專利名稱：arNOX跨膜蛋白超家族9(TM9SF)的克隆與表達及其方法和應用的制作方法
arNOX跨膜蛋白超家族9 (TM9SF)的克隆與表達及其方法和
應用相關申請的交叉引用本申請要求2009年8月17日提交的美國臨時申請61/234，368的優(yōu)先權，其以不與本公開內(nèi)容抵觸的程度以引用的方式納入本文。
背景技術：
本公開內(nèi)容涉及分子生物學和生物化學領域，具體地，本發(fā)明涉及利用NADH氧化酶的老化特異性同工型(aging-specific isoforms of NADH oxidase，arNCK)預防或治療由氧化性損傷導致的病癥，并涉及其作為老化相關病癥的循環(huán)標記物，重組表達以及用于其表達或抑制劑的篩選測定。本發(fā)明人闡明了具有氫醌(NADH)氧化酶活性的細胞表面蛋白(命名為Ν0Χ)，其行使質(zhì)膜電子傳遞的末端氧化酶的功能以完成涉及細胞溶質(zhì)氫醌還原酶、位于質(zhì)膜的醌類和所述 NOX 蛋白的電子傳遞鏈(Kishi et al.，1999，Biochem. Biophys. Acta 1412 :66-77 和 Morre,1998, Plasma Membrane Redox Systems and their Role in Biological Stress and Disease. Klewer Academic Publishers, Dordrecht,The Netherlands,pp. 121-156)。 此系統(tǒng)為老化的線粒體學說的生效和老化相關線粒體損傷的傳播——包括老化過程中線粒體ATP合成能力和其他能量依賴過程下降一一提供理論基礎(Boffoli et al.，1996， Biochem. Biophys. Acta 1226 :73-82 ；Lenaz et al.,1998, BioFactors 8 :195-204 ；de Grey,1997，BioEssays 19 161-166 ；禾口 de Grey,1998，J. Anti-Aging Med. 1 :53-66)。所述質(zhì)膜NADH氧化酶(Ν0Χ或ΕΝ0Χ)是通常對激素和生長因子有反應的且具有氫醌(NADH)氧化酶活性和蛋白質(zhì)二硫鍵-巰基交換活性的獨特的細胞表面蛋白。arNOX(或 EN0X3)是與老化細胞相關的生長相關蛋白的家族。所述NADH氧化酶的老化相關同工型(arNOX)是此ENOX蛋白家族的成員。arNOX 的循環(huán)形式在人血清和個體的淋巴細胞中顯著增加，尤其是在65歲之后。所述arNOX蛋白的獨特特征在于產(chǎn)生超氧自由基的能力，所述自由基可明顯造成老化相關變化，包括動脈粥樣硬化形成和其他超距作用(action-at-a-distance)老化現(xiàn)象。以前已描述過老化細胞禾口血 青中 arNOX 的活性(Morreand Morre, 2006, RejuvenationRes. 9 :231-236)。已提出老化是由于涉及自由基的破壞性化學反應的水平不斷增加，其中線粒體是所述過程的主要介質(zhì)(Harman，1956，J. Gerontol. 11 :298-300 和 Harman，1972，J.Am. Geriatr. Soc. 20 :145-147)。支持此觀點的主要根據(jù)是，在所有亞細胞組分中，線粒體既是自由基的主要來源，又是自由基損傷的主要直接受害者。因此，線粒體功能的喪失可能是導致老化現(xiàn)象的驅(qū)動性細胞內(nèi)變化，以及其他促氧化變化(如慢性蛋白轉(zhuǎn)換)的原因。對于所述理論，有大量的間接以及直接的實驗支持。例如，老化過程中ATP合成能力和能量依賴過程的下降己有 艮導(Syrovy and Gutmann，1997，Exp. Gerontol. 12 :31-35 ；Sugiyama et al. ,1993, Biochem. Mol. Biol. Intl. 30 :937-944 ；Boffoli et al. ,1996, Biochim. Biophys. Acta 1226 :73-82 ；禾口 Lenaz et al.，1998，BioFactors 8 :195-204)。
此arNOX作用模型與老化的線粒體學說相符，所述學說認為在老化過程中，線粒體中活性氧中間體的增加導致線粒體DNA的突變和線粒體組分的損傷，從而導致衰老。所述老化的線粒體學說提出線粒體DNA(mtDNA)的自發(fā)體細胞突變的積累導致mtDNA編碼的多肽鏈發(fā)生錯誤(Manczak M et al. , 2005, J. Neurochem. 92 (3) :494-504)。這些在 mtDNA 編碼的多肽鏈中出現(xiàn)的錯誤是隨機的并且在線粒體和細胞分裂過程中任意傳播。這些改變的后果是有缺陷的氧化磷酸化。呼吸鏈缺陷會變得與氧化脅迫增加相關，所述氧化脅迫增加可擴大初始損傷(0zawa、1995，Biochim. Biophys. Acta 1271 :177-189 ；禾口 Lenaz，1998， Biochim. Biophys. Acta 1366:53-67)。因此，從這個角度看，突變的線粒體DNA——盡管在體內(nèi)只以非常少的量存在——可以是氧化脅迫的主要發(fā)生器。在mtDNA的體細胞突變的積累導致有缺陷的氧化磷酸化的情況下，已經(jīng)提出一種質(zhì)膜氧化還原酶(PMOR)系統(tǒng)通過再生氧化吡啶核苷酸而增加線粒體缺陷細胞的存活 $ (de Grey,1997, BioEssays 19 :161-166 ；de Grey,1998, Anti-Aging Med. 1:53-66 ； Yoneda et al. ,1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209 :723-729 ；Schon et al. ,1996, Cellular Aging and Cell Death, Wiley and Sons, New York, pp. 19—34 ；Ozawa et al., 1997，Physiol. Rev. 77 :425-464 ；和 Lenaz，1998，BioFactors 8:195-204)。然而，一直難以將mtDNA的改變自身與其他形式的與老化有關的細胞和組織變化聯(lián)系起來。這些變化主要有低密度脂蛋白(LDL)氧化和動脈粥樣化形成(Steinberg，1997，J. Biol. Chem. 272 20963-20966)。首次用rho°細胞提出一個用于將mtDNA損傷的積累與胞外應答——例如低密度脂蛋白(LDL)中脂質(zhì)的氧化和隨之而來的動脈變化——聯(lián)系起來的模型(Larm et al.，1994，Biol. Chem. 269 :30097-30100 ；Lawen et al.，1994、Mol. Aspects. Med. 15 sl3-s27 ；de Grey, 1997,BioEssays 19 :161-166 ；and de Grey, 1998, Anti-Aging Med. 1 53-66)。已經(jīng)用培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化人細胞進行了類似的研究(Vaillant et al. , 1996,Bioenerg. Biomemb. 28 :531-540)。在質(zhì)膜氧化還原酶(PMOR)過表達的情況下，電子從NADH通過確定的電子傳遞鏈轉(zhuǎn)移至外部受體，導致在細胞表面產(chǎn)生活性氧簇(R0Q。然后，所述細胞表面產(chǎn)生的ROS將起始于線粒體的老化級聯(lián)傳播至相鄰細胞以及循環(huán)血液組分例如低密度脂蛋白(Mon^and Morre,2006, Rejuvenation Res. 9 :231-236)。由于老化對人的健康造成明顯的威脅，并且由于老化相關病癥導致高昂的經(jīng)濟和社會費用，因此本領域長期需要測定或模擬老化相關疾病狀態(tài)的抑制劑的高效、經(jīng)濟和技術上簡單的系統(tǒng)，老化相關的酶特異性標記物和抗體，以及試劑、抑制劑和活化劑篩選方法和表達系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供重組的膜結合蛋白形式或可溶性蛋白形式的重組的老化相關NADH氧化酶同工型(本文稱為arNOX)、它們的編碼序列，以及含有這些序列并表達這些蛋白的分離的宿主細胞。所述全長序列具有如表1和SEQ ID N0:l、3、5、7和9中所給出的具體示例的基因組編碼序列。序列表包括相應的經(jīng)剪接的編碼序列的信息。所述全長蛋白具有如表2和SEQ ID N0:2、4、6、8和10中所給出的氨基酸序列。在此目的內(nèi)還涵蓋與那些具體示例的序列同義的編碼序列。所述重組arNOX蛋白的另一方面是如表3和SEQ ID NO :13-17中所示的可溶性(截短的)arNOX的重組蛋白。那些截短的蛋白缺少界定膜整合區(qū)域的C-末端部分。任選地，所述重組arNOX蛋白還可包含“標簽”區(qū)域以有利于在表達本領域公知的標簽序列之后進行純化，所述標簽包括六組氨酸、鞭毛抗原(Flag)、谷胱甘肽合成酶(GST)、生物素結合肽(AviTag)等。還考慮編碼老化細胞表面標記物的序列，在嚴格條件下與所述具體示例的全長或部分序列雜交的編碼序列的序列以及具有arNOX的酶活性的序列。所述細胞表面arNOX的特征在于促使老化，并且當從細胞表面脫落(shed)時，其作為老化病癥的非侵入性標記物在體液內(nèi)循環(huán)。所述重組arNOX蛋白(特別是所述全長蛋白的酶促活性部分)可用于制備抗原，所述抗原用于產(chǎn)生診斷和治療老化病癥的多克隆和單克隆抗體。還提供了用于確定哺乳動物中的老化相關arNOX的方法，所述方法包括以下步驟通過測量具體蛋白(通過酶活測量、免疫檢測方法)或測量相關基因的轉(zhuǎn)錄表達來檢測生物樣本中一種或多種arNOX同工型的存在情況以及對其定量。本公開內(nèi)容使得可以——特別是使用重組arNOX同工型或截短的arNOX同工型蛋白或其序列來自于arNOX同工型氨基酸序列的抗原肽——產(chǎn)生抗體制劑，所述抗體與選自以下的蛋白特異性結合特征在于SEQ ID N0:2、4、6、8、10或13-17給出的氨基酸序列或本文給出的肽序列的蛋白。這些含抗體的組合物可用于檢測來自患者的血液、血清、唾液、汗水或組織(生物樣本)中的一種或多種arNOX蛋白以驗證arNOX狀態(tài)和/或?qū)χ委熃槿氲姆磻?。免疫原組合物包含至少一種重組arNOX同工型或截短的arNOX同工型蛋白或其序列來自于arNOX同工型氨基酸序列的抗原肽，所述酶或蛋白或肽特異性地與選自選自以下的抗體特異性結合特征在于表2中給出的氨基酸序列的蛋白。用于產(chǎn)生對所述5種同工型中的每一種特異性的抗體的肽具有如下氨基酸序列TM9SFla和/或TM9SFlb，QETYHYYQ LPVCCPEKIRHKSLSLGEVLD⑶R，SEQ ID NO 2 的氨基酸 56-87 ；TM9SF2, VLPYEYTAFDFCQASEGKR PSENLGQVLFGER, SEQ ID NO 6 的氨基酸 73-104 ；TM9SF3, QETYKYFSLPFCVGSKKSISHYHETLGEA LQGVE, SEQ ID NO 8 的氨基酸 55-88 和 TM9SF4，QLPYEYYSLPFCQPSKITYKAENLGEVLRGDR, SEQ ID NO: 10的氨基酸53-84，這些肽可用于制備如上所述的抗體。對膜結合形式的TM9SFla 特異性(但不對TM9SFlb特異性)的抗體是使用具有SEQ IDNO 2的氨基酸M8-568中所示序列(LYSVFYYARRS匪SGAVQTVE)的肽抗原制備的。含有肽抗體的免疫原組合物通常包含結合于載體分子的肽，所述載體可為鑰孔慽血蘭蛋白(keyhole limpet hemocyanin)以及本領域公知的其他蛋白。此外，這種免疫原組合物可用于減輕在人或動物中由arNOX酶進行的氧化反應某些有害方面的嚴重度，從而改善被給予這種免疫原組合物的個體的健康和康樂(well-being) ο對在組織中以及在尿液、血清、汗水、唾液或其他體液中的arNOX和脫落的 arNOX(可溶解形式)特異性的抗體可用作探針以用于篩選DNA表達文庫或者用于檢測或診斷來自人或動物的樣本中老化相關病癥或所述病癥的趨勢。理想地，將所述抗體(或?qū)ψR別arNOX的抗體特異性的第二抗體)通過與提供可檢測信號的物質(zhì)共價或非共價連接而進行標記。合適的標記包括但不限于放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光劑、 化學發(fā)光劑、磁性顆粒等。描述所述標記的用途的美國專利包括但不限于No. 3，817，837 ；3，580，752 ；3，939，350 ；3，996，345 ；4，277，437 ；4，275，149 ；和 4，366，241。可用于診斷和篩選測定法的抗體可使用其序列來源于所述全長蛋白的全部或部分的肽抗原或者對應于表2或3中給出的那些序列中氨基酸序列的蛋白來制備。包含arNOX蛋白或其抗原部分(例如上文所述的肽)的免疫原組合物和/或疫苗可通過本領域中已知的任何方式制劑或給藥。它們通常被制備為液體溶液或懸浮液形式的可注射制劑。也可制備適于在臨注射前溶于或者懸浮于液體的固體形式。所述制劑還可例如被乳化，或者所述蛋白/肽可被包封在脂質(zhì)體中。有利地，這樣的免疫原組合物包含至少一種刺激免疫應答的組分，例如佐劑。免疫原組合物的給藥可以是經(jīng)由人或?qū)嶒瀯游锏钠は隆⒄嫫?nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)途徑，或到實驗動物的足墊內(nèi)，或本領域中已知的其他途徑。蛋白質(zhì)印跡分析可用于指出，arNOX的編碼序列是在有患老化病癥風險的個體中表達。所述序列的可用性使得可快速地進一步檢測表達的特異性以及進一步發(fā)展治療性介入或抗老化化妝品或其他制劑。 編碼人arNOX的核苷酸序列、重組人arNOX蛋白和表達重組人arNOX的重組細胞可用于生產(chǎn)重組arNOX蛋白或其部分，所述蛋白或其部分可用于老化診斷方法以及用于篩選測定法以鑒定新的抗老化藥物和/或營養(yǎng)補充劑、藥妝品、營養(yǎng)藥和老化預防或延遲方法。


圖1是TM-9蛋白超家族成員的膜締合示意圖。N-末端可溶性片段被蛋白酶在切割位點切割并釋放到所述細胞的外部環(huán)境中或釋放到內(nèi)吞小泡的腔中。圖2示出了同工型SF2的功能性arNOX基序的種類和位置。對于所述可溶性酶的氨基酸序列，參見SEQ ID NO :6ο圖3示出了重組可溶性arNOX同工型SF_4的arNOX活性，僅顯示了超氧化物產(chǎn)生， 這是通過亞鐵細胞色素c的還原測量的。極值之間有^min的間隔。圖4示出了重組可溶性arNOX同工型SF_4的arNOX活性，總體地顯示了 ENOX蛋白的典型5-峰模式的活性特征。注意比活性的單位是ymoles/min/mg蛋白。超氧化物產(chǎn)生被加強，具有最多3個所示5-極值振蕩模式。圖5示出了在8°C下孵育的第2、第5和第6天時對28歲女性的淋巴細胞中arNOX 活性的誘導。注意到此時間段內(nèi)對全部5種arNOX同工型的顯著誘導。圖6示出了 arNOX活性(上圖)和arNOX信使RNA(下圖)的誘導的時程。后者對比了使用來自22和77歲個體的淋巴細胞所獲得的結果。圖7示出了進行以下操作所獲得的結果將肽抗體依次加入到血清中以顯示存在于預出量(prebleed)中的具體極值與具體同工型SFl到SF4的聯(lián)系的確定。在添加SF-4 特異性抗體后，未觀察到任何剩余arNOX活性的證據(jù)。在添加對TM9SF3特異性的抗體后， 只剩余一種同工型。在添加對TM9SF2特異性的抗體后，剩余兩種同工型，等等。圖8示出了使用arNOX特異性抗體(使用arNOX特異性肽作為抗原制備的)通過 ELISA在皮膚、唾液和血清中進行的arNOX檢測以及arNOX的相對量。圖9A-9C示出了在來自老年人和年輕人的材料中的arNOX的相對量，這是使用以arNOX特異性抗體制劑進行的ELISA估算的。圖9A示出了皮膚脫屑(filing)中的arNOX 的結果；圖9B示出了采集自三種不同年齡的四個個體的血清樣本中的相對量；圖9C示出了在來自老年個體和年輕個體的唾液樣本中使用對全部arNOX同工型特異性的抗體的結合物進行的ELISA的結果。
