專利名稱：通過天然感受態(tài)轉(zhuǎn)化屬于鏈球菌屬的細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過天然感受態(tài)(competence)轉(zhuǎn)化屬于鏈球菌屬(Str印tococcus genus)的細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)廣泛用于制造酸乳酪(yoghurt)和瑞士型或意大利型干酪。這些產(chǎn)品具有每年大約四百億美元的市場(chǎng)價(jià)值，從而使嗜熱鏈球菌成為具有巨大市場(chǎng)重要性的物種。即使該細(xì)菌的發(fā)酵性質(zhì)已經(jīng)通過篩選和傳統(tǒng)方法得到逐步改善，但仍然具有通過天然方法或通過遺傳工程進(jìn)一步改善的巨大潛能。為了能夠不使用任何遺傳工程技術(shù)而天然改善嗜熱鏈球菌技術(shù)性能、生理性質(zhì)，在不同培養(yǎng)基中的行為對(duì)于發(fā)酵食品和飼料業(yè)非常重要。所獲得的嗜熱鏈球菌改良株將完全順從于與用于食品和飼料的活微生物相關(guān)的當(dāng)前所有的調(diào)節(jié)。當(dāng)前可利用的嗜熱鏈球菌基因組序列的計(jì)算機(jī)(in silico)分析提示，通過橫向基因轉(zhuǎn)移獲得許多基因(1)。如在使用感受態(tài)作為用于基因組可塑性的整體機(jī)制的病原性鏈球菌中所報(bào)道的，這些橫向基因轉(zhuǎn)移潛在地通過被稱為感受態(tài)的天然轉(zhuǎn)化而發(fā)生。感受態(tài)是細(xì)胞從其環(huán)境中攝取細(xì)胞外(“裸”)DNA并將該DNA (或其部分)整合在其基因組中的能力。感受態(tài)可以分為天然感受態(tài)和人工感受態(tài)。天然感受態(tài)是細(xì)菌菌株在遺傳上具有執(zhí)行該DNA攝取的特定能力。天然感受態(tài)被認(rèn)為是在天然環(huán)境中自發(fā)發(fā)生，并且還在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中觀察到天然感受態(tài)。天然感受態(tài)似乎是鏈球菌的共同特征0，3)。與之相比，人工感受態(tài)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下激發(fā)并由使裸DNA能夠瞬時(shí)透過細(xì)胞組成。因此，天然基因轉(zhuǎn)化是通過天然感受態(tài)使給定細(xì)菌菌株能夠被轉(zhuǎn)化，即被修飾從而將多核苷酸整合至其基因組的過程。在肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)中對(duì)鏈球菌的天然感受態(tài)進(jìn)行了最深入的研究，并且發(fā)現(xiàn)鏈球菌的天然感受態(tài)似乎是鏈球菌種的共同特征。感受態(tài)通常受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)并且包括兩組基因早期感受態(tài)基因和晚期感受態(tài)基因G)。在肺炎鏈球菌中，天然感受態(tài)是依賴于培養(yǎng)基中信息素(CSP)的積累的瞬時(shí)事件。早期感受態(tài)基因編碼二組分系統(tǒng)(TCS =ComD和ComE)，其同族誘導(dǎo)因子(CSP =ComC)和旨在CSP輸出和熟化的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的組分(ComA和ComB)。CSP誘導(dǎo)時(shí)，TCS活化感受態(tài)σ因子ComX(oX)的轉(zhuǎn)錄。該選擇性σ因子由于正調(diào)節(jié)DNA攝取、保護(hù)和整合至染色體所需的所有重要的晚期基因，而是天然感受態(tài)的核心調(diào)節(jié)子。參見圖1的圖示。在嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)基因組中發(fā)現(xiàn)了推定的comX基因和組裝對(duì)嗜熱鏈球菌天然感受態(tài)至關(guān)重要的所有晚期感受態(tài)基因的其他基因(1)。此外，計(jì)算機(jī)鑒定中公認(rèn)為σ χ的推定“ComX-盒”在含有至關(guān)重要的晚期感受態(tài)基因的所有操縱子的上游。 用于天然感受態(tài)的所有至關(guān)重要基因在嗜熱鏈球菌中的這種維持提示其在嗜熱鏈球菌生態(tài)龕位中發(fā)揮重要的生理性功能(將DNA用作養(yǎng)分、基因組可塑性...)(1)。在2006年， Havarstein (5)小組通過使用遺傳工程學(xué)方法發(fā)現(xiàn)天然感受態(tài)在嗜熱鏈球菌LMG18311中的功能性。這通過使用包含在調(diào)節(jié)肽誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下的comX的基于質(zhì)粒的系統(tǒng)而得以實(shí)現(xiàn)(blp系統(tǒng)，(6))。顯著地，利用全部基因組DNA或者線性dsDNA以與肺炎鏈球菌類似的效率實(shí)現(xiàn)了高轉(zhuǎn)化率(10_3至10_2) (5)。值得注意的是，在這種情況下，通過ComX的遺傳工程化誘導(dǎo)使晚期感受態(tài)基因的人工誘導(dǎo)成為可能。然而并且令人驚訝的是，通常發(fā)現(xiàn)于肺炎鏈球菌基因組中并且在天然感受態(tài)的誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的早期感受態(tài)基因無一存在于嗜熱鏈球菌基因組中。最近，證明嗜熱鏈球菌LMD-9能夠在在化學(xué)限定培養(yǎng)基中生長的過程中誘導(dǎo)感受態(tài)。在LMD-9菌株中，發(fā)現(xiàn)在這些條件下尤其需要轉(zhuǎn)運(yùn)子Ami用于 comX的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)(7)。Ami系統(tǒng)主動(dòng)將細(xì)胞外培養(yǎng)基中存在的寡肽輸入并已知在革蘭氏陽性菌中具有營養(yǎng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能(7，8，9)。由于這種化學(xué)限定培養(yǎng)基是不含肽的培養(yǎng)基， Gardan等人(7)預(yù)言在這些生長條件下，細(xì)菌合成并分泌特定的感受態(tài)刺激肽，然后通過 Ami系統(tǒng)感受到該感受態(tài)刺激肽并再次輸入。內(nèi)化后，該現(xiàn)象然后與特定的胞質(zhì)調(diào)節(jié)子相互作用，導(dǎo)致comX的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)(模型可參見圖2)。在化學(xué)限定培養(yǎng)基條件下負(fù)責(zé)comX表達(dá)和天然轉(zhuǎn)化的信息素和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子仍不可知。雖然化學(xué)限定培養(yǎng)基中的天然轉(zhuǎn)化對(duì)于LMD-9菌株非常有效(10_4至10_3)， LMG18311菌株的轉(zhuǎn)化率顯著較低(10_7至10_6)。此外，在化學(xué)限定培養(yǎng)基中生長的 CNRZ1066菌株的情況下，可能檢測(cè)不到轉(zhuǎn)化子(轉(zhuǎn)化率< 10_8) (7)。據(jù)發(fā)明人了解，目前沒有不使用遺傳工程而在嗜熱鏈球菌的菌株中誘導(dǎo)天然感受態(tài)的成功報(bào)道?