專利名稱：包含異戊二烯衍生物的燃料組合物的制作方法
包含異戊二烯衍生物的燃料組合物相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2009年6月17日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/187，959的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用方式全文并入本文。
背景技術(shù)：
開發(fā)可再生交通運(yùn)輸燃料是21世紀(jì)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。當(dāng)前市場由衍生自酵母發(fā)酵蔗糖和淀粉的乙醇主導(dǎo)，并且在較低程度上由衍生自甘油三酯的生物柴油(脂肪酸酯)主導(dǎo)。乙醇具有作為液體燃料相對(duì)于烴而言能量密度較低的局限性。此外，因其水親和性和腐蝕性本質(zhì)，乙醇不能在常規(guī)基本設(shè)施中運(yùn)輸。用于可再生碳源(生物質(zhì)、糖、油)轉(zhuǎn)化成烴燃料的方法提供了有吸引力的生物乙醇替代品。
異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是一種主要用于生產(chǎn)合成橡膠的重要工業(yè)化學(xué)品。目前，異戊二烯通過石腦油和其他輕質(zhì)石油餾分的裂化直接地或經(jīng)化學(xué)合成間接地從石油化學(xué)源衍生(見，例如，H. Po_er 和 A. Nurrenbach, Industrial Synthesis ofTerpene Compounds, Pure AppI. Chem. ,1975,43,527-551 ；H. M. Weitz 和 E.Loser,異戍二烯，引自 Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry,第七版，電子版發(fā)行，Wiley-VCH Verlag GMBH, ffeinheim, 2005 ;和 H. M. Lybarger,異戍二烯，引自 Kirk-OthmerEncyclopedia of Chemical Technology,第 4 版，Wiley, New York(1995)，14，934-952.)。所得的粗制異戊二烯流一般地經(jīng)歷深度純化過程以除去眾多化學(xué)上相似的雜質(zhì)，它們中的一些可能干擾異戊二烯后續(xù)轉(zhuǎn)變成聚合物和其他化學(xué)品。相反，從生物來源衍生的異戊二烯含有極少烴雜質(zhì)，并且反而含有許多氧化的化合物，如乙醇、乙醛和丙酮。這些化合物中的一些可以通過與水接觸或者穿過氧化鋁或其他吸收劑來輕易地除去。工業(yè)依賴石油化學(xué)原料以生產(chǎn)異戊二烯，并且在異戊二烯可以轉(zhuǎn)化成聚合物和其他化學(xué)品之前，需要深度純化工作。需要有成本效益的方法以利用生物異戊二烯的高純度和/或獨(dú)特雜質(zhì)情況將生物方式產(chǎn)生的異戊二烯轉(zhuǎn)化成有價(jià)值的化學(xué)產(chǎn)品。本文中所引用的全部專利、專利申請(qǐng)、文獻(xiàn)和文章都通過引用的方式全文并入本文。

發(fā)明內(nèi)容
公開了用于從高純異戊二烯產(chǎn)生燃料組分的方法和系統(tǒng)以及自高純異戊二烯產(chǎn)生的燃料組合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于從生物異戊二烯組合物產(chǎn)生燃料組分的方法，所述方法包括將該生物異戊二烯組合物中的大部分異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成非異戊二烯化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過下述方式化學(xué)地轉(zhuǎn)變所述生物異戊二烯組合物使該生物異戊二烯組合物經(jīng)歷適于異戊二烯二聚化的熱或催化條件以產(chǎn)生異戊二烯二聚體，并且隨后催化地氫化異戊二烯二聚體以形成飽和的ClO燃料組分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(i)部分地氫化生物異戊二烯組合物以產(chǎn)生異戊烯，(ii)使異戊烯與選自異戊烯、丙烯和異丁烯的單烯烴二聚化以形成二聚物(dimate)，和(iii)完全氫化該二聚物以產(chǎn)生燃料組分。在一些實(shí)施方式中，生物異戊二烯組合物中至少約95%的異戊二烯在化學(xué)轉(zhuǎn)變期間轉(zhuǎn)化成非異戊二烯化合物。在一些實(shí)施方式中，加熱生物異戊二烯組合物到約150°C至約250°C以產(chǎn)生不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體并且催化地氫化不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體以產(chǎn)生飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體燃料組分。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(i)使生物異戊二烯組合物與用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑接觸以產(chǎn)生不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體，并且催化地氫化不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體以產(chǎn)生飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體燃料組分。在一些實(shí)施方式中，用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑包括選自鎳催化劑、鐵催化劑和鉻催化劑的催化劑。在一些實(shí)施方式中，部分地氫化生物異戊二烯組合物的步驟包括使生物異戊二烯組合物與氫氣和用于催化異戊二烯的部分氫化的催化劑接觸。在一些實(shí)施方式中，用于催化異戊二烯的部分氫化的催化劑包括鈀催化劑。在一些實(shí)施方式中，使異戊烯與單烯烴二聚化的步驟包括使異戊烯與單烯烴在用于催化單烯烴二聚化的催化劑存在下接觸。在一些實(shí)施方式中，用于催化單烯烴二聚化的催化劑包括酸催化劑。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在將所述生物異戊二烯組合物化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分之前純化來自生物異戊二烯組合物的異戊二烯。 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于從生物異戊二烯組合物產(chǎn)生燃料組分的系統(tǒng)，其中將該生物異戊二烯組合物中的大部分異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)化成非異戊二烯化合物，該系統(tǒng)包含生物異戊二烯組合物和(a) (i)能夠使生物異戊二烯組合物中的異戊二烯二聚化的一種或多種化學(xué)品或能夠使生物異戊二烯組合物中的異戊二烯二聚化的熱源；和(ii)能夠氫化異戊二烯二聚體以形成飽和的ClO燃料組分的催化劑；或(b) (i)能夠部分地氫化生物異戊二烯組合物中的異戊二烯以產(chǎn)生異戊烯的化學(xué)品，(ii)能夠使異戊烯與選自異戊烯、丙烯和異丁烯的單烯烴二聚化以形成二聚物(dimate)的化學(xué)品和(iii)能夠完全氫化該二聚物以產(chǎn)生燃料組分的化學(xué)品。在該系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，生物異戊二烯組合物包含大于約2mg的異戊二烯并且包含重量占該組合物中全部C5烴的總重量的大于或約99. 94%的異戊二烯。在該系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，能夠使異戊二烯二聚化的一種或多種化學(xué)品包括用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑，所述催化劑包括選自釕催化劑、鎳催化劑、鐵催化劑和鉻催化劑的催化齊U。在該系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，用于氫化不飽和異戊二烯二聚體的催化劑包括選自鈀催化劑、鎳催化劑、釕催化劑和銠催化劑的催化劑。在該系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，能夠部分地氫化異戊二烯的化學(xué)品包括鈀催化劑。在該系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，能夠使異戊烯與單烯烴二聚化的化學(xué)品包括酸催化劑。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供燃料組合物，其包含通過本文中所述方法產(chǎn)生的燃料組分。在一些實(shí)施方式中，該燃料組合物基本上不含異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該燃料組合物具有大于_22%?；蛟?32%。至-24%。范圍內(nèi)的S 13C值。在一些方面，本發(fā)明提供用于從異戊二烯產(chǎn)生燃料組分的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含(a)商業(yè)上有益量的高純異戊二烯；和(b)從至少一部分高純異戊二烯產(chǎn)生的燃料組分；其中至少一部分的商業(yè)上有益量的高純異戊二烯經(jīng)歷化學(xué)轉(zhuǎn)變。在該系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包含大于約2mg的異戊二烯并且包含重量占該組合物中全部C5烴的總重量的大于或約99. 94%的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包含大于約2mg的異戊二烯并且包含選自乙醇、丙酮、C5異戊二烯基醇和具有10個(gè)或更多個(gè)碳原子的類異戊二烯化合物的一種或多種化合物。在一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包含大于約2mg的異戊二烯并且包含選自乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、異丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基環(huán)氧乙燒、順式_和反式-3-甲基-I, 3-戍二烯、C5異戍二烯基醇、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、丁二酮、2- 丁酮、2-甲基-3- 丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I- 丁醛、3-甲基-2- 丁酮、I- 丁醇、2-戊酮、3-甲基-I- 丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3- 丁烯-I-基乙酸酯、3-甲基-2- 丁烯-I-基乙酸酯、3-己烯-I-醇、3-己烯-I-基乙酸酯、苧烯、香葉醇(反式_3，7- 二甲基-2，6-辛二烯-I-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-I-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)_3，7_ 二甲基-1，3，6-辛三烯、和2，3_環(huán)庚烯醇吡啶的一種或多種第二化合物；其中相對(duì)于異戊二烯的量，第二化合物的量是大于或約0.01% (w/w)。在一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包含大于約2mg的異戊二烯并且對(duì)于該組合物中抑制異戊二烯聚合的任意化合 物包含小于或約0. g/L每種化合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯通過生物過程產(chǎn)生。在該系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，燃料組分包含選自環(huán)狀異戊二烯二聚體與三聚體、線性異戊二烯低聚物、芳族及脂環(huán)族異戊二烯衍生物、和氧化異戊二烯衍生物的一種或多種化合物。在一些實(shí)施方式中，氧化異戊二烯衍生物是選自衍生自異戊二烯的醇、酮、酯和醚的化合物。在一些實(shí)施方式中，燃料組分包含環(huán)狀異戊二烯二聚體，并且化學(xué)轉(zhuǎn)變包括異戊二烯的二聚化反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，所述二聚化反應(yīng)通過加熱商業(yè)上有益量的高純異戊二烯進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述異戊二烯的二聚化反應(yīng)產(chǎn)生包含不飽和異戊二烯二聚體的產(chǎn)物，并且所述化學(xué)轉(zhuǎn)變還包括不飽和異戊二烯二聚體的氫化反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)還包含用于催化不飽和異戊二烯二聚體的氫化反應(yīng)的催化劑。在一些實(shí)施方式中，用于催化不飽和異戊二烯二聚體的氫化反應(yīng)的催化劑包括選自鈀催化劑、鎳催化劑、釕催化劑和銠催化劑的催化劑。在一些實(shí)施方式中，所述二聚化反應(yīng)通過使商業(yè)上有益量的高純異戊二烯與用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑接觸來進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑包括選自釕催化劑、鎳催化劑、鐵催化劑和鉻催化劑的催化劑。在一些實(shí)施方式中，用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑是鎳催化劑，并且燃料組分包含異戊二烯的一種或多種八元環(huán)二聚體。在一些實(shí)施方式中，燃料組分包含異戊二烯的線性和/或環(huán)狀三聚體，并且化學(xué)轉(zhuǎn)變包括異戊二烯的催化三聚化。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于從異戊二烯產(chǎn)生燃料組分的方法，該方法包括(a)獲得商業(yè)上有益量的高純異戊二烯；和(b)將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分。在一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包含生物異戊二烯。