具體實施例方式
本文使用的術語“病癥”是指小病、疾病、疾患、臨床病癥或生理病癥。本文使用的術語“活性氧簇”是指來自氧代謝或自由電子傳遞的氧衍生物，導致自由基(例如超氧化物或羥基自由基)的形成。本文所用的術語“抗氧化劑”是指中和活性氧簇的活性或抑制由所述活性氧簇造成的細胞破壞的化合物。本文所用的術語“跨膜9超家族”是指具有與如本文表1和表2中所示的成員la、 lb、2、3和4類似或同源的序列的任意和所有蛋白。本文所述的術語“分離的宿主細胞”是指所述細胞不是完整多細胞生物體的一部分。所述跨膜9(TM-9)超家族蛋白與作為arNOX活性測定的物質(zhì)的聯(lián)系開始于對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母缺失和過表達菌株的分析。arNOX活性是在缺失文庫中確定的，并且各種缺失被追蹤到基因YErll3C ；相應的蛋白隨后被從酵母過表達文庫中鑒定出來，并被確定為跨膜9超家族的成員。酵母數(shù)據(jù)庫中的表達序列標簽(EST) 使得可從人基因組的同源性搜索識別人arNOX。人arNOX cDNA編碼具有高度疏水性C末端部分的多肽，所述C末端部分構成9個跨膜結構域，所述結構域與被人類基因命名委員會 (Human Gene Nomenclature Committee)命名為〃 TM9SF (跨膜蛋白9超家族)〃的多跨度結構域蛋白具有非常相似的結構和序列。TM9SF家族的首要成員是釀酒酵母EMP70基因產(chǎn)物，一種被加工成位于核內(nèi)體的24kDa蛋白(pMa)的70kDa前體(Singer-Kruger et al.， 1993，J. Biol. Chem. 268 14376-14386)。目前，已經(jīng)鑒別了人TM9SF蛋白的5種亞型(同工型)，即 TM9SF-1(hMP70 ;Chuluba de Tapia et al.，1997，Gene 197 195-204)、TM9SF_lb、 TM9SF-2(p76 ；Schimmoller et al.，1998，Gene 216 :311-318)、TM9SF_3 和 D87444，這些亞型相互之間并與所述酵母前體具有30-40%的氨基酸序列同一性(Sugasawa et al., 2000,Gene 273 =229-237) 全部所述同工型均具有arNOX活性。arNOX活性是至少5種不同蛋白的結果是一個令人驚奇的結果。p76 及其近似物的親水性分析(Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157 105-132)揭示了這些蛋白共有獨特的膜結合結構域Gchimmoller et al.，1998、Gene 216 :311-318)。它們還含有短的N-末端疏水延伸特征的信號序列，其后跟隨有在某些家族成員中延伸至最長達氨基酸殘基300的(大部分是)親水的氨基末端部分。這些蛋白的剩余部分是極端疏水的并且含有9個跨膜結構域以使其成為采用1型拓撲結構的整合膜蛋白。多肽易位會由它們的N-末端疏水信號序列引發(fā)，并且它們最終會通過停止轉(zhuǎn)移序列錨定在膜中。基于通過對此MkDa蛋白的微測序得到的N-末端序列信息克隆所述EMP70基因 (Singer-Kruger et al.,1993,J.Biol. Chem. 268 :14376-14386 ；Genembl database entryX67316)。對釀酒酵母基因組的測序揭示了 EMP70基因位于染色體XII上(GenBank登錄號TO3880)。p76cDNA編碼663個氨基酸、推測分子量為76kDa的蛋白(Gen Bank登錄號 U81006)。在蛋白水平上，p76和蛋白前體(Emp70)共有35%的氨基酸序列同一性。顯著地，最高水平的序列同一性位于這些蛋白C-末端的60% ；相反，N-末端結構域表現(xiàn)出更大的氨基酸序列多樣性。另一人同系物(GenBank登錄號D87444)具有72kDa的推測分子量并且被稱為人EMP70p，以將其與p76區(qū)分。TM-9蛋白超家族成員的特征都是(與arNOX蛋白一樣)具有9個與質(zhì)膜交叉的跨膜疏水螺旋的特征性串聯(lián)的細胞表面蛋白。所述跨膜區(qū)域高度保守并與所述5個同工型各自相似或相同。有5個已知的此類同工型(la、lb、2、3和4 ；同工型Ia和Ib非常相似)。 它們似乎由不同基因編碼。它們不是剪接變體。已知TM-9家族成員存在于核內(nèi)體上。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述TM9SF蛋白的約30kDa N-末端區(qū)域——其在質(zhì)膜外表面上露出——脫落到血液和其他體液(唾液、汗水、尿液)中；它們存在于血清和血漿中并共同作為arNOX被測量。全部5種同工型均存在于老化個體的樣本中(盡管比例不同)。 在圖1的箭頭處是絲氨酸蛋白酶切割位點。每個所述脫落形式均含有ENOX蛋白必需的功能性基序，并且所述功能性基序是arNOX家族特有的。所述功能性基序示于圖2和3中，其是所述分離的arNOX蛋白的可溶性形式的序列。盡管每種所述同工型中均存在所需功能性基序，然而不同同工型之間的序列同一性很小。根據(jù)氨基酸序列或?qū)rNOX的可溶性形式的序列分析來確定它們即使對本領域技術人員也不是顯而易見的。獲得了 SF4同工型的cDNA并嘗試了在酵母中的表達。所述全長蛋白(SEQ ID NO 9)的表達沒有成功。然而，對TM9SF4的可溶性片段的克隆得以成功，并且所克隆的蛋白具有與arNOX蛋白相同的功能性特征(圖4和幻。然后利用所述同工型可溶形式的可溶性氨基酸和DNA序列來分別制備每種同工型的肽抗體以及每種同工型的RNA探針。所述抗體被用于系統(tǒng)地鑒別人血清和唾液中所述5種同工型中的每一種，以對應于TM-9超家族蛋白同工型的已知序列，DNA序列信息被用于產(chǎn)生每一種所述同工型的RT-PCR探針并證明它們在人淋巴細胞和人皮膚外植塊中的表達。這些數(shù)據(jù)確認TM-9超家族蛋白為人血清、血漿和其他體液的5種已知arNOX同工型的遺傳來源。目前arNOX的測定法費時、不準確，并且，當揭示5種不同同工型時，間隔沈分鐘的活性極值未將每個極值與具體的同工型關聯(lián)起來。為避免這些和其他困難，本文公開的信息已用于開發(fā)同工型特異性的基于ELISA的arNOX測定法。在兔中產(chǎn)生針對每一種所述同工型的可溶性蛋白序列的肽抗體。將一種arNOX來源包覆在96孔ELISA板的5個重復孔的每一個上，在合適的洗滌和阻斷后，將所述同工型特異性抗體單獨或作為混合物(如果目的僅是測量總arNOX)加至所述5個重復孔的每一個上。將過氧化物酶_連接的第二抗體與比色底物一起加入，然后在自動讀板儀中確定形成的顏色。吸光度讀數(shù)與arNOX量是線性關系，并通過使用如本文所述產(chǎn)生的重組可溶性arNOX蛋白的標準曲線來定量。所述 ELISA方案是標準的，不是獨特的。然而，使用arNOX同工型的抗體作為對arNOX和arNOX 同工型進行定量的方法的用途是新的且具備新穎性，并被納入本文以進一步證明這些發(fā)現(xiàn)的非顯而易見性。還已確定TM9SF同工型并非均勻地分布在體液(包括血清)中。然而，生物樣品可來自目的受試哺乳動物，特別是人，并且可非限制性地為皮膚樣本、唾液、血液、血清、尿液、 腹腔液、組織樣本或來自受試哺乳動物的其他樣本。技術人員應理解，在arNOX蛋白中可以存在有限數(shù)量的氨基酸取代而不明顯影響功能，并且未示例的arNOX可與具體示例的氨基酸序列具有一些氨基酸序列差異。這些天然存在的變體可例如通過與所示例的編碼序列(或其能夠與人arNOX序列特異性地雜交的部分)在適合檢測至少約70%的核苷酸序列同源性、優(yōu)選約80%、更優(yōu)選約90%或 95-100 %或在上面規(guī)定范圍內(nèi)的任意整數(shù)的序列同源性的條件下雜交來鑒別。優(yōu)選地，所編碼的arNOX與所示例的arNOX氨基酸序列具有至少約90%，或90到100%之間的任意整數(shù)的氨基酸序列同一性。在檢查未示例序列時，證明了特征性arNOX活性以及對arNOX特異性抑制劑(例如水楊苷)的敏感性使得本領域技術人員可確認產(chǎn)生了功能性arNOX蛋白。包含編碼arNOX蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子，以及在嚴格條件下與包含表 1給出的核酸序列中編碼序列的核酸分子雜交的分離核酸分子，也在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。 與本發(fā)明具體示例的arNOX編碼序列具有至少85%核苷酸序列同一性的DNA分子是通過使用本文給出的探針在嚴格條件下進行雜交來鑒別的。嚴格條件包括例如在水溶液(5 X SSC, 5X鄧哈特溶液(Denhardt's solution)，1 %十二烷基硫酸鈉)中于65°C至68°C之間的溫度下雜交，或者于約42°C下在50%甲酰胺溶液中雜交并在室溫下于0.2XSSC，0. 十二烷基硫酸鈉中洗滌。本發(fā)明的具體示例的arNOX序列容易為本領域普通技術人員所測試。表1.編碼arNOX跨膜超家族基因la、lb、2、3和4的DNA序列跨膜9超家族成員1同工型a(智人(Homo sapiens)) (SEQ ID NO :1)版本ΝΡ_006396· 2GI :21361315數(shù)據(jù)庫來源 REFSEQ 登錄號ΝΜ_006405· 5lggccgcgctg ccgatcgccg ggaggacccc cgcctcgccg aagacgggcg gggcaagccg61agcctcacgg ggtccccgga gctgggccgg gcctccagat ggagaaggcg caacggggag121ttcttgagta agccagagcg gtgtccagcg cggtgtagcc gcagccgccg ctgtcaggcg181cagcaacggg caaccccgta gaagtcggtc ggcaggtcct ctccaacccg ccgctaccgc241gccgctgtgg gagagacccc agcaggagcc caaaggcagc tacgggggcg cgaaggccgc301tggcgccgcc tcggccagcc cttcccgcgc ggttccactg ccttaaggat gacagtcgta361gggaaccctc gaagttggag ctgccagtgg ttgccaatcc tgatactgtt gctgggcaca421ggccatgggc caggggtgga aggcgtgaca cactacaagg ccggcgaccc tgttattctg481tatgtcaaca aagtgggacc ctaccataac cctcaggaaa cttaccacta ctatcagctt541ccagtctgct gccctgagaa gatacgtcac aaaagcctta gcctgggtga agtgctggat601ggggaccgaa tggctgagtc tttgtatgag atccgctttc gggaaaacgt ggagaagaga661attctgtgcc acatgcagct cagttctgca caggtggagc agctgcgcca ggccattgaa721gaactgtact actttgaatt tgtggtagat gacttgccaa tccggggctt tgtgggctac78latggaggaga gtggtttcct gccacacagc cacaagatag gactctggac ccatttggac841ttccacctag aattccatgg agaccgaatt atatttgcca atgtttcagt gcgggacgtc901aagccccaca gcttggatgg gttacgacct gacgagttcc taggccttac ccacacttat961agcgtgcgct ggtctgagac ttcagtggag cgtcggagtg acaggcgccg tggtgacgat1021ggtggtttct ttcctcgaac actggaaatc cattggttgt ccatcatcaa ctccatggtg
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781atactatcatgttgttgaaa ctgggtccat gggagcaaga ttagtggctg ctaaacttga841accgaaaagcttcaaacata cccatataga taaaccagac tgctcagggccccccatgga901cataagtaacaaggcttctg gggagataaa aattgcctat acttactctg ttagcttcga961ggaagatgataagatcagat gggcgtctag atgggactat attctggagtctatgcctca1021tacccacattcagtggttta gcattatgaa ttccctggtc attgttctcttcttatctgg1081aatggtagctatgattatgt tacggacact gcacaaagat attgctagatataatcagat1141ggactctacggaagatgccc aggaagaatt tggctggaaa cttgttcatg gtgatatatt1201ccgtcctccaagaaaaggga tgctgctatc agtctttcta ggatccggga cacagatttt1261aattatgacctttgtgactc tatttttcgc ttgcctggga tttttgtcacctgccaaccg1321aggagcgctgatgacgtgtg ctgtggtcct gtgggtgctg ctgggcacccctgcaggcta1381tgttgctgccagattctata agtcctttgg aggtgagaag tggaaaacaa atgttttatt1441aacatcatttctttgtcctg ggattgtatt tgctgacttc tttataatga atctgatcct1501ctggggagaaggatcttcag cagctattcc ttttgggaca ctggttgcca tattggccct1561ttggttctgcatatctgtgc ctctgacgtt tattggtgca tactttggttttaagaagaa1621tgccattgaacacccagttc gaaccaatca gattccacgt cagattcctg aacagtcgtt1681ctacacgaagcccttgcctg gtattatcat gggagggatt ttgccctttg gctgcatctt1741tatacaacttttcttcattc tgaatagtat ttggtcacac cagatgtattacatgtttgg1801cttcctatttctggtgttta tcattttggt tattacctgt tctgaagcaa ctatacttct1861ttgctatttccacctatgtg cagaggatta tcattggcaa tggcgttcattccttacgag1921tggctttactgcagtttatt tcttaatcta tgcagtacac tacttcttttcaaaactgca1981gatcacgggaacagcaagca caattctgta ctttggttat accatgataa tggttttgat2041cttctttctttttacaggaa caattggctt ctttgcatgc ttttggtttg ttaccaaaat2101atacagtgtggtgaaggttg actgaagaag tccagtgtgt ccagttaaaa cagaaataaa2161ttaaactcttcatcaacaaa gacctgtttt tgtgactgcc ttgagtttta tcagaattat2221tggcctagtaatccttcaga aacaccgtaa ttctaaataa acctcttcccatacaccttt2281cccccataagatctgtcttc aacactataa agcatttgta ttgtgatttg attaagtata2341tatttggtt gttctcaatga agagcaaatt taaatattat gtgcatttga aLOCUS NP—064508 589aa 線性 PRI 12-JUN-2008跨膜9超家族成員3(智人)(SEQ ID NO :7)版本NP—064508. 3 GI :190194386數(shù)據(jù)庫來源 REFSEQ 登錄號NM—020123. 3lgaggaagaggctgaggaggc gcggggggcg ggggaggctc aggagcgggcggtgacggcg61acggcggcggcagaggaggc agcggctggg ccgggccccg tgcgtctgtccgcgccccgt121ggatgcgaatcggccgcggc ggaggcggcg gcggcggagg aggcggcggcgggaggagga181gtcggtgagccggctccggg ccggaggggc gcggaggatg aggccgctgcctggcgctct241tggcgtggcggcggccgccg cgctgtggct gctgctgctg ctgctgccccggacccgggc301ggacgagcacgaacacacgt atcaagataa agaggaagtt gtcttatgga tgaatactgt361tgggccctaccataatcgtc aagaaacata taagtacttt tcacttccattctgtgtggg421gtcaaaaaaaagtatcagtc attaccatga aactctggga gaagcacttcaaggggttga
