專利名稱：從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化靶蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明至少部分涉及蛋白質(zhì)純化方法。具體地，本發(fā)明至少部分涉及用于從包含靶蛋白和一或多種雜質(zhì)的組合物中純化靶蛋白的方法，所述靶蛋白為例如含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)，如抗體或其片段和抗體樣分子，如免疫粘附素。
背景技術(shù)：
生物技術(shù)和制藥工廠越來越認識到對諸如包括抗體在內(nèi)的治療性蛋白等蛋白質(zhì)進行高效和經(jīng)濟的大規(guī)模純化的重要性。通常，蛋白質(zhì)純化的方法極其煩瑣且昂貴，并包括許多不同的步驟。例如，通常使用細胞培養(yǎng)法來制備蛋白質(zhì)，例如通過插入含目標蛋白基因的重組質(zhì)粒，使用工程化的哺乳動物細胞或細菌細胞系來制備目標蛋白。通常，要面對的巨大挑戰(zhàn)是如何將所希望的蛋白質(zhì)從加入到細胞的培養(yǎng)基組分和細胞本身的副產(chǎn)物以及可能存在的任何其它雜質(zhì)中分離。當欲將治療性蛋白用于人且必須經(jīng)過食品和藥品管理局許可時，這類分離就特別的重要。通常，目前所用的純化方法包括至少以下步驟細胞裂解以回收細胞內(nèi)蛋白或在分泌蛋白的情況下從培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)；通過差示離心或過濾去除細胞碎屑以獲得含目標蛋白的凈化樣品；在多步驟工藝中使用各種色譜介質(zhì)以從樣品的各種雜質(zhì)中分離目標蛋白。常用的色譜法包括親和色譜介質(zhì)、離子交換色譜介質(zhì)、疏水性相互作用、親水性相互作用、尺寸排阻和混合模式(即多種色譜法的組合)中的一或多種。例如，對于單克隆抗體的純化，已描述了許多方法，大部分方法包括起始的蛋白A親和捕獲步驟，和隨后的一或多種離子交換精制步驟(polishing st印s)。而且，可使用其它色譜技術(shù)，例如結(jié)合和洗脫疏水性相互作用色譜(HIC)；流過式疏水性相互作用色譜(FTHIC)；混合式色譜技術(shù)，如結(jié)合和洗脫弱陽離子和陰離子交換(Abx)、結(jié)合和洗脫疏水性和離子交換相互作用、和流過式疏水性和離子交換混合式相互作用(FTMM)，它們均可使用諸如Capto Adhere、Capto匪C、 HEA Hypercel, PPA Hypercel等樹脂。此外，可使用疏水性電荷誘導(dǎo)(HCI)色譜以及其它技術(shù)和多種技術(shù)的組合來進行精制。通常，包括能提供額外正交的病毒去除步驟的陰離子交換步驟對精制步驟很重要。如上所述，雖然已描述了涉及各種色譜步驟組合的蛋白質(zhì)純化方法，但這些方法需要在每個色譜步驟之間使用存儲罐(holding tank)和/或緩沖液交換步驟。通常，將靶蛋白洗脫入存儲罐，在存儲罐中調(diào)節(jié)緩沖液/溶液條件，以使它們適用于下一個色譜步驟 (稱為緩沖液交換)。在被上樣至下一個色譜介質(zhì)或過濾膜之前，通常根據(jù)需要來調(diào)節(jié)存儲罐中緩沖液的條件，如PH、鹽等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分涉及從一或多種雜質(zhì)中純化或分離目標蛋白的改進方法，其中所述方法不需要各個色譜步驟之間的存儲罐和/或緩沖液交換步驟。在各個實施方式中，本發(fā)明提供了通過強力模板純化含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)(如單克隆抗體和類似蛋白)，而避免了中間的存儲罐或緩沖液交換步驟。因此，可將所述純化方法稱為“連續(xù)方法”。所述方法包括使用適合的條件和色譜介質(zhì)來實現(xiàn)連續(xù)的、無存儲罐的方法。在本發(fā)明的一些實施方式中，提供了從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品接觸親和色譜介質(zhì)；(b)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述親和介質(zhì)洗脫；(c)使洗脫液接觸陽離子交換色譜介質(zhì)；(d) 將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述陽離子交換色譜介質(zhì)洗脫；(e)使洗脫液接觸陰離子交換色譜介質(zhì)；和(f)回收所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白，其中所述方法在步驟(b)和(c)之間以及步驟(d)和(e)之間不需要存儲罐。在本發(fā)明其它實施方式中，提供了從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品接觸親和色譜介質(zhì)；(b)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述親和介質(zhì)洗脫；(c)使洗脫液接觸陽離子交換色譜介質(zhì)；(d)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述陽離子交換色譜介質(zhì)洗脫；(e)使洗脫液接觸陰離子交換色譜介質(zhì)；和(f)回收所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白，其中所述方法在步驟(b)和(c)之間以及步驟(d)和(e)之間不需要緩沖液交換步驟。在本發(fā)明其它實施方式中，提供了從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品接觸親和色譜介質(zhì)；(b)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述親和介質(zhì)洗脫；(c)使洗脫液接觸陽離子交換色譜介質(zhì)；(d)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述陽離子交換色譜介質(zhì)洗脫；(e)使洗脫液接觸陰離子交換色譜介質(zhì)；和(f)回收所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白，其中所述方法在步驟(b)和(c)之間以及步驟(d)和(e)之間不需要存儲罐和緩沖液交換步驟。在所要求保護發(fā)明的方法的一些實施方式中，所述方法進一步包括在步驟(a)和 (b)之間的預(yù)洗脫步驟。在多個實施方式中，所述預(yù)洗脫步驟包括使步驟(a)的親和色譜介質(zhì)接觸陽離子交換色譜緩沖液。在多個實施方式中，所要求保護的方法可用于從一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白。此類含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白包括但不限于抗體、免疫粘附分子和Fc融合蛋白、以及它們的含F(xiàn)c的片段。在具體實施方式
中，含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白為單克隆抗體。在多個實施方式中，使用pH 2. 0-4. 0的緩沖液將含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從親和介質(zhì)中洗脫。在一些實施方式中，步驟(d)包括使用pH 5. 0-9.0的緩沖液。在其它實施方式中， 步驟(d)包括使用pH 6. 0-8. 0的緩沖液。在一些實施方式中，本發(fā)明方法中的親和色譜介質(zhì)步驟包括使用蛋白A或其功能性變體。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法進一步包括在步驟(C)和(d)之間的病毒滅活步驟。在一些實施方式中，所述病毒滅活步驟包括使所述陽離子交換色譜介質(zhì)與PH小于 4. 0的緩沖液接觸適合于病毒滅活的一段時間。所述時間通常為15至60分鐘。本發(fā)明還提供了用于從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的試劑盒。在一些實施方式中，這類試劑盒包括以下一或多種親和色譜柱、陽離子交換色譜柱、陰離子交換色譜柱和一或多種洗脫緩沖液以及試劑盒使用說明書。在一些實施方式中，試劑盒中所包括的一或多種色譜柱是一次性的。


