專利名稱：結(jié)合地高辛配基的雙特異性抗體的制作方法
結(jié)合地高辛配基的雙特異性抗體本發(fā)明涉及針對靶蛋白和半抗原的雙特異性抗體和抗體片段，其生產(chǎn)方法，其作為包含核酸的治療或診斷劑的遞送平臺的用途，包含所述抗體的藥物組合物及其用途。分子醫(yī)學(xué)需要與靶細(xì)胞特異性和有效相互作用的試劑。在藥物開發(fā)中，將功能性治療或診斷劑有效體內(nèi)遞送至靶組織或細(xì)胞仍然是最大的障礙之一。一種方法是將有效負(fù)載(payload)連接至特異性靶向細(xì)胞的遞送載體，例如連接至抗體。必須以良好的穩(wěn)定性連接有效負(fù)載，以確保特異性靶向和避免有效負(fù)載的非特異性全身釋放。然而，為了能夠進入細(xì)胞，理想地在靶細(xì)胞上或靶細(xì)胞內(nèi)釋放有效負(fù)載。在綴合物開發(fā)中，在循環(huán)中的良好穩(wěn)定性與在靶上的有效釋放的結(jié)合是主要的瓶頸。大多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)水平的綴合物不是由一種確定的分子類型組成，而是在不同位置連接不同量的有效負(fù)載的分子混合物。這些綴合物的主要缺點是，需要針對每種抗體和每種有效負(fù)載制定綴合程序；因此不能容易的交換有效負(fù)載，而且共價鍵可能引起免疫原性。最近，開發(fā)了很多重組抗體類型，例如，通過融合例如IgG抗體類型和單鏈結(jié)構(gòu)域得到的四價雙特異性抗體(見例如Coloma，Μ. J.，等人，Nature Biotech 15(1997) 159-163 ；WO 2001/077342 ；和 Morrison，S. L.，Nature Biotech 25(2007) 1233-1234)。也開發(fā)了一些其它的新類型，其中不再保留抗體的核心結(jié)構(gòu)(IgA， IgD, IgE, IgG或IgM)，例如能夠結(jié)合兩個或多個抗原的雙抗體、三抗體或四抗體、微型抗體(minibody)和一些單鏈類型(scFv，Bis-scFv) (Hoiliger P，等人，Nature Biotech 23(2005) 1126-1136 ；Fischer N. , Leger 0. , Pathobiology 74(2007)3-14 ；Shen J, 等人，Journal of Immunological Methods 318(2007)65-74;Wu， C.等人，Nature Biotech.25(2007) 1290-1297)。雙特異性抗體能夠同時結(jié)合2種不同的靶，并因此也能夠遞送多種有效負(fù)載至靶組織或細(xì)胞。迄今為止，已經(jīng)描述了特異性針對某些細(xì)胞靶的雙特異性抗體。然而此方法具有一個主要的缺點，即其需要針對希望用于診斷和治療用途的每一種試劑產(chǎn)生抗體。US 7’429’381公開了兩步預(yù)靶向法，其中首先對細(xì)胞施用特異性針對HSG半抗原和細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的雙特異性抗體，然后將其用于捕獲螯合了治療或診斷陽離子或治療或診斷劑的HSG半抗原。HSG半抗原是小分子，例如殺蟲劑、藥物、激素和毒素，其通常是沒有免疫原性的，除非連接了某些大分子，例如蛋白質(zhì)。然而，在兩步預(yù)靶向法中使用雙特異性抗-HSG半抗原抗體具有一些限制。主要的缺點是方法的復(fù)雜性，其包括2種單獨試劑的制備和給藥，及隨后的時間選擇和比例問題。另外，不可能分析得到的雙特異性抗體和治療或診斷劑的復(fù)合物。因此難以預(yù)測藥理學(xué)性能、化學(xué)計量和由雙特異性抗體捕獲的治療或診斷劑的可能的降解產(chǎn)物。另外，目前使用的綴合物不能應(yīng)用于大多數(shù)治療劑，因為綴合經(jīng)常導(dǎo)致減少或消除的治療劑活性或?qū)е驴贵w結(jié)合能力的不希望的改變。因此，需要治療和診斷劑的非常確定、有效和特異性的遞送平臺，其能夠在靶上有效釋放有效負(fù)載并可被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明涉及特異性針對半抗原和靶蛋白的雙特異性抗體，其包含結(jié)合半抗原的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合靶蛋白的第二抗原結(jié)合位點，其中半抗原與核酸綴合。優(yōu)選的半抗原為地高辛配基(digoxigenin)、生物素和聚乙二醇(PEG)。本發(fā)明提供了制備雙特異性抗體或抗體片段的方法，以及使用它們的方法，特別是它們作為治療和診斷劑的遞送平臺的用途，以及包含所述抗體的藥物組合物和診斷工具。優(yōu)選的實施方案包括針對靶蛋白和地高辛配基的雙特異性抗體或抗體片段，其包含結(jié)合地高辛配基(稱為“Dig”或“DIG”)的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合靶蛋白的第二抗原結(jié)合位點。