481attggaatttagtggtctgg atattaaatt taaagatgat gtgatgccagccacttactg541tgaaattgatttagataaag aaaagagaga tgcatttgta tatgccataaaaaatcatta601ctggtaccagatgtacatag atgatttacc aatatggggt attgttggtgaggctgatga66laaatggagaagattactatc tttggaccta taaaaaactt gaaataggttttaatggaaa721tcgaattgttgatgttaatc taactagtga aggaaaggtg aaactggttccaaatactaa781aatccagatgtcatattcag taaaatggaa aaagtcagat gtgaaatttgaagatcgatt841tgacaaatatcttgatccgt ccttttttca acatcggatt cattggttttcaattttcaa901ctccttcatgatggtgatct tcttggtggg cttagtttca atgattttaatgagaacatt96laagaaaagattatgctcggt acagtaaaga ggaagaaatg gatgatatggatagagacct1021aggagatgaatatggatgga aacaggtgca tggagatgta tttagaccatcaagtcaccc1081actgatattttcctctctga ttggttctgg atgtcagata tttgctgtgtctctcatcgt1141tattattgttgcaatgatag aagatttata tactgagagg ggatcaatgctcagtacagc1201catatttgtctatgctgcta cgtctccagt gaatggttat tttggaggaagtctgtatgc1261tagacaaggaggaaggagat ggataaagca gatgtttatt ggggcattccttatcccagc1321tatggtgtgtggcactgcct tcttcatcaa tttcatagcc atttattaccatgcttcaag1381agccattccttttggaacaa tggtggccgt ttgttgcatc tgtttttttgttattcttcc1441tctaaatcttgttggtacaa tacttggccg aaatctgtca ggtcagcccaactttccttg1501tcgtgtcaatgctgtgcctc gtcctatacc ggagaaaaaa tggttcatggagcctgcggt1561tattgtttgcctgggtggaa ttttaccttt tggttcaatc tttattgaaatgtatttcat1621cttcacgtctttctgggcat ataagatcta ttatgtctat ggcttcatgatgctggtgct1681ggttatcctgtgcattgtga ctgtctgtgt gactattgtg tgcacatattttctactaaa1741tgcagaagattaccggtggc aatggacaag ttttctctct gctgcatcaactgcaatcta1801tgtttacatgtattcctttt actactattt tttcaaaaca aagatgtatggcttatttca1861aacatcattttactttggat atatggcggt atttagcaca gccttggggataatgtgtgg1921agcgattggttacatgggaa caagtgcctt tgtccgaaaa atctatactaatgtgaaaat1981tgactagagacccaagaaaa cctggaactt tggatcaatt tctttttcataggggtggaa2041cttgcacagcaaaaacaaac aaacgcaaga agagatttgg gctttaacacactgggtact2101ttgtgggtctctctttcgtc ggtggcttaa agtaacatct atttccattgatcctaggtt2161cttcctgactgctttctcca actgttcaca gcaaatgctt ggattttatgcagtaggcat2221tactacagtacatggctaat cttcccaaaa actagctcat taaagatgaaatagaccagc2281tctcttcagtgaagaggaca aatagtttat ttaaagcatt tgttccaataaaataaatag2341agggaaacttggatgctaaa attacatgaa taggaatctt cctggcacttagtgtttcta2401tgttattgaaaaatgatgtt ccagaaagat tacttttttc ctcttatttttactgccatt2461gtcgacctattgtgggacat ttttatatat tgaatctggg ttcttttttgactttttttt2521tttcccaatccaacagcatc ctttttttta aaagagagaa ttagaaaatattaaatcctg2581catgtaatatatctgctgtc atcttagttg gaccaacttc ccatttatttatcttaaaac2641tatacagttacatcttaatt ccatccaaag aagatacagt ttgaagacagaagtgtactc2701tctacaatgcaatttactgt acagttagaa agcaaagtgt taaatggagaagatacttgt2761ttttattaaacattttgaga tttagataaa ctacatttta actgaatgtctaaagtgatt
2821atcttttttccccccaagtt agtcttaaat cttttgggtt tgaatgaaggttttacataa2881gaaattattaaaaacaaggg gggtgggtaa taaatgtata taacattaaataatgtaacg294ltaggtgtagattcccaaatg catttggatg tacagatcga ctacagagtacttttttctt3001atgatgattggtgtagaaat gtgtgatttg ggtgggcttt tacatcttgcctaccattgc3061atgaaacattggggtttctt caaaatgtgt gtgtcatact tcttttgggaggggggttgt3121tttcttctgtttattttctg agactcctac aggagccaaa tttgtaatttagagacactt3181aattttgttaatcctgtctg ggacacttaa gtaacatcta aagcattattgctttagaat3241gttcaaataaaatttcctga ccaaattgtt ttgtggaaat agatgtgtttgcaatttgaa3301gatatctttctgtccagaag gcaaaattac cgaatgccat ttttaaaagtatgctataaa3361ctatgctactctcatacagg ggacccgtat tttaaaatct ccagacttgcttacatctag3421attatccag cacaatcataa agtgaatgac aaaccctttg aatgaaattgtggcacaaaa3481tctgttcaggttggtgtacc gtgtaaagtg gggatggggt aaaagtggttaacgtactgt3541tggatcaacaaataaaggtt acagttttgt aagagaagtg atttgaatacatttttctgg3601aactattcataatatgaagt tttcctagaa ccactgagtt tctagtttaatagtttgcta3661tgcaaatgaccacctaaaac aatactttat attgttattt ttagaaagactcaaaacacc3721tgtatttaaaccttaatatg aaaatcatgc aattaatagt tacacaagatgttttcatta3781caaaatatgtacctatctat tgatggactc tacatcctat attgtgacatgtaagtcctt3841taaaaggtgaaaagtatgat ttcttaccac ttaagtatga ttgatatgatccaacaaatt3901tgatcagaagctgtaggtaa atcctcttct gaagccaaaa tggtatattaaatataattt3961attggtacttccattttctc ttccttctta cttgccttta agatcttataaaaaagaaac4021taaaagttaatatttagttg cctatattat gtaacctttt aactatatataaagtacttt4081tttggtttctttctcaccac ttttattcaa aagtactttt aacataccaatacatagtct4141gtctgatgggagtataaatt ggacagtaag gttttgtctt aataaaatgaaatttgtttc4201tcatgatatgaatcttgcag gtaagatgta gggtttattg aaaatgtgtgggttaaatgc4261tttcaggtacaccaattctt tctactaaat tgagctctat ttgaagttctttggaatctg4321tggtgaaaaataattttctg atttccaaat acattaagag cattaaatgaatattaatca4381cctttaaagtcttttagaaa aggacttgta ttggtttttg gctgcatagaggggttgaat4441aagtgtatgtatgtgtgtgc gtgtgtgtgt gtcttcttaa agaagatgtaattcacaaat4501agtttagctccctagcgctc agttgtagaa tagaaaatag aacattattcaagttaattg456laaaggtgaggtttttatacc cccactaatg ctgtgtatct gtctttcgtttgttaacatt4621atttgcttaatttctttcaa ctcacacttt ggataatact atcaaaaactaaggctaaac4681attccttgtgtatctttaag catgcttctc ctgaaattta actacattagtagttgacat4741ttgtatacatatatcctaat acaagagtag gataaggtgg aaatgtaatggcctgaggga4801tggtgaagcattcttttagt atttttcatc atgttgggct cctagattgtactggggttg4861cccataaatcaaaccccata ctcttagaat tcattatatt atggtgatatccgaacctag4921tgaatggtatgcttgggtgt tttccattga gagtggatgg acctctttataaagttggtt4981gctgcaaaatccagttcttc caaaagccac tttatttagg gtttattcacaagtcatatc5041cattttggtacagtgtttgt ttcctaatat ttattaacca ccttataccaaatgtcttgc5101aaagaaatgttattaaaacc ttgaattttt acaaatgtaagtgtattaat
