表達(dá)載體中，然后將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入在其它情況中不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞諸如HEK 293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞中，以獲得重組單克隆抗體在宿主細(xì)胞中的合成。通過(guò)將合適的核苷酸變化引入抗原結(jié)合蛋白DNA中，或者通過(guò)核苷酸合成來(lái)制備雙特異性抗原結(jié)合蛋白的氨基酸序列變體(或突變體)。然而，僅可以在非常有限的范圍中實(shí)施此類修飾，例如如上文所描述的。例如，修飾不改變上文所提及的抗體特征諸如IgG同種型和抗原結(jié)合，但是可以改善重組生成的產(chǎn)量、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或者便于純化。如本申請(qǐng)中所使用的，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指可以工程化改造以生成依照本發(fā)明的抗體的任何種類的細(xì)胞系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。如本文中所使用的，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有此類名稱包括后代。如此，詞語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主題細(xì)胞和自其衍生的培養(yǎng)物，而不管傳遞的次數(shù)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意或無(wú)意的突變，所有后代在DNA內(nèi)容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變體后代。例如，Barnes, L.M.等，Cytotechnology 32(2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.等， Biotech. Bioeng. 73(2001)261-270 描述了 NSO 細(xì)胞中的表達(dá)。例如，Durocher, Y.等， Nucl. Acids. Res. 30(2002)E9 描述了瞬時(shí)表達(dá)。Orlandi，R.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 (1992) 4285-4289 ； 及 Norderhaug，L.等，J. Immunol. Methods 204(1997)77-87 描述了可變域的克隆。 Schlaeger, Ε. -J.禾口 Christensen, K.,于 Cytotechnology 30 (1999) 71-83 及 Schlaeger, E. -J.，于 J. Immunol. Methods 194(1996) 191-199 描述了一種優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(HEK 293)。適合于原核生物的控制序列例如包括啟動(dòng)子，任選地操縱基因序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和多腺苷酸化信號(hào)。在將核酸放置在與另一種核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，它是“可操作連接的”。例如，若前序列或分泌前導(dǎo)的DNA以參與多肽分泌的前蛋白表達(dá)，則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列可操作連接；或者若核糖體結(jié)合位點(diǎn)定位為使得便于翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，“可操作連接的”意指所連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)的情況中，是連續(xù)的且在讀碼框中。然而，增強(qiáng)子不必是連續(xù)的。通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)處的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)連接。若不存在此類位點(diǎn)，則依照常規(guī)的實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl分帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳、和本領(lǐng)域中公知的其它技術(shù)來(lái)實(shí)施抗體純化以消除細(xì)胞組分或其它污染物，例如其它細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)° 參見(jiàn) Ausubel, F.等編 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)。不同方法是完善建立的，并且廣泛用于蛋白質(zhì)純化，諸如用微生物蛋白質(zhì)的親和層析(例如，蛋白A或蛋白G親和層析)、離子交換層析(例如，陽(yáng)離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式交換)、親硫性吸附(例如，用β -巰基乙醇和其它SH配體)、疏水性相互作用或芳香族吸附層析(例如，用苯基-S印harose、親氮雜芳烴性樹脂(aza-arenophilic resin)、或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合物親和層析(例如，用Ni (II)-和Cu(II)-親和材料)、大小排阻層析、和電泳方法(諸如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi，IL，Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。本發(fā)明的一方面是包含依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面是依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白用于制備藥物組合物的用途。本發(fā)明的又一方面是用于制備包含依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的藥物組合物的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了含有與藥用載體一起配制的依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的組合物，例如藥物組合物。本發(fā)明的另一方面是用于治療癌癥的所述藥物組合物。本發(fā)明的另一方面是用于治療癌癥的依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白。本發(fā)明的另一方面是依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白用于制備供治療癌癥用的藥物的用途。本發(fā)明的另一方面是治療患有癌癥的患者的方法，其通過(guò)對(duì)需要此類治療的所述患者施用依照本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白來(lái)進(jìn)行。如本文中所使用的，“藥用載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層材料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑，等等。優(yōu)選地，載體適合于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、胃腸外、脊柱或表皮施用(例如通過(guò)注射或輸注)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法來(lái)施用本發(fā)明的組合物。