圖1描述了在多種pH條件下將樣品上樣至陽離子交換柱的色譜圖。圖2描述了 SDS-PAGE實驗的結(jié)果，其中樣品在非還原性條件下分析，如實施例3 所詳述。全部泳道中的優(yōu)勢帶表示IgG。完整的IgG在約175kDa處可見。150kDa、lOOkDa、 75kDa、40kDa和20kDa處的其它帶來自部分還原的IgG、未組裝的IgG或IgG片段。圖3示意性描述了修改的Akta(即色譜工作站或系統(tǒng))，其顯示用于在線 (in-line)三步法的柱管道裝置(plumbing)。圖4描述了將蛋白A親和介質(zhì)直接上樣至陽離子交換柱上的色譜圖。圖5描述了將蛋白A親和捕獲步驟的2個循環(huán)產(chǎn)物上樣至單個在線陽離子交換柱上的色譜圖。圖6描述了將蛋白A親和捕獲步驟的4個循環(huán)產(chǎn)物上樣至單個在線陽離子交換柱上的色譜圖。圖7描述了 SDS-PAGE實驗的結(jié)果，如實施例4_7所詳述。全部泳道中的優(yōu)勢帶表示IgG。樣品在還原性和非還原性條件下分析。完整的IgG在約175kDa處可見。150kDa、 100kDa、75kDa、40kDa和20kDa處的其它帶來自部分還原的IgG、未組裝的IgG或IgG片段。
具體實施例方式本發(fā)明至少部分提供了用于從含靶蛋白和一或多種雜質(zhì)的樣品中純化靶蛋白的新型且改進的方法，其中所述方法特別不需要形成常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法的一部分的通常在各個色譜步驟之間進行的存儲罐和/或緩沖液交換步驟。本文所述的方法比現(xiàn)有技術(shù)所述那些方法更有創(chuàng)造性且更有效，因為本發(fā)明的方法減少了方法限制，并提供了用于一次性或部分一次性方法的模板，在所述方法中液體處理是很復(fù)雜的。此方法可適用于任何蛋白A結(jié)合多肽(如包含F(xiàn)c區(qū)域)，例如單克隆抗體和含F(xiàn)c區(qū)域的片段、免疫粘附分子和Fc融合蛋白。在一些實施方式中，方法條件取決于被純化的靶分子的Pl值，此Pl值可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定。本文所述的緩沖液對 Pl大于8. 0的諸如單克隆抗體等含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)效果最佳。然而，基于現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)和本發(fā)明，可很容易優(yōu)化本發(fā)明方法以用于Pl小于8. 0的蛋白質(zhì)。I.定義為了更容易地理解本發(fā)明，首先定義一些術(shù)語。另外的定義列于整個發(fā)明詳述中。術(shù)語“免疫球蛋白”、“Ig”或“抗體”(在本文中可互換地使用)指具有特異性結(jié)合抗原的能力并具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四條多肽鏈基本結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其中所述鏈通過例如鏈間二硫鍵被穩(wěn)定化。術(shù)語“單鏈免疫球蛋白”或“單鏈抗體”(在本文中可互換地使用)指具有特異性結(jié)合抗原的能力并具有由一條重鏈和一條輕鏈組成的二條多肽鏈結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其中所述鏈通過例如鏈間肽接頭被穩(wěn)定化。術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”指重鏈或輕鏈多肽的球形區(qū)域，其包括例如通過β-折疊和/或鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定化的肽環(huán)(例如包含3-4 個肽環(huán))。本文中將結(jié)構(gòu)域進一步稱作“恒定的”或“可變的”，在“恒定”結(jié)構(gòu)域的情況下是根據(jù)各類成員的結(jié)構(gòu)域中相對缺少序列變異，或者在“可變”結(jié)構(gòu)域的情況下是根據(jù)各類成員的結(jié)構(gòu)域中的顯著變異。在本領(lǐng)域中，抗體或多肽“結(jié)構(gòu)域”常常被互換地稱作抗體或多肽“區(qū)”?？贵w輕鏈的“恒定”結(jié)構(gòu)域被互換地稱作“輕鏈恒定區(qū)”、“輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域”、“CL” 區(qū)或“CL”結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的“恒定”結(jié)構(gòu)域被互換地稱作“重鏈恒定區(qū)”、“重鏈恒定結(jié)構(gòu)域”、“CH”區(qū)或“CH”結(jié)構(gòu)域?？贵w輕鏈的“可變”結(jié)構(gòu)域被互換地稱作“輕鏈可變區(qū)”、“輕鏈可變結(jié)構(gòu)域”、“VL”區(qū)或“VL”結(jié)構(gòu)域?？贵w重鏈的“可變”結(jié)構(gòu)域被互換地稱作“重鏈可變區(qū)”、“重鏈可變結(jié)構(gòu)域”、“VH”區(qū)或“VH”結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白或抗體可以是單克隆的或多克隆的，并可以單體或多聚體形式存在， 例如以五聚體形式存在的IgM抗體，和/或以單體、二聚體或多聚體形式存在的IgA抗體。 免疫球蛋白或抗體也可包括多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們保持或被修飾以包括配體特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“片段”指抗體或抗體鏈的部分，其包含少于完整或完全的抗體或抗體鏈的氨基酸殘基?？赏ㄟ^對完整或完全的抗體或抗體鏈進行化學(xué)或酶處理獲得片段。還可通過重組方式獲得片段。當通過重組方式獲得片段時，片段可單獨表達或作為稱作融合蛋白的較大蛋白質(zhì)的部分表達。示例性的片段包括Fab、Fab’、 F(ab' )2, Fc和/或Fv片段。示例性的融合蛋白包括Fc融合蛋白。通常，免疫球蛋白或抗體直接抗目標“抗原”。優(yōu)選地，抗原為生物學(xué)上重要的多肽，且將抗體施用至患病或紊亂的哺乳動物可在此哺乳動物中產(chǎn)生療效。然而，也希望直接抗非多肽抗原(如腫瘤相關(guān)的糖脂抗原，參見美國專利5，091，178)的抗體。當抗原為多肽時，其可為跨膜分子(如受體)或配體，如生長因子。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本相同的抗體群獲得的抗體，即包括單個抗體的群是相同的，區(qū)別為可能有少量的天然存在的突變。單克隆抗體是高度特異的，直接抗單個抗原位點。而且，相比于通常包括直接抗不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑，每個單克隆抗體直接抗抗原上的單個決定簇。修飾詞“單克隆”表示從基本相同抗體群獲得的抗體的特征，其不應(yīng)理解為以任何特別方法來限制抗體的制備。例如， 本發(fā)明所用的單克隆抗體可通過由Kohler et al. , Nature 256:495(1975)首先描述雜交瘤方法制備，或通過重組DNA方法制備(參見如美國專利4，816，567)?！皢慰寺】贵w”也可使用 Clackson et al.，Nature 352 :624-628(1991)禾口 Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 581-597(1991)中所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離。單克隆抗體可進一步包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源，而鏈剩余部分與源自其它物種或?qū)儆谄渌贵w類或亞類的抗體中的對應(yīng)序列相同或同源，以及這類抗體的片段，只要它們顯示出所希望的生物學(xué)活性(美國專利4，816，567;和Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。本文所用術(shù)語“高可變區(qū)”是指負責抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高可變區(qū)包括來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基對_34仏1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基31-35 (Hl)、50-65 (H2)和 95-102(H3) ；Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)),禾口 /或來自“高可變環(huán)”的那些殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基沈-32仏1)、50-52仏2)和 91-96 (L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基沈-32 (HI)、53-55(H2)和96-101 (H3) ；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987))?！