在一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯通過以下步驟獲得，所述步驟包括(i)在產(chǎn)生異戊二烯的合適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)包含編碼異戊二烯合酶多肽的異源核酸的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞(I)產(chǎn)生大于約400nmole/gwc;m/小時(shí)的異戊二烯，(2)將多于約0. 002摩爾％的所述細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中消耗的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯，或(3)具有大于約0. lmg/L###/小時(shí)的異戊二烯的異戊二烯平均體積生產(chǎn)率，并且(ii)產(chǎn)生異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包含編碼異戊二烯合酶多肽或MVA途徑多肽的異源核酸。在本文所述的方法的一些實(shí)施方式中，將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分包括i)加熱商業(yè)上有益量的高純異戊二烯到約150°C至約250°C ；(ii)將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯轉(zhuǎn)化成不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體；(iii)氫化不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體以產(chǎn)生飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體；和(iv)產(chǎn)生燃料組分。在一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯中至少約20%至約100%的異戊二烯轉(zhuǎn)化成不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體。 在該方法的一些實(shí)施方式中，將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分包括(i)使商業(yè)上有益量的高純異戊二烯與用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑接觸；(ii)將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯轉(zhuǎn)化成環(huán)狀異戊二烯二聚體；和(iii)產(chǎn)生燃料組分。在該方法的一些實(shí)施方式中，將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分包括i)使商業(yè)上有益量的高純異戊二烯與用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑接觸；(ii)將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯轉(zhuǎn)化成不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體；(iii)氫化不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體以產(chǎn)生飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體；和(iv)產(chǎn)生燃料組分。在該方法的一些實(shí)施方式中，用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑包括選自鎳催化劑、鐵催化劑和鉻催化劑的催化劑。在該方法的一些實(shí)施方式中，將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分包括(i)使高純異戊二烯組合物與催化劑體系接觸；(ii)將至少一部分起始異戊二烯組合物轉(zhuǎn)化成不飽和的異戊二烯二聚體和/或三聚體；和(iii)氫化不飽和的二聚體和/或三聚體以產(chǎn)生飽和的ClO和/或C15烴。在一些實(shí)施方式中，用于從異戊二烯產(chǎn)生燃料組分的方法包括(a)獲得商業(yè)上有益量的本文中所述的任何高純異戊二烯起始組合物；(b)將至少一部分起始異戊二烯組合物轉(zhuǎn)化成氧化異戊二烯衍生物；和任選地(C)氫化任何不飽和的氧化異戊二烯衍生物以產(chǎn)生飽和的氧化產(chǎn)物(oxygenate)。在一些實(shí)施方式中,氧化異戍二烯衍生物是選自衍生自異戊二烯的醇、酮、酯和醚的化合物。在一些實(shí)施方式中，本文中所述的任何方法還包括在將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分之前，純化商業(yè)上有益量的高純異戊二烯。在一個(gè)方面，提供了一種用于從異戊二烯產(chǎn)生燃料組分的連續(xù)方法，所述連續(xù)方法包括(a)連續(xù)地產(chǎn)生商業(yè)上有益量的高純異戊二烯；和(b)連續(xù)地將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分。在一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包括含有異戊二烯的氣相。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括使包含異戊二烯的氣相通過用于將至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分的反應(yīng)器。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包含生物異戊二烯。
還提供燃料組合物，其包含通過本文中所述的任何方法產(chǎn)生的燃料組分。在一些實(shí)施方式中，在經(jīng)歷根據(jù)本文中所述方法的步驟后，所述燃料組分包含少于或約0. g/L的來自除異戊二烯之外的C5烴中的產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，在經(jīng)歷根據(jù)本文中所述方法的步驟后，該燃料組分包含來自 一種或多種化合物的一種或多種產(chǎn)物，其中所述化合物選自乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、異丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基環(huán)氧乙烷、順式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5異戊二烯基醇、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5_三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I-丁醛、3-甲基-2-丁酮、I-丁醇、2-戊酮、3-甲基-I- 丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3- 丁烯-I-基乙酸酯、3-甲基-2- 丁烯-I-基乙酸酯、3-己烯-I-醇、3-己烯-I-基乙酸酯、苧烯、香葉醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-I-醇)、香茅醇(3，7_ 二甲基-6-辛烯-I-醇)、(E)-3，7-二甲基-I，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-I，3，6-辛三烯和2，3-環(huán)庚烯醇批P定。在一些實(shí)施方式中，該燃料組合物包含具有大于_22%。的5 13C值的燃料組合物。在一些實(shí)施方式中，該燃料組合物具有在_22%。至-10%?；?34%。至-24%。范圍內(nèi)的S 13C值。在一些實(shí)施方式中，該燃料組合物具有大于0.9的fM值。還提供本文中所述任何燃料組合物與石油基燃料的摻合物，基于總?cè)剂辖M合物的總重量或體積，所述石油基燃料的量為按重量或體積計(jì)的約1%至約95%。


圖I是針對(duì)在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的野葛(kudzu)異戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO :I)。atg起始密碼子以斜體表示，終止密碼子以加粗字體表示，添加的PstI位點(diǎn)以下劃線標(biāo)示。圖2 是 pTrcKudzu 的圖譜。圖3A-C是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。RBS以下劃線標(biāo)示，野葛異戊二烯合酶起始密碼子以加粗大寫字母表示，終止密碼子以加粗大寫字母表示。載體骨架是 pTrcHis2B0圖4 是 pETNHisKudzu 的圖譜。圖5A-C 是 pETNHisKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO :3)。圖6 是 pCL-lac-Kudzu 的圖譜。圖7A-C 是 pCL-lac-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 4)。圖8A的圖顯示了在無載體的大腸桿菌BL21細(xì)胞中生產(chǎn)異戊二烯。圖8B的圖顯示了在具有pCL-lac-Kudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中生產(chǎn)異戊二烯。圖8C的圖顯示了在具有pTrcKudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中生產(chǎn)異戊二烯。圖8D的圖顯示了在具有pETN-HisKudzu的大腸桿菌BL21細(xì)胞中生產(chǎn)異戊二烯。圖9A的圖顯示了在14升的補(bǔ)料分批發(fā)酵中，大腸桿菌BL21/pTrcKudzu的發(fā)酵隨時(shí)間的0D。圖9B的圖顯示了在14升的補(bǔ)料分批發(fā)酵中，大腸桿菌BL21/pTrcKudzu的發(fā)酵隨時(shí)間生產(chǎn)的異戊二烯。
圖IOA的圖顯示了朽1檬泛菌(Pantoea citrea)中異戍二烯的生產(chǎn)。對(duì)照細(xì)胞中無重組野葛異戊二烯合酶?；疑庑伪硎井愇於┑暮铣?，黑色方框表示0D_。圖IOB的圖顯示了表達(dá)pCL-lac Kudzu的朽1檬泛菌中異戍二烯的生產(chǎn)。灰色菱形表不異戍二烯的合成，黑色方框表不0D_。圖IOC的圖顯示了表達(dá)pTrcKudzu的朽1檬泛菌中異戍二烯的生產(chǎn)。灰色菱形表示異戊二烯的合成，黑色方框表示0D_。圖11的圖顯示了表達(dá)重組異戍二烯合酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中異戍二烯的生產(chǎn)。BG3594comK是無質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌菌株(天然的異戍二烯生產(chǎn))。CF443是具有pBSKudzu的枯草芽孢桿菌菌株BG3594comK (重組的異戊二烯生產(chǎn))。y軸上的IS表示異戊二烯。圖12A-C 是 pBS Kudzu#2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)。圖13是針對(duì)在耶氏酵母屬(Yairowia)中的表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO 6)。圖14是包含針對(duì)在耶氏酵母屬中的表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶基因的pTrex3g的圖譜。圖15A-C 是載體 pSPZl(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO :7)。圖16是針對(duì)在耶氏酵母屬中的表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的合成的野葛(越南葛藤(Pueraria montana))異戍二烯基因的核苷酸序列(SEQ ID NO :8)。圖17是合成的雜交白楊(poplar)(銀白楊(Populus alba)x歐洲山楊(Populustremula))異戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO :9)。ATG起始密碼子以加粗表示，終止密碼子以下劃線標(biāo)示。圖18A (圖 18A1 和 18A2)顯示了載體 pYLA UpYLl 和 pYL2 (SEQ ID NO :75、73、72、71、70、69)的構(gòu)建示意圖。
圖18B 顯示了載體 pYLA(POPl) (SEQ ID NO :68、69)的構(gòu)建示意圖。圖18C顯示了載體pYLA(KZl)的構(gòu)建示意圖。圖18D 顯示了載體 pYLI (KZl) (SEQ ID NO :66、67)的構(gòu)建示意圖。圖18E顯示了載體pYLI(MAP29)的構(gòu)建示意圖。圖18F顯示了載體pYLA(MAP29)的構(gòu)建示意圖。圖19A顯示了異戍二烯的MVA和DXP代謝途徑(基于F. Bouvier等人，Progressin Lipid Res. 44 :357-429, 2005)。以下描述包括該途徑中的每種多肽的替代性名稱，以及公開了用于測定指明的多肽的活性的測定法的參考文獻(xiàn)(這些文獻(xiàn)中的每一篇皆通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于測定MVA和DXP途徑中的多肽的多肽活性的測定法的那些)。甲羥戊酸途徑=AACT ；乙?；?輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶，MvaE, EC 2. 3. I. 9.測定法 J. Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ；HMGS ;羥基甲基戊二酰-輔酶 A 合酶，MvaS,EC 2. 3. 3. 10.測定法 J. Bacteriol.，184 :4065-4070,2002 ；HMGR ;3_ 羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A還原酶，MvaE，EC I. I. I. 34.測定法:J. Bacteriol.，184 :2116-2122,2002 ；MVK ；甲羥戊酸激酶，ERG12，EC 2. 7. I. 36.測定法=Curr Genet 19 :9_14，1991. PMK ;磷酸甲羥戊酸激酶，ERG8，EC 2. 7. 4. 2，測定法Mol Cell Biol.，11 :620_631，1991 ;DPMDC ;二磷酸甲羥戊酸脫羧酶，MVDI, EC 4. I. I. 33.測定法Biochemistry，33 :13355_13362，1994 ;IDI ；異戊烯-二磷酸 6 -異構(gòu)酶，IDI1, EC 5. 3. 3. 2. Assay J. Biol. Chem. 264 :19169-19175，1989. DXP Pathway DXS ;1_ 脫氧木酮糖 ~5~ 磷酸合酶，dxs, EC 2. 2. I. 7.測定法PNAS,94 :12857-62,1997 ；DXR ；1-脫氧-D-木酮糖 5-磷酸還原異構(gòu)酶，dxr, EC 2. 2. I. 7.測定法Eur. J. Biochem. 269 :4446-4457,2002 ；MCT ;4_ 二磷酸胞苷 _2C_ 甲基-D-赤蘚醇合酶，IspD, EC 2. 7. 7. 60.測定法PNAS,97 :6451-6456,2000 ；CMK ；4- 二磷酸胞苷 ~2~C~ 甲基-D-赤蘚醇激酶，IspE, EC 2. 7. I. 148.測定法PNAS,97 :1062-1067，2000 ；MCS ；2C-甲基-D-赤蘚醇 2，4_ 環(huán)二磷酸合酶，IspF, EC 4.6.1.12.測定法PNAS，96 :11758_11763，1999 ;HDS ;1_ 羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基 4-二磷酸合酶，ispG，EC I. 17. 4. 3.測定法J. Org. Chem. ,70 :9168-9174,2005 ;HDR;1_ 羥基-2-甲基 _2_ (E) - 丁烯基 4-二磷酸還原SI, IspH, EC I. 17. I. 2.測定法 JACS，126 :12847-12855，2004。圖19B顯示了經(jīng)典的和修飾的MVA途徑。1，乙?；?輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(AACT)；2，HMG-CoA合酶(HMGS) ;3，HMG-CoA還原酶(HMGR) ;4，甲羥戊酸激酶(MVK) ;5，磷酸甲羥戊酸激酶(PMK) ;6，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD或DPMDC) ;7，異戊烯二磷酸異構(gòu)酶(IDI) ;8，磷酸甲羥戊酸脫羧酶(PMDC) ;9，異戊烯磷酸激酶(IPK)。經(jīng)典的MVA途徑從反應(yīng)I開始，經(jīng)過反應(yīng)5和6 —直到達(dá)反應(yīng)7，而修飾的MVA途徑經(jīng)過翻譯8和9。結(jié)構(gòu)式中的P和PP分別是憐酸和焦憐酸。該圖取自 Koga 和 Morii,Microbiology and Mol. Biology Reviews, 71 97-120，2007，該文獻(xiàn)通過引用方式全文并入本文，尤其是關(guān)于修飾的MVA途徑的核酸和多肽的部分。修飾的MVA途徑存在于例如一些古細(xì)菌中，例如馬氏甲烷八疊球菌。圖20中的圖(圖20A和20B)顯示了由不含(左側(cè))或含有(右側(cè))野葛異戊二烯合酶基因的重組解脂耶氏酵母(Y. Iipolytica)菌株生產(chǎn)的異戊二烯的GC-MS分析的結(jié)果。箭頭表示真實(shí)的異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)物的洗脫時(shí)間。圖 21 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的圖譜。圖22A-D 是 pTrcKudzu yIDI DXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO: 10)。圖23A的圖顯示了在BL21/pTrcKudzukan中，從葡萄糖生產(chǎn)異戍二烯。時(shí)間0是 以IPTG(400 ii mol)誘導(dǎo)時(shí)的時(shí)間。x軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是0D_，y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)率(U g/L頂空或比生產(chǎn)率(U g/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓形代表總的異戊二烯生產(chǎn)率g/L)，方框代表異戊二烯的比生產(chǎn)率(y g/L/0D)。圖23B的圖顯示了在BL21/pTrcKudzu yIDI kan中，從葡萄糖生產(chǎn)異戍二烯。時(shí)間0是以IPTG(400 u mol)誘導(dǎo)時(shí)的時(shí)間。x軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是0D_，y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)率(U g/L頂空或比生產(chǎn)率(U g/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓形代表總的異戊二烯生產(chǎn)率g/L)，方框代表異戊二烯的比生產(chǎn)率(y g/L/0D)。圖23C的圖顯示了在BL21/pTrcKudzu DXS kan中，從葡萄糖生產(chǎn)異戍二烯。時(shí)間0是以IPTG(400 ii mol)誘導(dǎo)時(shí)的時(shí)間。x軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是0D_，y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)率(U g/L頂空或比生產(chǎn)率(U g/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓形代表總的異戊二烯生產(chǎn)率g/L)，方框代表異戊二烯的比生產(chǎn)率(y g/L/0D)。圖23D的圖顯示了在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中，從葡萄糖生產(chǎn)異戍二烯。時(shí)間0是以IPTG(400 u mol)誘導(dǎo)時(shí)的時(shí)間。x軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是0D_，y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)率(U g/L頂空或比生產(chǎn)率(U g/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓形代表總的異戊二烯生產(chǎn)率g/L)，方框代表異戊二烯的比生產(chǎn)率(y g/L/0D)。