5161gtatttgttcaggaaaagct acataccgaa gggcttttgt atatgaattctgtggtgggg5221agacccatttgtaatctata tggcagttcc atctgggttt taagtttaga tttcaccgtg5281tcttagtgcttcattctatt ggtttattgg aacatgtaat aaataggagtagtgatgtat5341taaaacacaagtattcatta atgttttata tcttcactaa aattctatag ttatgaaact5401atcaatcaaggtgttatatt tcagtcagaa gtgaaaattt atgaagagta tttggaagtg5461tgtacagaaataaactagac ttacaggtag gctagatcag aacgttaaca tatgaacctg5521cagaaatctggtaagactta aattcagtgt gaggaataac tctagttctctcctatgagc5581atttcctaaaagccatctga tttggcattc ttactggagc tgcagacaga aatctacaaa5641gacaaaagtaaacaaaatta agttattatt ccactgttag gaatggaaataaacttgtga5701agtctgtttattttgaagta ttggtgaact aggcttgcta attgataactgcagcagttt5761gtgtttactccagttcatca gcttaggtca tttgaaagat ataagagcttaaggcaagaa5821agaaataacatggaattcta tttgaaggac aacagaacat tcttggaaaa gcagctccag5881ttggtttttcaactgtcaaa cttgaatgtg taagtcccca cagagcatgg acagtcggtg5941cagagttccaaggaaacaat tattgcctga tgaccacttc cattttgtatacactctttg6001gttcgtataggccatattcc aactggcttt ttagtaatag aaatccagta tataatgtat6061caaatacaattgaggttcta acctagtgtg ttaatttatc tgaatttgga tttttaaaaa6121gtaataaaaagttaaatgta跨膜9超家族蛋白成員4(智人)(SEQ ID NO :9)版本NP—055557. 2 GI :164519076數(shù)據(jù)庫來源 REFSEQ 登錄號NM—014742. 3lagtttctgccaggagctaat atggcttcct tagttacacc gttctctctcttcacctaat61cagcgaccttactttcccag accagactgt cgagcaggag ctaagactccttttcccctc121tgctgaccgccactacagga gcggttgaag ccagacgacc accttgtgga gttaaactcc181gtaaccagggagcaccactt ccgctgacgt cattacggcg acacgtggatccaagatggc241gacggcgatggattggttgc cgtggtcttt actgcttttc tccctgatgtgtgaaacaag301cgccttctatgtgcctgggg tcgcgcctat caacttccac cagaacgatcccgtagaaat361caaggctgtgaagctcacca gctctcgaac ccagctacct tatgaatactattcactgcc421cttctgccagcccagcaaga taacctacaa ggcagagaat ctgggagagg tgctgagagg481ggaccggattgtcaacaccc ctttccaggt tctcatgaac agcgagaaga agtgtgaagt541tctgtgcagccagtccaaca agccagtgac cctgacagtg gagcagagccgactcgtggc601cgagcggatcacagaagact actacgtcca cctcattgct gacaacctgcctgtggccac661ccggctggagctctactcca accgagacag cgatgacaag aagaaggaaa aagatgtgca721gtttgaacacggctaccggc tcggcttcac agatgtcaac aagatctacctgcacaacca781cctctcattcatcctttact atcatcggga ggacatggaa gaggaccagg agcacacgta841ccgtgtcgtccgcttcgagg tgattcccca gagcatcagg ctggaggacctcaaagcaga901tgagaagagttcgtgcactc tgcctgaggg taccaactcc tcgccccaag aaattgaccc961caccaaggagaatcagctgt acttcaccta ctctgtccac tgggaggaaa gtgatatcaa1021atgggcctctcgctgggaca cttacctgac catgagtgac gtccagatccactggttttc1081tatcattaactccgttgttg tggtcttctt cctgtcaggt atcctgagca tgattatcat
1141tcggaccctccggaaggaca ttgccaacta caacaaggag gatgacattgaagacaccat1201ggaggagtctgggtggaagt tggtgcacgg cgacgtcttc aggcccccccagtaccccat1261gatcctcagctccctgctgg gctcaggcat tcagctgttc tgtatgatcctcatcgtcat1321ctttgtagccatgcttggga tgctgtcgcc ctccagccgg ggagctctcatgaccacagc1381ctgcttcctcttcatgttca tgggggtgtt tggcggattt tctgctggccgtctgtaccg1441cactttaaaaggccatcggt ggaagaaagg agccttctgt acggcaactctgtaccctgg1501tgtggtttttggcatctgct tcgtattgaa ttgcttcatt tggggaaagcactcatcagg1561agcggtgccctttcccacca tggtggctct gctgtgcatg tggttcgggatctccctgcc1621cctcgtctacttgggctact acttcggctt ccgaaagcag ccatatgacaaccctgtgcg1681caccaaccagattccccggc agatccccga gcagcggtgg tacatgaaccgatttgtggg1741catcctcatggctgggatct tgcccttcgg cgccatgttc atcgagctcttcttcatctt1801cagtgctatctgggagaatc agttctatta cctctttggc ttcctgttccttgttttcat1861catcctggtggtatcctgtt cacaaatcag catcgtcatg gtgtacttccagctgtgtgc1921agaggattaccgctggtggt ggagaaattt cctagtctcc gggggctctgcattctacgt1981cctggtttatgccatctttt atttcgttaa caagctggac atcgtggagttcatcccctc2041tctcctctactttggctaca cggccctcat ggtcttgtcc ttctggctgctaacgggtac2101catcggcttctatgcagcct acatgtttgt tcgcaagatc tatgctgctgtgaagataga2161ctgattggagtggaccacgg ccaagcttgc tccgtcctcg gacaggaagccaccctgcgt2221gggggactgcaggcacgcaa aataaaataa ctcctgctcg tttggaatgtaactcctggc2281acagtgttcctggatcctgg ggctgcgtgg ggggcgggag ggcctgtagataatcttgcg2341tttttcgtcatcttattcca gttctgtggg ggatgagttt ttttgtgggttgctttttct2401tcagtgctaagaaagttccc tccaacagga actctctgac ctgtttattcaggtgtattt2461ctggtttggatttttttttc cttctttgtt ttaacaaatg gatccaggatggataaatcc2521accgagataagggttttggt cactgtctcc acctcagttc ctcagggctgttggccaccc2581tatgactaactggaagagga cacgccagag cttcagtgag gtttccgagcctctccctgc2641ccatcctcaccactgaggcc acgacaaagc acagctccag ctcggacagcaccctcagtg270lccagccagcctctgccagac ctctctttcc ctcttctccc cagcctcctccagggctgcc2761caaggcagggtttccagcca ggcctcgggg tcatcttttc accaggagcaaacccaagtc2821ttagttgctacaagaaaatc ccctggaagt actgggggcc aggttccccagacagcagga2881attgcccctgttcagagcag ccggagtttg ctggaccaca aggaagaagagaagagactt2941gcagtgaactgtttttgtgc caagaaaccc tggacctggg gccaagtatttcccaagcca3001agcatccacttgtctgtgtc tgggaaggga tggccaaggc cgctagggtccttacccctc3061aggatcactccccagccctt tcctcaggag gtaccgctct ccaaggtgtgctagcagtgg3121gccctgcccaacttcaggca gaacagggag gcccagagat tacagatcccctcctgtaag3181tggccaggcattctctccct gccctctctg gcctctgggg tcatactcacttctttagcc3241agccccatcccctccacccc acacctgagt tcttgcctcc tccttttggggacacccaaa3301acactgcttgtgagaaggaa gatggaaggt aagttctgtc gttctttccccaatccccag3361gaatggacaagaagccaact tagaaagaag ggtctcacgt ggctggcctggctcctccgt3421agacccctgttcttttcaac ctctgcccac ccgtgcatgt catcacaaacatttgctctt
3481aagttacaagagaccacatccacccagggattagggttcaagtagcagctgctaaccctt
3541gcaccagcccttgtgggactCCC3.3.C3.C3.3.gacaaagctcaggatgctggtgatgctagg
3601aagatgtccctcccctcactgccccacattctcccagtggctctaccagcctcacccatc
3661aaaccagtgaatttctcaatcttgcctcacagtgactgcagcgccaagcggcatccacca
3721agcatcaagttggagaaaagggaacccaagcagtagagagcgatattggagtcttttgtt
3781cattcaaatcttggatttttttttttccctaagagattctctttttagggggaatgggaa
3841acggacacctcataaagggttcaaagatcatcaatttttctgactttttaaatcattatc
3901attattattt 3.3. 3.3.3.3.aaatgcctgtatgcctttttttggtcggattgtaaataaa
3961tataccatt ctcctactgaa 表2.arN0X跨膜9超家族蛋白la、lb、2、3和4的蛋白序列(智人)跨膜9超家族成員1同工型a(SEQ ID NO 2)MTVVGNPRSWSCQWLPILILLLGTGHGPGVEGVTHYKA⑶PVILYVNKVGPYHNPQETYHYYQLPVCCP EKTRHKSLSLGEVLD⑶RMAESLYEIRFRENVEKRILCHMQLSSAQVEQLRQAIEELYYFEFWDDLPIRGFVGYME ESGFLPHSHKIGLWTHLDFHLEFHGDRIIFANVSVRDVKPHSLDGLRPDEFLGLTHTYSVRWSETSVERRSDRRRGD DGGFFPRTLEIHWLSIINSMVLVFLLVGFVAVILMRVLRNDLARYNLDEETTSAGS⑶DFDQ⑶NGWKIIHTDVFRF PPYRGLLCAVLGVGAQFLALGTGIIVMALLGMFNVHRHGAINSAAILLYALTCCISGYVSSHFYRQIGGFRWVWNII LTTSLFSVPFFLTWSVVNSVHWANGSTQALPATTILLLLTVWLLVGFPLTVIGGIFGKNNASPFDAPCRTKNIAREI PPQPWYKSTVIHMTVGGFLPFSAISVELYYIFATVWGREQYTLYGILFFVFAILLSVGACISIALTYFQLSGEDYRW WWRSVLSVGSTGLFIFLYSVFYYARRS匪SGAVQTVEFFGYSLLTGYVFFLMLGTISFFSSLKFIRYIYVNLKMD跨膜9超家族成員1同工型b (SEQ ID NO 4)MTVVGNPRSWSCQWLPILILLLGTGHGPGVEGVTHYKA⑶PVILYVNKVGPYHNPQETYHYYQLPVCCP EKIRHKSLSLGEVLD⑶RMAESLYEIRFRENVEKRILCHMQLSSAQVEQLRQAIEELYYFEEWDDLPIRGFVGYME ESGFLPHSHKIGLWTHLDFHLEFHGDRIIFANVSVRDVKPHSLDGLRPDEFLGLTHTYSVRWSETSVERRSDRRRGD DGGFFPRTLEIHWLSIINSMVLVELLVGFVAVILMRVLRNDLARYNLDEETTSAGS⑶DFDQ⑶NGWKIIHTDVFRF PPYRGLLCAVLGVGAQFLALGTGIIVMALLGMFNVHRHGAINSAAILLYALTCCISGYVSSHFYRQIGGERWVWNII LTTSLFSVPFFLTWSVVNSVHWANGSTQALPATTILLLLTVWLLVGFPLTVIGGIFGKNNASPFDAPCRTKNIAREI PPQPWYKSTVIHMTVGGFLPFRYPPFIPWLLLSGS跨膜9超家族成員2 (SEQ ID NO :6)MSARLPVLSPPRWPRLLLLSLLLLGAVPGPRRSGAFYLPGLAPVNFCDEEKKSDECKAEIELFVNRLDS VESVLPYEYTAFDFCQASEGKRPSENLGQVLFGERIEPSPYKFTFNKKETCKLVCTKTYHTEKAEDKQKLEFLKKSM LLNYQHHWIVD匪PVTWCYDVEDGQRFCNPGFPIGCYITDKGHAKDACVISSDFHERDTFYIFNHVDIKIYYHVVE 'TGSMGARLVAAKLEPKSFKHTHIDKPDCSGPPMDISNKASGEIKIAYTYSVSFEEDDKIRWASRWDYILESMPHT HIQWFSIMNSLVIVLFLSGMVAMIMLRTLHKDIARYNQMDSTEDAQEEFGWKLVHGDIFRPPRKGMLLSVFLGSGTO ILIMTFVTLFFACLGFLSPANRGALMTCAVVLWVLLGTPAGYVAARFYKSFGGEKWKTNVLLTSFLCPGIVFADFFI MNLILWGEGSSAAIPFGTLVAILALWFCISVPLTFIGAYFGFKKNAIEHPVRTNQIPRQIPEQSFYTKPLPGIIMGG ILPFGCIFIQLFFILNSIWSHQMYYMFGFLFLVFIILVITCSEATILLCYFHLCAEDYHWQWRSFLTSGFTAVYFLI YAVHYFFSKLOITGTASTILYFGYT MIMVLIEFLFTGTIGFFACFWFVTKIYSVVKVD跨膜9超家族成員3 (SEQ ID NO :8)MRPLPGALGVAAAAALWLLLLLLPRTRADEHEHTYQDKEEVVLWMNTVGPYHNRQETYKYFSLPFCVGSKKSISITYHETLGEALQGVELEFSGLDIKFKDDVMPATYCEIDLDKEKRDAFVYAIKNHYWYQMYIDDLPIWGIVGE ADENGEDYYLWTYKKLEIGFNGNRIVDVNLTSEGKVKLVPNTKIOMSYSVKWKKSDVKFEDRFDKYLDPSFFQHRIH NFSIFNSFMMVIFLVGLVSMILMRTLRKDYARYSKEEEMDDMDRDLGDEYGWKQVHGDVFRPSSHPLIFSSLIGSGC QIFAVSLIVIIVAMIEDLYTERGSMLSTAIFVYAATSPVNGYFGGSLYARQGGRRWIKQMFIGAFLIPAMVCGTAFF INFIAIYYHASRAIPFGTMVAVCCICFFVILPLNLVGTILGRNLSGQPNFPCRVNAVPRPIPEKKWFMFPAVIVCLG GILPFGSIFIEMYFIFTSFWAYKIYYVYGFMMLVLVILCIVTVCVTIVCTYFLLNAEDYRWQWTSFLSAASTAIYVY MYSFYYYFFKTKMYGLFQTSFYFGYMAVFSTALGIMCGAIGYMGTSAFVRKIYTNVKID跨膜9超家族成員4 (SEQ ID NO 10)MATAMDWLPWSLLLFSLMCETSAFYVPGVAPINFHQNDPVEIKAVKLTSSRTQLPYEYYSLPFCQPSKI TYKAENLGEVLRGDRIVNTPFQVLMNSEKKCEVLCSQSNKPVTLTVEQSRLVAERITEDYYVHLIADNLPVATRLEL YSNRDSDDKKKEKDVQFEHGYRLGFTDVNKIYLHNHLSFILYYHREDMEEDQEHTYRVVRFEVIPQSIRLEDLKADE KSSCTLPEGTNSSPQEIDPTKENQLYFTYSVHWEESDIKWASRWDTYLTMSDVQIHWFSIINSVVVVFFLSGILSMI IIRTLRKDIANYNKEDDIEDTMEESGWKLVHGDVFRPPQYPMILSSLLGSGIQLFCMILIVIFVAMLGMLSPSSRGA LMTTACFLFMFMGVFGGFSAGRLYRTLKGHRWKKGAFCTATLYPGVVFGICFVLNCFIWGKHSSGAVPFPTMVALLC MWFGISLPLVYLGYYFGFRKQPYDNPVRTNQIPRQI. PEQRWYMNRFVGILMAGILPFGAMFIELFFIFSAIWENQF YYLFGFLFLVFIILVVSCSQISIVMVYFQLCAEDYRffffffRNFLVSGGSAFYVLVYAIFYFVNKLDIVEFIPSLLYFG YTALMVLSFWLLTGTIGFYAAYMFVRKIYAAVKID表3.