翱蚣堋被颉癋R” 殘基為除了本文定義的高可變區(qū)殘基外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。非人(如鼠)抗體的“人源化”形式為包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分為人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高可變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和性和容量的來自諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類等非人物種的高可變區(qū)殘基替代。在一些實例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被對應(yīng)的非人殘基替代。而且，人源化抗體可包括在受體抗體或供體抗體中沒有的殘基。進行這些修飾以進一步改進抗體性能。通常，人源化抗體將包括基本上全部的至少一個、通常兩個可變結(jié)構(gòu)域， 其中全部或基本上全部高可變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些高可變環(huán)，且全部或基本上全部FR區(qū)對應(yīng)于人免疫球蛋白的那些FR區(qū)。人源化抗體可包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，其通常為人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)。詳見Jones et al. ,Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al. , Nature 332 :323-329(1988) ；^P Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。本文可互換使用的術(shù)語“多核苷酸”和“核酸分子”是指任何長度的核苷酸(核糖核酸或脫氧核糖核酸)的聚合形式。這些術(shù)語包括單鏈、雙鏈或三鏈DNA、基因組DNA、 cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體、或包含嘌呤和嘧啶堿基、或其它天然、化學(xué)或生化修飾的非天然或衍生的核苷酸堿基的聚合物。多核苷酸的主鏈可包括糖和磷酸基團(通常存在于RNA或 DNA中)、或修飾或取代的糖或磷酸基團。此外，雙鏈多核苷酸可獲得自化學(xué)合成的單鏈多核苷酸產(chǎn)物，通過合成互補鏈并將鏈在合適條件下退火，或者通過使用DNA聚合酶和適合引物從頭合成互補鏈。核酸分子可采用多種不同形式，例如基因或基因片段、一個或多個外顯子、一個或多個內(nèi)含子、mRNA、cDNA、重組多核苷酸、支化多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包括修改的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物、uracyl、其它糖和連接基團，如氟核糖和thioate、以及核苷酸分支。如本文所用，“DNA”或“核苷酸序列”不但包括堿基A、T、C和G，而且包括這些堿基的任何類似物或修飾形式，如甲基化的核苷酸、核苷酸間修飾，如不帶電荷的連接鍵和 thioate、糖類似物的使用、和修飾的和/或其它主鏈結(jié)構(gòu)，如聚酰胺。在具體實施方式
中， 核酸分子包括編碼SpA變體的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語“免疫粘附素”是指這樣的抗體樣分子，其將異源“粘附”蛋白 (如受體、配體或酶)的“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)器功能結(jié)合。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括除抗體的抗原識別和結(jié)合位點(抗原結(jié)合位點)外的(即“異源的”) 粘附素氨基酸序列與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列的融合，所述粘附素氨基酸序列具有所希望的結(jié)合特異性。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列優(yōu)選源自Yl、Y2或重鏈，因為包括這些區(qū)域的免疫粘附素可通過蛋白A色譜純化(Lindmark et al.，J. Immunol. Meth. 62 :1-13(1983))。
“抗體-免疫粘附素嵌合物”包括將抗體的至少一個結(jié)構(gòu)域(如Fc區(qū)域)與至少一個免疫粘附素分子結(jié)合的分子。示例性的抗體-免疫粘附素嵌合物為雙特異性CD4-IgG嵌合物，如 Berg et al.，PNAS (USA) 88 :4723-4727(1991)和 Chamow et al.，J. Immunol. 153 4268(1994)所述。術(shù)語“Fe區(qū)域”和“含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)”是指蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白的重鏈和/ 或輕鏈恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(在前定義的CH和CL區(qū))。包含“Fe區(qū)”的蛋白質(zhì)可具有免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)器功能。諸如CH2/CH3區(qū)等“Fe區(qū)”可選擇性結(jié)合諸如蛋白A等親和配體或其功能性變體。在一些實施方式中，含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白特異性結(jié)合蛋白A或其功能性衍生物、變體或片段。在一些實施方式中，含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白特異性結(jié)合蛋白G或蛋白L、或其功能性衍生物、變體或片段。本文所用的術(shù)語“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指任何天然的細胞表面受體或其任何區(qū)域或衍生物，其保持至少與對應(yīng)天然受體的定性配體結(jié)合。在所要求保護的本發(fā)明的一些實施方式中，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Fc區(qū)融合。在具體實施方式
中，配體的受體源自具有細胞外結(jié)構(gòu)域的細胞表面多肽，其與免疫球蛋白超基因家族的成員同源。通常，如文中定義，只要受體包括Fc區(qū)或與Fc區(qū)融合，任何受體均可用在本發(fā)明的方法中。不是免疫球蛋白超基因家族成員，但也落入此定義的其它受體為細胞因子的受體，且特別是具有酪氨酸激酶活性的受體(受體酪氨酸激酶)、促紅細胞生成素和神經(jīng)生長因子受體超家族的成員、和細胞粘附分子，如(E-、L-和P-選擇素)。術(shù)語“受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指受體的任何天然配體，包括細胞粘附分子，或保持至少與對應(yīng)天然配體的定性受體結(jié)合能力的此類天然配體的任何區(qū)域或衍生物。其中，此定義具體包括來自上述受體的配體的結(jié)合序列。在一些實施方式中，如文中定義，受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)c區(qū)或與Fc區(qū)融合。本文中待純化的“組合物”、“溶液”或“樣品”包括靶蛋白(如含F(xiàn)c區(qū)的蛋白質(zhì)) 和一或多種雜質(zhì)。組合物或樣品可被“部分純化”(即已經(jīng)歷一個或多個純化步驟，如通過本文所述的非親和色譜)，或可從產(chǎn)生多肽的宿主細胞或生物體直接獲得(如組合物可包括收集的細胞培養(yǎng)液)。如本文所用，術(shù)語“多肽”通常是指大于約10個氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。本文可互換使用的術(shù)語“目標蛋白”和“靶蛋白”是指這樣的蛋白質(zhì)或多肽，其包括但不限于含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)，如待通過本發(fā)明方法從蛋白質(zhì)混合物和任選地存在的其它材料如細胞碎屑等中純化的抗體。如上所述，在一些實施方式中，靶蛋白為含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)，如免疫球蛋白。在一些實施方式中，含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)為包括與另一多肽或其片段融合的免疫球蛋白的Fc 區(qū)域的重組蛋白。