圖23E的圖顯示了在BL21/pCL PtrcKudzu中，從葡萄糖生產(chǎn)異戍二烯。時(shí)間0是以IPTG(400 ii mol)誘導(dǎo)時(shí)的時(shí)間。x軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是0D_，y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)率(U g/L頂空或比生產(chǎn)率(U g/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓形代表總的異戊二烯生產(chǎn)率g/L)，方框代表異戊二烯的比生產(chǎn)率(y g/L/OD)。圖23F的圖顯示了在BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中，從葡萄糖生產(chǎn)異戍二烯。時(shí)間0是以IPTG(400 u mol)誘導(dǎo)時(shí)的時(shí)間。x軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是0D_，y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)率(U g/L頂空或比生產(chǎn)率(U g/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓形代表總的異戊二烯生產(chǎn)率g/L)，方框代表異戊二烯的比生產(chǎn)率(y g/L/OD)。圖23G的圖顯示了在BL21/pCL PtrcKudzu DXS中，從葡萄糖生產(chǎn)異戊二烯。時(shí)間0是以IPTG(400 ii mol)誘導(dǎo)時(shí)的時(shí)間。x軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是0D_，y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)率(U g/L頂空或比生產(chǎn)率(U g/L頂空/0D)。菱形代表0D_，圓形代表總的異戊二烯生產(chǎn)率g/L)，方框代表異戊二烯的比生產(chǎn)率(y g/L/0D)。圖23H的圖顯示了在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中，從葡萄糖生產(chǎn)異戍二烯。箭 頭指示以IPTG(400 ii mol)誘導(dǎo)時(shí)的時(shí)間。x軸是誘導(dǎo)后的時(shí)間；y軸是0D_，y2軸是異戊二烯的總生產(chǎn)率(U g/L頂空或比生產(chǎn)率(U g/L頂空/0D)。黑色菱形代表0D_，黑色三角形代表異戊二烯生產(chǎn)率g/L)，白色方框代表異戊二烯的比生產(chǎn)率g/L/0D)。圖24 是 pTrcKKDylkIS kan 的圖譜。圖25A-D 是 pTrcKKDylkIS kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO :11)。圖26 是 pCL PtrcUpperPathway 的圖譜。圖27A-27D 是 pCL PtrcUpperPathway 的核苷酸序列(SEQ ID NO: 12)。圖28顯示了包含下部MVA途徑和用于整合進(jìn)入枯草芽孢桿菌染色體的nprE基因座的酵母idi的盒的圖譜。nprE上游/下游表示距離nprE基因座各Ikb的序列以用于整合。aprE啟動(dòng)子(堿性絲氨酸蛋白酶啟動(dòng)子)表示aprE基因的啟動(dòng)子(-35，-10，+1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，RBS)。MVKl表示酵母甲羥戊酸激酶基因。RBS-PMK表示在起始位點(diǎn)上游具有芽孢桿菌RBS的酵母磷酸甲羥戊酸激酶基因。RBS-MPD表示在起始位點(diǎn)上游具有芽孢桿菌RBS的酵母二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因。RBS-IDI表示在起始位點(diǎn)上游具有芽孢桿菌RBS的酵母idi基因。終止子表示來自解淀粉芽孢桿菌(B. amyliquefaciens)的終止子堿性絲氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄終止子。SpecR表示壯觀霉素抗性標(biāo)志物?！坝糜跀U(kuò)增的nprE上游重復(fù)序列”表示用于擴(kuò)增的上游區(qū)的直接重復(fù)序列。圖29A-D是含有下部MVA途徑和用于整合進(jìn)入枯草芽孢桿菌染色體的nprE基因座的酵母idi的盒的核苷酸序列(SEQ ID NO 13)。圖30 是 p9796_poplar 的圖譜。圖31A-B 是 p9796_poplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 14)。圖32 是 pTrcPoplar 的圖譜。圖33A-C 是 pTrcPoplar 的核苷酸序列(SEQ ID NO 15)。圖34 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的圖譜。圖35A-C 是 pTrcKudzu yIDI Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 16)。圖36 是 pTrcKudzuDXS Kan 的圖譜。圖37A-C 是 pTrcKudzuDXS Kan 的核苷酸序列(SEQ ID NO 17)。
圖38 是 pCL PtrcKudzu 的圖譜。圖39A-C 是 pCL PtrcKudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 18)。圖40 是 pCL PtrcKudzu A3 的圖譜。圖41A-C 是 pCL PtrcKudzu A3 的核苷酸序列(SEQ ID NO 19)。圖42 是 pCL PtrcKudzu yIDI 的圖譜。圖43A-C 是 pCL PtrcKudzu yIDI 的核苷酸序列(SEQ ID NO :20)。圖44 是 pCL PtrcKudzu DXS 的圖譜。圖45A-D 是 pCL PtrcKudzu DXS 的核苷酸序列(SEQ ID NO 21)。
圖46A-E的圖顯示了從生物質(zhì)原料生產(chǎn)異戊二烯。圖板A顯示了從玉米秸桿生產(chǎn)異戊二烯，圖板B顯示了從甘蔗渣生產(chǎn)異戊二烯，圖板C顯示了從軟木漿生產(chǎn)異戊二烯，圖板D顯示了從葡萄糖生產(chǎn)異戊二烯，圖板E顯示了不用額外的原料從細(xì)胞生產(chǎn)異戊二烯?；疑娇虼碓诮臃N后的指明的時(shí)間培養(yǎng)物的OD6tltl測量值，黑色三角形代表在接種后的指明的時(shí)間異戊二烯的產(chǎn)量。圖47A的圖顯示了在未添加葡萄糖的培養(yǎng)物中，由BL21(ADE3)pTrcKudzu yIDIDXS(kan)生產(chǎn)的異戊二烯。方框代表OD6tltl，三角形代表生產(chǎn)的異戊二烯(yg/ml)。圖47B的圖顯示了由BL21 (入DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從I %的葡萄糖原料轉(zhuǎn)化糖生產(chǎn)的異戊二烯。方框代表0D_，三角形代表生產(chǎn)的異戊二烯(yg/ml)。圖47C 的圖顯示了由 BL21UDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從 I % 的轉(zhuǎn)化糖原料生產(chǎn)的異戊二烯。方框代表0D_，三角形代表生產(chǎn)的異戊二烯(yg/ml)。圖47D 的圖顯示了由 BL2IU DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)從 1% 的 AFEX 玉米秸桿原料生產(chǎn)的異戊二烯。方框代表0D_，三角形代表生產(chǎn)的異戊二烯(yg/ml)。圖48A-C的圖顯示了酵母提取物對(duì)生產(chǎn)異戊二烯的影響。圖板A顯示了加入不同量的酵母提取物的發(fā)酵器內(nèi)的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖板B顯示了加入不同量的酵母提取物的發(fā)酵器內(nèi)的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖板C顯示了酵母提取物對(duì)于補(bǔ)料分批培養(yǎng)物中生長的大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯的影響。圖49A-C的圖顯示了從500L的生物反應(yīng)器中由含有pTrcKudzu+ylDI+DXS質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)的異戊二烯。圖板A顯示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖板B顯示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反應(yīng)器的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖板C顯示了從加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的總的異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖50 是 pJMupperpathway2 的圖譜。圖51A-C 是 pJMupperpathway2 的核苷酸序列(SEQ ID NO :22)。圖52 是 pBS Kudzu#2 的圖譜。圖53A的圖顯示了在14升的補(bǔ)料分批發(fā)酵中，表達(dá)重組野葛異戊二烯合酶的芽孢桿菌的發(fā)酵時(shí)間過程中的生長。黑色菱形代表無重組異戊二烯合酶的對(duì)照菌株(BG3594comK)(天然的異戊二烯生產(chǎn))，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢桿菌菌株BG3594comK(重組的異戊二烯生產(chǎn))。圖53B的圖顯示了在14升的補(bǔ)料分批發(fā)酵中，表達(dá)重組野葛異戊二烯合酶的芽孢桿菌的發(fā)酵時(shí)間過程中的異戊二烯生產(chǎn)。黑色菱形代表無重組異戊二烯合酶的對(duì)照菌株(BG3594comK)(天然的異戊二烯生產(chǎn))，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢桿菌菌株BG3594comK(重組的異戊二烯生產(chǎn))。圖54是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖55是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖56是從加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的總的異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖57是加入了甘油的15L的生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖58是加入了甘油的15L的生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖59是從加入了甘油的15L的生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的總的異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。 圖60A-60C是加入了葡萄糖的150L的生物反應(yīng)器中的光密度、甲羥戊酸效價(jià)、和比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖61A-61C是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度、甲羥戊酸效價(jià)、和比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖62A-62C是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度、甲羥戊酸效價(jià)、和比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖63A-63C是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度、異戊二烯效價(jià)、和比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖64A-64C是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度、異戊二烯效價(jià)、和比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖65A-65C是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度、異戊二烯效價(jià)、和比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖66A-66C是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度、異戊二烯效價(jià)、和比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖67A-67C是加入了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度、異戊二烯效價(jià)、和比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖68的圖是對(duì)于系列A，對(duì)于多個(gè)氧水平，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖例中列出的曲線是按照它們?cè)趫D中出現(xiàn)的順序。例如，圖例中的第一個(gè)條目(40°C空氣中的異戊二烯)對(duì)應(yīng)于圖中最高的曲線。圖69的圖是對(duì)于系列B，對(duì)于多個(gè)氧水平與4%的水，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖例中列出的曲線是按照它們?cè)趫D中出現(xiàn)的順序。圖70的圖是對(duì)于系列C，對(duì)于多個(gè)氧水平與5%的C02，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖例中列出的曲線是按照它們?cè)趫D中出現(xiàn)的順序。圖71的圖是對(duì)于系列D，對(duì)于多個(gè)氧水平與10%的C02，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖例中列出的曲線是按照它們?cè)趫D中出現(xiàn)的順序。圖72的圖是對(duì)于系列E，對(duì)于多個(gè)氧水平與15%的C02，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖例中列出的曲線是按照它們?cè)趫D中出現(xiàn)的順序。圖73的圖是對(duì)于系列F，對(duì)于多個(gè)氧水平與20%的C02，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖例中列出的曲線是按照它們?cè)趫D中出現(xiàn)的順序。