，F(xiàn)有技術(shù)仍然需要在鏈球菌中、優(yōu)選嗜熱鏈球菌和/或唾液鏈球菌 (Streptococcus salivarius)中誘導(dǎo)天然感受態(tài)的方法，和使用全世界公認(rèn)的非GMO技術(shù)轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了新的疏水短肽aip316，其具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，并且參與嗜熱鏈球菌菌株的天然感受態(tài)。此外，本發(fā)明人還證明了該肽的片段能夠在屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中誘導(dǎo)天然感受態(tài)。aip316具有以下氨基酸序列MKTLKIFVLFSLLIAILPYFAGCL(SEQ ID NO :1)。因此，本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO 1具有至少75%的同一性的肽或者所述肽的片段，其中所述肽或其片段能夠在嗜熱鏈球菌菌株中誘導(dǎo)或提高感受態(tài)。通常，所述肽或其片段能夠在編碼SEQ ID NO 1的基因已被失活的嗜熱鏈球菌菌株LMD-9中誘導(dǎo)或提高感受態(tài)。在本申請(qǐng)中，“本發(fā)明的肽”的表述涵蓋具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的肽、具有與SEQ ID NO 1具有某種相似性(至少75%的同一性)的氨基酸序列的肽和其片段(還稱為“成熟”肽)。本發(fā)明的肽的實(shí)例公開在附文III中。在提及肽時(shí)，“能夠在編碼SEQ ID NO 1的基因已被失活的嗜熱鏈球菌菌株LMD-9 中誘導(dǎo)或提高感受態(tài)”的表述是指能夠在實(shí)驗(yàn)A中將轉(zhuǎn)化率提高至少10倍，優(yōu)選至少50 倍，至少100倍，甚至更優(yōu)選至少1000倍的任何肽。按照實(shí)施例中和以下的描述進(jìn)行測(cè)定肽誘導(dǎo)或提高感受態(tài)的能力的實(shí)驗(yàn)A
將shp316基因(編碼肽Sip316的基因)已失活的LMD-9的突變株，例如LMD9- Δ blp: Pcomx-IuxAB Δ shp316: :P32-cat (該菌株的詳細(xì)信息參見實(shí)施例2)在M17-乳糖培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。收集預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞(5000g，9分鐘，20°C)并在化學(xué)限定培養(yǎng)基(CDM，參見附文 I)中洗滌2次，然后重懸在CDM中。將洗滌后的細(xì)胞稀釋在新鮮的CDM培養(yǎng)基中以獲得在 600nm為0. 05的光密度，然后在37°C孵育。孵育1. 5小時(shí)后，將培養(yǎng)基分為2份試樣，每份 IOmL,并將0或IOOOnM肽加入至所述培養(yǎng)樣本中。最后，將IOmL的每個(gè)試樣分成兩個(gè)樣本， 每個(gè)樣本5mL。所述2個(gè)樣本之一接受1 μ g/mL pGIUD0855ery (具有紅霉素抗性基因的質(zhì)粒)。通過進(jìn)行實(shí)施例1所述的天然轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究樣本的感受態(tài)表型。培養(yǎng)培養(yǎng)物6小時(shí)并將系列稀釋液鋪在含有或不含2. 5 μ g/mL紅霉素的M17-乳糖瓊脂培養(yǎng)基的表面。針對(duì)每個(gè)樣本計(jì)算存在或不存在所述肽時(shí)的轉(zhuǎn)化率，并用總細(xì)菌群中的紅霉素抗性細(xì)胞的比例表不。如果在所述肽存在下的轉(zhuǎn)化率與不存在所述肽的轉(zhuǎn)化率之比為至少10，優(yōu)選至少 50，更優(yōu)選至少100，甚至更優(yōu)選至少1000，則認(rèn)為所述肽已經(jīng)誘導(dǎo)或提高了其中的shp316 基因已失活的LMD-9菌株的感受態(tài)。本發(fā)明的肽與SEQ ID NO :1可具有至少75%同一性，優(yōu)選與SEQ ID NO 1具有至少79%同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少83%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO 1 具有至少87%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少91%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少95%同一性。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的肽的C-末端具有以下氨基酸序列AGCL或 TGCL0根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的肽的C-末端具有以下氨基酸序列 PYFAGCL, LPYFAGCL、ILPYFAGCL、AILPYFAGCL 或 PYFTGCL。在特定的實(shí)施方式中，所述多肽具有以下氨基酸序列 MKTLKIFVLFSLLIPILPYFAGCL(SEQ ID NO :2)。該序列與SEQ ID NO :1具有高于95%的同一性。推定該肽來自嗜熱鏈球菌菌株 CNCM 1-2423 的基因組，該菌株由 Rhodia Food SAS(B. P. 10，Ζ. A. de Buxieres,8622 ODange-Saint-Romain)于2000年4月5日保藏在法國微生物保藏中心(CNCM) (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,28 rue du Docteur Roux,75724 Paris CEDEX 15，F(xiàn)rance)，保藏號(hào)為 CNCM 1-2423。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述肽具有以下氨基酸序列MKKLKLFTLFSLLITILPYFTGCL(SEQ ID NO :3)。該序列與SEQ ID NO 1具有高于79 %的同一性，與SEQ ID NO :1具有高于 83%的相似性。推定該肽來自現(xiàn)有技術(shù)已知的菌株唾液鏈球菌菌株SK126(登錄號(hào)NZ_ ACL001000018)的基因組。因此，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽可以與SEQ ID NO :1具有至少79%相似性，優(yōu)選與SEQ ID NO 1具有至少83%相似性，更優(yōu)選與SEQ ID NO 1具有至少87%相似性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少91%相似性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID N0:1具有至少95%相似性。通過使用基于化學(xué)相似性或氨基酸之間的進(jìn)化距離的相似性打分矩陣測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的相似性。通常使用的這種矩陣的實(shí)例為BL0SUM62矩陣(12)，其是BLAST 組程序的缺省矩陣。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽可以-與SEQID NO :1具有至少75%同一性，優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少79%同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少83%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少 87%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少91%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性。