將雙特異性抗體或抗體片段的所述結(jié)合位點分別稱為“〈靶蛋白 >”(或簡稱“< 靶〉”)和 “<Dig>”。在其它實施方案中，設(shè)想了針對靶蛋白和有別于地高辛配基的半抗原的雙特異性抗體或抗體片段。優(yōu)選的半抗原為生物素和PEG。以下實施方案示例了針對靶蛋白和地高辛配基的雙特異性抗體或抗體片段，及其使用方法，特別是作為遞送平臺的應(yīng)用。盡管地高辛配基是本發(fā)明設(shè)想的最優(yōu)選半抗原，這些實施方案也適用生物素和PEG。此外，本發(fā)明涉及包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合靶蛋白的第二抗原結(jié)合位點的單克隆雙特異性抗體和抗體片段，編碼這樣的抗體和抗體片段的DNA，和表達DNA的載體。優(yōu)選地，所述雙特異性抗體是人源化和嵌合抗體。本發(fā)明的一個實施方案是結(jié)合地高辛配基和靶蛋白的雙特異性抗體，其包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合靶蛋白的第二抗原結(jié)合位點，其包含a)由2條全長抗體重鏈和2條全長抗體輕鏈組成的單特異性二價抗體，其中每條鏈僅包含一個可變結(jié)構(gòu)域，b) 2個肽接頭，c) 2種單特異性單價單鏈抗體，每種抗體由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域、抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、和在所述抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和所述抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的單鏈接頭組成；優(yōu)選地，所述單鏈抗體與單特異性二價抗體重鏈的相同末端(C-和N-末端)，或可選地與單特異性二價抗體輕鏈的相同末端(優(yōu)選C-末端)連接，更優(yōu)選地與單特異性二價抗體重鏈的相同末端(C-和N-末端)連接。在一個實施方案中，a)中的所述單特異性雙價親本抗體是人抗體，優(yōu)選重組人抗體。優(yōu)選地，b)中的所述肽接頭是具有至少10個氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個實施方案中，所述肽接頭是(GxS)n，其中G =甘氨酸，S =絲氨酸，(χ = 3和η = 3，4， 5或6)或(χ = 4和η = 2，3，4或5)，優(yōu)選χ = 4和η = 2或3，更優(yōu)選χ = 4，η = 2。優(yōu)選地，c)中的所述單鏈接頭是具有至少15個氨基酸長度，更優(yōu)選至少20個氨基酸長度的氨基酸序列的肽。在一個實施方案中，所述單鏈接頭是(GxS)n，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，(χ = 3和η = 4，5或6)或(χ = 4和η = 3，4或5)，優(yōu)選χ = 4和η = 4 或5，更優(yōu)選χ = 4，η = 4。優(yōu)選地，c)中的所述2種單特異性單價單鏈抗體包含抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域SEQ ID NO. 3，具有S49A、I57A和A60P突變的SEQ ID NO. 3，或SEQ ID NO. 2，抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域 SEQ ID NO 5或SEQ. ID NO. 1，和在所述抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和所述抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的單鏈接頭。優(yōu)選地，c)中的所述2種單特異性單價單鏈抗體包含SEQ. ID N0.4或SEQ. ID NO. 36作為重鏈Fd片段(Vh和CH1)，和包含SEQ. ID NO. 6或SEQ. ID NO. 37作為L鏈。在本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體的特征在于，所述特異性結(jié)合DIG的抗原結(jié)合位點包含SEQ ID NO. 3，具有S49A，I57A和A60P突變的SEQ ID NO. 3、 或SEQ ID NO. 2作為重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含SEQ ID NO 5或SEQ. ID NO. 1作為輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，所述特異性結(jié)合DIG的抗原結(jié)合位點包含SEQ. ID NO. 4或 SEQ. ID NO. 36 作為重鏈 Fd 片段(Vh和 CH1)，和包含 SEQ. ID NO. 6 或 SEQ. IDN0. 