圖74的圖是對(duì)于系列G，對(duì)于多個(gè)氧水平與30%的C02，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖例中列出的曲線是按照它們?cè)趫D中出現(xiàn)的順序。圖75A的表是對(duì)于系列A，從重量％轉(zhuǎn)化為體積％的CAFT模型結(jié)果。圖75B的圖是對(duì)于系列A，將圖68針對(duì)體積％作圖，從CAFT模型獲得的可燃性結(jié)果。
圖76A的表是對(duì)于系列B，從重量％轉(zhuǎn)化為體積％的CAFT模型結(jié)果。圖76B的圖是對(duì)于系列B，將圖69針對(duì)體積％作圖，從CAFT模型獲得的可燃性結(jié)果。圖77的圖顯示了可燃性測試的器皿。圖78A的圖是測試系列I的可燃性曲線0%蒸汽(steam) ,Opsig,40°C。圖78B的表總結(jié)了測試系列I的爆炸和非爆炸數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖78C的圖是測試系列I的可燃性曲線與CAFT模型的比較。圖79A的圖是測試系列2的可燃性曲線4%蒸汽，Opsig，40°C。圖79B的表總結(jié)了測試系列2的爆炸和非爆炸數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖79C的圖是測試系列2的可燃性曲線與CAFT模型的比較。圖80A-B的表是測試系列I的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果。圖81的表是測試系列2的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果。圖82的圖是在3個(gè)大氣壓下，對(duì)于多個(gè)氮/氧比例，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖83的圖是在I個(gè)大氣壓下，對(duì)于多個(gè)氮/氧比例，隨著燃料濃度變化的計(jì)算的絕熱火焰溫度。圖84的圖是使用來自圖82的數(shù)據(jù)，按照實(shí)施例13描述的方法構(gòu)建的可燃性包跡(envelope)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)(圓圈)來自本文描述的在I個(gè)大氣壓的最初系統(tǒng)壓力下進(jìn)行的測試。圖85的圖是使用來自圖83的數(shù)據(jù)，按照實(shí)施例13描述的方法構(gòu)建的可燃性包跡。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)(圓圈)來自本文描述的在I個(gè)大氣壓的最初系統(tǒng)壓力下進(jìn)行的測試。圖86A是發(fā)酵廢氣的GC/MS色譜圖。圖86B是圖86A的擴(kuò)展，以顯示存在于發(fā)酵廢氣中的較少的揮發(fā)物。圖87A是在-78°C進(jìn)行低溫冷阱后，存在于廢氣中的痕量揮發(fā)物的GC/MS色譜圖。圖87B是在-196°C進(jìn)行低溫冷阱后，存在于廢氣中的痕量揮發(fā)物的GC/MS色譜圖。圖87C是圖87B的擴(kuò)展。圖87D是圖87C的擴(kuò)展。圖88A-B是GC/MS色譜圖，比較了源自汽油的異戊二烯(圖88A)與生物生產(chǎn)的異戊二烯(圖88B)的C5烴。標(biāo)準(zhǔn)物含有在異戊二烯主峰附近洗脫的3種C5烴雜質(zhì)(圖88A)。與之相反，生物生產(chǎn)的異戊二烯含有某些量的乙醇和丙酮(運(yùn)行時(shí)間為3. 41分鐘)(圖 88A)。圖89是表達(dá)野葛異戊二烯合酶并進(jìn)料葡萄糖與3g/L酵母提取物的大腸桿菌BL21 (DE3) pTrcIS菌株的發(fā)酵廢氣的分析的圖。圖90顯示了在結(jié)構(gòu)上與異戊二烯相似并且也可以用作聚合催化劑毒的數(shù)種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。圖91 是 pTrcHis2AUpperPathway (也稱作 pTrcUpperMVA)的圖譜。圖92A-92C 是 pTrcHi s2AUpperPathway (也稱作 pTrcUpperMVA)的核苷酸序列(SEQ ID NO 23)。圖93是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖94是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖95是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖96是進(jìn)料了轉(zhuǎn)化糖的15L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖97是進(jìn)料了轉(zhuǎn)化糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定 義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖98是進(jìn)料了轉(zhuǎn)化糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖99是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖100是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖101是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯比活性的時(shí)間進(jìn)程。圖 102 是 pCLPtrcUpperPathwayHGS2 的圖譜。圖103A-103C 是 pCLPtrcUpperPathwayHGS2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 24)。圖104是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖105是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖106是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖107 是質(zhì)粒 MCM330 (在 attTn7 處的 FRT-cm-FRT-gil. 2-KKDy)的圖譜。圖108A-108C 是質(zhì)粒 MCM330 的核苷酸序列(SEQ ID NO 25)。圖109 是 pET24D-Kudzu 的圖譜。圖110A-B 是 pET24D-Kudzu 的核苷酸序列(SEQ ID NO 26)。圖IllA是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖IllB是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖IllC是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯比生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。圖112A是馬氏甲烷八疊球菌遠(yuǎn)古下部途徑操縱子的圖譜。圖112B-C是馬氏甲烷八疊球菌遠(yuǎn)古下部途徑操縱子的核苷酸序列(SEQ ID NO27)。圖 113A 是 MCM382-pTrcKudzuMVK(mazei)的圖譜。圖113B-C 是 MCM382-pTrcKudzuMVK(mazei)的核苷酸序列(SEQ ID NO :28)。圖114A是pET200D中來自馬氏甲烷八疊球菌遠(yuǎn)古Lower的MCM376-MVK的圖譜。圖114B-C是pET200D中來自馬氏甲烷八疊球菌遠(yuǎn)古Lower的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO 29)。圖115A-11 證明MVK和異戊二烯合酶的過表達(dá)引起異戊二烯產(chǎn)量增加。測定了經(jīng)過22小時(shí)的時(shí)間進(jìn)程，MCM401和MCM343在IOOmL生物反應(yīng)器中的葡萄糖中生長過程中(以100和200 ii M IPTG誘導(dǎo)異戊二烯生產(chǎn))累積的異戊二烯和C02。圖115A是從MCM343積累的異戊二烯)的圖。圖115B是從MCM401積累的異戊二烯)的圖。圖115C是從MCM343積累的C02(% )的圖。圖11 是從MCM401積累的C02(% )的圖。圖116是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖117是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖118是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖119是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的總二氧化碳釋放率(TCER)或代謝活性譜的圖。圖120是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)異戊二烯的過程中的細(xì)胞存活性 的圖。TVC/0D是ImL培養(yǎng)液中的總的活細(xì)胞計(jì)數(shù)(菌落形成單位)/光密度單位(OD55tl)。圖121是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖122是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖123是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖124是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的體積生產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。體積生產(chǎn)率定義為每升培養(yǎng)液每小時(shí)生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖125是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的瞬時(shí)產(chǎn)率的時(shí)間進(jìn)程。瞬時(shí)產(chǎn)率定義為數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的時(shí)間間隔期間，進(jìn)料到生物反應(yīng)器中的每數(shù)量的葡萄糖(克)所生產(chǎn)的異戊二烯的量(克)(w/w)。圖126是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中，總二氧化碳釋放速率(TCER)或代謝活性譜的圖。圖127是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)異戊二烯的過程中的細(xì)胞存活性。TVC/0D是ImL培養(yǎng)液中的總的活細(xì)胞計(jì)數(shù)(菌落形成單位)/光密度單位(OD55tl)。圖128是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖129是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。圖130是從進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器生產(chǎn)總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖131是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中，總二氧化碳釋放速率(TCER)或代謝活性譜的圖。圖132的圖顯示進(jìn)入到生物反應(yīng)器中的氣流的瞬間降低引起廢氣中異戊二烯濃度的波峰，其不引起代謝活性(TCER)的顯著下降。TCER或代謝活性，是總二氧化碳釋放速率。圖133是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)異戊二烯的過程中的細(xì)胞存活性的圖。TVC/0D是ImL培養(yǎng)液中的總的活細(xì)胞計(jì)數(shù)(菌落形成單位)/光密度單位(OD55tl)。圖134是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中光密度的時(shí)間進(jìn)程。垂直虛線表示以lg/L/hr的速率將異戊二烯導(dǎo)入生物反應(yīng)器時(shí)的時(shí)間間隔。圖135是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的總二氧化碳釋放速率(TCER)或代謝活性譜。垂直虛線表示以lg/L/hr的速率將異戊二烯導(dǎo)入生物反應(yīng)器時(shí)的時(shí)間間隔。圖136是進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)異戊二烯的過程中的細(xì)胞存活性。TVC/0D是ImL培養(yǎng)液中的總的活細(xì)胞計(jì)數(shù)(菌落形成單位)/光密度單位(OD55tl)。垂直虛線表示以lg/L/hr的速率將異戊二烯導(dǎo)入生物反應(yīng)器時(shí)的時(shí)間間隔。圖137A-B是銀白楊pET24a的序列以加粗字母著重顯示了異戊二烯合酶基因(SEQ ID NO 30)。圖137C-D是歐洲黑楊(Populus nigra) pET24a的序列以加粗字體著重顯示了異戊二烯合酶基因(SEQ ID NO 31)。圖137E-F是美洲山楊(Populus tremuloides)的pET24a 的序列(SEQ ID NO :32)。圖137G是美洲山楊異戊二烯合酶基因的氨基酸序列(SEQ ID NO 33)。
圖137H-I是毛果楊(Populus trichocarpa) pET24a的序列以加粗字體著重顯示了異戊二烯合酶基因(SEQ ID N0:34)。圖137J-K是歐洲山楊X銀白楊pET24a的序列以加粗字體著重顯示了異戊二烯合酶基因(SEQ ID NO 35).圖137L是MCM93的圖譜，其含有在pCR2. I骨架中的野葛IspS編碼序列。圖137M-N 是 MCM93 的序列(SEQ ID NO 36)。圖1370 是 pET24D_Kudzu 的圖譜。圖137P-Q 是 pET24D-Kudzu 的序列(SEQ ID NO 37)。圖138是在全細(xì)胞頂空測定法中測定的多個(gè)白楊物種的異戊二烯合酶表達(dá)數(shù)據(jù)。Y軸是以IPTG誘導(dǎo)的0. 2mL培養(yǎng)物生產(chǎn)的異戊二烯的U g/L/0D。圖139是通過DMAPP測定法所測的白楊異戊二烯合酶的相對(duì)活性。白楊酶類具有的活性顯著高于來自野葛的異戊二烯合酶。白楊[銀白楊(alba)x歐洲山楊(tremula)]僅具有痕量(< 1% )活性,未在圖中顯示。圖140 是 pD0NR221 19430-hybrid_HGS 的圖譜。圖141是pD0NR221 :19430_hybrid_HGS的核苷酸序列，為針對(duì)酵母進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的野葛異戊二烯合酶的序列(SEQ ID N0:38)。圖142A 是 pDW14 的圖譜。圖142B-C是pDW14的完整核苷酸序列(SEQ ID NO 39)。圖143顯示了攜帶pDW14或pYES_DEST52的誘導(dǎo)的INVSc-I菌株。圖143A.從以半乳糖誘導(dǎo)的INVSc-I菌株產(chǎn)生的裂解物的4-12% bis tris凝膠(Novex, Invitrogen),其經(jīng) SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色。圖 143B.使用 WesternBreeze 試劑盒(Invitrogen)對(duì)同一菌株的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道如下:1, INVSc_l+pYES_DEST52 ;2，INVSc-l+pDW14(分離物 I) ;3，INVSc-l+pDW14(分離物 2)。標(biāo)示出了 MW(以 kDa 表示)(使用SeeBlue Plus2分子量標(biāo)準(zhǔn)物)。圖144 (圖 144A 和 144B)顯示了攜帶 pDW14 或 pYES_DEST52 的誘導(dǎo)的 INVSc-I 菌株。圖144A.裂解前半乳糖誘導(dǎo)的菌株的0D_。y軸是0D_。圖144B.對(duì)照和攜帶異戊二烯合酶的菌株中的異戊二烯合酶頂空的DMAPP測定。比活性計(jì)算為Ug HG/L/0D。樣品如下對(duì)照，INVSc-l+pYES-DEST52 ;HGS_1，INVSc_l+pDW14 (分離物 I) ;HGS_2，INVSc_l+pDW14 (分離物2)。
圖145A是密碼子優(yōu)化的異戊二烯合酶fluo_opt2v2的圖譜。圖145B是密碼子優(yōu)化的異戊二烯合酶fluo-opt2V2的核苷酸序列(SEQ ID NO:40)。圖146A 是 pBBRlMCS5 的圖譜。圖146B-C 是 pBBRlMCS5 的核苷酸序列(SEQ ID NO 41)。圖147A 是 pBBR5HGS0pt2_2 的圖譜。圖147B-C 是 pBBR5HGS0pt2_2 的核苷酸序列(SEQ ID NO 42)。圖148是對(duì)于未誘導(dǎo)的、以IPTG(4x 50 ii mol)誘導(dǎo)的或以IPTG(2x 100 U mol)誘導(dǎo)的菌株MCM401，其CER相對(duì)于發(fā)酵時(shí)間的圖。