如熟練技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的，施用的路徑和/或模式會(huì)隨期望的結(jié)果而變化。為了通過(guò)某些施用路徑來(lái)施用本發(fā)明的化合物，可能有必要用某種材料包被化合物，或者與某種材料共施用化合物以阻止其失活。例如，可以將化合物在合適的載體，例如脂質(zhì)體或稀釋劑中對(duì)受試者施用。藥學(xué)可接受稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥用載體包括無(wú)菌水溶液或分散體和供臨場(chǎng)制備無(wú)菌可注射溶液或分散體用的無(wú)菌粉劑。對(duì)藥學(xué)活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域中已知的。如本文中所使用的，短語(yǔ)“胃腸外施用”意指通常通過(guò)注射進(jìn)行的與腸和表面施用不同的施用模式，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、 腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)癌癥指增殖性疾病，諸如淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性白血病、 肺癌、非小細(xì)胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細(xì)胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌(cancer of the head or neck)、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌(cancer of the anal region)、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌(carcinoma of the fallopian tubes)、〒宮內(nèi)(carcinoma of the endometrium)、宮(carcinoma of the cervix)、陰 (carcinoma of the vagina)、夕卜陰 (carcinoma of the vulva)
奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌(carcinoma ofthe renal pelvis)、間皮瘤、肝細(xì)胞癌、膽管癌(biliary cancer)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)新生物、脊柱軸腫瘤(spinal axis tumor)、腦干膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)、星形細(xì)胞瘤(astrocytoma)、施萬(wàn)細(xì)胞瘤(schwanomas)、 室管膜瘤(印endymona)、髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)、腦脊膜瘤(meningioma)、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma)、垂體腺瘤(pituitary adenoma)禾口尤因肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任何上述癌癥的頑固性型式，或一種或多種上述癌癥的組合。這些組合物還可以含有佐劑諸如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^(guò)無(wú)菌規(guī)程，見(jiàn)上文，及通過(guò)包括各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、 酚、山梨酸等來(lái)確保阻止微生物的存在。還可能期望將等張劑，諸如糖、氯化鈉等納入組合物中。另外，可以通過(guò)包括延遲吸收的藥劑諸如單硬脂酸鋁和明膠來(lái)弓I起可注射藥物形式的吸收延遲。不管選擇的施用路徑，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來(lái)將本發(fā)明的化合物 (其可以以合適的水合形式使用)和/或本發(fā)明的藥物組合物配制成藥學(xué)可接受劑量形式?？梢愿淖兓钚猿煞衷诒景l(fā)明的藥物組合物中的實(shí)際劑量水平，從而獲得對(duì)于實(shí)現(xiàn)特定患者的期望的治療響應(yīng)、組成、和施用模式有效的，而對(duì)患者無(wú)毒的活性成分量。選定的劑量水平會(huì)取決于多種藥動(dòng)學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明的特定組合物的活性、施用路徑、施用時(shí)間、所采用的特定化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時(shí)間、與所采用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、所治療的患者的年齡、性別、重量、狀況、一般健康和先前的醫(yī)學(xué)史等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的因素。組合物必須是無(wú)菌的，而且是流體的，其程度使得組合物通過(guò)注射器可投遞。在水夕卜，載體優(yōu)選地是等張緩沖鹽水溶液?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用涂層材料諸如卵磷脂、在分散體的情況中通過(guò)維持所要求的粒度、及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況中，優(yōu)選在組合物中包含等張劑(例如糖、多元醇諸如甘露醇或山梨醇、和氯化鈉)。如本文中所使用的，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”、和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有此類名稱包括后代。如此，詞語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主題細(xì)胞和自其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意或無(wú)意的突變，所有后代在DNA 內(nèi)容上可能不是正好相同的。包括具有與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變體后代。在意圖獨(dú)特的名稱的情況中，其從上下文看會(huì)是明顯的。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指將載體/核酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中的過(guò)程。若使用沒(méi)有難以應(yīng)付的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，則例如通過(guò)磷酸鈣沉淀法來(lái)實(shí)施轉(zhuǎn)染，如 Graham，F(xiàn).，L.和 Van der Eb, A. ,J. ,Virology 52 (1973) 456-467 所描述的。然而， 也可以使用其它用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，諸如通過(guò)核注射或者通過(guò)原生質(zhì)體融合來(lái)進(jìn)行。若使用原核細(xì)胞或含有堅(jiān)固細(xì)胞壁構(gòu)造的細(xì)胞，則例如一種轉(zhuǎn)染方法是使用氯化鈣進(jìn)行的鈣處理，如Cohen, S.，N.等，PNAS. 69 (1972) 2110-2114所描述的。如本文中所使用的，“表達(dá)”指將核酸轉(zhuǎn)錄成mRNA的過(guò)程和/或隨后將轉(zhuǎn)錄的 mRNA(又稱為轉(zhuǎn)錄物)翻譯成肽、多肽、或蛋白質(zhì)的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄物和編碼的多肽統(tǒng)稱為基因產(chǎn)物。若多核苷酸是自基因組DNA衍生的，則真核細(xì)胞中的表達(dá)可以包括mRNA的剪接?！拜d體”指將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中和/或在宿主細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的核酸分