37 作為 L 鏈。如本文使用的，術(shù)語“突變”指在根據(jù)本發(fā)明的抗體的CDR和/或可變區(qū)中的一個或多個氨基酸取代。術(shù)語“具有S49A，I57A和A60P突變”涉及在SEQ ID N0. 3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的3個取代(根據(jù)Kabat編號)。此外，所述單鏈抗體優(yōu)選地是二硫化物穩(wěn)定的。通過在單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間引入二硫鍵實現(xiàn)這樣進一步的單鏈抗體的二硫化物穩(wěn)定，并在例如WO 94/029350， Rajagopal，V.，等人，Prot. Engin. Vol. 10(12) 1453-59(1997) ；Kobayashi, H.，等人， Nuclear Medieine&Biology，Vol. 25，387-393 (1998)；或 Schmidt, Μ·，等人，Oncogene 18， 1711-1721(1999)中描述。在另一個實施方案中，發(fā)明的抗體包含人源化的地高辛配基結(jié)合模塊，其包含至少一個能夠結(jié)合地高辛配基的單鏈可變片段(scFv)。所述scFv優(yōu)選地包含通過接頭連在一起的一條人源化\和一條人源化Vh鏈。在另一個實施方案中，所述抗體還包含由2條重鏈組成的Fc區(qū)，所述重鏈提供2或3個恒定結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體包含基于與靶蛋白結(jié)合的全長抗體的結(jié)構(gòu)，通過肽接頭將2個(任選地二硫化物穩(wěn)定的)結(jié)合地高辛配基的單鏈可變片段 (scFv)與其連接。在另一個實施方案中，所述抗體包含具有2個地高辛配基結(jié)合位點的人源化IgG?？梢远喾N形式將地高辛配基結(jié)合模塊連接至細(xì)胞靶向?qū)嶓w。例如，為此不僅可應(yīng)用“經(jīng)典的，，抗體片段和抗體衍生模塊，例如Fab或Fv，而且可應(yīng)用以前在文獻中已描述的單結(jié)構(gòu)域的類似抗體的實體。除了與H鏈的C末端融合以外，如在實施例中描述的其他形式也是本發(fā)明的一部分。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述靶蛋白是細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原，優(yōu)選地所述靶蛋白是細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的腫瘤相關(guān)抗原。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合Her2的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述特異性結(jié)合Her2和地高辛配基的雙特異性抗體包含SEQ. ID N0. 7或SEQ. ID N0. 8的重鏈，和SEQ. ID N0. 9的輕鏈。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合IGFlR的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述特異性結(jié)合IGFlR和地高辛配基的雙特異性抗體包含SEQ. ID NO. 10或SEQ. IDN0. 11的重鏈，和SEQ. ID N0. 12的輕鏈。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合CD22的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述特異性結(jié)合CD22和地高辛配基的雙特異性抗體包含SEQ. ID N0. 13或55的重鏈，和SEQ. ID N0. 14或56的輕鏈。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合CD33的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述特異性結(jié)合CD33和地高辛配基的雙特異性抗體包含SEQ. ID NO. 59的重鏈，和SEQ. ID NO. 60的輕鏈。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合VEGFRl的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述特異性結(jié)合VEGFRl和地高辛配基的雙特異性抗體包含SEQ. ID NO. 51的重鏈，和SEQ. ID NO. 52的輕鏈。