示例性多肽包括例如腎素；生長激素，包括人類生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -1抗胰蛋白酶；胰島素 α鏈；胰島素的β鏈；胰島素原；卵泡刺激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如凝血因子VIIIC、凝血因子IX、組織因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C ；心鈉素；肺表面活性物質(zhì)；纖維蛋白溶酶原活化劑，如尿激酶或人尿或組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和β ；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌的激活)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素α鏈，松弛素β鏈；松弛素原 (prorelaxin)；鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，如β -內(nèi)酰胺酶；DNase ；IgE ；細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原(CTLA)(如CTLA-4)；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)； 激素或生長因子的受體；蛋白A或D ；類風濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，如骨源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、-4、-5或-6(ΝΤ-3、ΝΤ-4、ΝΤ-5或ΝΤ-6)，或神經(jīng)生長因子，如 NGF-β ；血小板衍生的生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，如α FGF和β FGF ；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β 1，TGF- β 2，TGF- β 3， TGF-β 4 或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II (IGF-1 和 IGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP) ；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34 和CD40;促紅細胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，如干擾素-α、- β和γ ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ；白細胞介素(ILs)， 如IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如 AIDS包膜部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整合素，如⑶11a、⑶lib、⑶11c、 ⑶18、ICAM、VLA-4和VCAM ；腫瘤相關(guān)抗原，如HER2、HER3或HER4受體；以上所列多肽中任一的片段和/或變體。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽為特異結(jié)合以上所列多肽中任一的抗體、其片段或變體。術(shù)語“酸性變體”為比靶蛋白酸性更強的靶蛋白的變體(通過陽離子交換色譜測定)。酸性變體的實例為去酰胺化的變體。文中可交換使用的術(shù)語“污染物”、“雜質(zhì)”和“碎屑”是指可存在于包括含F(xiàn)c的靶蛋白的樣品中的任何外源的或不希望的分子，包括生物大分子，如DNA、RNA、一或多種宿主細胞蛋白、內(nèi)毒素、脂質(zhì)和一或多種添加劑，所述含F(xiàn)c的靶蛋白通過使用本發(fā)明的方法從一或多種外源的或不希望的分子中分離。另外，此類污染物可包括在純化方法之前進行的步驟中使用的任何試劑。文中可互換使用的術(shù)語“中國倉鼠卵巢細胞蛋白”和“CHOP”是指源自中國倉鼠卵巢(“CH0”)細胞培養(yǎng)物的宿主細胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP通常作為雜質(zhì)存在于細胞培養(yǎng)基或裂解物(如收集的細胞培養(yǎng)液(“HCCF”)，其包含諸如抗體或免疫粘附素等在CHO細胞中表達的目標蛋白)中。包含目標蛋白的混合物中的CHOP量為目標蛋白純度提供了測量標準。HCP或CHOP包括但不限于在諸如CHO宿主細胞等宿主細胞中表達的目標蛋白。通常，蛋白混合物中CHOP量表示為相對于混合物中目標蛋白量的百萬分率 (parts per million)。應(yīng)理解當宿主細胞為諸如除CHO外的哺乳動物細胞、大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或植物細胞等另一細胞類型時，HCP是指在宿主細胞裂解物中除靶蛋白外的蛋白。文中可互換使用的術(shù)語“百萬分率”或“ppm”是指通過本發(fā)明方法純化的靶蛋白的純度測量標準。單位PPm是指每毫克/毫升目標蛋白中以納克/毫升計的HCP或CHOP 的量，即CHOP ppm = (CHOP ng/ml)/(目標蛋白mg/ml))，其中所述蛋白在溶液中。當所述蛋白被干燥時(例如通過凍干)，PPm是指(CHOP ng)/(目標蛋白mg)。文中可互換使用的術(shù)語“純化”、“分開”或“分離”是指增加來自包含多肽和一或多種雜質(zhì)的組合物或樣品中的多肽或目標蛋白或靶蛋白的純度。通常，靶蛋白的純度通過從組合物中去除(完全或部分)至少一種雜質(zhì)來增加。“純化步驟”可為導(dǎo)致“均質(zhì)”組合物或樣品的整個純化方法的一部分，所述“均質(zhì)”組合物或樣品用在本文中是指在包含目標蛋白的組合物中，組合物或樣品包含小于IOOppm的HCP，或者小于90ppm、小于80ppm、小于 70ppmヽ小于60ppmヽ小于50ppmヽ小于40ppmヽ小于30ppmヽ小于20ppmヽ小于IOppmヽ小于5ppm 或小于3ppm的HCP。文中可互換使用的術(shù)語“流過方法”、“流過模式”和“流過式色譜”是指產(chǎn)物分離技木，其中意圖使樣品中所含的至少ー種產(chǎn)物(如含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白)以及ー或多種污染物流過色譜樹脂或介質(zhì)，而至少ー種可能的污染物或雜質(zhì)與色譜樹脂或介質(zhì)結(jié)合?！傲鬟^模式” 通常為恒定的操作(即期間不改變流動相的組成的色譜方法)。在根據(jù)所要求保護的方法和文中實施例所述的ー些實施方式中，本方法使用以流過模式進行的陰離子交換色譜步驟。文中可互換使用的術(shù)語“結(jié)合和洗脫模式”和“結(jié)合和洗脫方法”是指產(chǎn)物分離技木，其中樣品中所含的至少ー種產(chǎn)物(如含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白)結(jié)合色譜樹脂或介質(zhì)并隨后被洗脫。文中可互換使用的術(shù)語“存儲罐”、“儲集罐”和“中間罐”是指可用于收集處理步驟輸出物(如來自柱的洗脫液)的任何容器、罐或袋。在大多數(shù)常規(guī)方法中，使用ー個或多個中間容器來調(diào)節(jié)來自ー個處理步驟輸出物的條件/性質(zhì)，以使其適用于隨后的處理步驟。 例如，在將收集物(pool)上樣到隨后的色譜柱或步驟前，需要調(diào)節(jié)來自色譜柱或步驟(如包含蛋白標靶和雜質(zhì))的洗脫液的PH和/或電導(dǎo)率。在本發(fā)明方法的多個實施方式中，不需要存儲罐。因此，在所要求保護的方法的多個實施方式中，此方法提供了從ー或多種雜質(zhì)中純化靶蛋白的改進方法，而無需在常規(guī)純化方法中常用的存儲罐。如本文所用，術(shù)語“連續(xù)方法”是指含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白的純化方法，其無需使用存儲罐和/或緩沖液交換步驟。因此，所要求保護的發(fā)明的連續(xù)方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中常用的常規(guī)純化方法，因為本發(fā)明的方法可顯著節(jié)約時間和資源。本文使用的術(shù)語“緩沖液交換步驟”是指在線溶液條件調(diào)整，其通常在很多常規(guī)方法中是使用如上所述的存儲罐的另ー選擇。在典型的緩沖液交換步驟中，可使用在試管或混合容器、過濾儀器或設(shè)備中混合溶液，在轉(zhuǎn)移期間將兩種溶液混合或滴定。例如，溶液可能需要通過將此溶液與另ー種較低電導(dǎo)率溶液混合來稀釋以降低電導(dǎo)率。緩沖液交換在諸如滲濾、超濾等過濾裝置幫助的情況下完成。在所要求保護的發(fā)明的一些實施方式中，此方法提供了無需緩沖液交換步驟的純化蛋白的改進方法。在ー些其它實施方式中，所要求保護的發(fā)明的方法無需存儲罐以及緩沖液交換步