18子，特別是自我復(fù)制的。該術(shù)語(yǔ)包括主要在將DNA或RNA插入細(xì)胞(例如，染色體整合)方面發(fā)揮功能的載體、主要在DNA或RNA復(fù)制方面發(fā)揮功能的復(fù)制載體、和在DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯方面發(fā)揮功能的表達(dá)載體。還包括提供超過(guò)一種功能的載體，如所描述的?！氨磉_(dá)載體”指在導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中時(shí)可以被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的多核苷酸。 “表達(dá)系統(tǒng)”通常指包含能發(fā)揮功能以產(chǎn)生期望的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體的合適的宿主細(xì)胞。提供以下實(shí)施例、序列表和圖以幫助理解本發(fā)明，其實(shí)際范圍在所附權(quán)利要求書中列出。應(yīng)當(dāng)理解，可以在不背離本發(fā)明的精神的前提下對(duì)所列規(guī)程做出修飾。序列表的描述SEQ ID NO 1 具有C端融合的經(jīng)修飾Fab片段<VEGF>VH_CL域的未修飾重鏈 <Ang-2> (CH1-CL 交換)SEQ ID NO 2 經(jīng)修飾 Fab 片段 <VEGF>VL_CH1 域(CH1-CL 交換)SEQ ID NO 3 未修飾輕鏈 <Ang_2>SEQ ID NO 4 具有N端融合的經(jīng)修飾Fab片段<VEGF>VH_CL域的未修飾重鏈 <Ang-2> (CH1-CL 交換)SEQ ID NO 5 具有C端融合的未修飾Fab片段<Ang-2>VH_CHl域的經(jīng)修飾重鏈 <VEGF> (CH1-CL 交換)附圖簡(jiǎn)述圖1特異性結(jié)合第一抗原1的沒(méi)有CH4域的全長(zhǎng)抗體的示意性結(jié)構(gòu)，所述全長(zhǎng)抗體具有兩對(duì)包含典型次序的可變和恒定域的重鏈和輕鏈。圖2a和2b在CHl-VH鏈C端(圖2a)或N端(圖2b)具有肽連接頭的特異性結(jié)合第二抗原2的典型的未修飾的Fab片段的示意性結(jié)構(gòu)。圖3特異性結(jié)合第一抗原1的全長(zhǎng)抗體(圖3a)和由錯(cuò)配所致的不想要的副產(chǎn)物(圖3b，和圖3c)的示意性結(jié)構(gòu)，所述全長(zhǎng)抗體已經(jīng)將兩個(gè)特異性結(jié)合第二抗原2的未修飾的Fab片段與其重鏈N端融合。圖4a、4b和4c依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的示意性結(jié)構(gòu)，其中通過(guò)替換a)特異性結(jié)合第一抗原1的全長(zhǎng)抗體的Fab片段中和/或b)特異性結(jié)合第二抗原2的兩個(gè)額外的融合Fab片段抗體中的某些域來(lái)降低錯(cuò)配。圖4a顯示了雙特異性抗原結(jié)合蛋白。圖4b和4c顯示了全長(zhǎng)Fab片段和額外的Fab片段內(nèi)VH/VL和/或CH1/CL域交換的所有組合，其導(dǎo)致具有降低的錯(cuò)配的依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白。圖5識(shí)別Ang-2和VEGF的依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白(實(shí)施例1)的示意性結(jié)構(gòu)。圖6識(shí)別Ang-2和VEGF的依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白(實(shí)施例2)的示意性結(jié)構(gòu)。圖7識(shí)別Ang-2和VEGF的依照本發(fā)明的雙特異性抗原結(jié)合蛋白(實(shí)施例3)的示意性結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例材料和通用方法關(guān)于人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息參見(jiàn)Kabat，Ε. Α.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)?？贵w鏈的氨基酸依照 EU編號(hào)方式 (EdeIman, G. Μ.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85 ；Kabat, Ε. Α.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))編號(hào)并提及。重組DNA技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)操作DNA，如記載于Sambrook，J.等，Molecular cloning :A laboratory manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989的。依照制造商的指令使用分子生物學(xué)試劑?；蚝铣勺酝ㄟ^(guò)化學(xué)合成生成的寡核苷酸制備期望的基因區(qū)段。通過(guò)寡核苷酸的退火和連接，包括PCR擴(kuò)增，隨后經(jīng)由指定的限制性位點(diǎn)，例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆入基于 pPCRScript (Stratagene)的pGA4克隆載體中來(lái)裝配基因區(qū)段，其側(cè)翼有單一的限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)。通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)確認(rèn)亞克隆的基因片段的DNA序列。依照給定的規(guī)格在 Geneart (Regensburg, Germany)定購(gòu)基因合成片段。DNA序列測(cè)定通過(guò)在 MediGenomi χ GmbH (Martinsried, Germany)或 Sequi serve GmbH(Vaterstetten,Germany)實(shí)施的雙鏈測(cè)序來(lái)測(cè)定DNA序列。DNA和蛋白質(zhì)序列分析及
序列數(shù)據(jù)管理使用GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)軟件包第 10. 2 版和 Infomax的Vector NTl Advance套件第8. O版來(lái)進(jìn)行序列創(chuàng)建、定位、分析、注釋和例示。表達(dá)載體對(duì)于所描述的雙特異性四價(jià)抗體的表達(dá)，應(yīng)用用于瞬時(shí)表達(dá)(例如在HEK293EBNA 或HEK293-F細(xì)胞中)的表達(dá)質(zhì)粒的變體，其基于具有或沒(méi)有CMV-內(nèi)含子A啟動(dòng)子的cDNA 構(gòu)造或基于具有CMV啟動(dòng)子的基因組構(gòu)造。在抗體表達(dá)盒外，載體含有-復(fù)制起點(diǎn)，其容許此質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制，和-β -內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性?？贵w基因的轉(zhuǎn)錄單元由下列元件構(gòu)成-5’端的獨(dú)特限制性位點(diǎn)_來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的立即早期增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，-在cDNA構(gòu)造的情況中接著有內(nèi)含子A序列，-人抗體基因的5’-非翻譯區(qū)，