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合Herf(Lieberman)的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述特異性結(jié)合 Her2 (Lieberman)和地高辛配基的雙特異性抗體包含SEQ. ID NO. 53的重鏈，和SEQ. ID N0. 54的輕鏈。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合LeY的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述特異性結(jié)合LeY和地高辛配基的雙特異性抗體包含SEQ. ID N0. 57的重鏈，和SEQ. ID N0. 58的輕鏈。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，使用所述雙特異性抗體作為治療或診斷劑的有效負(fù)載遞送載體。治療或診斷劑與地高辛配基綴合，從而通過本發(fā)明的雙特異性抗體的抗原結(jié)合位點連接。此復(fù)合物是確定和穩(wěn)定的，并特異性遞送有效負(fù)載至靶細(xì)胞或組織。由于地高辛配基化的治療或診斷劑以非共價的方式與雙特異性抗體連接，有效負(fù)載在循環(huán)時穩(wěn)定地與其遞送載體結(jié)合，而且在內(nèi)化后能被有效釋放。地高辛配基的綴合不影響大多數(shù)治療或診斷劑的活性。雙特異性抗體沒有包含異常的共價附加物并因此排除了任何免疫原性風(fēng)險。因此，此簡單的綴合程序可用于多種有效負(fù)載分子與僅一種抗體的組合；例如肽、 蛋白質(zhì)、小分子、成像試劑和核酸，如在以下特定實施方案和實施例的描述中詳細(xì)說明的。 地高辛配基化的診斷或治療劑與包含Dig結(jié)合模塊的雙特異性抗體衍生物的復(fù)合物可賦予診斷或治療劑(例如診斷或治療蛋白質(zhì)、肽或小分子)良好的生物物理行為和改進的PK 參數(shù)。此外，這樣的復(fù)合物能夠?qū)⑦f送的載荷靶向展示雙特異性抗體變體識別的抗原的細(xì)胞。使用通常使用的特異性針對地高辛配基的診斷劑，可在患者中容易地監(jiān)控地高辛配基化的治療或診斷有效負(fù)載分子的命運，例如使用如用于檢測地高辛配基和地高辛配基過量治療的Tina定量地高辛配基法的測定(Roche/Hitachi，No. 12218623001和 US#7100001)。通過臨床認(rèn)可的多克隆抗地高辛配基抗體(例如在上述測定中包含這樣的抗體)，可清除游離的地高辛配基或與雙特異性抗體連接的過量的地高辛配基化的治療或診斷有效負(fù)載分子。在一個實施方案中，在有效負(fù)載的細(xì)胞特異性遞送之后在體內(nèi)再次裝載雙特異性抗體。在優(yōu)選的實施方案中，雙特異性抗體包含特異性針對地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原的第二抗原結(jié)合位點。因此，負(fù)載治療或診斷劑的雙特異性抗體被特異性遞送至靶細(xì)胞或組織，優(yōu)選遞送至腫瘤。雙特異性抗體作為靶向細(xì)胞/組織的特異性遞送平臺的上述用途可用于多種不同的有效負(fù)載，特別是下面詳細(xì)說明的有效負(fù)載。在一個實施方案中，所述雙特異性抗體被用作治療和/或診斷肽或蛋白質(zhì)的有效負(fù)載遞送載體。肽或蛋白質(zhì)有效負(fù)載的連接可增強抗體的治療效力，例如在癌癥治療中的毒素綴合物。治療和/或診斷肽或蛋白質(zhì)與地高辛配基綴合，并因此通過抗體_半抗原相互作用連接至上述雙特異性抗體。此確定和穩(wěn)定的復(fù)合物特異性遞送肽或蛋白質(zhì)有效負(fù)載至靶細(xì)胞或組織，然后肽或蛋白質(zhì)有效負(fù)載在靶細(xì)胞內(nèi)釋放。在一個優(yōu)選的實施方案中，地高辛配基化肽或蛋白質(zhì)與下述雙特異性抗體連接， 其具有特異性針對地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和特異性針對靶蛋白，優(yōu)選細(xì)胞表面抗原或細(xì)胞內(nèi)抗原的第二抗原結(jié)合位點，優(yōu)選地所述細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原是腫瘤相關(guān)抗原。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些復(fù)合物由一種人源化的〈靶蛋白>_<Dig>IgG組成，在其兩個高親和力Dig結(jié)合位點上結(jié)合兩個地高辛配基化肽(每個位點結(jié)合一個)。盡管被地高辛配基化以及與抗體復(fù)合，所述肽保留良好的生物學(xué)活性。此外，本發(fā)明的雙特異性抗體的特異性和活性不受地高辛配基化肽的連接的影響。