人可溶性arNOX酶的氨基酸序列跨膜9超家族成員Ia (智人)(SEQ ID NO 13)IMTVVGNPRSff SCQffLPILIL LLGTGHGPGV EGVTHYKAGD61YYQLPVCCPE KIRHKSLSLG EVLD⑶RMAE SLYEIRFREN121QAIEELYYFE FVVDDLPIRG FVGYMEESGF LPHSHKIGLff181VRDVKPHSLD GLRPDEFLGL THTYSVRffSE TSVERRSDRR保守的CQ/CE位于氨基酸27-32的腺嘌呤核苷酸結合位點GXGXXG假定的蛋白質(zhì)二硫鍵交換位點CXXXL
假定的銅位點HYY和HSH跨膜9超家族成員Ib (智人)(SEQ ID NO 14)IMTVVGNPRSff SCQffLPILIL LLGTGHGPGV EGVTHYKAGD61YYQLPVCCPE KIRHKSLSLG EVLD⑶RMAE SLYEIRFREN121QAIEELYYFE FVVDDLPIRG FVGYMEESGF LPHSHKIGLff181VRDVKPHSLD GLRPDEFLGL THTYSVRffSE TSVERRSDRR保守的CQ/CE位于氨基酸27-32的腺嘌呤核苷酸結合位點GXGXXG假定的蛋白質(zhì)二硫鍵交換位點CXXXL假定的銅位點HYY和HSH跨膜9超家族成員2(智人)(SEQ ID NO 15)1MSARLPVLSP PRffPRLLLLS LLLLGAVPGP RRSGAFYLPG61ELFVNRLDSV ESVLPYEYTA FDFCQASEGK RPSENLGQVL
PVILYVNKVG PYHNPQETYH VEKRILCHMQ LSSAQVEQLR THLDFHLEFH GDRIIFANVS RGDDGGFFPR TLEIHWL
PVILYVNKVG PYHNPQETYH VEKRILCHMQ LSSAQVEQLR THLDFHLEFH GDRIIFANVS RGDDGGFFPR TLEIHWL
LAPVNFCDEE KKSDECKAEI FGERIEPSPY KFTFNKKETC
121KLVCTKTYHT EKAEDKQKLE FLKKSMLLNY QHHWIVDNMP VTffCYDVEDG QRFCNPGFPI181GCYITDKGHA KDACVISSDF HERDTFYIFN HVDIKIYYHV VETGSMGARL VAAKLEPKSF241KHTHIDKPDC保守的CQ/CE位于氨基酸97-102的腺嘌呤核苷酸結合位點GXVXXG假定的蛋白質(zhì)二硫鍵交換位點CXXXC假定的銅位點YQH和HTH 跨膜9超家族成員3 (智人)(SEQ ID NO 16)1MRPLPGALGV AAAAALffLLL LLLPRTRADE HEHTYQDKEE VVLWMNTVGP YHNRQETYKY61FSLPFCVGSK KSISHYHETL GEALQGYELE FSGLDIKFKD DVMPATYCEI DLDKEKRDAF12IVYAIKNHYffY QMYIDDLPIff GIVGEADENG EDYYLffTYKK LEIGFNGNRI VDVNLTSEGK181VKLVPNTKIQ MSYSVKffKKS DVKFEDRFDK YLDPSFFQHR IHWFSIFNSF MMVIFLVGLV假定的銅位點HTY和HYH位于氨基酸81-86的腺嘌呤核苷酸結合位點GXAXXG保守的CQ/CE 和 CV假定的蛋白質(zhì)二硫鍵交換位點CXXXL跨膜9超家族成員4 (智人)(SEQ ID NO 17)IMATAMDffLPff SLLLFSLMCE TSAFYVPGVA PINFHQNDPV EIKAVKLTSS RTQLPYEYYS61LPFCQPSKIT YKAENLGEVL RGDRIVNTPF QVLMNSEKKC EVLCSQSNKP VTLTVEQSRL121VAERITEDYY VHLIADNLPV ATRLELYSNR DSDDKKKEKD VQFEHGYRLG FTDVNKIYLH181NHLSFILYYH REDMEEDQEH TYRVVRFEVI PQSIRLEDLK ADEKSSCTLP EGTNSSPQEI241DPTKENQLYF TY保守的CQ/CE腺嘌呤核苷酸結合位點GXVXXG (氨基酸77_82)假定的蛋白質(zhì)二硫鍵交換位點CXXXC假定的銅位點YVH和HGY實施例實施例1.可溶性arNOX蛋白跨膜9超家族(TM9SF)同工型4的克隆與表達pETllb 載體和 BL21 (DE3)感受態(tài)細胞購自 Novagen (Madison，WI)。帶有 TM9SF4 序列的質(zhì)粒是通過將可溶性TM9SF4編碼序列插入pETllb載體(在NheI和BamHI位點之間)而制備的。TM9SF4序列是通過PCR從全長cDNA擴增的。所使用的引物為5’_GATATAC ATATGGCTAGCATGGCGACGGCGATGGAT-3，(正向)(SEQ ID NO 11)和 5，-TTGTTAGCAGCCGGATCCT CAGTCTATCTTCACAGC-3，(反向)(SEQ ID NO :12)。然后將 PCR 產(chǎn)物用 NheI 和 BamHI 雙消化并連接至PETllB載體。連接產(chǎn)物(pETl lb_TM9SF4)的DNA序列是通過DNA測序確認的。然后將 pETllb-TM9SF4轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。挑取單克隆并接種到5ml LB+氨芐青霉素 (LB/AM)培養(yǎng)基中。將過夜培養(yǎng)物(Iml)稀釋到100ml LB/AMP培養(yǎng)基中(1 100稀釋)。 將所述細胞在37°C下劇烈振蕩Q50rpm)培養(yǎng)至0. 4-0. 6的0D600，然后加入IPTG (0. 5mM) 誘導。在37°C下振蕩Q50rpm)孵育5小時后收集培養(yǎng)物。約30kDa的可溶性TM9SF4的表達是通過SDS-PAGE與銀染色確認的。將轉(zhuǎn)化的細胞置于標準甘油儲液中保存在_80°C下。為表達TM9SF4，將來自在LB+Amp瓊脂上生長的分離菌落的少量細胞接種到 LB+Amp中并培養(yǎng)8小時，然后保存在4°C下過夜。然后將所述培養(yǎng)物以6，OOOrpm離心6分鐘。棄去上清液，然后將細胞沉淀重懸浮于細1 LB+amp培養(yǎng)基中并以1 100接種到LB/ amp培養(yǎng)基中并培養(yǎng)8小時。所述細胞培養(yǎng)基中不添加IPTG。通過以6，OOOg離心20分鐘從所述培養(yǎng)物000ml)中收集細胞。將細胞沉淀物重懸浮于 20mM Tris-Cl,pH 8. 0,0. 5mM PMSF(加入 0. 3ml 的 50mM PMSF、60yl 的 IM 6-氫基己酸和60 μ 1的0. 5Μ鹽酸苯甲脒，通過加入Tris緩沖液將終體積調(diào)節(jié)至30ml)中。通過將細胞通過20000psi的French Press 3次來破碎細胞。將所述提取物以 10，OOOrpm離心20分鐘。棄去懸浮液，將沉淀(包涵體)重懸浮于20ml Tris緩沖液中。 將anl 20%的Triton X_100加入每個試管中并將樣本體積用Tris緩沖液調(diào)節(jié)至40ml。將試管在室溫下振蕩孵育超過1小時，然后以10，OOOrpm離心20分鐘。棄去上清液，通過沉淀重懸浮于25ml Tris緩沖液中并離心而將沉淀洗滌2次，并用25ml純水洗滌一次。內(nèi)涵體的溶解按照以下方法進行。將沉淀重懸浮于20ml水和細10. 5M CAPS緩沖液(pH 11，50mM終濃度)中，加入40 μ 1的IM DTT (ImM終濃度)和0. 4ml 30%的月桂酰肌氨酸鈉(0.3%終濃度)。用水將樣本體積調(diào)節(jié)至40ml。將樣本在室溫下孵育17小時。重組截短arNOX的重折疊按照以下方法進行。溶解后，將所述樣本以10，OOOrpm 離心20分鐘，然后收集上清液。將所述上清液通過0.45 μ m硝酸纖維素濾膜過濾。將所得濾出液灌注到2個透析袋中(3500MWC0，平面寬度45mm且直徑四讓，SpectraPor)并用冷的透析緩沖液1 05mM Tris-HCl (pH 8. 5)、ImM巰乙胺、0. ImM胱胺、ImM 6-氨基己酸和0. 5mM 鹽酸苯甲脒)透析，換液3次；用冷的透析緩沖液2 (25mMTris-HCl (pH 8. 0)、ImM 6-氫基己酸和0. 5mM鹽酸苯甲脒)透析，換液1次；用透析緩沖液3(50mM Tris-HCl (pH 8. 0) UmM 6-氨基己酸和0. 5mM鹽酸苯甲脒)透析，換液1次。每次換液后透析至少17小時。透析后，加入PMSF至終濃度0. 5mM,并且將所述樣本以10，OOOrpm離心20分鐘。 收集上清液并通過使用Centriplus濃縮器(Amicon, MWCO 10, 000 ；4700rpm, 2800 X g)濃縮為約16ml。將重折疊的arNOX分為0. 5ml的等份試樣置于微量離心管中并保存在_80°C。實施例2.重組arNOX的表征超氧化物對高鐵細胞色素c的還原被采用作為一種超氧化物形成的標準測量方法(Mayo, L. A. and Curnutte, J. , 1990, Meth. Enzymo 1. 186 :567-575 ；Butler, J. et al., 1982，J. Biol. Chem. 257 :10747-10750)。當與超氧化物歧化酶抑制結合使用時，此方法一般被接受用于測量超氧化物產(chǎn)生。所述測定試劑由150 μ 1溶于PBSG緩沖液(8. 06g NaCl, 0. 2g KCl、0· 18g Na2HPO4^O. 13g CaCl2,0. Ig MgCl2U. 35g 葡萄糖溶解于 1000ml 去離子水， 調(diào)節(jié)至pH 7. 4，過濾并保存在4°C下)中的緩沖包覆材料構成。以在MOnm下的吸光度為參比，用在550nm下的吸光度的增加監(jiān)測超氧化物對高鐵細胞色素c的還原(Butler et al., 1982)。作為arNOX活性的特異性的另一對照，在所述測定快結束加入時60單位的超氧化物歧化酶(SOD)以確定比率回到基線。使用SLM Aminco DW-2000分光光度計在雙波長操作模式下確定比率。使用SLM Aminco Dff-2000 分光光度計(Milton Roy, Rochester, NY)在雙波長操作模式下每1. 5分鐘連續(xù)測量1分鐘來確定比率。45分鐘后，加入測試化合物并使所述反應再繼續(xù)進行45分鐘。45分鐘后，對還原的高鐵細胞色素c使用19. IcnT1的毫摩爾消光系數(shù)。對于用TM9SF4進行的實驗，下面提供所述測試化合物的結果(表4)，但是從圖7的結果中可得出結論所有arNOX同工型對下面給出的各種化合物均有相似的反應。除非另有指明，否則所述化合物的提取在水中進行。表4.重組 arNOX (TM9SF4)的性質(zhì)對similikalactone D具有抗性的26分鐘被超氧化物歧化酶抑制78%被arNOX抑制劑香薄荷(savory)抑制70%被arNOX抑制劑沒食子酸抑制80 %被3重抑制劑(脫落酸(Dormin) +五味子(Schizandra) +水楊苷)抑制70%本文引用的全部文獻均以不與本公開內(nèi)容抵觸的程度以引用的方式納入本文。本說明書中提到的全部專利和出版物都表明本發(fā)明所屬技術領域的技術人員的技術水平。本文引用的參考文獻以引用的方式全文納入本文中以說明在某些情況下到它們的提交日的本領域的狀態(tài)，并且意圖是如果需要的話，此信息可用于本文中，以排除(例如，放棄)屬于現(xiàn)有技術中的特定實施方案。例如，當要求保護化合物時，應理解為現(xiàn)有技術中已知的化合物(包括在本文公開的參考文獻中(尤其是在引用的專利文獻中)公開的化合物)不意圖被包括在權利要求中。當本文使用馬庫什組或其他分組時，本公開內(nèi)容意圖逐個地包括該組的所有個體成員和該組所有可能的組合及亞組合。除非另有指明，否則所述或所示例的成分的每種制劑或結合物都可用于本發(fā)明的實行。蛋白或編碼序列或基因的具體名稱旨在示例，因為已知本領域技術人員可對相同的基因或蛋白進行不同的命名。當本文例如以未具體指明蛋白的具體同工型的方式描述一個化合物時，該描述意圖單獨地或以任何組合的方式包括每種所述同工型。本領域技術人員會理解，除具體示例的那些之外的其他載體、啟動子、編碼方法、 起始材料、合成方法等不需借助過多的實驗即可用于實行本發(fā)明。本發(fā)明意圖包括任何這些方法、載體、啟動子、編碼序列、合成方法等的所有本領域已知的功能等價物。當本說明書中給出一個范圍，例如，溫度范圍、時間范圍、序列相關性范圍或組成范圍時，本公開內(nèi)容意圖包括所有中間范圍和子范圍，以及包括在此范圍內(nèi)的所有單個值。本文使用的“包含”是“包括”、“含有”、“特征在于”的同義詞，并且是包容性的或開放的，不排除另外的、未提到的元素或方法步驟。本文所用的“由...組成”不包括權利要求元素中未指出的任何元素、步驟或成分。本文使用的“基本上由...組成”不排除不實質(zhì)影響權利要求的基礎和新特性的材料或步驟。本文中對術語“包含”的任何記載，特別是在組合物的組分的描述中或在設備的元件的描述中，應被理解為涵蓋基本上由或由所述組分或元件組成的那些組合物和方法。在適當?shù)那闆r下，本文中舉例說明性地描述的本發(fā)明可在缺少本文未具體公開的任何一種或多種元素或任何一種或多種限制的條件下實行。所使用的術語和表達用于描述而不作為限制，這些術語和表達的使用并不意在排除所顯示和描述的特征或其部分的任何等價物，而是應認識到在本發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)可做多種修改。