-免疫球蛋白重鏈信號(hào)序列，-人雙特異性四價(jià)抗體鏈(野生型或具有域交換)，其作為cDNA或作為具有免疫球蛋白外顯子_內(nèi)含子構(gòu)造的基因組構(gòu)造-具有多腺苷酸化信號(hào)序列的3’非翻譯區(qū)，和-3’端的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。通過(guò)PCR和/或基因合成來(lái)生成如下文所描述的包含所描述的抗體鏈的融合基因，并用已知重組方法和技術(shù)例如使用各載體中的獨(dú)特限制性位點(diǎn)通過(guò)連接相符的核酸區(qū)段來(lái)裝配。通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)確認(rèn)亞克隆的核酸序列。為了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，通過(guò)來(lái)自經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒制備物來(lái)制備更大量的質(zhì)粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，如記載于Current Protocols in Cell Biology(2000), Bonifacino, J. S. , Dasso, Μ. ,Harford,J.B., Lippincott-Schwartz, J.禾口 Yamada, K. Μ.(編)，John Wiley & Sons，Inc 的。通過(guò)在貼壁生長(zhǎng)的HEK293-EBNA中或在懸浮生長(zhǎng)的HEK29-F細(xì)胞中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染各三種表達(dá)質(zhì)粒來(lái)表達(dá)雙特異性四價(jià)抗體，如下文所描述的。HEK293-EBNA系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通過(guò)在補(bǔ)充有10%超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)JP 250yg/ml遺傳霉素(Gibco)的DMEM(Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基，Gibco)中培養(yǎng)的貼壁生長(zhǎng)的HEK293-EBNA細(xì)胞(表達(dá)埃巴病毒核抗原的人胚腎細(xì)胞系293 ；美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)ATCC#CRL-10852，Lot. 959218)中瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染各三種表達(dá)質(zhì)粒(例如，編碼經(jīng)修飾的重鏈，及相應(yīng)的輕鏈和經(jīng)修飾的輕鏈)來(lái)表達(dá)雙特異性四價(jià)抗體。對(duì)于轉(zhuǎn)染，以 FuGENE 試劑(μ )與DNA(yg)的比率為4 1(范圍為3 1至6 1)使用FuGENE 6 轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Biochemicals)。使用(經(jīng)修飾的和野生型)輕鏈和經(jīng)修飾的重鏈編碼質(zhì)粒的摩爾比率為1 1 1(等摩爾)(其范圍為1 1 2至2 2 1)分別自各質(zhì)粒表達(dá)蛋白質(zhì)。在第3天用加至4mM的L-谷氨酰胺、葡萄糖[Sigma]和NAA[Gibco] 飼養(yǎng)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后第5天至第11天通過(guò)離心來(lái)收獲含有雙特異性四價(jià)抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，并于-20°C貯存。關(guān)于人免疫球蛋白在例如HEK293細(xì)胞中的重組表達(dá)的一般信息參見(jiàn)Meissner，P.等，Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203。HEK293-F系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或者，使用HEK293-F系統(tǒng)(Invitrogen)依照制造商的指令通過(guò)各質(zhì)粒(例如編碼經(jīng)修飾的重鏈，及相應(yīng)的輕鏈和經(jīng)修飾的輕鏈)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)生成雙特異性四價(jià)抗體。 簡(jiǎn)言之，用如上文所描述的三種表達(dá)質(zhì)粒和293feCtin或Fectin (Invitrogen)的混合物轉(zhuǎn)染在無(wú)血清FreeStyle 293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)中在搖瓶中或在攪動(dòng)式發(fā)酵罐中懸浮生長(zhǎng)的HEK293-F細(xì)胞(Invitrogen)。對(duì)于2L搖瓶(Corning)，以1. 0E*6個(gè)細(xì)胞/mL的密度在600mL中接種HEK293-F細(xì)胞，并以120rpm，8% CO2溫育。次日，以約1. 5E*6個(gè)細(xì)胞 /mL的細(xì)胞密度用約42mL A) 20mL具有600 μ g總質(zhì)粒DNA (1 μ g/mL)(編碼等摩爾比率的經(jīng)修飾的重鏈、相應(yīng)的輕鏈和相應(yīng)的經(jīng)修飾的輕鏈)的Opti-MEM(Invitrogen)和B) 20ml 0pti-MEM+l. 2mL 293 Fectin或Fectin (2 μ 1/mL)的混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。依照葡萄糖消耗，在發(fā)酵過(guò)程期間添加葡萄糖溶液。在5-10天后收獲含有分泌的抗體的上清液，并自上清液直接純化抗體，或者將上清液冷凍并貯存。蛋白質(zhì)測(cè)定使用依照Pace, C.，N.等，Protein Science 4(1995)2411-1423 基于氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)，通過(guò)測(cè)定280nm的光密度(OD)來(lái)測(cè)定純化的雙特異性四價(jià)抗體和衍生物的蛋白質(zhì)濃度。上清液中的抗體濃度測(cè)定通過(guò)用蛋白A瓊脂糖珠(Roche)的免疫沉淀來(lái)評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的雙特異性四價(jià)抗體的濃度。將6(^1^蛋白六瓊脂糖珠在185-呢40(501111111^8，？!1 7. 5,150mM NaCl, 1% Nonidet-P40)中清洗三次。隨后，將l_15mL細(xì)胞培養(yǎng)物上清液應(yīng)用于在TBS-NP40中預(yù)平衡的蛋白A瓊脂糖珠。于室溫溫育1小時(shí)后，將珠在Ultrafree-MC-過(guò)濾柱(Amicon] 上用0. 5mL TBS-NP40清洗一次，用0. 5mL 2x磷酸鹽緩沖鹽水(2xPBS，Roche)清洗兩次， 并用0. 5mL IOOmM檸檬酸鈉pH 5，0短暫清洗4次。通過(guò)添加35 μ 1 NuPAGE LDS樣品緩沖液(Irwitrogen)來(lái)洗脫結(jié)合的抗體。分別將樣品的一半與NuPAGE 樣品還原劑組合或者保持未還原，并于70°C加熱10分鐘。