づ水ο術(shù)語“色譜”是指將目標分析物(如含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白，如免疫球蛋白)與混合物中存在的其它分子分離的任何類型的技木。通常，由于混合物中個體分子在移動相影響下遷移通過固定介質(zhì)速率的差異，或在結(jié)合和洗脫エ藝中，將目標分析物與其它分子分離。術(shù)語“色譜樹脂”或“色譜介質(zhì)”在文中可互換使用，且是指將目標分析物(如含F(xiàn)c 區(qū)域的蛋白，如免疫球蛋白)與混合物中存在的其它分子分離的任何類型的固定相。通常， 由于混合物中個體分子在移動相影響下遷移通過固定固體相速率的差異，或在結(jié)合和洗脫 エ藝中，將目標分析物與其它分子分離。非限定性實例包括陽離子交換樹脂、親和樹脂、陰離子交換樹脂、陰離子交換膜、疏水交換樹脂和離子交換整料(monoliths)。
本文所用的術(shù)語“親和分離”或“親和純化”是指任何純化或測定技木，所述技術(shù)包括使含靶分析物(如含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白，如免疫球蛋白)的樣品接觸已知可結(jié)合此靶分析物的親和介質(zhì)(如將其攜帶至已知可結(jié)合諸如蛋白A或其變體等分析物的親和配體的固體支持物)。文中可互換使用的術(shù)語“親和色譜”和“蛋白質(zhì)親和色譜”是指蛋白分離技木，其中靶蛋白(如含F(xiàn)c區(qū)域的目標蛋白或抗體)特異地結(jié)合該靶蛋白的特異性配體。此類配體通常被稱為生物特異性配體。在一些實施方式中，生物特異性配體(如蛋白A或其功能性變體)共價連接色譜固相材料，且當溶液接觸色譜固相材料時可接近溶液中的靶蛋白。靶蛋白通常在色譜步驟期間保持其對生物特異性配體的特異性結(jié)合親和力，而混合物中的其它溶質(zhì)和/或蛋白不強カ或特異性地結(jié)合所述配體。靶蛋白與固定配體的結(jié)合會使污染的蛋白或蛋白雜質(zhì)通過色譜介質(zhì)，而靶蛋白保持與固定相材料上固定化配體的特異性結(jié)合。特異性結(jié)合的靶蛋白隨后在適合的條件下(如低PH、高pH、高鹽、競爭性配體等)以活性形式從固定化配體移除，井隨著洗脫緩沖液一起通過色譜柱，此靶蛋白不含已提前通過柱的污染蛋白或蛋白雜質(zhì)?？蓪⑷魏谓M分用作純化其各自特異性結(jié)合蛋白如抗體的配體。然而， 在本發(fā)明的多個方法中，蛋白A被用作含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的配體。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定用于從靶蛋白(如含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白)的生物特異性配體(如蛋白A)中洗脫的條件。 在一些實施方式中，蛋白G或蛋白L或其功能性變體可被用作生物特異性配體。在ー些實施方式中，在PH 5-9的范圍下使用生物特異性配體如蛋白A，以與含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白結(jié)合，清洗或再平衡生物特異性配體/靶蛋白綴合物，隨后用含至少ー種鹽的PH約4或小于4的緩沖液洗脫。術(shù)語“離子交換”和“離子交換色譜”是指這樣的色譜方法，其中混合物中的目標溶質(zhì)或分析物(如含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白)與連接(如通過共價連接)至固相離子交換材料上的帶電荷化合物相互作用，使得與混合物中溶質(zhì)雜質(zhì)或污染物相比，目標溶質(zhì)或分析物與帶電荷化合物發(fā)生更強或更弱的非特異性相互作用?；旌衔镏形廴镜娜苜|(zhì)比目標溶質(zhì)更快或更慢地從離子交換材料柱中洗脫，或者相對于目標溶質(zhì)與樹脂結(jié)合，或者相對于目標溶質(zhì)被樹脂排斥?！半x子交換色譜”具體包括陽離子交換色譜、陰離子交換色譜、和混合模式的離子交換色譜。例如，陽離子交換色譜可結(jié)合靶分子(如含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白)井隨后進行洗脫(陽離子交換結(jié)合和洗脫色譜或“CIEX”)，或可主要結(jié)合雜質(zhì)，而靶分子“流過”柱 (陽離子交換流過色譜FT-CIEX)。陰離子交換色譜可結(jié)合靶分子(如含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白) 井隨后進行洗脫，或可主要結(jié)合雜質(zhì)，而靶分子“流過”柱。在一些實施方式和本文所述實施例中，陰離子交換色譜步驟以流過模式進行。短語“離子交換材料”是指帶負電荷(即陽離子交換樹脂)或帶正電荷(即陰離子交換樹脂)的固相。電荷可通過將ー或多種帶電荷的配體經(jīng)由如共價連接與固相相連來提供?；蛘呋虼送猓姾煽蔀楣滔嗟墓逃行再|(zhì)(如對于氧化硅而言，其整體帶有負電)?！瓣栯x子交換樹脂”是指帶負電荷的固相，因此其具有游離的陽離子以用于與通過或穿過固相的水溶液中的陽離子進行交換。與固相連接形成陽離子交換樹脂的帶負電荷的配體可為如羧酸鹽或磺酸鹽?？缮藤彽年栯x子交換樹脂包括羧甲基纖維素、固定在瓊脂糖上的磺丙基(SP)(如 SP-SEPHAROSE FAST FLOW 或 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE ，來自Pharmacia)、和固定在瓊脂糖上的磺酰(如S-SEPHAROSE FAST FLOW ,來自Pharmacia)。
“混合模式的離子交換樹脂”是指被陽離子、陰離子和疏水部分共價改性的固相。 可商購的混合模式的離子交換樹脂為BAKERBOND ABX (J. Τ. Baker, Phillipsburg，N. J.)， 其包含弱陽離子交換基團、低濃度陰離子交換基團和與硅膠固相支持基質(zhì)連接的疏水配體。文中所用的術(shù)語“陰離子交換樹脂”是指這樣的固相，其帶正電荷，如具有與其相連的ー個或多個帶正電荷的配體，如季氨基基團(quaternary amino group)。可商購的陰離子樹脂包括 DEAE 纖維素、QAE SEPHADEX 和 FAST Q SEPHAROSE (Pharmacia)。術(shù)語“蛋白A”或“ProA”可互換地使用，且包括從其天然來源回收的蛋白A、合成產(chǎn)生的蛋白A (例如通過肽合成或通過重組技術(shù))、和其保留了結(jié)合具有CH2/CH3區(qū)域(例如 Fc區(qū)域)的蛋白質(zhì)的能力的變體。蛋白A可商購自R印ligen、Pharmacia和！7ermatech。 蛋白A通常固定在固相支持材料上。術(shù)語“ftx)A”也指親和色譜樹脂或包含共價連接蛋白 A的色譜固體支持基質(zhì)的柱。本發(fā)明方法中所用的蛋白A的功能性衍生物、片段或變體可表征為對鼠IgG^1或人IgGl的Fc區(qū)域至少K = IO-8M且優(yōu)選K = IO-9M的結(jié)合常數(shù)。符合此結(jié)合常數(shù)值的相互作用在文中被稱為“高親和カ結(jié)合”。優(yōu)選地，蛋白A的此功能性衍生物或變體包括野生型蛋白A功能性IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一部分，其選自天然結(jié)構(gòu)域E、D、A、B、C或其仍保持 IgG結(jié)合功能性的工程化突變體。此外，經(jīng)工程化以允許單點連接的蛋白A衍生物或變體也可被用在所要求保護的方法的親和色譜步驟中。單點連接通常是指蛋白部分經(jīng)由單個共價鍵與蛋白A親和色譜的色譜支持材料相連。此類單點連接也可通過利用適合的反應(yīng)性殘基來進行，所述反應(yīng)性殘基位于暴露的氨基酸位置，即在環(huán)中、接近N或C端、或在蛋白折疊的外圍上。適合的反應(yīng)性基團為例如硫氫基或氨基官能團。本發(fā)明中“污染物蛋白A”為蛋白A的任何類型的功能性IgG結(jié)合產(chǎn)物，或通過洗脫結(jié)合抗體從蛋白A親和色譜柱中獲得的定義如上的其功能性衍生物。此類污染物蛋白A 物質(zhì)可由如肽鍵的水解導(dǎo)致，特別是エ業(yè)生產(chǎn)中所述肽鍵的水解很可能通過酶作用的方式而發(fā)生。蛋白A色譜作為下游方法的早期步驟，而此時粗純化的新鮮產(chǎn)物溶液仍具有顯著的蛋白酶活性。細胞培養(yǎng)液中的死亡細胞或在初始離心或過濾步驟中被破碎的細胞很可能已釋放出蛋白酶；相比于生化研究實踐，通常無法出于調(diào)整目的而在下游エ藝之前或期間向細胞培養(yǎng)液中添加蛋白酶抑制劑。實例為苯基甲基磺酰氯(PMSF)或ε-己酸。此類化學(xué)試劑為生物制藥生產(chǎn)中不希望的添加剤。還有的可能是，根據(jù)蛋白折疊的三級結(jié)構(gòu)，蛋白 A的重組功能性衍生物或片段的蛋白酶抗性低于野生型蛋白。一旦結(jié)合結(jié)構(gòu)域的總數(shù)降低， 則會暴露連接單個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸區(qū)段。結(jié)構(gòu)域間接觸可能有助于結(jié)構(gòu)域折疊的穩(wěn)定性。也可能是由于基于抗體結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象改變，蛋白A或其所述功能性衍生物的抗體的結(jié)合影響或促進對蛋白酶作用的敏感性。而且，野生型或全長蛋白A或其功能化的エ 程化片段可能表現(xiàn)不同。將分子與色譜樹脂“結(jié)合”是指在適合條件(pH/電導(dǎo)率)下使分子暴露于色譜樹脂，使得分子通過配體-蛋白相互作用被可逆地固定在色譜樹脂之中或之上。非限定性實例包括分子和帶電荷基團或離子交換材料的帶電荷基團之間的離子相互作用，以及蛋白A 和免疫球蛋白之間的生物特異性相互作用。