在復(fù)合的地高辛配基化肽的存在下， 雙特異性抗體衍生物的細(xì)胞表面靶結(jié)合位點保留其結(jié)合特異性和親和力。優(yōu)選地，所述靶蛋白是Her 2。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白是IGFR1。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白是CD22。在地高辛配基化肽或蛋白質(zhì)與本發(fā)明的雙特異性抗體結(jié)合后，所述肽或蛋白質(zhì)保留其完整的生物學(xué)活性。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的重組人源化雙特異性抗體和抗體片段改進了治療肽的PK和穩(wěn)定性。優(yōu)選的地高辛配基化肽的非限制性實例是Dig-蜂毒素(Mellitin)，Dig-Fam5B, Dig-INF7, Dig-FallVl和 DigFallV2。在本發(fā)明的一個方面，雙特異性抗體用于遞送細(xì)胞毒性肽至表達抗原的腫瘤細(xì)胞。因此本發(fā)明為靶向癌癥治療提供了特異性遞送平臺。在一個優(yōu)選的實施方案中，雙特異性抗體被用作治療或診斷小分子的有效負(fù)載遞送載體。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些復(fù)合物由一種人源化的〈靶蛋白>_<Dig>IgG組成， 在其兩個高親和力Dig結(jié)合位點上結(jié)合兩個地高辛配基化化合物(每個位點結(jié)合一個)。 盡管被地高辛配基化以及與抗體復(fù)合，所述化合物保留生物學(xué)活性。在復(fù)合的Dig-化合物的存在下，雙特異性抗體衍生物的細(xì)胞表面靶結(jié)合位點保留其結(jié)合特異性和親和力。在一個優(yōu)選的實施方案中，地高辛配基化小分子與雙特異性 < 靶蛋白>_<Dig>抗體衍生物連接。因此產(chǎn)生確定和穩(wěn)定的分子復(fù)合物，其在靶細(xì)胞內(nèi)釋放有效負(fù)載。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述小分子是地高辛配基化的且與下述雙特異性抗體連接，其包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合靶蛋白的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述靶蛋白是腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白是Her2。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白是IGFR1。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白是 CD22。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體被用作地高辛配基化的細(xì)胞毒性分子的有效負(fù)載遞送載體。優(yōu)選地，所述細(xì)胞毒性分子因此被特異性遞送至表達抗原的腫瘤細(xì)胞。因此本發(fā)明為靶向癌癥治療提供了特異性遞送平臺。在一個優(yōu)選的實施方案中，雙特異性抗體被用作地高辛配基化的放射性同位素或與地高辛配基化小分子連接的放射性同位素的有效負(fù)載遞送。因此本發(fā)明為放射療法提供了特異性遞送平臺。地高辛配基化的放射性同位素或與地高辛配基化小分子連接的放射性同位素顯示了有效的組織滲透、快速清除，并僅在由〈靶>_<Dig>雙特異性抗體覆蓋的細(xì)胞(靶組織/腫瘤)上保留。這能夠特異性靶向并避免治療放射性同位素的全身性非特異性釋放。在一個優(yōu)選的實施方案中，用地高辛配基化的放射性同位素或與地高辛配基化小分子連接的放射性同位素在體內(nèi)“再次裝載”與靶細(xì)胞或組織結(jié)合的雙特異性抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體用于遞送地高辛配基化的放射性同位素或與地高辛配基化小分子連接的放射性同位素至患病組織。優(yōu)選地，所述患病組織是腫瘤。在一個優(yōu)選的實施方案中，雙特異性抗體被用作成像試劑的有效負(fù)載遞送載體。 用于成像，良好的信號背景比是理想的，這需要良好的組織滲透以及良好的組織靶向?？贵w顯示了良好的穩(wěn)定性和良好的靶向，但只有中等的組織滲透。這些缺點現(xiàn)在被克服了。在一個優(yōu)選的實施方案中，地高辛配基化的熒光底物和含有重組Dig結(jié)合模塊的雙特異性抗體衍生物的復(fù)合物用于攜帶靶抗原的組織或細(xì)胞的特異性成像。在優(yōu)選的實施方案中，這些組織或細(xì)胞在體內(nèi)成像。這些復(fù)合物由一種人源化的 < 靶>_<Dig>IgG組成， 在其兩個高親和力Dig結(jié)合位點上結(jié)合兩個地高辛配基化底物(每個位點結(jié)合一個)，所述底物可通過成像技術(shù)顯像。