因此，將5-30 μ 1應(yīng)用于4-12%NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen)(對(duì)于非還原性SDS-PAGE用MOPS緩沖液，而對(duì)于還原性 SDS-PAGE用含NuPAGE 抗氧化劑運(yùn)行緩沖液添加劑(Invitrogen)的MES緩沖液)，并用考馬斯藍(lán)染色。通過(guò)親和HPLC層析來(lái)定量測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的雙特異性四價(jià)抗體的濃度。簡(jiǎn)言之，在Agilent HPLC 1100系統(tǒng)上，將含有結(jié)合蛋白A的抗體和衍生物的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液應(yīng)用于 200mM KH2PO4UOOmM 檸檬酸鈉，pH7. 4 中的 Applied Biosystems Poros A/20柱，并用200mM NaCl、IOOmM檸檬酸，pH 2，5自基質(zhì)洗脫。通過(guò)UV吸光度和峰面積級(jí)分來(lái)量化洗脫的蛋白質(zhì)。純化的標(biāo)準(zhǔn)IgGl抗體充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品?；蛘?，通過(guò)三明治式-IgG-ELISA來(lái)測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的雙特異性四價(jià)抗體的濃度。簡(jiǎn)言之，用100 μ L/孔0. 1 μ g/mL的生物素化的抗人IgG捕捉分子 F(ab，) 2<h-Fc y >BI (Dianova)包被Str印taWell高結(jié)合鏈霉親合素A-96孔微量滴定板(Roche)，于室溫持續(xù)1小時(shí)或者備選地于4 °C過(guò)夜，隨后用200 μ L/孔PBS、0. 05% Tween (PBST, Sigma)清洗三次。將100 μ L/孔含有各抗體的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在 PBS(Sigma)中的稀釋系列添加至孔，并在微量滴定板搖動(dòng)器上于室溫溫育1_2小時(shí)。將孔用 200 μ L/孔 PBST 清洗三次，并用 100 μ 10. 1 μ g/mL 的 F(ab ‘)2<hFc γ >P0D (Dianova)作為檢測(cè)抗體在微量滴定板搖動(dòng)器上于室溫檢測(cè)結(jié)合的抗體達(dá)1-2小時(shí)。用200 μ L/孔PBST 將未結(jié)合的檢測(cè)抗體洗掉三次，并通過(guò)添加IOOyL ABTS/孔來(lái)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)抗體。在 Tecan Fluor光譜儀上以405nm的測(cè)量波長(zhǎng)(參照波長(zhǎng)492歷)實(shí)施吸光度測(cè)定。蛋白質(zhì)純化參考標(biāo)準(zhǔn)的方案自過(guò)濾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液純化蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)言之，將雙特異性四價(jià)抗體應(yīng)用于蛋白A S印harose柱(GE healthcare)，并用PBS清洗。在pH 2. 8實(shí)現(xiàn)雙特異性四價(jià)抗體的洗脫，接著立即中和樣品。通過(guò)在PBS中或在20mM組氨酸、150mM NaCl pH 6. O中的大小排阻層析(Superdex 200，GEHealthcare)將聚集的蛋白質(zhì)與單體抗體分離。將單體級(jí)分合并，若需要的話，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWC0)離心濃縮器來(lái)濃縮，冷凍，并于-20°C或-80°C貯存。為隨后的蛋白質(zhì)分析學(xué)和分析表征(例如通過(guò) SDS-PAGE、大小排阻層析或質(zhì)譜術(shù)進(jìn)行)提供樣品的一部分。SDS-PAGE依照制造商的指令，使用NuPAGE 預(yù)制凝膠系統(tǒng)(Irwitrogen)。具體地，使用 10%或 4-12%NuPAGE Novex Bis-TRIS 預(yù)制凝膠(pH 6.4)和NuPAGE MES (還原性凝膠，具有NuPAGE 抗氧化劑運(yùn)行緩沖液添加劑)或MOPS (非還原性凝膠)運(yùn)行緩沖液。分析用大小排阻層析
通過(guò)HPLC層析來(lái)實(shí)施用于測(cè)定雙特異性四價(jià)抗體的聚集和寡聚狀態(tài)的大小排阻層析。簡(jiǎn)言之，將蛋白A純化的抗體應(yīng)用于Agilent HPLC 1100系統(tǒng)上在300mM NaCl、50mM ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04, pH 7. 5 中的 Tosoh TSKgelG3000SW 柱，或者應(yīng)用于 Dionex HPLC-系統(tǒng)上在 2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通過(guò)UV吸光度和峰面積級(jí)分來(lái)量化洗脫的蛋白質(zhì)。BioRad凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)品151-1901充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)譜術(shù)經(jīng)由電噴射離子化質(zhì)譜術(shù)(ESI-MS)來(lái)測(cè)定并確認(rèn)雙特異性四價(jià)抗體的總脫糖基化質(zhì)量。簡(jiǎn)言之，將100 μ g純化的抗體用50mU在100mMKH2P04/K2HP04，pH 7中的N-糖苷酶 F(PNGaseF, ProZyme)于37°C以多至2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度脫糖基化12-24小時(shí)，隨后經(jīng)由 Sephadex G25柱(GEHealthcare)上的HPLC脫鹽。脫糖基化并還原后，通過(guò)ESI-MS來(lái)測(cè)定經(jīng)修飾的重鏈、輕鏈和經(jīng)修飾的輕鏈各自的質(zhì)量。簡(jiǎn)言之，將115 μ 1中的50 μ g雙特異性四價(jià)抗體與60 μ 1 IM TCEP和50 μ 1 8Μ鹽酸胍一起溫育，隨后脫鹽。在裝備有NanoMate 源的Q-Star Elite MS系統(tǒng)上經(jīng)由ESI-MS來(lái)測(cè)定總質(zhì)量和還原的重鏈和輕鏈的質(zhì)量。VEGF 結(jié)合 ELISA在ELISA測(cè)定法中用全長(zhǎng)VEGF165_His蛋白(R&D Systems)來(lái)評(píng)估雙特異性四價(jià)抗體的結(jié)合特性。出于此目的，用100 μ 1 2μ g/mL在PBS中的重組人VEGF165 (R&D Systems)包被Falcon聚苯乙烯清潔增強(qiáng)型微量滴定板，于室溫持續(xù)2小時(shí)或于4V過(guò)夜。 將孔用 300 μ 1 PBST (0,2% Tween 20)清洗三次，并用 200 μ 1 2% BSA 0,1% Tween 20 于室溫封閉30分鐘，隨后用300 μ 1 PBST清洗三次。將100 μ L/孔純化的雙特異性四價(jià)抗體在PBS(Sigma)中的系列稀釋添加至孔，并在微量滴定板搖動(dòng)器上于室溫溫育1小時(shí)。將孔用 300 μ 1 PBST (0,2% Tween 20)清洗三次，并用 100 μ L/ 孔 0. 1 μ g/ml 在 2% BSA 0,1% Tween 20中的F(ab ‘)<hFcgamma>P0D (Immuno research)作為檢測(cè)抗體在微量滴定板搖動(dòng)器上于室溫檢測(cè)結(jié)合的抗體達(dá)1小時(shí)。將未結(jié)合的檢測(cè)抗體用300 μ L/孔PBST洗掉三次，并通過(guò)添加100 μ L ABTS/孔來(lái)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)抗體。