文中所用術(shù)語“特異性結(jié)合”，如為描述靶蛋白(如含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白)和與固體支持物結(jié)合的配體(如與固相基質(zhì)或樹脂結(jié)合的蛋白A)之間的相互作用，是指目標蛋白通過結(jié)合位點處的蛋白質(zhì)和配體結(jié)構(gòu)的空間互補性，以及結(jié)合位點處的靜電力、氫鍵、疏水力和 /或范德華力的組合作用與配體的常規(guī)可逆性結(jié)合。通常，空間互補性越大，結(jié)合位點處的其它カ越強，蛋白質(zhì)與其各自配體的結(jié)合特異性就越強。特異性結(jié)合的非限定性實例包括抗體-抗原結(jié)合、酶-底物結(jié)合、酶-輔因子結(jié)合、金屬離子螯合、DNA結(jié)合、蛋白-DNA結(jié)合、 調(diào)節(jié)性蛋白-蛋白相互作用等。理想地，在親和色譜中，特異性結(jié)合在自由溶液中以約10_4 至10_8M的親和カ發(fā)生。文中所用術(shù)語“非特異性結(jié)合”，如為描述目標分子(如本文所述的靶蛋白)和與固體支持物結(jié)合的配體或其它化合物(如與固相基質(zhì)或樹脂結(jié)合的蛋白A)之間的相互作用，是指目標蛋白通過結(jié)合位點處的靜電力、氫鍵、疏水力和/或范德華力與固體支持物上的配體或化合物的結(jié)合，但缺少增強非結(jié)構(gòu)力作用的結(jié)構(gòu)互補性。非特異性相互作用的實例包括但不限于靜電力、疏水力和范德華カ以及氫鍵?！胞}”是由酸和堿的相互作用形成的化合物。可用在本文所用緩沖液中的各種鹽包括但不限于乙酸鹽(如乙酸鈉)、檸檬酸鹽(如檸檬酸鈉)、氯化物(如氯化鈉)、硫酸鹽 (如硫酸鈉)或鉀鹽。如本文所用，術(shù)語“溶剤”是指能夠溶解或分散一或多種其它底物以提供溶液的液體物質(zhì)。溶劑包括水性溶劑和有機溶剤，其中有用的有機溶劑包括非極性溶劑、乙醇、甲醇、
異丙醇、乙腈、已ニ醇、丙ニ醇和2，2-硫ニ甘醇。術(shù)語“去污劑”是指離子和非離子表面活性剤，如聚山梨酸酯(如聚山梨酸酯20 或80)；泊洛沙姆(如泊洛沙姆188) ；Triton ；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基_、肉豆蔻基_、亞油烯基-或硬脂基-硫代甜菜堿；月桂基_、肉豆蔻基_、 亞油烯基-或硬脂基-肌氨酸；亞油烯基_、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰胺丙基 (Iauroamidopropyl) _、椰油酰胺丙基_、亞油酰胺丙基_、肉豆蔻酰胺丙基_、棕櫚酰胺丙基 (palmidopropyl)-，或異硬脂酰胺丙基-甜菜堿(如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-，棕櫚酰胺丙基_，或異硬脂酰胺丙基-ニ甲胺；鈉甲基椰油基_，或ニ鈉甲基油烯基-牛磺酸； 和 M0NAQUAT 系列(Mona Industries, Inc.，Paterson, N. J.)。有用的去污劑為聚山梨酸酷，如聚山梨酸酷20 (TWEEN 20丨 .)或聚山梨酸酯80 (TWEEN 80 )。文中所用術(shù)語“聚合物”是指通過兩種或多種單體的共價鍵形成的分子，其中單體不是氨基酸殘基。聚合物的實例包括聚乙ニ醇、聚丙ニ醇和共聚物(如PluroniCS，PF68 等)。有用的聚合物為聚乙ニ醇(PEG)，如PEG 400和PEG 8000?！肮滔唷被颉岸嗫谆住被颉盎|(zhì)”是指一或多種帶電荷的配體可附著的非水性基質(zhì)。固相可為純化柱、離散顆粒的不連續(xù)相、膜、整料或過濾器等。形成固相的材料的實例包括多糖(如瓊脂糖和纖維素)；和其它機械性穩(wěn)定的基質(zhì)，如氧化硅(如可控孔徑玻璃)、 聚(苯乙烯ニ乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷顆粒和上述任何一種的衍生物?！熬彌_液”為通過其酸-堿共軛組分的作用抵抗PH變化的溶液?？筛鶕?jù)如緩沖液的所需PH使用的各種緩沖液描述在Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D. , ed. Calbiochem Corporation(1975)中。 在所要求保護發(fā)明的方法的一些步驟中，緩沖液具有2. O至4. O或2. 8至3. 8范圍內(nèi)的pH。在所要求保護發(fā)明的其它步驟中，緩沖液具有5. 0至9. 0范圍內(nèi)的pH。在所要求保護發(fā)明的其它步驟中，緩沖液具有4. 0至6. 5范圍內(nèi)的pH。在所要求保護發(fā)明的方法的一些步驟中，緩沖液具有小于4.0的pH。將pH控制在此范圍內(nèi)的緩沖液的非限定性實例包括MES、 MOPS、M0PS0、Tris, HEPES、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和銨緩沖液以及它們的組
ロ O術(shù)語“陽離子交換緩沖液”是指平衡緩沖液，其具有的pH和電導(dǎo)率使得靶分子(如免疫球蛋白)結(jié)合陽離子交換材料?！吧蠘泳彌_液”為這樣的緩沖液，其用于將包含目標靶分子(如含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白)和一或多種雜質(zhì)的樣品或組合物上樣至色譜柱(如親和柱或離子交換柱)。上樣緩沖液具有這樣的電導(dǎo)率和/或PH，其使得目標分子(和通常一或多種雜質(zhì))結(jié)合色譜樹脂，或其使得目標蛋白流過柱，而雜質(zhì)與樹脂結(jié)合?！爸虚g緩沖液”用于在洗脫目標多肽分子前，將ー或多種雜質(zhì)從色譜樹脂中洗脫。 中間緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH使得一或多種雜質(zhì)從離子交換樹脂中洗脫，而不洗脫顯著量的目標多肽。術(shù)語“清洗緩沖液”或“平衡緩沖液”可在文中互換使用，其是指在洗脫目標多肽分子前，用于清洗或再平衡色譜柱的緩沖液。在一些情況中，清洗緩沖液和上樣緩沖液可以相同。“洗脫緩沖液”用于將靶蛋白從固相中洗脫。洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH通常使得靶蛋白從色譜樹脂中洗脫。“再生緩沖液”可用于再生色譜樹脂，使得其可以重新使用。再生緩沖液具有從色譜樹脂去除基本上全部雜質(zhì)和靶蛋白所需的電導(dǎo)率和/或pH。術(shù)語“電導(dǎo)率”是指水溶液在兩電極間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流通過離子傳輸流動。因此，隨著水溶液中離子含量的増加，溶液將具有更高的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率的測量單位為毫西門子/厘米(mS/cm或mS)，且可使用如Orion銷售的電導(dǎo)計來測量。溶液的電導(dǎo)率可通過改變其中的離子濃度來改變。例如，可改變?nèi)芤褐芯彌_劑的濃度和/或鹽(如 NaCl或KCl)的濃度，以實現(xiàn)所需的電導(dǎo)率。優(yōu)選地，修改各種緩沖液的鹽濃度以實現(xiàn)以下實施例中所需的電導(dǎo)率。多肽的“pi”或“等電點”是指多肽的正電荷平衡其負電荷時的pH。pi可從多肽所連接的碳水化合物的氨基酸殘基或唾液酸殘基的凈電荷計算，或可通過等電聚焦來確定?！扒逑础鄙V介質(zhì)是指使適合的緩沖液通過或穿過介質(zhì)。從色譜樹脂“洗脫”分子(如目標多肽或雜質(zhì))是指通過改變?nèi)芤簵l件使得緩沖液與目標分子競爭色譜樹脂上的配體位點，從而從色譜樹脂上去除此分子。非限定性實例是通過改變離子交換材料周圍緩沖液的離子強度，使得緩沖液與分子競爭離子交換材料上的帶電荷位點，從而將分子從離子交換樹脂上洗脫。如本文所用，“濾液”是指通過過濾膜的樣品部分。如本文所用，“滯留物”是指基本被過濾膜保留的樣品部分。文中可交換使用的術(shù)語“病毒滅活”、“病毒清除”或“病毒減少”是指通過物理化學(xué)方法可導(dǎo)致病毒無法感染細胞或抑制病毒功能的任何方法。常規(guī)的病毒滅活方法包括但不限于低PH處理(如小于pH 4. 5、小于4. 0或小于3. 8)、熱處理、用表面活性劑和輻射(如紫外曝光)處理。在一些實施方式中，病毒滅活方法直接針對逆轉(zhuǎn)錄病毒。在具體實施方式