-與SEQID NO 1的第6- 位具有至少84%同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO 1的第6- 位(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 4)具有至少89%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO=I的第 6-24位(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 4)具有至少94%同一性。不期望受理論束縛，Shp316被認(rèn)為是感受態(tài)誘導(dǎo)肽的前體；Shp316被熟化并以片段的形式(稱為“成熟” Shp316)且以臨界濃度被分泌在細(xì)胞外培養(yǎng)基中，所述“成熟” Shp316通過comX表達(dá)的活化而誘導(dǎo)感受態(tài)。寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)子Ami在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)放大中的參與(7)以及Rgg調(diào)節(jié)子STER_0316(參見實(shí)施例1)的參與進(jìn)一步表明，“成熟”》ιρ316 被重輸送至細(xì)胞中以與STER_0316相互作用。這種相互作用然后將活化STER_0316，其反過來將直接或者不直接誘導(dǎo)comX轉(zhuǎn)錄(模型參見圖5)。通常，本發(fā)明的肽可以包含至少7個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少6個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少5個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少4個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明的肽包含至多M個(gè)氨基酸，至多23個(gè)氨基酸，至多22個(gè)氨基酸，至多21個(gè)氨基酸，至多20個(gè)氨基酸，優(yōu)選至多19個(gè)、至多18個(gè)、至多17個(gè)、至多16個(gè)、至多 15個(gè)、至多14個(gè)、至多13個(gè)、至多12個(gè)、至多11個(gè)、至多10個(gè)、至多9個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至多8個(gè)、至多7個(gè)、至多6個(gè)、至多5個(gè)氨基酸或至多4個(gè)氨基酸。Shp316顯示帶正電荷的N-末端，疏水核心和短的C-末端序列(CL)。對(duì)應(yīng)于氨基酸第 6-24 位的序列是序列IFVLFSLLIAILPYFAGCL(SEQ ID NO 4)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽包含氨基酸序列AGCL或TGCL。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽包含氨基酸序列PYFAGCL、LPYFAGCL、 ILPYFAGCL、AILPYFAGCL 或 PYFTGCL。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽包含來自SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的至少 7個(gè)，優(yōu)選至少6個(gè)，甚至更優(yōu)選至少5個(gè)，甚至更優(yōu)選至少4個(gè)連續(xù)氨基酸。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽具有氨基酸序列PYFAGCL，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1的第18-M位。推定該肽來自嗜熱鏈球菌菌株LMD-9或菌株CNCM H423的基因組。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽具有氨基酸序列PYFTGCL，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:3的第18- 位。推定該肽來自現(xiàn)有技術(shù)已知的唾液鏈球菌菌株SK126(登錄號(hào)NZ_ ACL001000018)的基因組。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽具有選自附文III中公開的序列的氨基酸序列?！矫?，本發(fā)明還涉及編碼上文描述的肽的分離的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述分離的核酸包含SEQ ID NO :6中所示的序列或與SEQ ID NO 6具有至少80%同一性的序列。
SEQ ID NO 6對(duì)應(yīng)于shp316 (Shp316的編碼基因)并對(duì)應(yīng)于以下序列TTGAAAACCCTGAAAATATTTGTACTATTTTCACTACTTATTGCTATCTTGCCTTATTTTGCAGGATGT CTTTAA所述分離的核酸可以與SEQ ID NO 6具有至少80%同一性，優(yōu)選與SEQ ID NO 6 具有至少85%同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO :6具有至少90%同一性，更優(yōu)選與SEQ ID NO: 6具有至少95%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :6具有至少98%同一性。在具體的實(shí)施方式中，所述分離的核酸具有以下序列TTGAAAACCCTGAAAATATTTGTACTATTTTCACTACTTATTCCTATCTTGCCTTATTTTGCAGGATGT CTTTAA(SEQ ID NO 7)該序列與SEQ ID NO :6具有高于98%同一性，并且在嗜熱鏈球菌菌株CNCM 1-2423的基因組中檢測(cè)到該序列。在具體的實(shí)施方式中，所述分離的核酸具有以下序列TTGAAAAAACTAAAATTATTTACACTATTCTCACTACTTATCACTATCTTGCCCTATTTTACAGGTTGT CTTTAA(SEQ ID NO 8)該序列與SEQ ID NO :6具有高于84%同一性，并且在唾液鏈球菌菌株SK126 (登錄號(hào)NZ_ACL001000018)的基因組中檢測(cè)到該序列。本發(fā)明還涉及包含上文所述的分離核酸的載體。通常，所述載體可以為質(zhì)粒，即作為自復(fù)制(即其包含復(fù)制起點(diǎn))或整合載體的環(huán)形雙鏈DNA分子。上文描述的肽、核酸和載體可在屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中、尤其是屬于嗜熱鏈球菌種或唾液鏈球菌種的細(xì)菌中用于誘導(dǎo)或提高感受態(tài)。因此，本發(fā)明的肽、核酸和載體可通過天然遺傳轉(zhuǎn)化用于轉(zhuǎn)化屬于鏈球菌屬的細(xì)菌，尤其是屬于嗜熱鏈球菌種或唾液鏈球菌種的細(xì)菌。