以405nm的測(cè)量波長(zhǎng)(參照波長(zhǎng) 492nm)在Tecan Fluor光譜儀上實(shí)施吸光度測(cè)定。VEGF結(jié)合通過(guò)表面等離振子共振(Biacore)于37°C對(duì)VEGF結(jié)合的動(dòng)力學(xué)表征為了進(jìn)一步確證ELISA發(fā)現(xiàn)，依照以下方案在Biacore TlOO儀上使用表面等離振子共振技術(shù)來(lái)定量分析雙特異性四價(jià)抗體對(duì)VEGF的結(jié)合，并使用TlOO軟件包來(lái)分析簡(jiǎn)言之，經(jīng)由結(jié)合山羊抗人IgGCJIR 109-005-098)在CM5-芯片上捕獲雙特異性四價(jià)抗體。如下使用標(biāo)準(zhǔn)的氨基偶聯(lián)通過(guò)氨基偶聯(lián)來(lái)固定化捕捉抗體=HBS-N緩沖液充當(dāng)運(yùn)行緩沖液， 以700個(gè)RU的配體密度為目標(biāo)通過(guò)EDC/NHS的混合物來(lái)完成活化。將捕捉抗體在偶聯(lián)緩沖液NaAc，pH5. 0中稀釋，c = 2 μ g/mL，最后通過(guò)注射IM乙醇胺來(lái)封閉仍活化的羧基基團(tuán)。 以5 μ L/分鐘的流動(dòng)和c = 10ηΜ(用運(yùn)行緩沖液+lmg/mL BSA稀釋)完成雙特異性四價(jià) <VEGF>抗體的捕獲；應(yīng)當(dāng)達(dá)到約30個(gè)RU的捕獲水平。使用rhVEGF(rhVEGF，R&D-Systems 產(chǎn)品目錄編號(hào)293-VE)作為分析物。于25°C或37°C在作為運(yùn)行緩沖液的PBS+0.005% (ν/ ν) Tween20中實(shí)施VEGF與雙特異性四價(jià)<VEGF>抗體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)表征。以300-0. 29nM的 rhVEGF濃度系列以50 μ L/分鐘的流動(dòng)及80秒結(jié)合時(shí)間和1200秒解離時(shí)間注射樣品。在每次分析物循環(huán)后用IOmM甘氨酸pH 1. 5和60秒接觸時(shí)間實(shí)施游離的捕捉抗體表面的再生。通過(guò)使用通常的雙重參照方法來(lái)計(jì)算動(dòng)力學(xué)常數(shù)(對(duì)照參照rhVEGF對(duì)捕捉分子山羊
23抗人IgG的結(jié)合，測(cè)量流動(dòng)池上的空白，rhVEGF濃度“0”，模式朗繆爾結(jié)合1 1，(由于捕捉抗體結(jié)合，Rmax設(shè)置為局部))。Ang-2 結(jié)合 ELISA在ELISA測(cè)定法中用全長(zhǎng)Ang-2-His蛋白(R&D Systems)評(píng)估雙特異性四價(jià)抗體的結(jié)合特性。出于此目的，用ΙΟΟμΙ 1 μ g/mL在PBS中的重組人Ang-2 (R&D Systems，無(wú)載體)包被Falcon聚苯乙烯清潔增強(qiáng)型微量滴定板，于室溫持續(xù)2小時(shí)或于4°C過(guò)夜。將孔用 300 μ 1 PBST (0,2% Tween 20)清洗三次，并用 200 μ 1 2% BSA 0,1% Tween 20 于室溫封閉30分鐘，隨后用300 μ 1 PBST清洗三次。將100 μ L/孔純化的雙特異性四價(jià)抗體在PBS(Sigma)中的系列稀釋添加至孔，并在微量滴定板搖動(dòng)器上于室溫溫育1小時(shí)。將孔用 300 μ 1 PBST(0,2% Tween 20)清洗三次，并用 100 μ L/孑L 0. 1 μ g/ml 在 2% BSA 0,1% Tween 20中的F (ab ‘)<hk>P0D (Biozol產(chǎn)品目錄編號(hào)206005)作為檢測(cè)抗體在微量滴定板搖動(dòng)器上于室溫檢測(cè)結(jié)合的抗體達(dá)1小時(shí)。將未結(jié)合的檢測(cè)抗體用300 μ L/孔PBST洗掉三次，并通過(guò)添加100 μ L ABTS/孔來(lái)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)抗體。以405nm的測(cè)量波長(zhǎng)(參照波長(zhǎng)492nm)在Tecan Fluor光譜儀上實(shí)施吸光度測(cè)定。Ang-2 結(jié)合 BIAC0REBIAC0RE T100 Χ (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden) ffljl 表面等離振子共振來(lái)調(diào)查雙特異性四價(jià)抗體對(duì)人Ang-2的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，對(duì)于親和力測(cè)量， 經(jīng)由胺偶聯(lián)將山羊<hIgG-FcY>多克隆抗體固定化于CM5芯片上以呈現(xiàn)針對(duì)人Ang-2的雙特異性四價(jià)抗體。在 HBS 緩沖液(HBS-P(1 OmMHEPES、150mM NaCl,0. 005% Tween 20，ph 7. 4)，25°C中測(cè)量結(jié)合。以在溶液中的多個(gè)濃度添加純化的Ang-2-His(R&D Systems或內(nèi)部純化的)。通過(guò)3分鐘的Ang-2注射來(lái)測(cè)量結(jié)合；通過(guò)用HBS緩沖液清洗芯片表面達(dá)3分鐘來(lái)測(cè)量解離，并使用1 1朗繆爾結(jié)合模式來(lái)評(píng)估KD值。由于Ang-2制備物的異質(zhì)性， 沒(méi)能觀察到1 1結(jié)合；如此，KD值僅是相對(duì)估值。自樣品曲線扣除陰性對(duì)照數(shù)據(jù)(例如緩沖液曲線)以校正系統(tǒng)固有基線漂移并用于噪聲信號(hào)降低。使用Biacore T100評(píng)估軟件第1. 1. 1版來(lái)分析傳感圖(sensorgram)并計(jì)算親和力數(shù)據(jù)?；蛘?，可以經(jīng)由五His抗體 (五 His-Ab 無(wú) BSA，Qiagen No. 34660)以 2000-1700 個(gè) RU 的捕捉水平捕捉 Ang_2，所述五 His抗體經(jīng)由胺偶聯(lián)(無(wú)BSA)固定化于CM5芯片上(參見(jiàn)下文)。Ang-2-VEGF 橋接 ELISA在ELISA測(cè)定法中用固定化的全長(zhǎng)VEGF165_His蛋白(R&D Systems)和用于檢測(cè)結(jié)合的雙特異性抗體的人Ang-2-His蛋白(R&D Systems)來(lái)評(píng)估雙特異性四價(jià)抗體的結(jié)合特性。僅雙特異性四價(jià)<VEGF-Ang-2>抗體能夠同時(shí)結(jié)合VEGF和Ang_2，并且如此橋接兩種抗原，而單特異性“標(biāo)準(zhǔn)” IgGl抗體不能同時(shí)結(jié)合VEGF和Ang-2 (圖7)。出于此目的，用100 μ 1 2 μ g/mL 在 PBS 中的重組人 VEGF165 (R&D Systems)包被Falcon聚苯乙烯清潔增強(qiáng)型微量滴定板，于室溫持續(xù)2小時(shí)或于4°C過(guò)夜。將孔用 300 μ 1 PBST (0,2% Tween 20)清洗三次，并用 200 μ 1 2% BSA 0,1% Tween 20 于室溫封閉30分鐘，隨后用300 μ 1 PBST清洗三次。將100 μ L/孔純化的雙特異性四價(jià)抗體在 PBS(Sigma)中的系列稀釋添加至孔，并在微量滴定板搖動(dòng)器上于室溫溫育1小時(shí)。將孔用300 μ 1 PBST (0,2% Tween 20)清洗三次，并通過(guò)添加100 μ 1 0. 5 μ g/ml在PBS中的人 Ang-2-His_ Systems)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。將孔用 300 μ 1 PBST (0,2% Tween 20)清洗三次，并用 100 μ 1 0. 5μ g/mL<Ang-2>mIgGl-生物素抗體(BAM0981, R&D Systems)于室溫檢測(cè)結(jié)合的Ang-2達(dá)1小時(shí)。