中，使用低PH條件進行病毒滅活，因為此條件通常破壞病毒脂質(zhì)包膜，以此滅活病毒。如本文所用，術(shù)語“低pH條件”是指水溶液或緩沖液的性質(zhì)，其中溶液或緩沖液的 PH低于正常操作條件，所述溶液或緩沖液通常用于包括含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白(如單克隆抗體或MAb)的樣品在陽離子(CIEX)交換介質(zhì)上的上梓。例如，典型的CIEX上樣條件高于pH 4. 5，且通常為pH 5至6。在本發(fā)明的方法中，可使用低pH條件，如pH小于4. 5。術(shù)語“預(yù)洗脫步驟”是指在洗脫前倒數(shù)第二步的色譜步驟，其中靶分子保持與柱結(jié)合，而在上樣至下ー個柱期間混合的緩沖液對目標產(chǎn)率或目標純度沒有負面影響。非限定性實例包括在適合于陽離子交換柱上樣的緩沖液(如PH 5.4的乙酸鈉或pH 5.0的檸檬酸鈉)中平衡載有含F(xiàn)c的蛋白的蛋白A柱，隨后通過pH 3的乙酸鈉將柱洗脫到陽離子交換柱上?！扒邢蛄鬟^濾”或“ TFF”或“交叉流過濾”是指這樣的過濾方法，其中樣品混合物循環(huán)通過膜的上部，而所施加的壓カ引起某些溶質(zhì)和小分子通過此膜。通常，溶液與過濾器膜平行流動?？缒亥钜鹆黧w或可過濾的溶質(zhì)流過過濾器。這可以連續(xù)流エ藝進行，因為溶液重復(fù)通過膜，而流過過濾器的流體被連續(xù)排入?yún)g獨的環(huán)路?！案咝邢蛄鬟^濾”或“HPTFF”是指在流量對跨膜壓カ曲線上，以在5%和100%跨膜壓カ之間的流量下進行的TFF(參見如美國專利第5，256，694號；美國專利第4，490，937 號；和美國專利第6,0 , 051號)。“孔徑分布”基本上是指具有接近一些理論半徑(r)的實際半徑(R)的孔的數(shù)量， 以概率密度函數(shù)表示(參見 Zeman，L. J. and Zydney, A. L.，supra, p. 299-301)。隨著實際孔半徑標準偏差的増加，孔徑分布増加。變窄的孔徑分布是因為孔對理論值的標準偏差減少。例如，當通過將帶電荷的化合物加入到帶電荷膜的較大孔中來降低一些較大孔的尺寸時，這就可以實現(xiàn)。液-液孔侵入的原理可用于測量孔徑分布(參見R. van Reis and A. L. Zydney, supra, p. 2201)。根據(jù)此原理，通過混合來使諸如硫酸鹽溶液和聚(乙ニ醇) 等兩種高度不混溶液體相接觸，以實現(xiàn)平衡分隔。帶測試的膜用其中ー種液體涂覆，使得全部孔被填滿。在排干進料通道后，將第二流體引入系統(tǒng)。第一流體隨后被第二流體排出孔中，且流速作為反面膜壓カ的函數(shù)測定。所得結(jié)果提供了孔徑分布的信息，且可與標稱分子星截流 Uiominal molecular weight cutoff)相關(guān)狀、參見 R. van Reis and A. L. Zydney, supra，p. 2201)?！肮倌軋F”的實例包括但不限于離子交換基團、生物親和性或生物特異性基團、疏水基團、親硫相互作用基團、螯合物或螯合基團、和靶化合物具有被稱為n-n相互作用的基團、氫結(jié)合基團和親水基團?！芭潴w”的實例包括但不限于離子交換基團、疏水相互作用基團、親水相互作用基團、親硫相互作用基團、金屬親和性基團、親和性基團、生物親和性基團和混合模式的基團 (上述基團的組合)。本文可用的一些優(yōu)選配體包括但不限于強陽離子交換基團，如磺丙基、磺酸；強陰離子交換基團，如三甲基氯化銨；弱陽離子交換基團，如羧酸；弱陰離子交換基團，如N，N-ニ乙胺基或DEAE ；疏水相互作用基團，如苯基、丁基、丙基、己基；和親和性基團，如蛋白A、蛋白G和蛋白しII.親和色譜步驟
在本發(fā)明的多個實施方式中，本發(fā)明的方法包括將基于蛋白A的親和性樹脂應(yīng)用于親和色譜步驟中。蛋白A可為天然蛋白A(來自Maph. Aureus)、重組蛋白A或它們的功能性變體?？捎迷诒景l(fā)明方法中的蛋白A樹脂的實例包括Prokp-vA HC, ProSep Ultra Plus.MabSelect.MabSelect SuRe和其它可商購的親和性樹脂。其它親和性配體/樹脂可用在本發(fā)明的方法中，如蛋白G和其它Fc結(jié)合蛋白(如單鏈駱駝抗體)。在本發(fā)明方法中，在親和捕獲步驟后，靶蛋白優(yōu)選使用pH 2. 0-4. O且優(yōu)選pH 2. 8-3. 8洗脫。洗脫池體積需要足夠大，以將靶蛋白從親和柱中移除并成功上樣至此エ藝中的后續(xù)在線陽離子交換柱上。這些體積將根據(jù)親和柱與陽離子交換柱的相對大小來改變。例如，如果親和柱和陽離子交換柱大小相同，洗脫池將優(yōu)選以1-5個柱體積(CV)，最優(yōu)選1. 5-4CV被洗脫。親和洗脫緩沖液的非限定性實例為乙酸、檸檬酸、磷酸鹽或甘氨酸 (glysine)。這些親和洗脫緩沖液可通過額外的鹽或添加劑來調(diào)整，以控制電導(dǎo)率或改進產(chǎn)物回收率。例如，額外的組分可包括降低聚集物形成的添加剤。添加劑的非限定性實例包括但不限于精氨酸、己ニ醇或聚乙ニ醇。在一些實施方式中，親和捕獲步驟為隨后的離子交換步驟提供了良好的上樣能力、產(chǎn)物回收率和雜質(zhì)去除。III.離子交換色譜步驟在本文所述方法中，親和步驟洗脫池被直接上樣至陽離子交換柱上，因此無需使用存儲罐/緩沖液交換步驟。陽離子交換柱可使用PH為3. 0-7. 0且電導(dǎo)率為2-20mS的緩沖液，最優(yōu)選PH為4. 5-6且電導(dǎo)率為2-16mS的緩沖液平衡?？捎脕碜杂H和柱的單次洗脫循環(huán)的每升樹脂5-120g靶蛋白(g/L)或者用來自親和柱的多個洗脫循環(huán)的5-120g/L靶蛋白對柱進行蛋白上梓。在一些實施方式中，陽離子交換柱的總上樣量為20-80g/L或40-60g/
し通過在上樣后將陽離子交換柱再平衡至比親和洗脫pH更高的pH，陽離子交換柱可上樣ー個或多個來自親和捕獲步驟的循環(huán)物。為了確定病毒在全部エ藝中被去除，CIEX柱可與pH小于4.0(如<3. 8)的緩沖液交換，以在上樣后進行10-60分鐘或15-45分鐘的病毒滅活。或者，可在上樣pH下對柱流過進行病毒去除的確定，這導(dǎo)致對于病毒流過和降低的PH病毒滅活均為累積的病毒去除?，F(xiàn)已觀察到某些靶蛋白在蛋白質(zhì)上樣或結(jié)合到柱期間或之后接觸低PH條件能夠影響靶蛋白的整體回收率。本發(fā)明提供了改進的純化方法，其避免了由提高某些方法步驟的電導(dǎo)率而導(dǎo)致的回收損失。例如，從陽離子交換步驟(CIEX)的靶蛋白回收率可受到純化方法期間的低PH緩沖液步驟(如常在低pH下實施的蛋白A洗脫步驟和病毒滅活步驟)的影響。在本發(fā)明方法的某些實施方式中，提供了改進的純化方法，其采用了電導(dǎo)率提高的低 PH緩沖液，從而改進了靶蛋白的整體回收?；蛘?，低pH緩沖液的pH可略有増加(例如，使用 pH 4. 5vs. pH 3. 5)?？赏ㄟ^，例如向蛋白A洗脫緩沖液或病毒滅活緩沖液添加鹽來提高低pH緩沖液的電導(dǎo)率。可使用的鹽可取決于所述緩沖液的PH，且可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員簡單地確定。 在一些實施方式中，所添加的鹽量在25mM至500mM和IOOmM至250mM的范圍?？赏ㄟ^本文所述的任意步驟和本領(lǐng)域已知的那些步驟或可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員簡單確定的那些步驟完成陽離子交換柱的洗脫。例如，在一些實施方式中，可使用ー個或多個PH步驟完成陽離子交換柱的洗脫，其中將所述洗脫液直接上樣到流過模式中的陰離子交換介質(zhì)上。洗脫PH變化還可包括緩沖液類型、緩沖液濃度和鹽濃度的變化。用于本文所述陽離子交換步驟的洗脫PH的優(yōu)選范圍是約6. 0至9. 0或約7. 0至8. 0。還可僅使用提高的緩沖電導(dǎo)率完成陽離子交換柱的洗脫。洗脫電導(dǎo)率的優(yōu)選范圍取決于PH和靶分子的等電點(pi)。通常，電導(dǎo)率變化在^iS至50mS或8mS至30mS范圍時可有效洗脫。必須優(yōu)化陽離子交換柱的洗脫以確保隨后的陰離子交換流通步驟的性能。例如，在一些情況下，可通過使用具有低電導(dǎo)率的較高pH，例如pH 7. 0的6mS緩沖液，或使用具有較高電導(dǎo)率的較低PH，例如，如pH 5. 5的15mS緩沖液實現(xiàn)從陽離子交換步驟的有效洗脫。在這些情況下，應(yīng)使用兩種條件研究陰離子交換流過步驟的性能，且陽離子交換步驟下游的性能決定了用于陽離子交換的優(yōu)選洗脫方法。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法可適合地包括在所述方法的任意步驟之間和之后的病毒過濾步驟。