圖149顯示了經(jīng)pH調(diào)節(jié)的或未經(jīng)調(diào)節(jié)的甘蔗溶液中，隨著高壓滅菌循環(huán)數(shù)目的函數(shù)(I個(gè)循環(huán)=30分鐘)變化的葡萄糖的濃度。圖150顯示了惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)Fl和突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) ATCC13525在葡萄糖、甘鹿、和轉(zhuǎn)化的甘鹿上的生長曲線(0D600隨著時(shí)間變化)。圖151 顯示了大腸桿菌 BL21(DE3)、MG1655、ATCC11303 和 B REL 606 在葡萄糖、甘蔗、和轉(zhuǎn)化的甘蔗上的生長曲線(0D600隨著時(shí)間變化)。圖152 是質(zhì)粒 pET24P. alba HGS 的圖譜。圖153A-B 是質(zhì)粒 pET24P. alba HGS 的核苷酸序列(SEQ ID NO 43)。圖154是示意圖，其顯示了用于進(jìn)行核酸內(nèi)切酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL230的限制性位點(diǎn)，以及BspHI與NcoI位點(diǎn)之間的相容性粘末端。圖155是質(zhì)粒EWL230的圖譜。圖156A-B 是質(zhì)粒 EWL230 的核苷酸序列(SEQ ID NO 44)。圖157是示意圖，其顯示了用于進(jìn)行核酸內(nèi)切酶消化以構(gòu)建質(zhì)粒EWL244的限制性位點(diǎn)，以及NsiI與PstI位點(diǎn)之間的相容性粘末端。圖158是質(zhì)粒EWL244的圖譜。圖159A-B 是質(zhì)粒 EWL244 的核苷酸序列(SEQ ID NO 45)。圖160A是馬氏甲烷八疊球菌遠(yuǎn)古下部途徑操縱子的圖譜。圖160B-C是馬氏甲烷八疊球菌遠(yuǎn)古下部途徑操縱子的核苷酸序列(SEQ ID NO46)。圖161A是pET200D中來自馬氏甲烷八疊球菌遠(yuǎn)古Lower的MCM376-MVK的圖譜。圖161B-C是pET200D中來自馬氏甲烷八疊球菌遠(yuǎn)古Lower的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO 47)。圖162 是質(zhì)粒 pBBRCMPGIl. 5-pgl 的圖譜。圖163A-B 是質(zhì)粒 pBBRCMPGIl. 5-pgl 的核苷酸序列(SEQ ID NO 48)。圖164A-F是由表達(dá)馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶、銀白楊異戊二烯合酶、和pgl(RHMl11608-2)并且生長于15L級(jí)別的補(bǔ)料分批培養(yǎng)物中的大腸桿菌菌株生產(chǎn)異戊二烯的圖。圖164A顯示了進(jìn)料了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的光密度的時(shí)間進(jìn)程。圖164B顯示了進(jìn)料了葡萄糖的15L的生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。效價(jià)定義為每升發(fā)酵液生產(chǎn)的異戊二烯的量。用于計(jì)算異戊二烯的方法在59小時(shí)內(nèi)累積生產(chǎn)的異戊二烯，在59小時(shí)的g/發(fā)酵器體積，L[ = ] g/L培養(yǎng)液。圖164C也顯示了進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的異戊二烯效價(jià)的時(shí)間進(jìn)程。用于計(jì)算異戊二烯的方法/ (瞬時(shí)異戊二烯生產(chǎn)速率，g/L/hr) dt從t = O至59小時(shí)[=]g/L發(fā)酵液。圖164D顯示了從進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中生產(chǎn)總異戊二烯的時(shí)間進(jìn)程。圖164E顯示了進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的體積生產(chǎn)率。圖164F顯示了進(jìn)料了葡萄糖的15L生物反應(yīng)器中的二氧化碳釋放速率(CER)或代謝活性譜。圖165A-B的圖顯示了 15L生物反應(yīng)器中發(fā)酵生產(chǎn)的廢氣的分析。樣品A是在64. 8小時(shí)取樣的菌株RMl11608-2。樣品B是在34. 5小時(shí)取樣的菌株EWL256，即大腸桿菌 BL21(DE3), pCL upper, cmR-gil. 2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK。對(duì)于兩個(gè)樣品均在基線(0. 95xl0-8torr)以上檢測到了氫。圖166A顯示示例性生物異戊二烯 回收裝置。圖166B顯示示例性生物異戊二烯 解吸附/冷凝裝置。
圖167顯示生物異戊二烯 產(chǎn)品的GC/FID色譜圖。測定該物質(zhì)具有99. 7%純度。圖168A-C顯示生物異戊二烯1樣品在處理之前⑷和用氧化鋁⑶或二氧化硅(C)處理之后的GC/FID色譜圖。在這些色譜圖中未顯示異戊二烯峰。圖169顯示用于從發(fā)酵廢氣純化異戊二烯的工藝和相關(guān)裝置的示意圖。圖170顯示部分氫化的生物異戊二烯 單體的GC/FID色譜圖。化合物I (RT =12. 30分鐘)=3-甲基-I- 丁烯，化合物2 (RT = 12. 70分鐘)=2-甲基丁烷，化合物3 (RT=13. 23分鐘)=2-甲基-I- 丁烯，化合物4 (RT = 13. 53分鐘)=異戊二烯，化合物5 (RT=14. 01 分鐘)=2-甲基-2- 丁烯)。圖171顯示從Amberlyst-15酸性樹脂催化的2_甲基_2_ 丁烯二聚化衍生的產(chǎn)物的GC/MS總離子色譜圖。圖172顯示從Amberlyst 15酸性樹脂催化的生物異戊二烯 單體寡聚化衍生的產(chǎn)物的GC/MS總離子色譜圖。圖173顯示了使用二聚化反應(yīng)器將C5流轉(zhuǎn)化成C10/C15產(chǎn)物流的工藝流程圖。C5流包含生物異戊二烯 單體和/或生物異戊二烯 單體的C5衍生物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明特別提供了用于從異戊二烯產(chǎn)生燃料組分的組合物和方法。本文提供燃料組分或添加物，例如，環(huán)狀異戊二烯二聚體與三聚體、線性異戊二烯低聚物、芳族及脂環(huán)族異戊二烯衍生物和氧化異戊二烯衍生物。燃料組分可以通過化學(xué)轉(zhuǎn)變包含商業(yè)上有益量的高純異戊二烯的原料產(chǎn)生。在一個(gè)方面，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包含生物異戊二烯。在另一個(gè)方面，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯可以是生物異戊二烯。在另一個(gè)方面，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯可以是通過培養(yǎng)表達(dá)異源異戊二烯合酶的細(xì)胞所產(chǎn)生的高純異戊二烯組合物。在其他方面，高純異戊二烯經(jīng)歷寡聚化以形成不飽和的異戊二烯低聚物，如環(huán)狀二聚體或三聚體和線性低聚物。不飽和的低聚物可以被氫化以產(chǎn)生飽和的烴燃料組分。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯與醇類在酸催化劑存在下的反應(yīng)產(chǎn)生燃料氧化產(chǎn)物。在另一方面，將高純異戊二烯部分地氫化以產(chǎn)生異戊烯。在一些實(shí)施方式中，從高純異戊二烯衍生的異戊烯產(chǎn)物經(jīng)歷二聚化以形成異癸烯。在一些實(shí)施方式中，從高純異戊二烯衍生的異戊烯產(chǎn)物與醇類在酸催化劑存在下反應(yīng)以產(chǎn)生燃料氧化產(chǎn)物。從可再生碳衍生的生物異戊二烯可以通過化學(xué)催化作用轉(zhuǎn)化成多種烴燃料。本文提供用于從發(fā)酵中回收異戊二烯并隨后通過化學(xué)催化成分子量較高的化合物來轉(zhuǎn)化成烴燃料的方法。這些方法包括，但不限于回收和純化來自發(fā)酵廢氣的異戊二烯并且隨后氣相或液相催化以提供具有燃料價(jià)值的化合物。本發(fā)明范圍內(nèi)構(gòu)思了連續(xù)和分批模式過程。如本文進(jìn)一步詳述，生物異戊二烯組合物與石油異戊二烯組合物的區(qū)別之處在于，生物異戊二烯組合物基本上不含通常存在于石油異戊二烯組合物中的 任何污染性不飽和C5烴，如，但不限于1,3-環(huán)戊二烯、反式-1，3-戊二烯、順式-1，3-戊二烯、1，4_戊二烯、I-戊炔、2-戊炔、3-甲基-I- 丁炔、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔、和順式-戊-3-烯-I-炔。如果任何污染性不飽和的C5烴存在于本文中所述的生物異戊二烯原料中，則它們以比石油-異戊二烯組合物中低的水平存在。因此，從本文所述的生物異戊二烯組合物衍生的任何燃料產(chǎn)品基本上不含或以低于衍生自石油異戊二烯的燃料產(chǎn)品中的水平含有任何污染性不飽和的C5烴或從此類染性不飽和C5烴衍生的產(chǎn)物。此外，生物異戊二烯組合物中的硫水平低于石油-異戊二烯組合物中的硫水平。從生物異戊二烯組合物衍生的燃料產(chǎn)品比石油-異戊二烯衍生的燃料產(chǎn)品含有較低水平的硫。生物異戊二烯與石油異戊二烯的區(qū)別之處在于，產(chǎn)生的生物異戊二烯具有石油-異戊二烯組合物中不存在的或以低得多的水平存在的其他生物副產(chǎn)物(從生物源和/或相關(guān)生物過程中衍生的隨生物異戊二烯一起獲得的化合物)，如醇、醛、酮等。所述生物副產(chǎn)物可以包括，但不限于乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、異丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基環(huán)氧乙燒、順式_和反式-3-甲基-I, 3-戍二烯、C5異戍二烯基醇(如3-甲基-3- 丁烯-I-醇或3-甲基-2- 丁烯-I-醇)、2_庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I- 丁醛、3-甲基-2- 丁酮、I- 丁醇、2-戊酮、3-甲基-I- 丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基_3_ 丁稀-I-基乙酸酷、3_甲基_2_ 丁稀-I-基乙酸酷、3_己稀-I-醇、3_己稀-I-基乙酸酯、苧烯、香葉醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-I-醇)、香茅醇(3，7_ 二甲基-6-辛稀 _1_ 醇)、(E)-3, 7_ 二甲基-I, 3,6_ 羊二稀、(Z)-3, 7_ 二甲基-I, 3,6_ 羊二稀、2, 3_ 環(huán)庚烯醇吡啶、或線性異戊二烯聚合物(如從多個(gè)異戊二烯單元聚合衍生的線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚體)。從生物異戊二烯衍生的燃料產(chǎn)品含有一種或多種生物副產(chǎn)物或從所述生物副產(chǎn)物中任何者衍生的化合物。此外，從生物異戊二烯衍生的燃料產(chǎn)品可以含有在后續(xù)化學(xué)轉(zhuǎn)化期間從這些生物副產(chǎn)物形成的化合物。此類化合物的實(shí)例包括從Diels-Alder環(huán)加成親雙烯體為異戊二烯或其燃料衍生物、氧化異戊二烯或燃料衍生物所衍生的那些化合物。此外，生物異戊二烯與石油異戊二烯的區(qū)別之處在于碳指紋。在一個(gè)方面，生物異戊二烯比石油-異戊二烯具有更高的放射性碳-14 (14C)含量或更高的14C/12C比。生物異戊二烯從可再生碳源產(chǎn)生，因而生物異戊二烯中的14C含量或14C/12C比與當(dāng)前大氣相同。另一方面，石油-異戊二烯從成千至上百萬年前沉積的化石燃料衍生，因而14C含量或14C/12C比因放射性衰變減少。如本文更詳細(xì)地討論，從生物異戊二烯衍生的燃料產(chǎn)品比衍生自石油-異戊二烯的燃料產(chǎn)品具有更高的14C含量或14c/12c比。在一個(gè)實(shí)施方式中，從本文中所述的生物異戊二烯衍生的燃料產(chǎn)品具有與大氣中相似的14C含量或14c/12c比。在另一方面，生物異戊二烯可以因穩(wěn)定的碳同位素比(13c/12c)與石油異戊二烯在分析水平上相區(qū)別，所述的穩(wěn)定碳同位素比可以報(bào)道為由S 13C符號(hào)所示的“ △值”。例如，對(duì)于從萃取蒸餾來自煉油廠的C5流衍生的異戊二烯，s 13C是約-22%。至約-24%。。該范圍常見于從石油衍生的輕質(zhì)不飽和烴，并且從基于石油的異戊二烯衍生的產(chǎn)物一般含有S 13C相同的異戊二烯單元。通過在伴有最小量的其他含碳營養(yǎng)物(例如，酵母提取物)情況下發(fā)酵玉米衍生的葡萄糖(S13C-IO. 73%。)所產(chǎn)生的生物異戊二烯產(chǎn)生了這樣的異戊二烯，所述異戊二烯可以聚合成具有313(>14.66%。至-14.85%。的聚異戊二烯。從這類生物異戊二烯產(chǎn)生的產(chǎn)品預(yù)期具有比從基于石油的異戊二烯衍生的那些S 13C值更負(fù)的S 13C值。通過這些方法產(chǎn)生的化合物包括環(huán)狀異戊二烯二聚體和三聚體、線性低聚物、芳族和脂環(huán)族衍生物。通過包括部分氫化生物異戊二烯組合物的方法產(chǎn)生二異戊烯。異戊二烯的這些化學(xué)衍生物可用作交通運(yùn)輸液體燃料(IsoFuels )并且用作燃料添加物。本文還提供了用于產(chǎn)生異戊二烯氧化衍生物(包括醇、酮、酯和醚)的方法。使用 均相和多相催化劑，也可以在液相或氣相中進(jìn)行用于合成異戊二烯氧化衍生物的方法。這個(gè)化學(xué)類型的化合物也可用作交通運(yùn)輸液體燃料，并且可以用在燃料摻合物中作為減排用燃料氧化產(chǎn)物和作為燃料調(diào)節(jié)物，例如作為柴油的十六烷增進(jìn)劑。雖然異戊二烯可以通過分餾石油來獲得，但是該物質(zhì)的純化是昂貴且耗時(shí)的。烴的C5流的石油裂解僅產(chǎn)生約15%的異戊二烯。異戊二烯也天然地由多個(gè)微生物、植物、和動(dòng)物物種產(chǎn)生。具體地，已經(jīng)鑒定了生物合成異戊二烯的兩條途徑甲羥戊酸(MVA)途徑和非-甲羥戊酸(DXP)途徑?；蛐揎椀募?xì)胞培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中已經(jīng)以更大的量和更高純度和/或伴隨獨(dú)特雜質(zhì)情況而更高效地產(chǎn)生異戊二烯，如2007年12月13日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/013，386和61/013，574 ；W0 2009/076676 ;2008年7月2日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?61/134，094,61/134, 947,61/134, 011 和 61/134，103 ；W0 2010/003007 ；2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，163 ；W0 2010/031079 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，186 ；W0 2010/031062 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，189 ；W0 2010/031077 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097, 200 ；W0 2010/031068 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，204 ;WO 2010/031076 ；2008年12月30日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/141，652 ；PCT/US09/069862 ;2008 年 12 月 15 日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?12/335，071 (US 2009/0203102A1)和2009年4月23日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/429，143 (US 2010/0003716A1)，所述文獻(xiàn)通過引用方式全文并入。定義除非本文另外定義，本文中所用的全部技術(shù)術(shù)語及科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料用于本發(fā)明的實(shí)施中，然而本文描述了優(yōu)選的方法和材料。因而，通過整體地參考本說明書更充分地描述下文立即定義的術(shù)語。所引用的全部文獻(xiàn)在有關(guān)的部分中通過引用的方式并入本文。