因此，本發(fā)明還涉及在屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中誘導(dǎo)感受態(tài)的方法，所述方法包括用上文描述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌的步驟。本發(fā)明還涉及在屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中誘導(dǎo)和/或提高感受態(tài)的方法(方法B)， 其中在包含本發(fā)明的肽和/或產(chǎn)生本發(fā)明的肽的細(xì)菌的培養(yǎng)基中孵育所述細(xì)菌。本發(fā)明還涉及所述感受態(tài)細(xì)菌和通過該方法B可獲得的具有改良的感受態(tài)的細(xì)菌。特別地，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含-在第一部分中的屬于鏈球菌屬的細(xì)菌；和-在第二部分中的本發(fā)明的肽和/或產(chǎn)生本發(fā)明的肽的細(xì)菌。本發(fā)明還涉及通過用多核苷酸的天然遺傳轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化屬于鏈球菌屬的細(xì)菌的方法(方法C)，所述方法包括以下步驟a)向?qū)儆阪溓蚓鷮俚乃黾?xì)菌的培養(yǎng)基中加入本發(fā)明的肽和/或產(chǎn)生本發(fā)明的肽的細(xì)菌和b)加入所述多核苷酸。步驟a)和b)可以順次或同時(shí)進(jìn)行。根據(jù)該方法，在包含以下組分的生長培養(yǎng)基中孵育所述細(xì)菌
a)本發(fā)明的肽。所述肽可以以多種方式加入。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將所述肽直接加入至所述培養(yǎng)基中。通常，所述肽可以是合成肽或重組肽。獲得肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。通常，所述肽可以以IOOnM-IO μ M，優(yōu)選500ηΜ_2500ηΜ，甚至更優(yōu)選 200ηΜ-2000ηΜ，甚至更優(yōu)選約IOOOnM的濃度使用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽被細(xì)菌分泌，其作為共培養(yǎng)物加入至屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中。b)多肽，其待轉(zhuǎn)化屬于鏈球菌屬的細(xì)菌。通常，所述多核苷酸在引入至細(xì)菌中時(shí)賦予細(xì)菌目的表型，即噬菌體抗性、蛋白水解活性、胞外多糖生物合成、天然感受態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸是包含如上文描述shp316基因的核酸。所述多核苷酸可以，例如編碼蛋白，例如蛋白酶、肽酶、糖基轉(zhuǎn)移酶或細(xì)菌素。通常，所述多核苷酸可以是基因序列的一部分、一個(gè)基因序列或多個(gè)基因序列。所述多核苷酸可以是線性或環(huán)形的。通常，所述多核苷酸可以是質(zhì)粒，其在所轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中可以自復(fù)制或者不可自復(fù)制。通常，所述多核苷酸可以經(jīng)設(shè)計(jì)以有助于通過同源重組將其引入至細(xì)菌的基因組中。所述多核苷酸可以是單鏈的線性DNA。通常，所述多核苷酸的尺寸包括10bp-100kbp，優(yōu)選IOObp-IOkbp或100bp_50kbp， 更優(yōu)選500bp-30kbp，甚至更優(yōu)選lkbp-20kbp，更優(yōu)選500bp_25kbp，甚至更優(yōu)選 lkbp_16kbp。通常，多核苷酸在生長培養(yǎng)基中的濃度包括0. lyg/L_2g/L，優(yōu)選0.5 μ g/ L-1. 5g/L，更優(yōu)選 1 μ g/L-lg/1。本發(fā)明還涉及通過上述方法C獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)菌。通過將來自一個(gè)菌株的DNA的目的特征(蛋白水解活性、氨基酸生物合成、細(xì)菌素生產(chǎn)、胞外多糖生產(chǎn)、有利代謝物的生產(chǎn)、噬菌體抗性、天然感受態(tài)...)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)菌株，并允許在相同遺傳背景下產(chǎn)生獨(dú)特的組合，上述肽、核酸、載體、方法和細(xì)菌可用于改善用于發(fā)酵食品和飼料業(yè)(或使用嗜熱鏈球菌或唾液鏈球菌的其它行業(yè))的鏈球菌菌株，并且尤其是嗜熱鏈球菌或唾液鏈球菌的菌株。根據(jù)期望的特征選擇合適的多核苷酸用于這種轉(zhuǎn)化在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。從上述方法(方法B和C)獲得的屬于鏈球菌屬的細(xì)菌可用于食品業(yè)，尤其是奶產(chǎn)品的制造中。通常，上述細(xì)菌歸屬于“公認(rèn)安全使用物質(zhì)”(GRAS)。因此，本發(fā)明還涉及獲得食品或飼料產(chǎn)品的方法，所述方法包括使用通過上述方法(方法B和C)獲得的細(xì)菌的步驟。本發(fā)明還涉及通過所述方法可獲得的食品或飼料產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及包含上述方法(方法B和C)獲得的細(xì)菌的食品或飼料產(chǎn)品。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)于上述方法(方法B和方法C)，所述屬于鏈球菌屬的細(xì)菌表達(dá)編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子STER_0316的基因STER_0316。確實(shí)，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了用于阻斷屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中，尤其是屬于嗜熱鏈球菌種的細(xì)菌中的天然感受態(tài)的方法。確實(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Shp316(或任意“成熟”的》!ρ316)及其同族調(diào)節(jié)子(cognate regulator) STER_0316是天然感受態(tài)必需的。因此，本發(fā)明另一方面涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(Rgg) STER_0316 (SEQ ID NO :9)。本發(fā)明因此涉及具有SEQ ID NO :9所示的氨基酸序列的多肽或與SEQ ID N0:9具有至少85%同一性、優(yōu)選與SEQ ID NO :9具有至少90%同一性、更優(yōu)選與SEQ ID NO :9具有至少95%同一性、甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :9具有至少98%同一性的其變體。在具體的實(shí)施方式中，所述多肽具有序列SEQ ID NO :10。該序列與SEQ ID NO :9具有高于98%的同一性，并且推定其來自嗜熱鏈球菌菌株 CNCM 1-2423的基因組。在具體的實(shí)施方式中，所述多肽具有序列SEQ ID NO 11。該序列與SEQ ID NO :9具有高于93 %的同一性，并且推定來自唾液鏈球菌菌株 SK126的基因組。