在一個優(yōu)選的實施方案中，成像化合物是熒光體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述成像化合物是放射性標(biāo)記的化合物。盡管被地高辛配基化以及與抗體復(fù)合，成像化合物保留其性能。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述成像化合物是Cy5。在復(fù)合的Dig-化合物的存在下，雙特異性抗體衍生物的細(xì)胞表面靶結(jié)合位點保留其結(jié)合特異性和親和力。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合地高辛配基的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合靶蛋白的第二抗原結(jié)合位點。優(yōu)選地，所述靶蛋白是腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物。 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白是Her2。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白是 IGFR1。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白是⑶22。地高辛配基化成像化合物顯示了有效的組織滲透、快速清除，并僅在由〈靶 >-<Dig>雙特異性抗體覆蓋的細(xì)胞(靶組織/腫瘤)上保留。這能夠進行有效的時間解析的成像，和評估腫瘤血管生成或腫瘤血管生成中的變化。在一個優(yōu)選的實施方案中，用地高辛配基化的染料在體內(nèi)“再次裝載”與靶細(xì)胞或組織結(jié)合的雙特異性抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體用于患病組織的成像。優(yōu)選地，所述患病組織是腫瘤。本發(fā)明的另一個方面是特異性靶向和遞送核酸至和進入靶組織和靶細(xì)胞，這是目前的技術(shù)未能良好解決的一個主要瓶頸。迄今為止描述的大多數(shù)核酸遞送實體不是由單一的確定分子組成，而是由分子或微粒的混合物組成。然而，在治療應(yīng)用中需要同質(zhì)的確定實體。在一些實例中顯示了抗體或抗體片段介導(dǎo)的核酸遞送(例如Lieberman等人，Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nature Biotechnology [1087-0156] Song yr 2005 vol :23pg :709)，但仍面臨嚴(yán)峻的技術(shù)障礙。最引人注目的是特異性靶向和遞送雙鏈RNA分子(dsRNA)至和進入靶組織和靶細(xì)胞。雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子已顯示通過被稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守的調(diào)控機制阻止基因表達?？蓪sRNA與抗體以良好的穩(wěn)定性綴合，以確保特異性靶向并避免全身性非特異性釋放。另一方面，必須在靶細(xì)胞上或其內(nèi)釋放dsRNA以使其能夠進入細(xì)胞。靶向dsRNA通常積累在內(nèi)體中，其需要從內(nèi)體逃逸以發(fā)揮活性。然而，仍需要發(fā)現(xiàn)用于靶向 dsRNA的有效的無毒的非免疫原性內(nèi)體逃逸機制?，F(xiàn)在，通過使用本發(fā)明的雙特異性抗體作為核酸的有效負(fù)載遞送載體，克服了這些缺點。因此本發(fā)明為靶向的基因治療和靶向的RNAi遞送提供了特異性遞送平臺。
在一個優(yōu)選的實施方案中，地高辛配基化核酸和含有重組Dig結(jié)合模塊的雙特異性抗體衍生物的復(fù)合物用于將核酸特異性靶向表達抗原的細(xì)胞。這樣的復(fù)合物能夠?qū)㈦陌邢蛘故居呻p特異性抗體變體識別的抗原的細(xì)胞。這些復(fù)合物由一種人源化的〈靶 >-<Dig>IgG組成，在其兩個高親和力Dig結(jié)合位點上結(jié)合兩個地高辛配基化核酸(每個位點結(jié)合一個)。盡管被地高辛配基化以及與抗體復(fù)合，核酸保留其功能。另外，在復(fù)合的地高辛配基化核酸的存在下，雙特異性抗體衍生物的細(xì)胞表面靶結(jié)合位點保留其結(jié)合特異性和親和力。優(yōu)選地，地高辛配基化核酸與雙特異性 < 靶>_<Dig>抗體變體的復(fù)合物可用于將核酸特異性靶向表達靶抗原的細(xì)胞。因此，核酸選擇性地處理通過表面抗原識別的細(xì)胞， 因此在表達抗原的細(xì)胞中增強了核酸引起的活性(例如RNAi或核酸介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)。