然而，對(duì)任何文獻(xiàn)的引用不得解釋為承認(rèn)該文獻(xiàn)相對(duì)于本文發(fā)明而言是現(xiàn)有技術(shù)。如本文中所用，單數(shù)術(shù)語“一個(gè)(a) ”、“一種(an) ”、和“該(the) ”包括復(fù)數(shù)指稱，除非上下文另外清晰地說明。意圖在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個(gè)最大數(shù)字界限包括每個(gè)較小的數(shù)字界限，如同在本文中明確地寫出此類較小的數(shù)字界限。在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個(gè)最小數(shù)字界限將包括每個(gè)較高的數(shù)字界限，如同在本文中明確地寫出此類較高的數(shù)字界限。在本說明書通篇范圍內(nèi)給出的每個(gè)數(shù)字范圍將包括屬于這種較寬泛數(shù)字范圍內(nèi)的每個(gè)較窄的數(shù)字范圍，如同在本文中完全明確地寫出此類較窄的數(shù)字范圍。術(shù)語“異戊二烯”指2-甲基-1，3-丁二烯化六5#78-79-5)，它是從3，3_二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消去焦磷酸而來的直接和最終的揮發(fā)性C5烴產(chǎn)物，并且不包括[一個(gè)]IPP分子與[一個(gè)]DMAPP分子的連接或聚合。術(shù)語“異戊二烯”通常不意圖受限于其產(chǎn)生方法，除非本文另外指明。如本文中所用，“生物產(chǎn)生的異戊二烯”或“生物異戊二烯”是通過任何生物學(xué)手段產(chǎn)生的異戊二烯，如通過基因修飾的細(xì)胞培養(yǎng)物、天然微生物、植物或動(dòng)物產(chǎn)生。 “生物異戊二烯組合物”指可以通過任何生物學(xué)手段(如工程化以產(chǎn)生異戊二烯的系統(tǒng)(例如，細(xì)胞))產(chǎn)生的組合物。它含有異戊二烯和隨異戊二烯一起共同產(chǎn)生和/或分離的其他化合物(包括雜質(zhì))。生物異戊二烯組合物通常含有比產(chǎn)自石油化學(xué)源的異戊二烯更少的烴雜質(zhì)，并且經(jīng)常需要最少處理以達(dá)到聚合級(jí)。如本文詳述，生物異戊二烯組合物還具有與石油化學(xué)地產(chǎn)生的異戊二烯組合物不同的雜質(zhì)情況。如本文中所用，“至少一部分異戊二烯起始組合物”可以指經(jīng)歷化學(xué)轉(zhuǎn)變的至少約 1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 599. 6%,99. 7%,99. 8%,99. 9%、或100%的異戊二烯起始組合物。如本文中所用，IsoFuels 指這樣的燃料，所述燃料包括從異戊二烯衍生的交通運(yùn)輸液體燃料。BioIsoFuels 指這樣燃料，所述燃料包括從生物異戊二烯衍生的交通運(yùn)輸液體燃料。如本文中所用的術(shù)語“寡聚化”指合并兩個(gè)或更多個(gè)單體單元的化學(xué)過程。異戊二烯的“寡聚化”產(chǎn)生從異戊二烯的兩個(gè)或更多個(gè)分子衍生的異戊二烯衍生物，如異戊二烯的線性二聚體、異戊二烯的環(huán)狀二聚體、異戊二烯的線性三聚體、異戊二烯的環(huán)狀三聚體等。將“完全氫化”、“完全地氫化”或“充分地氫化”定義為添加氫(H2)( 一般在氫化催化劑存在下)至前體化合物內(nèi)的全部的不飽和官能團(tuán)如碳-碳雙鍵以產(chǎn)生充分飽和的產(chǎn)物化合物。例如，異戊二烯的完全氫化形成異戊烷，從而每摩爾異戊二烯消耗2摩爾H2。將“部分氫化”或“部分地氫化”定義為添加氫(H2)(—般在氫化催化劑存在下)至前體化合物內(nèi)部至少一個(gè)、但非全部的不飽和官能團(tuán)如碳-碳雙鍵。部分氫化的產(chǎn)物可以進(jìn)一步完全地氫化以產(chǎn)生充分飽和的產(chǎn)物化合物。二烯的部分氫化形成一種或多種單烯烴。例如，異戊二烯的部分氫化可以產(chǎn)生3種異構(gòu)異戊烯(2-甲基丁-I-烯、2-甲基丁-2-烯和3-甲基丁 -I-烯)，從而每摩爾異戊二烯消耗I摩爾H2。將“選擇性氫化”或“選擇性地氫化”定義為添加氫(H2)( 一般在氫化催化劑存在下)至前體化合物內(nèi)的至少一個(gè)、但非全部的不飽和官能團(tuán)如碳-碳雙鍵，從而在所選的條件下，某些不飽和官能團(tuán)比其他不飽和基團(tuán)優(yōu)先地氫化。例如，異戊二烯的選擇性氫化可以優(yōu)先地形成2-甲基-2- 丁烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁烯或其混合物。
如本文使用的術(shù)語“多肽”包括多肽、蛋白、肽、多肽的片段、和融合多肽。如本文使用的“分離的多肽”不是多肽文庫的一部分，所述多肽文庫例如2、5、10、20,50或更多個(gè)不同多肽的文庫；而是分離自天然狀態(tài)下與其一起產(chǎn)生的至少一個(gè)成分?？梢岳缤ㄟ^表達(dá)編碼多肽的重組核酸來獲得分離的多肽?！爱愒炊嚯摹币馑际前被嵝蛄信c在相同宿主細(xì)胞中天然表達(dá)的另一多肽的氨基酸序列不相同的多肽。具體地，異源多肽與天然狀態(tài)下存在于相同宿主細(xì)胞中的野生型多肽是不同的。“密碼子簡并性”是指遺傳密碼的多樣性，其允許核苷酸序列變化而不影響所編碼的多肽的氨基酸序列。技術(shù)人員熟知特定的宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子來指定給定氨基酸時(shí)表現(xiàn)出的“密碼子偏愛”。因此，當(dāng)合成用于改善宿主細(xì)胞中的表達(dá)的核酸時(shí)，在一些實(shí)施方式中合乎需要地將核酸設(shè)計(jì)為使其密碼子使用頻率達(dá)到宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用頻率。
如本文使用的“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的共價(jià)連接在一起的兩個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸?！爸亟M核酸”意思是這樣的目標(biāo)核酸其不含在所述目標(biāo)核酸所源自的生物體的天然狀態(tài)下存在的基因組中側(cè)接該目標(biāo)核酸的一個(gè)或多個(gè)核酸(例如基因)。因此，該術(shù)語包括例如，摻入到載體、摻入到自我復(fù)制型質(zhì)?；虿《尽⒒驌饺氲皆嘶蛘婧思?xì)胞的基因組DNA中的重組DNA，或作為獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)的分子(例如，cDNA、基因組DNA片段、或通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA片段)而存在。“異源核酸”意思是核酸序列與在相同宿主細(xì)胞中天然存在的另一核酸的核酸序列不相同的核酸。具體地，異源核酸與天然狀態(tài)下存在于相同宿主細(xì)胞中的野生型核酸是不同的。如本文使用的“載體”意思是能夠遞送并合乎需要地在宿主細(xì)胞中表達(dá)一種或多種目標(biāo)核酸的構(gòu)建體。載體的實(shí)例包括但不限于，質(zhì)粒、病毒載體、DNA或RNA表達(dá)載體、粘粒、和噬菌體載體。如本文使用的“表達(dá)控制序列”意思是指導(dǎo)目標(biāo)核酸的轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)控制序列可以是啟動(dòng)子，例如組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，或增強(qiáng)子?！翱烧T導(dǎo)啟動(dòng)子”是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動(dòng)子。表達(dá)控制序列與待轉(zhuǎn)錄的核酸區(qū)段可操作地連接。術(shù)語“選擇性標(biāo)志物”或“可選擇標(biāo)志物”是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)以允許容易地選擇含有導(dǎo)入的核酸或載體的那些宿主細(xì)胞的核酸?？蛇x擇標(biāo)志物的實(shí)例包括但不限于，抗生素抗性核酸(例如卡那霉素、氨比西林、羧芐西林、慶大霉素、潮霉素、腐草霉素、博來霉素、新霉素、或氯霉素)和/或賦予宿主細(xì)胞代謝優(yōu)勢例如營養(yǎng)優(yōu)勢的核酸。示例性的營養(yǎng)選擇性標(biāo)志物包括那些本領(lǐng)域已知的標(biāo)志物，例如amdS、argB、和pyr4。組合物和系統(tǒng)從石油化學(xué)源衍生的異戊二烯通常是不純的C5烴級(jí)分，所述不純的C5烴級(jí)分在該物質(zhì)適合聚合或其他化學(xué)轉(zhuǎn)變之前，需要深度純化。鑒于幾種雜質(zhì)與異戊二烯的結(jié)構(gòu)相似性和它們可以充當(dāng)聚合催化劑毒物的事實(shí)，這些雜質(zhì)特別帶來麻煩。此類化合物包括，但不限于1，3_環(huán)戍二烯、順式-和反式-1，3_戍二烯、1,4-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、3-甲基-I- 丁炔、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔、和順式-戊-3-烯-I-炔。如下文詳述，生物產(chǎn)生的異戊二烯可以基本上不含任何污染性不飽和C5烴，無需經(jīng)歷深度純化。一些生物產(chǎn)生的異戊二烯組合物含有乙醇、丙酮、和C5異戊二烯基醇。這些組分比衍生自石油化學(xué)源的異戊二烯組合物中存在的異構(gòu)C5烴級(jí)分更容易地從異戊二烯流中除去。另外，可以在生物過程中管控這些雜質(zhì)，例如通過對(duì)生產(chǎn)菌株作基因修飾、碳原料、替代性發(fā)酵條件、回收過程調(diào)節(jié)和額外或替代性純化方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于用于從異戊二烯產(chǎn)生燃料組分的組合物和系統(tǒng)，所述的組合物和系統(tǒng)包含(a)商業(yè)上有益量的高純異戊二烯起始組合物；和(b)從至少一部分高純異戊二烯起始組合物產(chǎn)生的燃料組分；其中至少一部分商業(yè)上有益量的高純異戊二烯起始組合物經(jīng)歷化學(xué)轉(zhuǎn)變。高純異戊二烯原料經(jīng)歷化學(xué)反應(yīng)以產(chǎn)生商業(yè)上有益量的用于制造燃料的產(chǎn)物。在一個(gè)方面，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯包含生物異戊二烯。在一個(gè)方面，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯可以是生物異戊二烯。示例性的起始異戊二烯組合物
在一些實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純異戊二烯起始組合物包含大于或約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或 IOOOmg 的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，起始異戊二烯組合物包含大于或約2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，起始異戊二烯組合物包含大于或約0. 2、
0.5、l、2、5、10、20、50、100、200、500、1000kg的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，異戊二烯在起始組合物中的量是約2至約5，OOOmg,如約2至約lOOmg、約100至約500mg、約500至約
1,OOOmg、約I, 000至約2，OOOrng、或約2，000至約5，OOOmg。在一些實(shí)施方式中，異戊二烯在起始組合物中的量是約20至約5，OOOmg、約100至約5，OOOmg、約200至約2，OOOmg、約200至約1，OOOmg、約300至約1，OOOmg、或約400至約1，OOOmgo在一些實(shí)施方式中，異戊二烯在起始組合物中的量是約2至約5，000g,如約2至約100g、約100至約500g、約500至約l，000g、約1，000至約2，00(^、或約2，000至約5，00(^。在一些實(shí)施方式中，異戊二烯在起始組合物中的量是約2至約5，000kg、約10至約2，000kg、約20至約1，000kg、約20至約500kg、約30至約200kg、或約40至約100kg。在一些實(shí)施方式中，起始組合物的大于或約20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或 95% (w/w)的揮發(fā)性有機(jī)級(jí)分是異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物包含重量占該起始組合物中全部C5烴的總重量的大于或約98. 0%,98. 5%,99. 0%,99. 5%、或100%的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物包含重量占該起始組合物中全部C5烴的總重量的大于或約 99. 90%,99. 92%,99. 94%,99. 96%,99. 98%、或 100% 的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該起始組合物具有異戊二烯的占該起始組合物中全部C5烴的檢測器應(yīng)答的大于或約98. 0%、98. 5%,99. 0%,99. 5%、或100%的相對(duì)檢測器應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，該起始組合物具有異戊二烯的占該起始組合物中全部C5烴的檢測器應(yīng)答的大于或約99. 90%,99. 91 %,99. 92 %,99. 93 %,99. 94 %,99. 95 % ,99. 96 %,99. 97 %,99. 98 %、99. 99 %、或100%的相對(duì)檢測器應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物包含重量占該起始組合物中全部C5烴的總重量的約98. 0%至約98. 5%、約98. 5%至約99. 0%、約99. 0%至約99. 5%、約99. 5%至約99. 8%、約99. 8%至100%的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物包含重量占該起始組合物中全部C5烴的總重量的約99. 90%至約99. 92 %、約 99. 92 % 至約 99. 94 %、約 99. 94 % 至約 99. 96 %、約 99. 96 % 至約 99. 98 %、約99. 98%至100%的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物包含重量占該起始組合物中全部C5 烴的總重量的小于或約 2. 0%、1. 5%、1. 0%、0. 5%、0. 2%、0. 12%,0. 10%,0. 08%,0. 06 %,0. 04 %,0. 02 %,0. 01 %,0. 005 %,0. 001 %,0. 0005 %,0. 0001 %,0. 00005 %、或0. 00001%的除異戊二烯之外的C5烴(如1，3-環(huán)戊二烯、順式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戍二烯、I，4-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁炔、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔、或順式-戊-3-烯-I-炔)。在一些實(shí)施方式中，該起始組合物具有除異戊二烯之外的C5烴的占該起始組合物中全部C5烴的檢測器應(yīng)答的小于或約 2. 0%A. 5%A. 0%,0. 5%,0. 2%,0. 12%,0. 10%,0. 08%,0. 06%,0. 04%,0. 02%,0. 01%,0. 005%,0. 001%,0. 0005%,0. 0001%,0. 00005%、或 0. 00001%的相對(duì)檢測器應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，該起始組合物具有1，3_環(huán)戊二烯、順式-1，3-戊二烯、反式_1，3-戍二烯、1,4-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I-丁烯、3-甲基-I-丁炔、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔、或順式-戊-3-烯-I-炔的占該起始組 合物中全部C5烴的檢測器應(yīng)答的小于或約2. 0%、1. 5%、1. 0%、0. 5%、0. 2%、0. 12%,0. 10%,0. 08%,0. 06%,0. 04%,0. 02%,0. 01 %,0. 005 %,0. 001 %,0. 0005 %,0. 0001%,0.00005%、或0.00001%的相對(duì)檢測器應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，該高純異戊二烯起始組合物包含重量占該起始組合物中全部C5烴的總重量的約0. 