本發(fā)明還涉及分離的核酸STER_0316(其編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子STER_0316)，其包含SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO 12具有至少80%同一性、優(yōu)選與SEQ ID NO 12具有至少85%同一性、優(yōu)選與SEQ ID NO :12具有至少90%同一性、更優(yōu)選與SEQ ID N0:12具有至少95% 同一性、甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :12具有至少98%同一性的其變體。在具體的實(shí)施方式中，所述分離的核酸具有序列SEQ ID NO :13。該序列與SEQ ID NO :12具有高于99 %同一性，并且在嗜熱鏈球菌菌株CNCM 1-2423的基因組中檢測(cè)到該序列。在具體的實(shí)施方式中，所述分離的核酸具有序列SEQ ID NO :14。該序列與SEQ ID NO :12具有高于91%的同一性，并且在唾液鏈球菌菌株SKU6的基因組中檢測(cè)到該序列。本發(fā)明還涉及阻斷屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中，尤其是屬于嗜熱鏈球菌種或唾液鏈球菌種的細(xì)菌中的天然感受態(tài)的方法，所述方法包括使STER_0316基因和/或shp316基因失活的步驟。本發(fā)明還涉及提高屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中，尤其是屬于嗜熱鏈球菌種或唾液鏈球菌種的細(xì)菌中的天然感受態(tài)的方法，所述方法包括過表達(dá)STER_0316基因和/或shp316基因的步驟。術(shù)語“ STER_0316基因”和“ shp316基因”包括嗜熱鏈球菌菌株LMD-9的上述 STER_0316和shp316基因(分別為SEQ ID N0:12禾口 SEQ ID NO 6)以及嗜熱鏈球菌菌株 CNCM 1-2423和唾液鏈球菌SKU6和其他嗜熱鏈球菌種或唾液鏈球菌種中各自的同源物。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及不能表達(dá)STER_0316和/或shp316或在其基因組中沒有這些基因的細(xì)菌的突變體，其中引入了 STER_0316和/或shp316基因。


圖1 用于肺炎鏈球菌和變形鏈球菌(S. mutans)中的DNA轉(zhuǎn)化的感受態(tài)的誘導(dǎo)圖示(1)在肺炎鏈球菌和變形鏈球菌生長過程中，引發(fā)感受態(tài)信息素基因comC的前體的轉(zhuǎn)錄。
(2和3)翻譯基因comC并通過ComAB ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)子將其分泌在細(xì)胞外培養(yǎng)基中。 在其分泌過程中，前體肽ComC熟化成在細(xì)胞外培養(yǎng)基中聚集的CSP肽。(4)在臨界濃度，成熟CSP被組氨酸激酶ComD識(shí)別，組氨酸激酶ComD催化其自磷酸化。(5)磷酸基團(tuán)被轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)調(diào)節(jié)子ComE，使其活化。(6)磷酸化的ComE調(diào)節(jié)子活化comX和早期至關(guān)重要的感受態(tài)基因comAB⑶E的轉(zhuǎn)錄。(7) comX與RNA聚合酶核心結(jié)合并活化對(duì)DNA轉(zhuǎn)化至關(guān)重要的基因的轉(zhuǎn)錄。圖2 在化學(xué)限定培養(yǎng)基(CDM)中的菌株LMD-9中comX表達(dá)誘導(dǎo)的模型圖示(改自 Gardan et al. ,2009 ；J.Bacteriol)(1)在CDM生長條件中，可能誘導(dǎo)編碼感受態(tài)信息素的前體的特定基因的表達(dá)。(2)相應(yīng)的信息素被翻譯并且可能然后被分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中，在此其可能最終被熟化⑶。(4)在臨界濃度，所述感受態(tài)信息素可能被特異識(shí)別并且被Ami轉(zhuǎn)運(yùn)子內(nèi)化。(5)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，信息素可能與導(dǎo)致其活化和隨后的comX轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子相互作用(6)。圖3 用于測(cè)試嗜熱鏈球菌LMD-9、LMG18311和CNRZ1066的天然轉(zhuǎn)化率的策略的圖示用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的外源DNA是自殺質(zhì)粒pGIUD0855ery。該質(zhì)粒是pUC18的衍生物， 包含約11Λ的兩個(gè)片段，該兩個(gè)片段對(duì)應(yīng)于來自菌株LMG18311的stu0855的上游(UP)和下游(DOWN)區(qū)。所述質(zhì)粒還包含由啟動(dòng)子PCTy和紅霉素抗性基因ery的融合體組成的表達(dá)盒。分別將stu0855的上游和下游區(qū)克隆在pUC18的PCTy-ery表達(dá)盒的上游和下游，以獲得質(zhì)粒pGIUD0855ery。在天然轉(zhuǎn)化過程中，PGIUD0855ery的表達(dá)盒PCTy_ery將通過雙同源重組(用虛線表示)整合在STER_0891基因座(stu0855或str0855基因座，取決于受體菌株)，并取代染色體中的STER_0891開放閱讀框(或stu0855或str0855開放閱讀框)。 用于檢測(cè)PCTy_ery在預(yù)期基因座的整合的引物對(duì)upstu0855/DOwnstu0855用箭頭表示。圖4 用于構(gòu)建嗜熱鏈球菌LMD-9 Δ (StblpD-StblpX) Pcomx-IuxAB的策略的圖示載體pGIUDblp 是 pGhost9 的衍生物(Maguin, E.，P. Duwat, T. Hege, D. Ehrlich, and A.Gruss. 1992. New thermosensitive plasmid for gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 174 :5633-5638)。通過接連克隆分別對(duì)應(yīng)于LMD-9菌株的Blp細(xì)菌素基因的上游(UP)和下游(DOWN)區(qū)的約11Λ的兩個(gè)片段而獲得該載體。pGIUDblp載體還包含由來自嗜熱鏈球菌LMD-9的啟動(dòng)子P。。mX和來自發(fā)光桿菌(Wiotorabdus luminescens) 的IuxAB基因之間的融合體組成的表達(dá)盒(所述融合體描述在圖下側(cè))。在pGIUDblp的上游和下游區(qū)之間克隆該表達(dá)盒。如之前的描述(Maguin, E.，H. Prevost, S. D. Ehrlich, 以及 A. Gruss. 1996. Efficient insertional mutagenesis in lactococci and other gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 178 :931-935)，通過兩步同源重組過程用 Pcomx-IuxAB盒取代blp基因(用虛線表示)。圖5 在化學(xué)限定培養(yǎng)基(CDM)中的菌株LMD-9中comX表達(dá)誘導(dǎo)的模型圖示(由以上描述的實(shí)施例推定)