在一個實施方案中，通過另外應(yīng)用靶向內(nèi)體的調(diào)節(jié)劑進一步增強這些活性。優(yōu)選地，不僅將核酸特異性遞送至表達抗原的細(xì)胞，而且使核酸內(nèi)化到靶細(xì)胞中。由于地高辛配基化核酸以非共價的方式與本發(fā)明的雙特異性抗體連接，有效負(fù)載(即核酸)在內(nèi)化后被釋放。在優(yōu)選的實施方案中，這樣的靶抗原是腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶抗原是Her2。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶抗原是IGFRl。在另一個優(yōu)選的實施方案中， 所述靶抗原是CD22。在優(yōu)選的實施方案中，核酸是DNA，在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸是 dsRNA。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙鏈RNA用于抑制靶基因的表達。將地高辛配基與核酸連接的方法和用于其表征的分析方法是本發(fā)明的一部分。為了介導(dǎo)其活性(例如通過siRNA特異性破壞mRNA)，治療或診斷核酸必須進入其靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。遞送特異性核酸活性的一個重要因素是，不僅將分子遞送至細(xì)胞，而且必須將足夠量的核酸轉(zhuǎn)移至這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。為此，這些分子必須穿越生物膜至少1次。 由于生物制劑不易透過膜，為了有效遞送核酸活性，此步驟是必須克服的瓶頸?？朔似款i的方式可為膜滲透、蛋白質(zhì)跨膜易位、或可能涉及膜破壞過程的內(nèi)體逃逸或小泡逃逸機制。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體被用作核酸的有效負(fù)載遞送模塊，在所述核酸上連接內(nèi)體功能調(diào)節(jié)子或內(nèi)體逃逸/破壞模塊。優(yōu)選地，所述內(nèi)體逃逸模塊包含肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，這樣的內(nèi)體逃逸模塊包含動態(tài)多聚綴合物(DPC)。 DPC是化學(xué)實體，在細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化后導(dǎo)致siRNA的內(nèi)體逃逸(Rozema DB et. al.， Dynamic PolyConjugates for targeted in vivo delivery of siRNA to hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America ；2007 Aug7 ； 104 (32) 12982-7 PMID :17652171)。這樣的 DPC 由 PBAVE (丁基氨基乙烯基醚的聚合物)支架組成，使用雙官能團的馬來酰胺酸連接(maleamate linkage)在支架上可逆地連接PEG分子。在所述馬來酰胺酸連接中可使用羧化的二甲基馬來酸(CDM)。 使用PEG單元屏蔽PBAVE的內(nèi)體裂解的正電荷。在PBAVE上還連接siRNA負(fù)載(例如通過可逆的二硫鍵)。將得到的遞送載體稱為siRNA動態(tài)多聚綴合物，因為siRNA、屏蔽基團(和另外的靶向配體)以可逆的方式綴合在聚合物上。導(dǎo)致siRNA的細(xì)胞質(zhì)遞送的這樣的DPC 的內(nèi)體裂解性能是通過其化學(xué)環(huán)境引起的在成熟中的內(nèi)吞溶酶體(endolysome)中的pH 的降低引起CDM-PEG的釋放，暴露PBAVE的正電荷，其進而介導(dǎo)內(nèi)體裂解。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，組合DPC的內(nèi)體裂解特征和雙特異性地高辛配基遞送系統(tǒng)的特異性靶向性質(zhì)。優(yōu)選地，這些復(fù)合物由一種人源化的〈靶>-<Dig>IgG組成， 其在其兩個高親和力Dig結(jié)合位點上結(jié)合兩個地高辛配基化的與DPC綴合的核酸(每個位點結(jié)合一個)。在一個實施方案中，與地高辛配基化核酸復(fù)合的雙特異性抗體用于成像分析。在此實施方案中，用地高辛配基和可檢測的標(biāo)記物同時標(biāo)記核酸。因此有可能通過顯微鏡或其他成像技術(shù)顯現(xiàn)靶向表達抗原的細(xì)胞的核酸的定位。優(yōu)選地，所述可檢測的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。