02%至約0. 04%、約0. 04%至約0. 06%、約0. 06%至0. 08%、約0. 08%至0. 10 %、或約0. 10至約0. 12%的除異戊二烯之外的C5烴(如1，3_環(huán)戊二烯、順式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4_戊二烯、1_戍炔、2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁炔、戍-4-烯-I-炔、反式-戍_3_烯-I-炔、或順式-戍-3-烯-I-炔)。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于起始組合物中抑制異戊二烯聚合的任意化合物，高純異戊二烯起始組合物包含小于或約 50、40、30、20、10、5、1、0. 5,0. 1,0. 05,0. 01、或 0. 005 u g/L的抑制異戊二烯聚合的化合物。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于起始組合物中抑制異戊二烯聚合的任意化合物，該起始異戊二烯組合物包含約0. 005至約50、例如約0. 01至約10、約0. 01至約5、約0. 01至約I、約0. 01至約0. 5、或約0. 01至約0. 005 u g/L的抑制異戊二烯聚合的化合物。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物包含小于或約50、40、30、20、10、5、I、0. 5,0. 1,0. 05,0. 01、或0. 005 u g/L的除異戊二烯之外的烴(如1，3_環(huán)戊二烯、順式_1，3-戍二烯、反式-1，3_戍二烯、1,4-戍二烯、I-戍炔、2-戍炔、I-戍烯、2-甲基-I- 丁烯、3-甲基-I- 丁炔、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔、或順式-戊-3-烯-I-炔)。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物包含約0. 005至約50，例如約0. 01至約10、約0. 01至約5、約0. 01至約I、約0. 01至約0. 5、或約0. 01至約0. 005 u g/L的除異戊二烯之外的烴。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物包含小于或約50、40、30、20、10、5、1、0. 5,0. 1,0. 05,0. 01、或0. 005 u g/L的的蛋白質(zhì)或脂肪酸(例如與天然橡膠天然結(jié)合的蛋白質(zhì)或脂肪酸)。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物包含小于或約10、5、1、0. 8,0. 5、0. 1、0. 05、0. 01、或0. 005ppm的a乙炔、戊二烯、乙腈、或1，3-環(huán)戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物包含小于或約5、1、0. 5,0. 1,0. 05,0. 01、或0. 005ppm的硫或丙二烯。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物包含小于或約30、20、15、10、5、1、0. 5,0. 1、0.05、0.01、或0.005 111的全部乙炔類(如I-戊炔、2-戊炔、3-甲基-I-丁炔、戊-4-烯-I-炔、反式-戊-3-烯-I-炔、和順式-戊-3-烯-I-炔)。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物包含小于或約 2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0. 5、0. 1、0. 05,0. 01、或0. 005ppm的異戊二烯二聚體，例如環(huán)狀異戊二烯二聚體(例如，從兩個(gè)異戊二烯單元的二聚化衍生的環(huán)狀ClO化合物)。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物包含乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、異丁烯醒、甲基乙稀基麗、2_甲基-2-乙稀基環(huán)氧乙燒、順式_和反式_3_甲基-I, 3_戍二稀、C5異戊二烯基醇(如3-甲基-3- 丁烯-I-醇或3-甲基-2- 丁烯-I-醇)、或前述任意兩項(xiàng)或更多項(xiàng)。在具體的實(shí)施方式中，起始異戊二烯組合物包含大于或約0. 005,0. 01,0. 05,0. I、0. 5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120 u g/L的乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、異丁烯醛、甲基乙烯基酮、甲基-2_乙烯基環(huán)氧乙燒、順式-和反式-3-甲基-I, 3-戍二烯、C5異戍二烯基醇(如3-甲基-3- 丁烯-I-醇或3-甲基-2- 丁烯-I-醇)、或前述任意兩項(xiàng)或更多項(xiàng)。在一些實(shí)施方式中，該異戊二烯組合物包含約0. 005至約120，例如約0. 01至約80、約0. 01 至約60、約0. 01至約40、約0. 01至約30、約0. 01至約20、約0. 01至約10、約0. I至約80、約0. I至約60、約0. I至約40、約5至約80、約5至約60、或約5至約40 y g/L的乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、異丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基環(huán)氧乙烷、順式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5異戊二烯基醇、或前述任意兩項(xiàng)或更多項(xiàng)。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物包含以下組分中的一種或多種2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I-丁醛、3-甲基-2-丁酮、I-丁醇、2-戊酮、3-甲基-I-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2- 丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3- 丁烯-I-基乙酸酯、3-甲基-2- 丁烯-I-基乙酸酯、3-己烯-I-醇、3-己烯-I-基乙酸酯、苧烯、香葉醇(反式-3，7- 二甲基-2，6-辛二烯-I-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-I-醇)、(E)-3，7-二甲基_1，3，
6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、2，3-環(huán)庚烯醇吡啶、或線性異戊二烯聚合物(例如，從多個(gè)異戊二烯單元的聚合衍生的線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚體)。在多種實(shí)施方式中，以重量％為單位，這些組分之一的量相對(duì)于異戊二烯的量(即，該組分的重量除以異戊二烯的重量乘以100)是大于或約0. 01%,0. 02%,0. 05%,0. 1%,0. 5%,1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或 110% (w/w)。在一些實(shí)施方式中，第二化合物的相對(duì)檢測器應(yīng)答相對(duì)于異戊二烯的檢測器應(yīng)答是大于或約0. 01%,0. 02%,0. 05%,0. 1%,0. 5%,1%>5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%、90%、100%、或110%。在多種實(shí)施方式中，以重量％為單位，這些組分之一的量相對(duì)于異戊二烯的量(即，該組分的重量除以異戊二烯的重量乘以100)是約0. 01%至約105%(w/w)，例如約0. 01%至約90%，約0. 01%至約80%，約0. 01%至約50%，約0. 01%至約20%，約0. 01%至約10%，約0. 02%至約50%，約0. 05%至約50%，約0. 1%至約50%，或0.1% 至約 20% (w/w) o在一些實(shí)施方式中，至少一部分高純異戊二烯起始組合物處于氣相中。在一些實(shí)施方式中，至少一部分高純異戊二烯起始組合物處于液相(如冷凝物)中。在一些實(shí)施方式中，至少一部分高純異戊二烯起始組合物處于固相中。在一些實(shí)施方式中，至少一部分異戊二烯吸附于固體支持物，例如包括二氧化硅和/或活性炭的支持物。在一些實(shí)施方式中，起始異戊二烯組合物與一種或多種溶劑混合。在一些實(shí)施方式中，起始異戊二烯組合物與一種或多種氣體混合。在其他實(shí)施方式中，商業(yè)上有益量的高純起始組合物通過生物過程產(chǎn)生。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物是通過培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的生物異戊二烯組合物，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生大于約400nmole異戍二烯/克細(xì)胞的細(xì)胞濕重/小時(shí)(nmole/gwail/小時(shí))的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，通過培養(yǎng)將細(xì)胞培養(yǎng)基中多于約0. 002%的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯的細(xì)胞產(chǎn)生所述生物異戊二烯組合物。在其他實(shí)施方式中，細(xì)胞具有(i)編碼異戊二烯合酶多肽(例如來自植物如葛屬(Pueraria)的天然存在的多肽)且(ii)與啟動(dòng)子(例如17啟動(dòng)子)可操作連接的異源核酸。其他異戊二烯合酶多肽，例如，來自白楊和天然存在的以及親代異戊二烯合酶的變體，可以用來產(chǎn)生生物異戊二烯。可以使用的異戊二烯合酶及其變體的實(shí)例在美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/429，143中描述，該文獻(xiàn)通過引用的方式全文并入本文。
在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞在包含碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述碳源例如是，但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羥基丙酮、一碳源、油、動(dòng)物脂肪、動(dòng)物油、脂肪酸、脂質(zhì)、磷月旨、甘油脂、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、來自酵母提取物的組分或前述二者或更多者的任意組合。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞在限葡萄糖的條件下培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包含編碼IDI多肽的異源核酸。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞還包含編碼MDV途徑多肽的異源核酸。在一些實(shí)施方式中，起始異戊二烯組合物是如2008年7月2日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/134，094.W02010/003007、和 2008 年 12 月 15 日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?12/335，071 (US 2009/0203102Al)中所述的異戊二烯組合物或通過培養(yǎng)在前述文獻(xiàn)中描述的任何細(xì)胞所產(chǎn)生的異戊二烯組合物，所述文獻(xiàn)通過引用方式全文并入。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物包含由培養(yǎng)物中產(chǎn)生異戊二烯的細(xì)胞所產(chǎn)生的氣相(廢氣)。在一些實(shí)施方式中，該氣相具有非可燃濃度的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，該氣相包含小于約9. 5% (體積)的氧。在一些實(shí)施方式中，該氣相包含大于或約9. 5% (體積)的氧，并且異戊二烯在氣相中的濃度小于燃燒下限或高于燃燒上限。在一些實(shí)施方式中，除了異戊二烯以外的氣相部分包含約0%至約100% (體積)的氧，例如約10%至約100% (體積)的氧。在一些實(shí)施方式中，除了異戊二烯以外的氣相部分包含約0%至約99% (體積)的氮。在一些實(shí)施方式中，除了異戊二烯以外的氣相部分包含約I %至約50% (體積)的CO2。在一些實(shí)施方式中，高純異戊二烯起始組合物包含以下一項(xiàng)或多項(xiàng)醇、醛、酯、或酮(例如本文所述醇、醛、酯或酮的任意項(xiàng))。在一些實(shí)施方式中，該異戊二烯組合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些實(shí)施方式中，所述異戊二烯組合物的任意者還包含酯。在一些實(shí)施方式中，從生物來源(如細(xì)胞培養(yǎng)物)衍生的高純異戊二烯起始組合物包含以下一項(xiàng)或多項(xiàng)甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、I- 丁醇、3-甲基-I-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-I-丁醇、或吲哚。在一些實(shí)施方式中，該異戊二烯起始組合物含有Ippm或更多的以下一項(xiàng)或多項(xiàng)甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、I-丁醇、3-甲基-I-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-I-丁醇、或吲哚。在一些實(shí)施方式中，在起始異戊二烯組合物(例如純化前的廢氣)中，下列一項(xiàng)或多項(xiàng)的濃度是約I至約10，OOOppm 甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、I- 丁醇、3-甲基-I-丙醇、丙酮、乙酸、2- 丁酮、2-甲基-I- 丁醇、或吲哚。在一些實(shí)施方式中，起始異戊二烯組合物(例如經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)純化步驟之后的廢氣)包含濃度為約I至約IOOppm (如約I至約lOppm、約10至約20ppm、約20至約30ppm、約30至約40ppm、約40至約50ppm、約50至約60ppm、約60至約70ppm、約70至約80ppm、約80至約90ppm、或約90至約IOOppm)的下列一項(xiàng)或多項(xiàng)甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、I-丁醇、3-甲基-I-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-I-丁醇、或吲哚。在一些實(shí)施方式中，該起始異戊二烯組合物含有小于Ippm的甲硫醇(一種強(qiáng)力的催化劑毒物和燃料終產(chǎn)品中的硫源)。可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法例如本文描述的那些方法或其它標(biāo)準(zhǔn)方法例如質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜(見，例如，Bunge等人，Applied and Environmental Microbiology, 74 (7) :2179-2186, 2008,該文獻(xiàn)通過引用方式全文并入本文，尤其關(guān)于分析揮發(fā)性有機(jī)化合物的方面)分析來自細(xì)胞培養(yǎng)物的揮發(fā)性有機(jī)化合物(例如，細(xì)胞培養(yǎng)物的頂空中的揮發(fā)性有機(jī)化合物)。