(1)在CDM生長條件下，引發(fā)感受態(tài)信息素基因shp316的前體的轉(zhuǎn)錄。(2和幻翻譯基因shp316并通過仍未鑒定的分泌系統(tǒng)將其分泌在細(xì)胞外培養(yǎng)基中。前體肽aip316熟化并在細(xì)胞外培養(yǎng)基中聚集。(4)在臨界濃度，成熟》ιρ316*被識(shí)別并且被寡肽Ami轉(zhuǎn)運(yùn)子內(nèi)化。(5)成熟與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子STER_0316相互作用并活化之。(6)調(diào)節(jié)子 STER_0316 活化 comX 和 shp316 的轉(zhuǎn)錄。圖6 在嗜熱鏈球菌中進(jìn)行靶向誘變的策略的圖示(1)進(jìn)行三個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)以擴(kuò)增片段A、B和C。片段A對(duì)應(yīng)于目的基因(即必須刪除的基因)的上游區(qū)。用引物對(duì)0L1/0L2擴(kuò)增片段A。片段B對(duì)應(yīng)于氯霉素表達(dá)盒 P32-Cat并且用引物對(duì)0L3/0L4擴(kuò)增。片段C對(duì)應(yīng)于目的基因的下游區(qū)并用引物對(duì)0L5/0L6 擴(kuò)增。0L3和0L4的序列分別與0L2的5’末端和0L5的5’末端互補(bǔ)(淺灰線表示)。(2)以等摩爾濃度混合PCR產(chǎn)物A、B和C。(3)利用引物對(duì)0L1/0L6進(jìn)行重疊PCR以將片段A、B和C連接在一起。(4)通過天然感受態(tài)將重疊PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到在CDM中生長的LMD-9 Δ (StblpD-Stb ΙρΧ) Pcomx-IuxAB菌株中。通過雙同源重組用P32-cat表達(dá)盒取代目的基因。圖7 用于檢測(cè)嗜熱鏈球菌菌株的天然轉(zhuǎn)化率的策略的圖示用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的外源DNA是自殺質(zhì)粒pGID0855cat。該質(zhì)粒是pUC18的衍生物， 包含約11Λ的兩個(gè)片段，該兩個(gè)片段對(duì)應(yīng)于來自菌株LMG18311的stu0855的上游(UP)和下游(DOWN)區(qū)。所述質(zhì)粒還包含由來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的組成型啟動(dòng)子P32和氯霉素抗性基因cat之間的融合體組成的表達(dá)盒。在pGID0855cat的上游和下游區(qū)之間克隆該表達(dá)盒。在天然的轉(zhuǎn)化過程中，PGIUD0855cat的P32_cat表達(dá)盒將通過雙同源重組整合在stu0855基因座(用虛線表示)，并取代染色體中的stu0855開放閱讀框。用于檢測(cè)P32-Cat在預(yù)期基因座的整合的引物對(duì)upstu0855/DOwnstu0855用箭頭表示。在任何試驗(yàn)前通過PCR檢測(cè)所有嗜熱鏈球菌中stu0855基因座的存在(數(shù)據(jù)未顯示)。圖8 :42°C培養(yǎng)在牛奶中的CNRZ1066和CNRZ1066prtS的酸化動(dòng)力學(xué)圖9 菌株LMD_9(A)和菌株LMG18311(B)中的his基因座的圖示小黑箭頭表示在進(jìn)一步構(gòu)建和分析中使用的引物。圖10 在嗜熱鏈球菌中進(jìn)行靶向誘變的策略的圖示(1)進(jìn)行三個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)以擴(kuò)增片段A、B和C。片段A對(duì)應(yīng)于目的基因(即必須刪除的基因)的上游區(qū)。用引物對(duì)UP1/UP2(黑箭頭)擴(kuò)增片段A。片段B對(duì)應(yīng)于氯霉素表達(dá)盒P32-Cat并且用引物對(duì)UploX66/DNloX71擴(kuò)增。片段C對(duì)應(yīng)于目的基因的下游區(qū)并用引物對(duì)DN1/DN2擴(kuò)增。Uplox66和DNlox71的序列分別與UP2的5，末端和DNl的5，末端互補(bǔ)。(2)以等摩爾濃度混合PCR產(chǎn)物A、B和C。(3)利用引物對(duì)UP1/DN2進(jìn)行重疊PCR以將片段A、B和C連接在一起。(4)通過天然感受態(tài)將重疊PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到在CDM中生長的LMD-9菌株中。通過雙同源重組用P32-cat表達(dá)盒取代目的基因。圖11 通過Cre介導(dǎo)的刪除實(shí)現(xiàn)從染色體除去lOX66-P32Cat-lOX71表達(dá)盒在Cre重組后，將突變1οχ66和1οχ71位點(diǎn)重組至大幅降低對(duì)于Cre的結(jié)合親和性的雙突變1οχ72位點(diǎn)中。圖12 :LMD-9 (方形)和LMD-9 δ His (三角形)在CDM(黑色符號(hào))和缺乏組氨酸的CDM(白色符號(hào))中的生長比較圖13 :LMG18311(方形)和LMG18311 :His (三角形)在CDM(黑色符號(hào))和缺乏組氨酸的CDM(白色符號(hào))中的生長比較圖14 :LMG18311、LMG18311: :His和通過用LMD-9DNA提取物天然誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得的多個(gè)his陽性分離物在缺乏組氨酸的CDM中的生長比較
實(shí)施例下文描述的試驗(yàn)提供了嗜熱鏈球菌和唾液鏈球菌中的天然感受態(tài)嚴(yán)格依賴于源自由shp316基因編碼的Sip316肽的信號(hào)肽的分泌和感受的證據(jù)。具體地，以下實(shí)施例證明 基因STER_0316(SEQ ID NO :12)編碼負(fù)責(zé)comX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(Rgg) (SEQ ID NO 9)?！?shp316基因(SEQ ID NO 6)是用于感受態(tài)信息素Sip316 (短疏水肽316)的結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO :1)。 可以通過帶有shp316的質(zhì)粒修復(fù)shp316刪除的菌株的感受態(tài)缺陷。 可以通過在培養(yǎng)基中加入源自Sip316的合成肽而修復(fù)shp316刪除的菌株的感受態(tài)缺陷。 可以通過在培養(yǎng)基中加入源自Sip316的合成肽而改善化學(xué)限定培養(yǎng)基(CDM) 中菌株嗜熱鏈球菌LMG18311和CNRZ1066以及唾液鏈球菌JIM8777的低轉(zhuǎn)化率。 源自》!ρ316的合成肽能夠在多數(shù)嗜熱鏈球菌菌株中誘導(dǎo)天然感受態(tài)。 天然感受態(tài)可以用于有利地修飾嗜熱鏈球菌菌株的功能特征，例如營養(yǎng)要求和酸化特征。對(duì)于嗜熱鏈球菌LMD-9、LMG18311和CNRZ1066 (它們是通常安全的嗜熱鏈球菌菌株)和唾液鏈球菌JIM8777(其是從人口腔分離的)進(jìn)行試驗(yàn)。還在試驗(yàn)6中對(duì)其它菌株進(jìn)行測(cè)試。1. STER_0316的刪除損害了 CDM中的comX誘導(dǎo)和天然轉(zhuǎn)化為了具有在comX基因的啟動(dòng)子控制下的發(fā)光基因，構(gòu)建了嗜熱鏈球菌菌株。 在這種構(gòu)建體中，僅在表達(dá)comX基因時(shí)才將測(cè)定到發(fā)光增加。將所構(gòu)建的菌株命名為 LMD9-Ablp::P。。mX-luxAB。該構(gòu)建體在圖4中顯示。在該構(gòu)建體中，部分blp操縱子(自 blpD至blpX)被刪除(6)并且被報(bào)告子盒取代，在所述報(bào)告子盒中來自發(fā)光桿菌的熒光素酶基因IuxAB與P。。mX融合。