因此，應理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實施方案和可選特征而具體公開，然而本文公開的對概念的修改和變化可由業(yè)內(nèi)技術人員作出，且認為這些修改和變化處于所附權利要求的范圍之內(nèi)。如本文所述，本公開內(nèi)容的一個方面涉及分離的核酸以及使用分離的核酸的方法。在某些實施方案中，本文公開的核酸序列和其選定的區(qū)域可用作雜交探針或擴增引物。 這些核酸可用于例如對組織樣本的診斷評估。在某些實施方案中，這些探針和引物由寡核苷酸片段構成。所述片段應足夠長以提供與RNA或DNA組織樣本的特異性雜交。所述序列通常為10-20個核苷酸，但也可能更長。對于某些實施方案，優(yōu)選更長的序列，例如40、50、 100,500甚至全長?？紤]到了具有約 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、750、1000、1500、 2000,2500或更多個核苷酸的連續(xù)片段的核酸分子，所述片段來源于選自所公開核酸序列的序列。還考慮到了與上述序列互補的分子和與這些序列在高嚴格條件下結合的分子。這些探針可用于多種雜交實施方案，例如DNA印跡和RNA印跡。使用長度在14和100個核苷酸之間的雜交探針使得可形成既穩(wěn)定又具有選擇性的雙鏈分子。通常優(yōu)選具有與長度超過20個堿基的片段互補的序列的分子，目的是增加所述雜交分子的穩(wěn)定性和選擇性，從而提高所獲得的具體雜交分子的質(zhì)量和等級。技術人員通常優(yōu)選設計具有20-30個核苷酸的片段或在需要時甚至更長片段的核酸分子。這些片段可容易地通過以下方法制備例如借助化學方法直接合成所述片段或者將選定序列引入用于重組生產(chǎn)的重組載體中。因此，可以使用本文所述的核苷酸序列，因其具有以下能力與基因或RNA的互補片段選擇性地形成雙鏈分子或者提供用于從組織擴增DNA或RNA的引物。根據(jù)所預想的應用，技術人員可能需要使用不同的雜交條件來實現(xiàn)探針對靶標序列的不同程度的選擇性。對于需要高度選擇性的應用，技術人員通常采用相對嚴格的條件來形成雜交分子，例如，技術人員會選擇相對較低的鹽和/或高溫條件，例如由在約50°C至約70°C的溫度下約0. 02M至約0. IOM Nacl提供的條件。這種高嚴格條件幾乎不會允許所述探針與所述模板或靶標鏈之間的錯配(如果有的話)，并且會特別適用于分離特定基因或檢測特定mRNA 轉(zhuǎn)錄物。通常會理解通過加入更大量的甲酰胺可使條件更嚴格。對于某些應用，需要較低的嚴格條件。在這些條件下，甚至在探針和靶標鏈的序列不是完全互補而是在一個或多個位置錯配時也會發(fā)生雜交。通過增加鹽的濃度和降低溫度可導致條件的嚴格程度下降。例如，在約37至約55°C的溫度下約0. 1-0. 25M NaCl可提供中等嚴格條件，而在20至約55°C的溫度下約0. 15M至約0.9M鹽可提供低嚴格條件。因此， 雜交條件可被容易地操作，并因此一般是可根據(jù)所需結果進行選擇的方法。在另外的實施方案中，雜交可在例如以下條件下實現(xiàn)50mMTris-HCl(pH 8.3)， 75mM KCl,3mM MgCl2, IOmM 二硫蘇糖醇，在約20°C的溫度下。所使用的其他雜交條件可以包括約 IOmM Tris-HCl (pH8. 3), 50mM KC1,1. 5μΜ MgCl2，在約 40 至約 72°C 的溫度下。在某些實施方案中，有利地使用本文所述的核酸序列和合適的工具(例如標記物)用于確定雜交。多種能夠被檢測的合適指示工具為本領域中所知，包括熒光、放射性、 酶促或其他配體(如抗生物素蛋白/生物素)。在優(yōu)選的實施方案中，技術人員可能需要使用熒光標記物或酶標簽(例如脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶)而不是放射性或其他對環(huán)境有害的試劑。對于酶標簽，可用于提供一種人眼可見或分光光度法可檢測的檢測手段以鑒別與含互補核酸樣本的特異性雜交的量熱指示底物是已知的。通常，可預想到本文所述的雜交探針可用作溶液雜交中(例如在PCR中)的試劑， 以檢測相應基因的表達，也可用在采用固相的實施方案中。在涉及固相的實施方案中，測試 DNA(或RNA)被吸附于或者固定于選定的基質(zhì)或表面上。然后使此固定化的、單鏈的核酸與選定的探針在所需的條件下進行雜交。所選擇的條件取決于基于所需的具體標準的具體環(huán)境(取決于例如G+C含量、靶標核酸的類型、核酸來源、雜交探針的大小等)。在洗滌所述雜交表面以除去非特異性結合的探針分子后，借助所述標記物檢測或定量雜交。本文公開的方法不限于所公開的具體探針，并具體地意圖至少涵蓋可與所公開的序列雜交的核酸序列，或者這些序列的功能性序列類似物。例如，一部分序列可用于鑒別結構相關的基因或者作為所述基因來源的全長基因組或cDNA克隆。本領域技術人員清楚地知曉用于產(chǎn)生可用作上述探針的靶標的cDNA和基因組文庫的方法(Sambrook et al., 1989)。對于其中將本發(fā)明的核酸片段整合到載體(例如本文公開的質(zhì)粒)中的應用，這些片段可與其他DNA序列(例如啟動子、多腺苷酸化信號、限制性酶切位點、多克隆位點、其他編碼片段)等結合，從而使得其全長可有相當大程度的變化。應考慮到，可使用幾乎任何長度的核酸片段，然而總長度優(yōu)選地限于容易制備和可用在預計的重組DNA方案中?？蓪⒕幋a特定基因的DNA片段引入重組宿主細胞中并用于表達特定的結構蛋白或調(diào)節(jié)蛋白?；蛘?，通過應用遺傳工程技術，可使用選定基因的一部分或衍生物。可分離含有調(diào)控區(qū)域(例如啟動子區(qū)域)的上游區(qū)域并隨后在與目的編碼序列可操作地連接后用于表達所述選定的基因。在會產(chǎn)生表達產(chǎn)物的情況下，核酸序列可能變化而同時保持編碼相同產(chǎn)物的能力。參照提供同義編碼序列的密碼子表，本領域技術人員可設計編碼已知氨基酸序列的多肽產(chǎn)物的任意核酸。質(zhì)粒制備和復制方式為本領域中所知。參見例如美國專利No. 4，273，875和 4，567，146。本發(fā)明的實施方案包括使用本領域公知的條件和試劑擴增靶標遺傳物質(zhì)的至少一部分。本文的某些實施方案包括用于擴增微生物遺傳物質(zhì)的至少一部分的任何方法 (例如聚合酶鏈式反應(PCR)、實時PCR(RT-PCR)、NASBA(基于核酸序列的擴增))。在一個實施方案中，實時PCR(RT-PCR)可用于擴增受試者遺傳物質(zhì)的至少一部分，同時擴增用于確認受試者的遺傳物質(zhì)擴增結果的內(nèi)對照質(zhì)粒。本文的范圍包括用于擴增微生物遺傳物質(zhì)的至少一部分的任何方法(例如，聚合酶鏈式反應即PCR，和基于核酸序列的擴增即NASBA)，作為一個實例，本公開內(nèi)容涉及關于 RT-PCR技術的實施方案。通常，為了驗證PCR技術的工作條件，在樣本管的平行反應中進行陽性和陰性外部對照以測試反應條件，例如使用對照核酸序列進行擴增。在某些實施方案中，可使用內(nèi)對照來確定RT-PCR反應的條件是否在特定試管中對于特定靶標樣本起作用?；蛘?，在某些實施方案中，可使用內(nèi)對照來確定RT-PCR反應的條件是否在特定時間和特定試管中對于特定靶標樣本起作用。通過知曉受試哺乳動物和內(nèi)對照的遺傳物質(zhì)的核苷酸序列，可設計特定引物序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于擴增靶標哺乳動物的一部分遺傳物質(zhì)的引物對的至少一個引物與用于擴增內(nèi)對照的一部分遺傳物質(zhì)(例如內(nèi)對照質(zhì)粒或其他目的序列)的的引物對的一個引物相同。在一個實施方案中，引物長約但不限于10-50個寡核苷酸，或長約 15-40個寡核苷酸，或長約20-30個寡核苷酸。合適的引物序列可容易地由本領域技術人員合成或容易地從供應商(例如BRL(New England Biolabs)等)獲得。其他核酸序列擴增 (例如PCR)所必需的試劑(例如DNA聚合酶和核苷酸)也是市售的。PCR擴增產(chǎn)物的存在與否可通過本領域技術人員所知的任何技術進行檢測。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法包括使用與所述微生物的具體遺傳物質(zhì)雜交的探針來檢測PCR擴增產(chǎn)物的存在與否。通過設計與所述微生物遺傳物質(zhì)的不同部分雜交的PCR引物序列和探針核苷酸序列，技術人員可增加本文所公開方法的精確性和/或靈敏性。盡管有多種可用的經(jīng)標記的探針(例如放射性標記或熒光標記的探針)，然而在一個具體實施方案中，方法使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)標記的探針作為內(nèi)雜交探針。在一個具體實施方案中，PCR反應混合物中包括內(nèi)雜交探針從而使得可隨著PCR擴增產(chǎn)物的形成而進行產(chǎn)物檢測，因此減少了 PCR后處理時間。Roche Lightcycler PCR裝置(美國專利No. 6，174，670)或其他實時PCR裝置可用于此實施方案，例如參見美國專利 No.6，814，934。在某些情況下，實時PCR擴增和檢測顯著減少了總測定時間。因此，本發(fā)明方法提供快速和/或高度精確的結果，并且這些結果為內(nèi)對照所證實。在某些實施方案中，可通過使用載體將DNA片段引入目的細胞中，所述載體是復制子，其中連接有另一多核苷酸片段從而使得所連接片段的復制和/或表達。載體可具有一個或多個限制性內(nèi)切酶識別位點，在所述位點處其DNA序列能夠以可確定的方式被切開而不喪失所述載體基本生物學功能。載體還可提供引物位點(例如用于PCR)、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始和/或調(diào)控位點、重組信號、復制子、可選擇的標記物等。載體的實例包括質(zhì)粒、 噬菌體、粘粒、噬菌粒、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(HAC)、病毒、基于病毒的載體(例如腺病毒載體、慢病毒載體)以及能夠在體外或在宿主細胞中復制或被復制或者能夠?qū)⑺璧腄NA片段運輸?shù)剿拗骷毎麅?nèi)所需位置的其他DNA序列。所述載體可為例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。反轉(zhuǎn)錄病毒載體可為可復制的或復制缺陷的。在后一種情況下，病毒增殖通常僅發(fā)生在補足宿主細胞中。多核苷酸可連接于含有可選擇標記物的用于在宿主中增殖的載體。如果所述載體是病毒，那么可使用合適的包裝細胞系將其在體外包裝，然后轉(zhuǎn)導到宿主細胞中。多核苷酸插入片段可以可操作地連接于合適的啟動子，例如但不限于噬菌體入PL 啟動子，大腸桿菌(E. c0li)lac、trp、ph0A和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及反轉(zhuǎn)錄LTR啟動子。其他合適的啟動子為本領域技術人員所知。表達構建體還含有轉(zhuǎn)錄起始位點、終止位點，以及在轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中含有用于翻譯的核糖體結合位點。由所述構建體表達的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選地包括位于起始處的翻譯起始密碼子和大致位于待翻譯的多肽末尾處的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。如所指出的，所述表達載體可包括至少一種可選擇標記物。示例性標記物可包括但不限于二氫葉酸還原酶、G418、谷氨酰胺合酶，或者用于真核細胞培養(yǎng)的新霉素抗性基因，以及用于在大腸桿菌或其他細菌中培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。合適宿主細胞的代表性實例包括但不限于細菌細胞，例如大腸桿菌、鏈霉菌(Streptomyce) 和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)細胞；真菌細胞，例如酵母細胞(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或畢赤酵母(Pichia pastoris) (ATCC登錄號:201178))； 昆蟲細胞，例如果蠅S2 (Deosophila S2)和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda) Sf9細胞；動物細胞，例如CH0、C0S、293和黑色素瘤(Bowes melanoma)細胞；以及植物細胞。用于上述宿主細胞的細胞生長和基因表達的合適培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)化技術以及條件為本領域中所知。在某些實施方案中，用于細菌的載體包括但不限于，可從QIAGEN，Inc.獲得的 pQE70、pQE60 禾口 pQE-9 ；可從 Stratagene Cloning Systems, Inc.獲得的 pBluescript 載 #、Phagescript i^#、pNH8A> pNH16a> pNH18A> pNH46A ； IiLR^i JA Pharmacia Biotech, Inc.獲得的 ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的真核載體主要有可從 Stratagene 獲得的 pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl 和 pSG ；以及可從 Pharmacia 獲得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。用于酵母系統(tǒng)的優(yōu)選表達載體包括但不限于pYES2、ρYDU pTEFl/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3. 5、pHIL_D2、pHIL-SU pPIC3. 5K、pPIC9K 和 PA0815(均可從 hvitrogen，Carlbad, Calif.獲得)。其他合適的載體易于為本領域所獲得。用于構建所述表達載體的重組DNA技術是本領域技術人員已知的并常用的那些。 使用標準技術進行克隆、DNA分離、擴增和純化；涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶的酶促反應是根據(jù)廠商建議進行的。這些和其他技術通常是根據(jù)Sambrook et al. (1989) 進行的。在某些實施方案中，分離的宿主細胞可含有本文所述的載體構建體，并且/或者分離的宿主細胞可含有使用本領域已知的技術和序列與一個或多個異源控制區(qū)域(例如啟動子和/或增強子)可操作地連接的本文核苷酸序列。所述宿主細胞可為高等真核細胞例如哺乳動物細胞(例如人源細胞)或低等真核細胞例如酵母細胞，或者所述宿主細胞可為原核細胞例如細菌細胞?？蛇x擇能夠調(diào)節(jié)所述插入基因序列表達，或以所需的特定形式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主株。某些啟動子的表達可在某些誘導物存在的情況下提高；因此可控制通過遺傳工程得到的多肽的表達。此外，不同的宿主細胞具有用于蛋白的翻譯以及翻譯后加工和修飾(例如磷酸化、剪切)的特征性和特異性機制?？蛇x擇合適的細胞系以確保對所表達的外源蛋白進行所需的修飾和加工。