本發(fā)明也構(gòu)思了從共同產(chǎn)生異戊二烯和氫的生物源(如細(xì)胞培養(yǎng)物)衍生的高純異戊二烯起始組合物的用途。在一些實(shí)施方式中，起始生物異戊二烯組合物以下述的比率包含異戊二烯和氫從至少I摩爾％的異戊二烯/3摩爾％的氫至至少I摩爾％的異戊二烯/4摩爾％的氫。在一些實(shí)施方式中，起始生物異戊二烯組合物以約I比9、2比8、3比7、4比6、5比5、6比4、7比3、8比2或9比I的摩爾比包含異戊二烯和氫。在一些實(shí)施方式中，該組合物還包含I至11摩爾％的異戊二烯和4至44摩爾％的氫。在一些實(shí)施方式中，該組合物還包含氧、二氧化碳、或氮。在一些實(shí)施方式中，該組合物還包含0至21摩爾％的氧、18至44摩爾％的二氧化碳、和0至78摩爾％的氫。在一些實(shí)施方式中，該組合物還包含I. 0 X 10_4摩爾％或更少的非甲烷揮發(fā)性雜質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，非甲烷揮發(fā)性雜質(zhì)包括以下一項(xiàng)或多項(xiàng)2_庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、I-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-I-丙醇、3-甲基-I-丁醛、3-甲基-2-丁酮、I-丁醇、2-戊酮、3-甲基-I-丁醇、異丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-I-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-I-基乙酸酯、3-己烯-I-醇、3-己烯-I-基乙酸酯、苧烯、香葉醇(反式-3，7- 二甲基-2，6-辛二烯-I-醇)、香茅醇(3，7- 二甲基-6-辛烯-I-醇)、(E) -3，
7-二甲基-I，3，6-辛三烯、⑵_3，7-二甲基-I，3，6-辛三烯、2，3-環(huán)庚烯醇吡啶、或線性異戊二烯聚合物(例如，從多個(gè)異戊二烯單元的聚合衍生的線性異戊二烯二聚體或線性異戊二烯三聚體)。在一些實(shí)施方式中，非甲烷揮發(fā)性雜質(zhì)包括以下一項(xiàng)或多項(xiàng)該異戊二烯組合物包含下列一項(xiàng)或多項(xiàng)醇、醛、或酮(例如本文所述的醇、醛、或酮的任意項(xiàng))。在一些實(shí)施方式中，該異戊二烯組合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些實(shí)施方式中，非甲烷揮發(fā)性雜質(zhì)包括以下一項(xiàng)或多項(xiàng)甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、I- 丁醇、3-甲基-I-丙醇、丙酮、乙酸、2- 丁酮、2-甲基-I- 丁醇、或吲哚。用于在產(chǎn)生異戊二烯的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生異戊二烯的技術(shù)在下述文獻(xiàn)中描述2007年12月13日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/013，386和61/013，574 ；W02009/076676 ；2008年7月2日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/134，094,61/134, 947、61/134，011、和 61/134，103 ;W0 2010/003007 ;2008 年 9 月 15 日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，163 ;WO 2010/031079 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，186 ；WO 2010/031062 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，189 ；WO 2010/031077 ；2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，200 ；W02010/031068 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，204 ；W0 2010/031076 ；2008年12月30日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/141，652 ；PCT/US09/069862 ;2008年12月15日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/335，071 (US 2009/0203102 Al)和2009年4月23日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/429，143 (US 2010/0003716 Al)，所述文獻(xiàn)的教導(dǎo)通過引用方式并入本文，目的在于教授通過這種過程產(chǎn)生和回收異戊二烯的技術(shù)。在任何情況下，下述文獻(xiàn)教授了用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生增加量的異戊二烯的組合物和方法2007年12月13日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/013，386和61/013，574 ；W0 2009/076676 ；2008年7月
2日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?61/134，094、61/134，947、61/134，011、和 61/134，10 3 ；W02010/003007 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，163 ；W0 2010/031079 ；2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，186 ;W0 2010/031062 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，189 ；W0 2010/031077 ；2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097,200 ;W0 2010/031068 ;2008年9月15日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/097，204 ；W0 2010/031076 ；2008年12月30日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/141，652 ；PCT/US09/069862 ；2008年12月15日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/335，071 (US 2009/0203102 Al)和2009年4月23日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/429, 143 (US 2010/0003716 Al)。美國專利申請(qǐng)?zhí)?12/335，071 (2008 年 12 月 15 日提交)和US 2009/0203102 Al進(jìn)一步教授用于從培養(yǎng)的細(xì)胞共同產(chǎn)生異戊二烯和氫的組合物和方法。特別地，這些組合物和方法提高異戊二烯產(chǎn)生的速率并且增加產(chǎn)生的異戊二烯的總量。例如，已經(jīng)產(chǎn)生了生成4. 8x 104nmole/gwc;n/小時(shí)的異戊二烯的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(表I)。這些系統(tǒng)的效率通過細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中消耗的約2. 2%的碳轉(zhuǎn)化成異戊二烯來證明。如實(shí)施例和表2中所示，每升培養(yǎng)液大約生成3g異戊二烯。如果需要，使用其他條件，如本文中所述的那些條件，可以獲得甚至更大的量的異戊二烯。在一些實(shí)施方式中，可再生碳源用于異戊二烯的產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，異戊二烯的產(chǎn)生與細(xì)胞的生長解偶聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，異戊二烯和任意氧化劑的濃度處于不可燃范圍內(nèi)，以減少或消除產(chǎn)生或回收異戊二烯過程中可能出現(xiàn)火災(zāi)的風(fēng)險(xiǎn)。所述組合物和方法是合乎需要的，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S每細(xì)胞的高異戊二烯產(chǎn)率、高碳產(chǎn)率、高異戊二烯純度、高生產(chǎn)率、低能量消耗、低生產(chǎn)成本及投資、和最少的副反應(yīng)。這種用于異戊二烯生產(chǎn)的高效大規(guī)模生物合成方法為基于合成性異戊二烯的產(chǎn)品(如橡膠)提供了異戊二烯源并且為使用天然橡膠提供了合乎需要的低成本替代方式。如下文進(jìn)一步討論，可以通過將編碼異戊二烯合酶多肽(例如，植物異戊二烯合酶多肽)的異源核酸導(dǎo)入細(xì)胞而大大增加由所述細(xì)胞產(chǎn)生的異戊二烯的量。異戊二烯合酶多肽將二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化成異戊二烯。如實(shí)施例中所示，異源越南葛藤(野葛)異戍二烯合酶多肽在多種宿主細(xì)胞如大腸桿菌(Escherichia coli)、朽1檬泛菌、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)、和里氏木霉(Yarrowia Iipolytica)中表達(dá)。全部這些細(xì)胞比沒有異源異戍二烯合酶多肽的相應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生更多的異戊二烯。如表I和表2中所示，使用本文所述的方法，產(chǎn)生大量的異戊二烯。例如，具有異源異戊二烯合酶核酸的枯草芽孢桿菌細(xì)胞在14升發(fā)酵器中比沒有該異源核酸的相應(yīng)的對(duì)照枯草芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生約10倍的更多的異戊二烯(表2)。發(fā)酵器中大腸桿菌的每升培養(yǎng)液300mg異戊二烯的生產(chǎn)量(mg/L，其中培養(yǎng)液的體積包括細(xì)胞培養(yǎng)基的體積和細(xì)胞的體積)和枯草芽孢桿菌的30mg/L異戊二烯的生產(chǎn)量表明可以產(chǎn)生顯著量的異戊二烯(表2)。如果需要，可以在甚至更大的規(guī)模上產(chǎn)生異戊二烯，或者本文中所述的其他條件可以用來進(jìn)一步增加異戊二烯的量。表I和表2中列出的載體和實(shí)驗(yàn)條件在下文和實(shí)施例部分中進(jìn)一步詳細(xì)描述。表I :使用本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)物和方法，來自搖瓶的異戊二烯的示例性產(chǎn)率。用 于測量異戊二烯產(chǎn)生量的測定法在實(shí)施例I，第II部分中描述。對(duì)于該測定法，在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)從搖瓶取得樣品并且將其培養(yǎng)30分鐘。隨后測量該樣品中產(chǎn)生的異戊二烯的量。異戊二烯產(chǎn)生量的頂空濃度和比速率在表I中列出并且在本文中進(jìn)一步描述。
權(quán)利要求
1.一種用于從生物異戊二烯組合物產(chǎn)生燃料組分的方法，所述方法包括將所述生物異戊二烯組合物中的大部分異戊二烯通過以下方式化學(xué)地轉(zhuǎn)變成非異戊二烯化合物 (a)使所述生物異戊二烯組合物經(jīng)歷適于異戊二烯二聚化的熱或催化條件以產(chǎn)生異戊二烯二聚體，并且隨后催化地氫化所述異戊二烯二聚體以形成飽和的ClO燃料組分；或 (b)(i)部分地氫化所述生物異戊二烯組合物以產(chǎn)生異戊烯，(ii)使所述異戊烯與選自異戊烯、丙烯和異丁烯的單烯烴二聚化以形成二聚物，并且(iii)完全氫化所述二聚物以產(chǎn)生燃料組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述生物異戊二烯組合物中至少約95%的異戊二烯轉(zhuǎn)化成非異戊二烯化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中加熱所述生物異戊二烯組合物到約150°C至約.2500C以產(chǎn)生不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體，并且催化地氫化所述不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體以產(chǎn)生飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體燃料組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述方法包括(i)使所述生物異戊二烯組合物與用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑接觸以產(chǎn)生不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體，并且催化地氫化所述不飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體以產(chǎn)生飽和的環(huán)狀異戊二烯二聚體燃料組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑包括選自鎳催化劑、鐵催化劑和鉻催化劑的催化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述部分地氫化所述生物異戊二烯組合物的步驟包括使所述生物異戊二烯組合物與氫氣和用于催化異戊二烯的部分氫化的催化劑接觸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述用于催化異戊二烯的部分氫化的催化劑包括鈀催化劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中使所述異戊烯與單烯烴二聚化的步驟包括使所述異戊烯與所述單烯烴在用于催化單烯烴的二聚化的催化劑存在下接觸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述用于催化單烯烴的二聚化的催化劑包括酸催化劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，還包括在將所述生物異戊二烯組合物化學(xué)地轉(zhuǎn)變成燃料組分之前純化來自所述生物異戊二烯組合物的異戊二烯。
11.一種用于從生物異戊二烯組合物產(chǎn)生燃料組分的系統(tǒng)，其中將所述生物異戊二烯組合物中的大部分異戊二烯化學(xué)地轉(zhuǎn)化成非異戊二烯化合物，所述系統(tǒng)包含生物異戊二烯組合物和 (a)(i)能夠使所述生物異戊二烯組合物中的異戊二烯二聚化的一種或多種化學(xué)品或能夠使所述生物異戊二烯組合物中的異戊二烯二聚化的熱源；和(ii)能夠氫化異戊二烯二聚體以形成飽和的ClO燃料組分的催化劑；或 (b)(i)能夠部分地氫化所述生物異戊二烯組合物中的異戊二烯以產(chǎn)生異戊烯的化學(xué)品，(ii)能夠使所述異戊烯與選自異戊烯、丙烯和異丁烯的單烯烴二聚化以形成二聚物的化學(xué)品，和(iii)能夠完全氫化所述二聚物以產(chǎn)生燃料組分的化學(xué)品。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中所述生物異戊二烯組合物包含大于約2mg的異戊二烯并且包含重量占所述組合物中全部C5烴的總重量的大于或約99. 94%的異戊二烯。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中能夠使異戊二烯二聚化的所述一種或多種化學(xué)品包括用于催化異戊二烯的環(huán)二聚化的催化劑，所述催化劑包括選自釕催化劑、鎳催化劑、鐵催化劑和鉻催化劑的催化劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中用于氫化不飽和的異戊二烯二聚體的催化劑包括選自鈀催化劑、鎳催化劑、釕催化劑和銠催化劑的催化劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中能夠部分地氫化異戊二烯的化學(xué)品包括鈀催化劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中能夠使所述異戊烯與單烯烴二聚化的化學(xué)品包括酸催化劑。
17.一種燃料組合物，其包含由根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法產(chǎn)生的燃料組分。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的燃料組合物，其中所述燃料組合物基本上不含異戊二烯。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的燃料組合物，其中所述燃料組合物具有大于-22%?；蛟?32%。至-24%。范圍內(nèi)的S13C值。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用從可再生碳衍生的生物異戊二烯以產(chǎn)生多種烴燃料和燃料添加物的方法、組合物和系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C07C5/02GK102803185SQ201080036083
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者J·C·麥考利夫, S·E·帕拉莫諾夫, K·J·桑福德 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國公司