選擇該啟動(dòng)子，原因是其證明在生長在CDM中的嗜熱鏈球菌 LMD-9的天然感受態(tài)的形成過程中，comX被強(qiáng)烈誘導(dǎo)(7)。發(fā)明人在LMD9_Ablp: Pcomx-IuxAB菌株中進(jìn)行了 Rgg編碼基因STER_0316的刪除。用于進(jìn)行靶向誘變的方法描述在下文(參見圖6)。通過重疊PCR體外制備含期望插入/刪除的DNA片段并通過感受態(tài)轉(zhuǎn)移至CDM培養(yǎng)條件中的LMD9- Ablp:: Pcomx-IuxAB菌株中(7)。重疊片段由位于靶基因側(cè)翼并被P32-cat片段分開的兩個(gè)1.21Λ的重組片段構(gòu)成 (圖6)。然后在含氯霉素(5 μ g/mL氯霉素)的M17-乳糖瓊脂培養(yǎng)基上選擇期望的突變體并利用引物對(duì)Ch0316A/Ch0316B通過PCR檢測(cè)其身份。使用以下引物OLl 5' -AAACAATGGTGGCCCAGGATCAATGATTGGG-3‘0L2 5' -CCTTATGGGATTTATCTTCCTTAGATTCTTAGTCCAATGCT-3‘0L3 5' -TAAGGAAGATAAATCCCATAAGG-3‘0L4 5' -TTCACGTTACTAAAGGGAATGTA-3‘0L5 5' -TACATTCCCTTTAGTAACGTGAAGTTTTGGAAGACTCGG-3‘0L6 5' -CAATAATAGCAGTATTGACCTGACTATTTGCCTCC-3‘Ch0316A 5' -TAAGAGTGCTATTGGTGTTCTCTTGC-3‘Ch0316B 5' -TCATGGAATTTCACCTCAATTTCTTGC-3‘通過監(jiān)測(cè)CDM生長條件下由P。。mX驅(qū)動(dòng)的發(fā)光來計(jì)算Rgg-編碼基因STER_0316的刪除對(duì)感受態(tài)的影響。在M17-乳糖培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)LMD9-Ablp: :P。。mX-luxAB衍生物。收集預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞(5000g，9分鐘，20°C)并在CDM培養(yǎng)基中洗滌2次。利用洗滌后的細(xì)胞接種 CDM培養(yǎng)基以獲得在600nm為0. 05的光密度。然后將小體積嗜熱鏈球菌培養(yǎng)物(300 μ 1) 轉(zhuǎn)移在透明底的白色微孔板(655095 ；Greiner, Alphen a/d Rijn, The Netherlands)中并在37°C培養(yǎng)。利用自動(dòng)化Synergy HT多模式微孔板讀數(shù)儀記錄在595nm的發(fā)光和在600nm 的光密度(0D·)。由LuxAB催化的熒光素酶活性需要壬醛存在作為底物。在該實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人通過將在礦物油中稀釋的含壬醛(Acros Organics ref. 204-688-5)的50 μ 1溶液放置于帶蓋微孔板的孔之間的空隙內(nèi)，而向培養(yǎng)物中提供揮發(fā)形式的壬醛(11)。溶液中存在的壬醛將揮發(fā)并將在空氣和培養(yǎng)樣本之間形成壬醛濃度的平衡。在6小時(shí)內(nèi)每10分鐘掃描一次發(fā)光和吸光度。將突變菌株的最大RLU/0D與原始菌株進(jìn)行比較。Rgg基因STER_0316 的刪除對(duì) LuxAB 活性具有負(fù)作用(LMD9-Ablp: Pcomx-IuxAB Δ STER_0316: :P32_cat 突變體結(jié)果示于表1 ；對(duì)于每次實(shí)驗(yàn)僅顯示最大RLU/0D值)。表1 在CDM中培養(yǎng)的LMD9_Ablp: Pcomx-IuxAB衍生物的最大熒光素酶活性
Rgg編碼基因被刪除菌株最大熒光素酶活性 (RLU/OD)無\MD9-Ablp·. -.YcomX-IuxAB9970STER—0316lMD9^blp\: comX-luxAB ASTER_0316::P32cat103.8確實(shí)，在菌株LMD9-Ablp: :Pc。mX_luxAB Δ STER_0316: :P32_cat 中測(cè)定的最大 RLU/0D值比親本菌株中低96倍。這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)子STER_0316是控制comX表達(dá)的主要因子。由于證明STER_0316的刪除顯著降低了 comX的轉(zhuǎn)錄，預(yù)期菌株 LMD9-Ablp: Pcomx-IuxAB ASTER_0316: :P32_cat中的感受態(tài)也將受到影響。確實(shí)，已知 ComX是負(fù)責(zé)表達(dá)晚期感受態(tài)基因的主要σ因子。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)工作，比較了菌株LMD9-Ablp: Pramx-IuxAB和LMD9-Ablp: Pcomx-IuxAB Δ STER_0316: :P32_cat的轉(zhuǎn)化率。這兩個(gè)菌株均對(duì)紅霉素敏感。供體DNA是質(zhì)粒pGIUD0855ery (圖幻。該質(zhì)粒在嗜熱鏈球菌中不能復(fù)制，其包含與 stu0855(來自LMG18311菌株的嗜熱鏈球菌基因)的左末端和右末端融合的可操作紅霉素抗性基因(PCTy_ery)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以在獲得PCTy_ery表達(dá)盒時(shí)賦予菌株LMD-9紅霉素抗性。在存在或不存在所添加的質(zhì)粒pGIUD0855ery的情況下，在含300 μ LCDM的微孔板中培養(yǎng)兩個(gè)菌株。按照以上描述進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)和培養(yǎng)。在一組實(shí)驗(yàn)中，在接種的同時(shí)將ι μ g/ mL質(zhì)粒pGIUD0855ery添加至培養(yǎng)物中，在第二組實(shí)驗(yàn)中沒有添加質(zhì)粒DNA。培養(yǎng)所述培養(yǎng)物6小時(shí)并將系列稀釋物鋪在含紅霉素的M17-乳糖瓊脂培養(yǎng)基的表面。下表2顯示了所述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表2 添加或沒有添加供體DNA(lyg/mL)時(shí)生長在CDM中的 LMD9- Ablp: Pcomx-IuxAB 衍生物的轉(zhuǎn)化率
權(quán)利要求
1.具有SEQID NO :1所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO :1具有至少75%同一性的肽或所述肽的片段，其中所述肽或所述片段能夠誘導(dǎo)或提高嗜熱鏈球菌(S. thermophilus) 菌株的感受態(tài)。
2.如權(quán)利要求1所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段能夠誘導(dǎo)或提高其中編碼 SEQ ID NO 1的基因已經(jīng)被失活的嗜熱鏈球菌菌株LMD-9的感受態(tài)。