本文考慮到了某些實施方案還涵蓋脊椎動物來源特別是哺乳動物來源的原代、繼代和永生化宿主細胞，所述細胞已通過遺傳工程來除去或取代了內(nèi)源遺傳物質(zhì)(例如所述編碼序列)并且/或者包含與本發(fā)明多核苷酸可操作地連接并且活化、改變和/或擴增內(nèi)源多核苷酸的遺傳物質(zhì)(例如異源多核苷酸序列)。例如，本領域已知的技術可用于經(jīng)同源重組可操作地連接異源控制區(qū)域(例如啟動子和/或增強子)和內(nèi)源多核苷酸序列(參見例如美國專利 No. 5，641，670 ；WO 96/29411 ；WO 94/12650 ；Roller et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989)；和 Zijlstraet al. , Nature 342:435-438(1989))。用作擴增模板的核酸可根據(jù)標準方法從生物樣本所含的細胞中分離(Sambrook et al.，1989)。所述核酸可為基因組DNA或者部分或全細胞RNA。當使用RNA時，可能需要將所述RNA轉(zhuǎn)化為互補cDNA。在一個實施方案中，所述RNA是全細胞RNA并直接用作擴增模板。使與對應于特異性標記物的核酸選擇性雜交的引物對與分離的核酸在允許選擇性雜交的條件下接觸。一旦雜交，就使所述核酸引物復合物與一種或多種有助于模板依賴的核酸合成的酶接觸。進行多輪擴增(也稱為“循環(huán)”)直至產(chǎn)生足夠量的擴增產(chǎn)物。然后，檢測所述擴增產(chǎn)物。在某些應用中，此檢測可通過可視方式進行。或者，所述檢測可包括通過化學發(fā)光、整合放射標記或熒光標記的放射性顯像或者甚至通過使用電或熱脈沖信號的系統(tǒng)(例如AfTymax)間接鑒別所述產(chǎn)物。本文定義的術語引物意圖涵蓋能夠在模板依賴的過程中起動新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是長度為10-20個堿基對的寡核苷酸，但也可使用更長的序列。引物可以以雙鏈或單鏈的形式提供，但是優(yōu)選單鏈形式。多種模板依賴的過程可用于擴增在給定模板樣本中存在的標記物序列。最著名的擴增方法之一是聚合酶鏈式反應(稱為PCR)，其在美國專利No. 4，683，195,4, 683，202和 4，800，159 以及 Innis et al.，1990 中有詳細描述?？蛇M行反轉(zhuǎn)錄PCR擴增方法以確定擴增的mRNA的量。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法廣為人知并記載于Sambrook et al.，1989中。反轉(zhuǎn)錄的其他方法使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。這些方法記載于WO 90/07641中。聚合酶鏈式反應方法在本領域中廣為人知。本領域還知曉除PCR以外的其他擴增方法例如LCR (連接酶鏈式反應)，該方法在歐洲專利公開 No. 320308中被公開。一種等溫擴增方法——其中使用限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶來實現(xiàn)對在限制位點的一條鏈中含有核苷酸5' -[α-硫代]-三磷酸的靶標分子的擴增——也可用于擴增本文的核酸。鏈置換擴增(SDA)是進行核酸的等溫擴增的另一種方法，該方法包括多輪鏈置換和合成，即切口平移(nick translation)。一種稱為修復鏈式反應(Impair Chain Reaction,RCR)的類似方法包括在整個擴增靶標區(qū)域上退火數(shù)個探針，然后進行修復反應， 在所述反應中僅存在4種堿基中的兩種。另外兩種堿基可作為易于檢測的生物素化的衍生物加入。SDA中使用類似的方法。靶標特異性序列還可使用循環(huán)探針反應(cyclic probe reaction, CPR)檢測。在CPR中，具有非特異性DNA的3 ‘和5 ‘序列以及特異性RNA中間序列的探針，與樣品中存在的DNA雜交。雜交后，用RNase H處理所述反應，所述探針的產(chǎn)物被確定為在消化后釋放的不同產(chǎn)物。初始模板與另一循環(huán)探針退火并重復所述反應。本領域中已知的其他擴增方法也可用于本文所述的方法。擴增后，可能需要將擴增產(chǎn)物與模板和過量的引物分離，目的是確定是否已發(fā)生特異性擴增。擴增產(chǎn)物可用標準方法通過瓊脂糖、瓊脂糖-丙烯酰胺或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。參見 Sambrook et al. ,1989?；蛘撸墒褂蒙V技術來有效分離擴增產(chǎn)物或其他分子?？墒褂枚喾N色譜方法吸收色譜、分配色譜、離子交換色譜和分子篩色譜，以及本領域中所知的使用它們的許多專門化技術，包括柱色譜、紙色譜、薄層色譜和氣相色譜。擴增產(chǎn)物可被可視化，目的是證實所述標記物序列的擴增。一種典型的可視化方法包括用溴化乙錠對凝膠進行染色并在UV線下可視化?；蛘撸绻鰯U增產(chǎn)物本身被經(jīng)放射性標記或熒光標記的核苷酸所標記，那么可將所述擴增產(chǎn)物在分離后暴露于χ射線膠片或者在合適的激發(fā)光譜下可視化。
可視化可間接實現(xiàn)。在分離擴增產(chǎn)物后，使被標記的核酸探針與所擴增的標記物序列接觸。所述探針優(yōu)選地與發(fā)色團綴合，但也可被放射性標記。在另一實施方案中，使所述探針與結合伴侶(binding partner)(例如抗體或生物素)綴合，其中所述結合對的另一成員帶有可檢測基團。通常，用于在構建本文可使用的載體中克隆DNA序列的原核生物可包括但不限于任何革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌菌株K12或菌株W3110?？墒褂玫钠渌⑸镏臧ㄣ~綠假單胞菌(P. aeruginosa)菌株PAOl和大腸桿菌B菌株。這些實例是說明性的而非限制性的。其他用于構建文庫的細菌宿主的實例包括但不限于埃希氏菌屬(Escherichia)、 假單胞菌屬O^seudomonus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、粘質(zhì)沙雷氏菌屬(Serratia marcescens)禾口桿菌屬(Bacillus)。通常，含有來源于與所述宿主細胞相容的物種的啟動子和控制序列的質(zhì)粒載體被用于這些宿主。所述載體通常帶有復制位點以及能夠在轉(zhuǎn)化細胞中提供表型選擇的一個或多個標記物序列。例如，本發(fā)明中可使用可用于許多革蘭氏陰性細菌菌株的PBBRl復制子區(qū)域或者用于許多革蘭氏陰性宿主細菌的任何其他復制子區(qū)域。適合用于原核宿主的啟動子示例性地包括β -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)。在其他實施方案中，用于原核宿主細胞的表達載體還可含有對編碼特定mRNA序列的特定基因的有效翻譯所必需的序列，其中所述特定mRNA序列可由任何合適的啟動子表達。這使得必須將啟動子整合到與編碼所述mRNA的DNA可操作地連接的核糖體結合位點或夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno，S. D.)序列之前。含有所需編碼和控制序列的合適載體的構建采用標準連接技術。將分離的質(zhì)?；?DNA片段切斷、裁剪并以所需的形式重新連接以形成所需的質(zhì)粒。對于確認所構建的質(zhì)粒中正確序列的分析，使用所述連接混合物以轉(zhuǎn)化細菌菌株例如大腸桿菌K12，并且在合適的情況下通過抗生素抗性(如四環(huán)素抗性)選出成功的轉(zhuǎn)化體。制備來自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，通過限制性酶切進行分析和/或進行測序。分離的宿主細胞可用表達載體轉(zhuǎn)化并在適于誘導啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增基因的改良常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件(例如溫度、PH等)是之前用于所述選擇用于表達的宿主細胞的條件，并為本領域普通技術人員所明了。轉(zhuǎn)化是指使宿主細胞獲得表達載體，不管實際上是否表達任何編碼序列。用于將目的DNA分子的引入分離宿主細胞的多種方法為本領域中所知，例如Ca鹽和電穿孔法。通常在所述宿主細胞內(nèi)出現(xiàn)任何所述載體發(fā)生作用的跡象時可確認實現(xiàn)了成功的轉(zhuǎn)化。DNA消化是指用僅作用于DNA中特定序列的限制性酶催化切割所述DNA。本文使用的多種限制性酶均有市售，其反應條件、輔因子和其他要求如本領域中所知的使用。從限制性消化物中回收或分離給定DNA片段是指在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上通過電泳對所述消化物進行分離，通過與具有已知分子量的DNA片段標記的遷移率比較來鑒別所述目的片段，移出含有所需片段的凝膠塊，并將所述凝膠與DNA分離。此方法是公知的(Lawn，R. et al.,Nucleic Acids Res. 9 :61036114[1981]和Goeddel，D. et al. ,Nucleic Acids Res. 8 :4057[1980])。去磷酸化是指通過用細菌堿性磷酸酶(BAP)處理來除去末端5，磷酸。此過程防止 DNA片段的兩個限制性切割末端“環(huán)化”或形成閉合的環(huán)，所述“環(huán)化”或形成閉合的環(huán)會妨礙另一DNA片段在所述限制性位點處的插入。去磷酸化的方法和試劑是常規(guī)的(Maniatis， T.et al. ,Molecular Cloning，133-134，Cold Spring Harbor, [1982])。使用 BAP 的反應是在50mM Tris中于68°C下進行，以抑制酶制劑中可能存在的任何核酸外切酶的活性。反應進行1小時。所述反應后，對所述DNA片段進行凝膠純化。連接是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T. et al.， 1982, at 146)。除非另外提供，否則連接可以10單位T4DNA連接酶(〃 ligase" )/0. 5yg 約等摩爾量的要連接的DNA片段使用已知的緩沖液和條件進行。補平或平端化是指使限制性酶切割的核酸的粘性末端中的單鏈末端轉(zhuǎn)變成雙鏈的過程。這消除了粘性末端并形成平端。此方法是一種用于使限制性切割末端轉(zhuǎn)變?yōu)榕c任何平端切割的限制性內(nèi)切酶或其他填補的粘性末端相容的末端的通用工具，所述限制性切割末端可能與由一種或幾種其他限制性酶形成的末端有粘性。在一個實施方案中，平端化是通過以下方式實現(xiàn)的在存在8單位DNA聚合酶I的Klenow片段和各自均為250 μ M的4 種脫氧三磷酸核苷酸的情況下，于約37°C下在IOmMMgCl2、lmM二硫蘇糖醇、50mM NaClUOmM Tris (pH 7. 5)緩沖液中孵育約2_20 μ g的靶標DNA。此孵育通常是在30分鐘后用苯酚和氯仿抽提并用乙醇沉淀來終止。如本文可互換使用的，術語“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括RNA或 DNA(單鏈或雙鏈，編碼、互補或反義)或者單鏈或雙鏈形式的超過一個核苷酸的RNA/DNA 雜合序列(盡管每種上述物質(zhì)均可特別指出)。本文使用的術語“核苷酸”用作形容詞來描述包含任意長度的單鏈或雙鏈形式的RNA、DNA或RNA/DNA雜合序列的分子。更精確地， 表述“核苷酸序列”涵蓋核材料自身，并因此不限于生物化學上表征具體DNA或RNA分子的序列信息(例如，在4種堿基字母中選擇的字母的序列)。本文使用的術語“核苷酸”還用作名詞來指代單種核苷酸或多種核苷酸，表示一個分子或更大核酸分子中的單個單元， 包含嘌呤或嘧啶、核糖或脫氧核糖糖基團以及磷酸基團，對于寡核苷酸或多核苷酸內(nèi)的核苷酸的情況還包含磷酸二酯鍵。本文使用的術語“核苷酸”還涵蓋包含至少一種修飾的 “經(jīng)修飾的核苷酸”，所述修飾例如(a)替代性連接基團、(b)嘌呤的類似形式、(c)嘧啶的類似形式或(d)糖的類似形式。對于連接基團、嘌呤、嘧啶和糖的類似形式的實例，參見例如TO 95/04064，其公開內(nèi)容以引用的方式全文納入本文。本發(fā)明的優(yōu)選修飾包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5_(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基鳥苷、肌苷、Ν6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、 2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基鳥苷、5’ -甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-Ν6-異戊烯基腺嘌呤、尿 11 密 F 乙酸(v) ybutoxosine (uracil-5-oxyacetic acid (ν) ybutoxosine)、{段尿 U密 F 、 鳥苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6_ 二氨基嘌呤。本文的多核苷酸序列可通過任何已知方法制備，包括合成、 重組、離體產(chǎn)生或其組合，以及利用本領域中已知的任何純化方法。亞甲基甲基亞氨基連接的寡核苷酸以及混合的主鏈化合物可如美國專利No. 5，378，825 ；5, 386，023 ；5, 489，677 ；5，602, 240 和 5，610, 289 所述制備。甲縮酸(formacetal)和硫甲縮酸(thioformacetal) 連接的寡核苷酸可如美國專利No. 5，264, 562和5，264, 564所述制備。環(huán)氧乙烷連接的寡核苷酸可如美國專利No. 5，223，618所述制備。亞膦酸寡核苷酸可如美國專利No. 5，508，270 所述制備。烷基膦酸寡核苷酸可如美國專利No. 4，469，863所述制備。3'-脫氧_3'-亞甲基膦酸寡核苷酸可如美國專利No. 5，610，289或5，625，050所述制備。亞磷酰胺寡核苷酸可如美國專利No. 5，256，775或5，366，878所述制備。烷基硫代膦酸酯寡核苷酸可如WO 94/17093和WO 94/0M99所述制備。3'-脫氧_3'-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸可如美國專利No. 5，476，925所述制備。磷酸三酯寡核苷酸可如美國專利No. 5，023, 243所述制備。 Borano磷酸寡核苷酸可如美國專利No. 5，130, 302和5，177，198所述制備。本文使用的術語“上游”是指從具體參照點開始接近多核苷酸的5’末端的位置。本文互換使用的術語“堿基配對的”和“華生-克里克堿基配對的(Watson&Crick base paired) ”是指憑借序列同一性可相互以氫鍵鍵合的核苷酸，鍵合的方式類似于在雙鏈DNA中發(fā)現(xiàn)的方式，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶殘基通過兩個氫鍵與腺嘌呤殘基連接，而胞嘧啶與鳥嘌呤殘基通過三個氫鍵連接。本文使用的術語“互補的”或“其互補體”是指能夠與另一指定的多核苷酸在整個互補區(qū)域形成華生-克里克堿基對的多核苷酸的序列。出于本發(fā)明的目的，當?shù)谝欢嗪塑账岬拿總€堿基都與其互補堿基配對時，就認為第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。互補堿基通常為A與T (或A與U)，或者C與G。