將未結(jié)合的檢測(cè)抗體用300 μ 1 PBST (0,2% Tween 20)洗掉三次，并通過(guò)添加100 μ 1在封閉緩沖液中以1 4稀釋的1 2000鏈霉親合素-POD綴合物(Roche Diagnostics GmbH，產(chǎn)品目錄編號(hào)11089153)于室溫檢測(cè)結(jié)合的抗體達(dá)1小時(shí)。 將未結(jié)合的鏈霉親合素-POD綴合物用300 μ 1 PBST (0,2% Tween 20)洗掉3_6次，并通過(guò)添加IOOyL ABTS/孔來(lái)檢測(cè)結(jié)合的鏈霉親合素-POD綴合物。在Tecan Fluor光譜儀上以 405nm的測(cè)量波長(zhǎng)(參照波長(zhǎng)492nm)實(shí)施吸光度測(cè)定。通過(guò)Biacore證明雙特異性四價(jià)抗體<VEGF_Ang-2>對(duì)VEGF-A和Ang_2的同時(shí)結(jié)合為了進(jìn)一步確證來(lái)自橋接ELISA的數(shù)據(jù)，依照以下方案在Biacore TlOO儀上使用表面等離振子共振技術(shù)，建立別的測(cè)定法來(lái)確認(rèn)對(duì)VEGF和Ang-2的同時(shí)結(jié)合，并使用TlOO 軟件包(TlOOControl，第 2. 01 版，TlOOEvaluation，第 2. 01 版，TlOOKinetics Summary，第 1.01 版)來(lái)分析經(jīng)由五 His 抗體(五 His-Ab 無(wú) BSA，Qiagen No. 34660)在 PBS，0.005% (v/v) Tween20運(yùn)行緩沖液中以2000-1700個(gè)RU的捕獲水平捕獲Ang_2，所述五His抗體經(jīng)由胺偶聯(lián)(無(wú)BSA)固定化于CM5芯片上。HBS-N緩沖液充當(dāng)偶聯(lián)過(guò)程中的運(yùn)行緩沖液，通過(guò) EDC/NHS的混合物完成活化。將五His-Ab無(wú)B SA捕捉抗體在偶聯(lián)緩沖液NaAc，pH 4. 5中稀釋，c = 30 μ g/mL，最后通過(guò)注射IM乙醇胺來(lái)封閉仍活化的羧基基團(tuán)；測(cè)試5000和17000 個(gè)RU的配體密度。以5 μ L/分鐘的流動(dòng)用運(yùn)行緩沖液+lmg/mL BSA稀釋，具有500nM濃度的Ang-2被五His-Ab捕獲。隨后，通過(guò)與rhVEGF —起溫育，并形成三明治式復(fù)合物來(lái)證明 <Ang-2, VEGF>雙特異性四價(jià)抗體對(duì)Ang-2及對(duì)VEGF的結(jié)合。出于此目的，將雙特異性四價(jià)<VEGF-Ang-2>抗體以50 μ L/分鐘的流動(dòng)和IOOnM的濃度(用運(yùn)行緩沖液+lmg/mL BSA 稀釋)結(jié)合Ang-2，并通過(guò)以50 μ L/分鐘的流動(dòng)和150nM的VEGF濃度與PBS+0. 005% (ν/ ν)Tween20運(yùn)行緩沖液中的VEGF(rhVEGF，R&D-Systems產(chǎn)品目錄編號(hào)293-VE) —起溫育來(lái)檢測(cè)同時(shí)結(jié)合。結(jié)合時(shí)間120秒，解離時(shí)間1200秒。每個(gè)循環(huán)后用2xl0mM甘氨酸pH 2.0 以50 μ L/分鐘的流動(dòng)和60秒接觸時(shí)間來(lái)完成再生。使用通常的雙重參照(對(duì)照參照雙特異性抗體和rhVEGF對(duì)捕捉分子五HisAb的結(jié)合)來(lái)校正傳感圖。用rhVEGF濃度“0”測(cè)量每種抗體的空白。HEK293_Tie2細(xì)胞系的生成為了測(cè)定<Ang-2，VEGF>雙特異性四價(jià)抗體干擾Ang_2刺激的Tie2磷酸化及 Ang-2對(duì)細(xì)胞上的Tie2的結(jié)合，生成重組HEK293_Tie細(xì)胞系。簡(jiǎn)言之，使用Fugene (Roche Applied Science)作為轉(zhuǎn)染試劑將在CMV啟動(dòng)子和新霉素抗性標(biāo)志物控制下編碼全長(zhǎng)人 Tie2 的基于 pcDNA3 的質(zhì)粒(RB22_pcDNA3Topo hTie2)轉(zhuǎn)染入 HEK293 細(xì)胞(ATCC)中，并在DMEM lO^FCSJOOyg/mKMlS中選擇抗性細(xì)胞。經(jīng)由克隆圓筒分離個(gè)別的克隆，隨后通過(guò)FACS來(lái)分析Tie2表達(dá)。克隆22鑒定為即使在沒(méi)有G418的情況中也具有高的且穩(wěn)定的 Tie2表達(dá)的克隆(HEK293-Tie2克隆22)。隨后，使用HEK293_Tie2克隆22來(lái)進(jìn)行細(xì)胞測(cè)定法Ang-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化和Ang-2細(xì)胞配體結(jié)合測(cè)定法。Ang-2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化測(cè)定法依照以下測(cè)定法原理來(lái)測(cè)量<Ang-2，VEGF>雙特異性四價(jià)抗體對(duì)Ang_2誘導(dǎo)的 Tie2磷酸化的抑制。在沒(méi)有或存在Ang-2抗體的情況中用Ang-2刺激HEK293_Tie2克隆
222達(dá)5分鐘，并通過(guò)三明治式ELISA來(lái)量化P_Tie2。簡(jiǎn)言之，將每孔2xl05個(gè)HEK293_Tie2 克隆22細(xì)胞在經(jīng)聚-D-賴氨酸包被的96孔微量滴定板上在100 μ 1 DMEMUO % FCS, 500 μ g/ml遺傳霉素中培養(yǎng)過(guò)夜。次日，在微量滴定板中制備<Ang-2，VEGF>雙特異性四價(jià)抗體的滴定行(4倍濃縮的，75 μ 1終體積/孔，一式兩份)，并將其與75 μ 1 Ang-2 (R&D systems#623-AN]稀釋(3. 2 μ g/ml作為4倍濃縮溶液)混合。將抗體和Ang-2于室溫預(yù)溫育 15 分鐘。將 100 μ 1 混合物添加至 HEK293-Tie2 克隆 22 細(xì)胞(與 ImM NaV3O4，Sigma#S6508 一起預(yù)溫育5分鐘)，并于37°C溫育5分鐘。隨后，將細(xì)胞用每孔200 μ 1冰冷的PBS+lmM NaV3O4 來(lái)清洗，并通過(guò)添加冰上的每孔120 μ 1裂解緩沖液(20mM Tris, pH 8.0、137mM NaClU % NP-40、10%甘油、2mM EDTAUmMNaV3O4UmM PMSF禾口 10 μ g/ml 抑肽酶(Aprotinin))來(lái)裂解。 將細(xì)胞于4°C在微量滴定板搖動(dòng)器上裂解30分鐘，并在沒(méi)有先前離心的情況中及在沒(méi)有總蛋白質(zhì)測(cè)定的情況中將100 μ 1溶胞物直接轉(zhuǎn)移入p-Tie2 ELISA微量滴定板(R&DSystems， R&D#DY990)中。依照制造商的指令來(lái)量化P_Tie2量，并使用Excel的XLf it4分析插件程序(劑量響應(yīng)一位點(diǎn)，205型)來(lái)測(cè)定抑制的IC50值。IC50值可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)比較，但是在實(shí)驗(yàn)間可能存在變化。VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖測(cè)定法選擇VEGF誘導(dǎo)的HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，Promocell #C_12200)增殖以測(cè)量 <Ang-2,VEGF>雙特異性四價(jià)抗體的細(xì)胞功能。簡(jiǎn)言之，將每96孔5000個(gè)HUVEC細(xì)胞(低傳代數(shù)目，小于等于5次傳代)在經(jīng)膠原I包被的BD Biocoat膠原I 96孔微量滴定板(BD #354407/35640)中在 100 μ 1 饑餓培養(yǎng)基(ΕΒΜ-2 內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2、Promocell #C_22211， 0.5% 05、青霉素/鏈霉素)中溫育過(guò)夜。