3 如權(quán)利要求1或2所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段-與SEQ ID NO :1具有至少75%同一性，優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少79%同一性， 更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少83%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少87%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :1具有至少91%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID N0:1具有至少95%同一性；和-與SEQ ID NO :1的第6- 位具有至少84%同一性，更優(yōu)選與SEQ ID N0:1的第6- 位(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 4)具有至少89%同一性，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO 1的第6- 位 (對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 4)具有至少94%同一性。
4.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含至少7個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少6個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少5個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少4個(gè)氨基酸。
5.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含至多M個(gè)氨基酸，至多23個(gè)氨基酸，至多22個(gè)氨基酸，至多21個(gè)氨基酸，至多20個(gè)氨基酸，優(yōu)選至多 19個(gè)、至多18個(gè)、至多17個(gè)、至多16個(gè)、至多15個(gè)、至多14個(gè)、至多13個(gè)、至多12個(gè)、至多11個(gè)、至多10個(gè)、至多9個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至多8個(gè)、至多7個(gè)、至多6個(gè)、至多5個(gè)或至多4個(gè)氨基酸。
6.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含SEQID NO 2所示的氨基酸序列。
7.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含SEQID NO 3所示的氨基酸序列。
8.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段包含SEQID NO 4所示的氨基酸序列。
9.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段的C-末端具有選自AGCL或TGCL的氨基酸序列。
10.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段的C-末端具有選自 PYFAGCL、LPYFAGCL、ILPYFAGCL、AILPYFAGCL、PYFTGCL 的氨基酸序列。
11.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段示于附文III中。
12.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段是氨基酸序列 AGCL或TGCL，或包含氨基酸序列AGCL或TGCL。
13.如前述任一個(gè)權(quán)利要求所述的肽或其片段，其中，所述肽或其片段是以下氨基酸序列或包含以下氨基酸序列PYFAGCL、LPYFAGCL、ILPYFAGCL、AILPYFAGCL 或 PYFTGCL。
14.分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的肽或其片段。
15.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其中，所述分離的核酸包含SEQID NO :6所示的序列或與SEQ ID NO :6具有至少80%同一性的序列。
16.如權(quán)利要求15所述的分離的核酸，其具有SEQID NO :7所示的序列。
17.如權(quán)利要求16所述的分離的核酸，其具有SEQID NO :8所示的序列。
18.載體，其包含權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的分離的核酸。
19.誘導(dǎo)和/或提高屬于鏈球菌屬(Str印tococcusgenus)的細(xì)菌的感受態(tài)的方法，其中，在包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的肽和/或產(chǎn)生權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的肽的細(xì)菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌。
20.試劑盒，其包含-在第一部分中的屬于鏈球菌屬的細(xì)菌；和-在第二部分中的權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的肽和/或產(chǎn)生權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的肽的細(xì)菌。
21.通過用多核苷酸的天然遺傳轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化屬于鏈球菌屬的細(xì)菌的方法，所述方法包括以下步驟a)向?qū)儆阪溓蚓鷮俚乃黾?xì)菌的培養(yǎng)基中加入權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的肽和/或產(chǎn)生權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的肽的細(xì)菌和b)加入所述多核苷酸。
22.通過權(quán)利要求19或21所述的方法獲得的細(xì)菌。
23.獲得食品或飼料產(chǎn)品的方法，其包括使用權(quán)利要求22所述的細(xì)菌的步驟。
24.通過權(quán)利要求23所述的方法獲得的食品或飼料產(chǎn)品。
25.食品或飼料產(chǎn)品，其包含通過權(quán)利要求19或21所述的方法獲得的細(xì)菌。
26.阻斷屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中，尤其是屬于嗜熱鏈球菌種或唾液鏈球菌 (S. salivarius)種的細(xì)菌中的天然感受態(tài)的方法，所述方法包括使其它嗜熱鏈球菌或唾液鏈球菌菌株中的STER_0316基因和/或shp316基因或其各自的同源物失活的步驟。
27.提高屬于鏈球菌屬的細(xì)菌中，尤其是屬于嗜熱鏈球菌種和/或唾液鏈球菌種的細(xì)菌中的天然感受態(tài)的方法，所述方法包括過表達(dá)其它嗜熱鏈球菌和唾液鏈球菌菌株中的 STER_0316基因和/或shp316基因或其各自的同源物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及肽、核酸和通過天然感受態(tài)轉(zhuǎn)化屬于鏈球菌屬的細(xì)菌的方法以及其在食品和飼料業(yè)的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/315GK102574898SQ201080028500
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者克里斯托夫·弗里莫克斯, 利蒂希婭·方丹, 帕斯卡爾·霍爾斯, 派翠克·布瓦亞瓦爾, 菲利普·霍瓦思 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司