本文使用的“互補體”與“互補多核苷酸”、“互補核酸”和“互補核苷酸序列”同義。這些術語用于多核苷酸對，所述多核苷酸對僅基于其序列而非兩個多核苷酸會實際結合的任何具體條件組。除非另有指明，所有互補的多核苷酸均在所考慮的多核苷酸的整個長度上完全互補。本文可互換使用的術語“多肽”和“蛋白”是指氨基酸的多聚體而不管所述多聚體的長度；因此，肽、寡肽和蛋白均包括在多肽的定義內(nèi)。此術語也不指定或排除對本文多肽的化學或表達后修飾，盡管作為具體的實施方案可包括/排除這些多肽的化學或表達后修飾。因此，術語多肽清楚地涵蓋，例如，包括糖基團、乙酰基團、磷酸基團、脂質(zhì)基團等的共價結合的對多肽的修飾。此外，可將具有這些修飾的多肽規(guī)定為本發(fā)明包括或排除的個別種類。天然或其他化學修飾(例如上面實例中列出的那些修飾)可在多肽中的任意位置發(fā)生，包括肽主鏈、氨基酸側鏈以及氨基或羧基末端。應理解相同類型的修飾可以在給定多肽的數(shù)個位點以相同或不同的程度存在。而且，給定多肽可含有許多類型的修飾。多肽可分枝，例如由于泛素化；并且可為有或沒有分枝的環(huán)狀。如本領域所知，修飾包括乙?；??；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價結合、血紅素基團的共價結合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價結合、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價結合、磷脂酰肌醇的共價結合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵的形成、去甲基化、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；⒀趸?、聚乙二醇化、蛋白水解加工、 磷酸化、異戊二烯化、消旋化、硒化、硫酸化、轉(zhuǎn)運RNA介導的氨基酸向蛋白的加合如精氨酰化，以及泛素化。該定義還包括含有一種或多種氨基酸類似物(包括例如非天然存在的氨基酸、僅在非相關生物系統(tǒng)中天然存在的氨基酸、來自哺乳動物系統(tǒng)的修飾氨基酸等)的多肽，具有取代鍵的多肽以及本領域所知的天然存在和非天然存在的其他修飾。本文可互換使用的術語“重組多核苷酸”和“多核苷酸構建體”是指已被人為設計過并包含至少兩種核苷酸序列的直鏈或環(huán)狀的、純化或分離的多核苷酸，所述至少兩種核苷酸序列在其初始天然環(huán)境中不以連續(xù)的核苷酸序列的形式存在。具體地，這些術語是指所述多核苷酸或cDNA與在其天然環(huán)境中不與其鄰接的“主鏈”核酸鄰接。本發(fā)明的主鏈分子包括例如以下的核酸表達載體、自復制核酸、病毒、集成核酸(integrating nucleic acid)以及用于維持或操作目的核酸插入片段的其他載體或核酸。本文中所用的術語“可操作地連接”是指多核苷酸元件以功能性關系的連接。與調(diào)控序列(例如啟動子)“可操作地連接”的序列是指所述調(diào)控元件相對于所述核酸處于正確的位置和方向以控制RNA聚合酶起始和目的核酸的表達。例如，如果啟動子或增強子影響一段編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么所述啟動子或增強子就與所述編碼序列可操作地連接。在一個實施方案中，所述多核苷酸為至少15、30、50、100、125、500或1000個連續(xù)的核苷酸。在另一個實施方案中，所述多核苷酸的長度小于或等于3001Λ、2001Λ、1001Λ、 50kb、10kb、7. 5kb,5kb,2. 5kb,2kbU. 5kb或Ikb0在另一實施方案中，如本文所公開，本文的多核苷酸包含所述編碼序列的一部分，但不包含任何內(nèi)含子的全部或一部分。在另一實施方案中，包含編碼序列的多核苷酸不包含基因組側翼基因的編碼序列(即基因組中目的基因的5'或3')。在其他實施方案中，所述多核苷酸不包含多于1000、500、250、100、75、 50、25、20、15、10、5、4、3、2或1個天然存在的基因組側翼基因的編碼序列。用于檢測能夠與可檢測探針雜交的核酸的存在情況的方法包括廣為人知的技術， 例如DNA印跡、RNA印跡、斑點印跡、菌落雜交和噬菌斑雜交。在某些應用中，可將能夠與標記的探針雜交的核酸克隆到載體(例如表達載體、測序載體或體外轉(zhuǎn)錄載體)中以幫助所述樣本中所述雜交核酸的表征和表達。例如，所述技術可用于分離和克隆基因組文庫或 cDNA文庫中能夠與本文所述可檢測探針雜交的序列。某些實施方案可包括將標記納入探針、引物和/或靶標核酸中以有助于通過檢測裝置對其進行檢測?？墒褂萌舾煞N不同的標記，例如Raman標簽、熒光團、發(fā)色團、放射性同位素、酶標簽、抗體、化學發(fā)光標記、電發(fā)光標記、親和標記等。本領域技術人員會認識到這些和本文未提到的其他標記基團可用于所公開的方法。所使用的熒光標記可包括但不限于Alexa 350, Alexa 430、AMCA (7-氨基_4_甲基香豆素-3-乙酸)、BODIPY (5，7- 二甲基-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-s_吲丹烯-3-丙酸)630/650、BODIPY 650/665、B0DIPY_FL(熒光素)、B0DIPY-R6G (6-羧基羅丹明)、 B0DIPY-TMR(四甲基羅丹明)、B0DIPY-TRX (德克薩斯紅 _x) ^Cascade Blue,Cy2 (花青素)、 〇73丄75，6呼六1(5-羧基熒光素)、熒光素、6-( ^' V -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基焚光素)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、 Rhodamine Green、Rhodamine Red、ROX(6-羧基-X-羅丹明)、TAMRA(N，N, N'，N'-四甲基-6-羧基羅丹明)、四甲基羅丹明和德克薩斯紅。熒光或發(fā)光標記可從標準商業(yè)來源例如 Molecular Probes (Eugene, OR)獲得。酶標記的實例包括脲酶、堿性磷酸酶或過氧化物酶。可將比色指示劑底物與所述酶一起使用以提供一種對人眼可見或分光光度法可檢測的檢測手段?？赡苁褂玫姆派湫酝凰匕?14C、3H、125I、32P 和 35S0在某些實施方案中，使用表達載體來制備用于篩選一種或多種TM9SF arNOX同工型的抑制劑的材料。表達可能需要在所述載體中提供合適的信號，所述載體包括多種調(diào)控元件例如驅(qū)動目的基因在宿主細胞中表達的病毒或哺乳動物來源的增強子/啟動子。可將雙向、宿主因子依賴的轉(zhuǎn)錄終止子元件整合到所述表達載體中，并可使用本領域所知的標準技術確定轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA穩(wěn)定性或蛋白穩(wěn)定性的水平。所述雙向、宿主因子依賴的轉(zhuǎn)錄終止子序列的作用可通過與缺少所述雙向、宿主因于依賴的轉(zhuǎn)錄終止子序列的對照表達載體進行比較或與含有具有已知作用的雙向、宿主因子依賴的轉(zhuǎn)錄終止子序列的表達載體進行比較而確定。在某些實施方案中，構建了含有編碼基因產(chǎn)物的核酸的表達構建體或表達載體或任意類型的遺傳構建體(其中部分或全部所述核酸編碼序列能夠被轉(zhuǎn)錄)，從而使得所述目的編碼序列可操作地連接于啟動子并且在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下表達?！皢幼印笔侵敢l(fā)基因的特異性轉(zhuǎn)錄所必需的由細胞合成機制或誘導的合成機制識別的DNA序列。短語“在轉(zhuǎn)錄控制下”可指所述啟動子相對于所述核酸處于正確的位置和方向以在所述分離的目的宿主細胞中控制RNA聚合酶起始和所述基因的表達。當使用eDNA插入片段時，所述片段通?？砂ǘ嘞佘账峄盘栆詫崿F(xiàn)所述基因轉(zhuǎn)錄物的正確多腺苷酸化。終止子也作為所述表達構建體的元件被考慮到。這些元件可用于增強信使水平并且最小化從所述構建體到其他序列的連讀(read through) 0在某些實施方案中，所述表達構建體或載體含有報告基因，可檢測或測量所述報告基因的活性來確定雙向、宿主因子依賴的轉(zhuǎn)錄終止子元件或其他元件的作用。便利地， 所述報告基因產(chǎn)生易于測定的產(chǎn)物，例如帶有顏色的產(chǎn)物、熒光產(chǎn)物或發(fā)光產(chǎn)物。報告基因有許多可用實例，例如編碼GFP (綠色熒光蛋白)、CAT (氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、熒光素酶、 6八1^(0-半乳糖苷酶)、6舊(0-葡糖醛酸酶)的基因等。所使用的具體報告基因并不重要， 只要其能夠表達并且表達可被檢測。報告基因的其他實例為本領域中所熟知，并且任何已知的報告基因均可用于實行本發(fā)明要求保護的方法。Maniatis et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982), Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N. Y. (1989) ；Ausubel 1993,Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，NY以及本領域容易獲得的其他文獻。與目的arNOX蛋白特異性反應的單克隆或多克隆抗體可通過本領域中熟知的方法制備。參見例如 Harlow and Lane (1988) Antibodies :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories ； Go ding (1986)Monoclonal Antibodies :Principles and Practice,2d ed. , Academic Press, New York ；禾口 Ausubel et al. (1993)Current Protocols in MolecularBiology, Wiley Interscience/Greene Publishing, New York, NY,以及本領域中容易獲得的其他文獻。除非另有指明，否則本文使用的術語和短語通常具有其本領域承認的含義，其可通過參照教科書、期刊文獻和本領域技術人員所知的文本而找到。
權利要求
1.一種非天然存在的重組DNA分子，包含編碼可溶性老化相關NADH氧化酶(arNOX) 多肽或其酶學活性片段的部分，所述部分包含編碼蛋白——所述蛋白包含選自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17的氨基酸序列——的核苷酸序列或者包含在嚴格條件下與前述序列之一雜交的核苷酸序列，并且其中所述雜交序列編碼同工型的arNOX家族的老化相關標志蛋白。
2.被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以包含權利要求1的重組DNA分子的分離的宿主細胞。
3.權利要求2的分離的宿主細胞，其為細菌細胞。
4.權利要求3的分離的宿主細胞，其中所述細菌細胞為大腸桿菌細胞。
5.權利要求2的分離的宿主細胞，其中所述細胞為真核細胞。
6.權利要求2的分離的宿主細胞，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
7.權利要求6的分離的宿主細胞，其中所述細胞為COS細胞。
8.權利要求5的分離的宿主細胞，其中所述細胞為酵母細胞。
9.一種用于在宿主細胞中重組產(chǎn)生arNOX活性蛋白或多肽的方法，所述方法包括以下步驟a.用載體感染或轉(zhuǎn)化分離的宿主細胞以產(chǎn)生重組宿主細胞，所述載體包含在所述宿主細胞中有活性的啟動子和所述arNOX多肽的編碼區(qū)，其中所述arNOX蛋白或多肽包含選自由氨基酸序列 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :13,SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15,SEQ ID NO :16 或 SEQ ID NO :17 確定的跨膜超家族9成員la、lb、2、3和4的氨基酸序列，所述啟動子與所述編碼區(qū)可操作地連接；并且b.在所述arNOX蛋白或多肽被表達的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細胞。
10.一種用于確定哺乳動物中老化狀態(tài)和arNOX同工型組成的方法，所述方法包括以下步驟a.提供生物樣本；并且b.檢測所述生物樣本中編碼一種或多種老化相關的arNOX蛋白的核糖核酸分子的存在情況，其中所述檢測步驟是使用在嚴格條件下的雜交或使用其中需要引物與模板的完全匹配的聚合酶鏈式反應進行，此時雜交探針或引物基本上由SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 9給出的核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸組成；其中所述核糖核酸分子在生物樣本中的存在指示arNOX表達。
11.一種抗體制劑，其與選自以 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16 或 SEQ ID NO: 17給出的氨基酸序列或者SEQ ID NO :2的氨基酸56-87、SEQ ID NO :2的氨基酸M8-568、 SEQ ID NO 6 的氨基酸 73-104、SEQ ID NO :8 的氨基酸 55-88 或 SEQ ID NO :10 的氨基酸 53-84表征的蛋白的抗原特異性結合。
12.一種用于確定哺乳動物中arNOX同工型組成的方法，所述方法包括以下步驟a.提供來自哺乳動物的生物樣本；b.使步驟a)所述的生物樣本與對至少一種arNOX蛋白特異性的可檢測抗體在允許所述抗體與arNOX蛋白結合的條件下接觸；并且c.當所述對arNOX蛋白特異性的可檢測抗體被結合時，檢測生物樣本中至少一種與老化相關疾病有關的arNOX同工型的存在情況。
13. 一種可有效改善哺乳動物中老化相關疾病的免疫原組合物，所述組合物包含至少一種 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、13、14、15、16 或 17 給出的 arNOX 蛋白或多肽；或者具有 SEQ ID NO 2 的氨基酸 548-568、SEQ ID NO 2 的氨基酸 57-87、SEQ ID NO 6的氨基酸73-104、SEQ ID NO :8的氨基酸55-88或SEQ ID NO 10的氨基酸53-84給出的氨基酸序列的肽。
全文摘要
本發(fā)明描述用于老化相關疾病的細胞表面和循環(huán)標記物(NADH氧化酶的特定同工型(arNOX))。本發(fā)明提供了重組的老化相關NADH氧化酶同工型及其編碼序列，以及用于檢測arNOX同工型在組織中以及在血液、血清、尿液、唾液、汗水和其他體液中的存在情況和數(shù)量的方法。重組arNOX蛋白可用于制備用于產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體的抗原以及用于診斷和治療老化疾病的免疫原組合物?；谒峁┑腄NA序列信息的DNA探針可用于鑒別具有患老化疾病的風險的個體以及用于開發(fā)治療性干預或抗老化化妝品或其他有益于延緩哺乳動物老化過程的制劑。
文檔編號C07H21/00GK102574889SQ201080036642
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權日2009年8月17日
發(fā)明者C·梅德思, D·J·摩爾, D·M·摩爾, S·迪克, 唐曉宇 申請人:諾克斯科技有限公司