在一些實施方式中，所述病毒過濾步驟采用預(yù)濾器，其可以為任意形式，包括但不限于膜、深層濾器、色譜柱或其組合。所述方法可包括在親和捕獲之前的使用膜、深層濾器、色譜柱或其組合的另外的浄化或深層過濾?？稍陉庪x子交換之后添加另外的精制步驟，包括但不限于HPTFF、FT-HIC、HIC等。通過以下實施例進ー步舉例說明本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)解釋為限制性的。在本申請全文中引用的所有文獻、專利和公布的專利申請的內(nèi)容以及附圖均通過援引加入本文。實施例實施例1 用于低pH上樣的樹脂的結(jié)合能力的比較使用以下方法比較了三種陽離子交換介質(zhì)在表1中列出的條件(用于蛋白A親和層析的典型洗脫條件)下的動態(tài)負載量。使用了具有以下特征的示例性陽離子交換介質(zhì)平均粒徑為60 μ m，孔徑大小在 60-80nm之間，“S”配基密度在170-270 μ mol/mL樹脂之間，并且具有壓流性質(zhì)，使得在20cm 的床高下能夠在2bar下達到> 400cm/hr，且在3分鐘停留時間的IgG負載量> 50g/L的多孔單分散聚甲基丙烯酸酯樹脂，將商業(yè)上來自Millipore Corporation的I^roRes-S ，來自 EMD Merck 的 FractogeトS 禾ロ來自 GE Healthcare ^ SP-Sepharose Fast Flow. 裝入 omnifit 柱(直徑 0. 66cm，床高 7cm) (Bio Chem Valve, Inc. , Boontown, NJ)并檢測對多克隆人Y球蛋白(IgG)的動態(tài)結(jié)合負載量。使用表1中的pH和電導(dǎo)率進行柱平衡，根據(jù)需要使用氯化鈉調(diào)節(jié)電導(dǎo)率。使用在與平衡緩沖液相同的緩沖液中的蛋白質(zhì)將所述蛋白質(zhì) (5g/L)上樣到柱上。使用在與3分鐘停留時間一致的上樣流速下5%貫流(breakthrough) 的容量來表征動態(tài)結(jié)合負載量。表1 低pH下CIEX結(jié)合能力的總結(jié)
權(quán)利要求
1.從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的方法，所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品接觸親和色譜介質(zhì)；(b)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述親和介質(zhì)洗脫；(c)使洗脫液接觸陽離子交換色譜介質(zhì)；(d)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述陽離子交換色譜介質(zhì)洗脫；(e)使洗脫液接觸陰離子交換色譜介質(zhì)；和(f)回收所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白，其中所述方法在步驟(b)和(c)之間以及步驟(d)和(e)之間不需要存儲罐。
2.從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品接觸親和色譜介質(zhì)；(b)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述親和介質(zhì)洗脫；(c)使洗脫液接觸陽離子交換色譜介質(zhì)；(d)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述陽離子交換色譜介質(zhì)洗脫；(e)使洗脫液接觸陰離子交換色譜介質(zhì)；和(f)回收所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白，其中所述方法在步驟(b)和(c)之間以及步驟(d)和(e)之間不需要緩沖液交換步驟。
3.從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品接觸親和色譜介質(zhì)；(b)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述親和介質(zhì)洗脫；(c)使洗脫液接觸陽離子交換色譜介質(zhì)；(d)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述陽離子交換色譜介質(zhì)洗脫；(e)使洗脫液接觸陰離子交換色譜介質(zhì)；和(f)回收所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白，其中所述方法在步驟(b)和(c)之間以及步驟(d)和(e)之間不需要存儲罐和緩沖液交換步驟。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述方法還包括步驟(a)和(b)之間的預(yù)洗脫步驟。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白選自抗體、免疫粘附分子和Fc融合蛋白，及其含F(xiàn)c的片段。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述步驟(d)包括使用pH范圍為2.0-4. 0的緩沖液。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述預(yù)洗脫步驟包括使所述親和介質(zhì)接觸陽離子交換色譜緩沖液。
9.權(quán)利要求1的方法，還包括步驟(c)和(d)之間的病毒滅活步驟。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒滅活步驟包括使所述陽離子交換色譜介質(zhì)與pH 小于4. 0的緩沖液接觸適合于病毒滅活的一段時間。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述時間的范圍為15-60分鐘。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述緩沖液的電導(dǎo)率為5-50mS。
13.權(quán)利要求3的方法，其中所述步驟(d)包括使用pH范圍為5.0-9. 0的緩沖液。
14.權(quán)利要求3的方法，其中所述步驟(d)包括使用具有pH范圍為6.0-8.0的緩沖液。
15.權(quán)利要求3的方法，其中所述步驟(b)包括使用電導(dǎo)率在5-50mS范圍的緩沖液。
16.權(quán)利要求3的方法，其中所述步驟(b)包括使用電導(dǎo)率在12-25mS范圍的緩沖液。
17.權(quán)利要求3的方法，其中所述親和色譜介質(zhì)包含蛋白A或其功能性變體。
18.用于從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的試劑盒，所述試劑盒包含以下一或多種親和色譜介質(zhì)、陽離子交換色譜介質(zhì)、陰離子交換色譜介質(zhì)和一或多種洗脫緩沖液，以及無需存儲罐和/或緩沖液交換步驟而使用所述試劑盒的說明書。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述一或多種介質(zhì)裝在柱中。
20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述柱是一次性柱。
21.從樣品的一或多種雜質(zhì)中純化含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白的連續(xù)方法，所述方法包括以下步驟(a)使所述樣品接觸親和色譜介質(zhì)；(b)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述親和介質(zhì)洗脫；(c)使洗脫液接觸陽離子交換色譜介質(zhì)；(d)將所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白從所述陽離子交換色譜介質(zhì)洗脫；(e)使洗脫液接觸陰離子交換色譜介質(zhì)；和(f)回收所述含F(xiàn)c區(qū)域的靶蛋白。
22.權(quán)利要求21的連續(xù)方法，其中所述方法在步驟(b)和(c)之間以及步驟(d)和(e) 之間不需要存儲罐和/或緩沖液交換步驟。
全文摘要
本發(fā)明至少部分地涉及蛋白質(zhì)純化的改進方法。具體地，本發(fā)明至少部分地涉及用于從包括含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)和一或多種雜質(zhì)的組合物中純化含F(xiàn)c區(qū)域的蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法不需要存儲罐和/或緩沖液交換步驟。
文檔編號C07K17/00GK102574911SQ201080035153
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者D·哈伯德, J·哈姆齊克, N·索伊斯, Y·張 申請人:米利波爾公司