將變化濃度的<Ang-2，VEGF>雙特異性四價(jià)抗體與rhVEGF(30ngl/ml終濃度，BD#354107)混合，并于室溫預(yù)溫育15分鐘。隨后，將混合物添加至HUVEC細(xì)胞，并將它們于37°C，5% CO2 一起溫育72小時(shí)。在分析當(dāng)天，將平板平衡至室溫達(dá)30分鐘，并使用CellTiter-GloTM發(fā)光細(xì)胞存活力測(cè)定試劑盒依照手冊(cè)(Promega， #G7571/2/3)來(lái)測(cè)定細(xì)胞存活力/增殖。在光譜儀中測(cè)定發(fā)光。實(shí)施例1識(shí)別Ang-2和VEGF-A的雙特異性和四價(jià)抗體的生成、表達(dá)、純化和表征在第一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)經(jīng)由(G4S) 4-連接頭將針對(duì)VEGF-A的VH-CL域融合物與識(shí)別Ang-2的抗體的重鏈C端融合(SEQ1或相應(yīng)的IgGl同種異型)來(lái)生成在識(shí)別Ang-2和 VEGF-A的各抗體鏈間沒(méi)有接頭的雙特異性四價(jià)抗體。為了獲得雙特異性四價(jià)抗體，將此重鏈構(gòu)建體與編碼Ang-2抗體的相應(yīng)輕鏈(SEQ3)和識(shí)別VEGF-A的VL-CHl域融合物(SEQ2) 的質(zhì)粒共表達(dá)。圖5中給出了相應(yīng)抗體的方案。通過(guò)經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)在通用方法部分中所描述的那樣生成雙特異性四價(jià)抗體，并在HEK293F細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，如上文所描述的。隨后，通過(guò)蛋白A親和層析和大小排阻層析的組合來(lái)自上清液將其純化。在身份方面(通過(guò)質(zhì)譜術(shù))及在分析特征諸如純度 (通過(guò)SDS-PAGE)、單體含量和穩(wěn)定性方面表征所獲得的產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其包含a)抗體的兩條輕鏈和兩條重鏈，所述抗體特異性結(jié)合第一抗原并包含兩個(gè)Fab片段；b)特異性結(jié)合第二抗原的抗體的兩個(gè)額外的Fab片段，其中所述額外的Fab片段經(jīng)由肽連接頭在a)的重鏈的C或N端融合；其中在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，或者在b)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換，和/或恒定域CL和CHl彼此替換，ii)在a)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換， 及恒定域CL和CHl彼此替換， 且在b)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換， 或恒定域CL和CHl彼此替換，iii)在a)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換，或恒定域CL和CHl彼此替換， 且在b)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換， 及恒定域CL和CHl彼此替換，iv)在a)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換， 且在b)的兩個(gè)Fab片段中， 恒定域CL和CHl彼此替換， 或ν)在a)的兩個(gè)Fab片段中， 恒定域CL和CHl彼此替換， 且在b)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換。
2.依照權(quán)利要求1的雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其中所述額外的Fab片段經(jīng)由肽連接頭與a)的重鏈的C端，或與a)的重鏈的N端融合。
3.依照權(quán)利要求1或2的雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其特征在于 在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中，或者在b)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換， 和/或恒定域CL和CHl彼此替換。
4.依照權(quán)利要求3的雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其特征在于 在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換， 和/或恒定域CL和CHl彼此替換。
5.依照權(quán)利要求4的雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其特征在于 在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在a)的兩個(gè)Fab片段中， 恒定域CL和CHl彼此替換。
6.依照權(quán)利要求3的雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其特征在于 在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在b)的兩個(gè)Fab片段中， 可變域VL和VH彼此替換， 和/或恒定域CL和CHl彼此替換。
7.依照權(quán)利要求6的雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其特征在于 在所述Fab片段中，實(shí)施下列修飾i)在b)的兩個(gè)Fab片段中， 恒定域CL和CHl彼此替換。
8.一種用于制備依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的方法，包括下列步驟a)用包含編碼依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的雙特異性抗原結(jié)合蛋白的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，b)在容許所述抗原結(jié)合蛋白分子合成的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；并c)自所述培養(yǎng)物回收所述抗原結(jié)合蛋白分子。
9.包含依照權(quán)利要求8的載體的宿主細(xì)胞。
10.一種藥物組合物，其包含依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的雙特異性抗原結(jié)合蛋白和至少一種藥學(xué)可接受賦形劑。
11.依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的雙特異性抗原結(jié)合蛋白，其用于治療癌癥。
12.依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的雙特異性抗原結(jié)合蛋白在制造用于治療癌癥的藥物中的用途。
13. 一種用于治療需要治療的患者的方法，其特征在于對(duì)所述患者施用治療有效量的依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的雙特異性抗原結(jié)合蛋白。
全文摘要
雙特異性抗原結(jié)合蛋白、其生成方法、含有所述抗體的藥物組合物、及其用途。
文檔編號(hào)C07K16/22GK102459345SQ201080026530
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者C.克萊因, J.M.尚澤, J.T.雷古拉, S.英霍夫-瓊格, W.謝弗 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司