在一個實施方案中，在細(xì)胞中，即體外顯現(xiàn)核酸的定位。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在體內(nèi)顯現(xiàn)核酸的定位。特異性針對地高辛配基的多克隆抗體廣泛用于診斷測定。然而，從這些雜交瘤來源的抗體中不能產(chǎn)生理想的穩(wěn)定小片段和融合蛋白。因此，需要重組人源化或嵌合<Dig> 或<Dig>融合蛋白作為診斷試劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體或片段被用作診斷工具和試劑。這些雙特異性抗體或片段包括但不限于特異性針對地高辛配基的功能性重組人IgG、Fab片段，scFv和二硫化物穩(wěn)定的Fv。優(yōu)選地，雙特異性抗體或抗體片段識別地高辛配基化的化合物或分子，例如，但不限于，地高辛配基化的蛋白質(zhì)、肽或核酸。在優(yōu)選的實施方案中，所述雙特異性抗體或片段與酶、蛋白質(zhì)A、(鏈霉)抗生物素或融合蛋白綴合以用于診斷測定。多克隆<Dig>(Fab)在治療中被用于抵消地高辛配基過量?，F(xiàn)存的產(chǎn)品可能是相當(dāng)不確定的并很可能具有免疫原性。本發(fā)明的雙特異性抗體或抗體片段特異性結(jié)合地高辛配基，并且是非常確定的，具有低免疫原性或不具有免疫原性。在一個實施方案中，重組人源化或嵌合<Dig>或<Dig>片段被用作洋地黃毒苷(Digitoxin)解毒劑。如本文使用的，“抗體”指包含抗原結(jié)合位點的結(jié)合蛋白質(zhì)。如本文使用的，術(shù)語 “結(jié)合位點”或“抗原結(jié)合位點”表示抗體分子的與配體實際結(jié)合的區(qū)域。在本發(fā)明的一個實施方案中，每個結(jié)合位點包含抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和/或抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)， 優(yōu)選地由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)組成的配對形成。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗體包含單鏈可變片段(scFv)?？贵w特異性指抗體對抗原的特定表位的選擇性識別。例如，天然抗體是單特異性的。根據(jù)本發(fā)明的“雙特異性抗體”是具有2種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。當(dāng)抗體具有超過一種特異性時，識別的表位可與單個抗原或與超過一種抗原相關(guān)。本發(fā)明的抗體特異性針對2種不同的抗原，即地高辛配基作為第一抗原和靶蛋白作為第二抗原。如本文使用的，術(shù)語“單特異性”抗體表示具有一個或多個結(jié)合位點的抗體，每一個結(jié)合位點與相同抗原的相同表位結(jié)合。如在本申請中使用的，術(shù)語“價”表示在抗體分子中存在的結(jié)合位點的特定數(shù)目。 類似地，術(shù)語“二價”、“四價”和“六價”表示在抗體分子中分別存在2個結(jié)合位點、4個結(jié)合位點和6個結(jié)合位點。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體至少是“二價”的，并可為“三價”或“多價”的(例如“四價”或“六價”)。本發(fā)明的抗體具有2個或多個結(jié)合位點并且是雙特異性的。即，所述抗體可為雙特異性的，甚至在超過2個結(jié)合位點的情況下(即抗體是三價或多價的)。本發(fā)明的雙特異性抗體包括，例如多價單鏈抗體、二抗體和三抗體，以及具有全長抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的抗體，其上通過一個或多個肽接頭連接另外的抗原結(jié)合位點(例如，單鏈Fv，VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ab或(Fab) 2)?？贵w可為來自一個物種的全長抗體，或為嵌合的或人源化的。在具有超過2個抗原結(jié)合位點的抗體中，只要蛋白質(zhì)具有針對2個不同抗原的結(jié)合位點，一些結(jié)合位點可為相同的。即，盡管第一結(jié)合位點特異性針對地高辛配基，第二結(jié)合位點特異性針對靶蛋白。類似天然抗體，本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點一般包含6個互補決定區(qū)(CDR)，其為抗原結(jié)合位點的親和力提供不同的程度。存在3個重鏈可變結(jié)構(gòu)域CDR(CDRH1，CDRH2和 ⑶RH3)和3個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶R (⑶RLl，⑶RL2和⑶RL3)。通過與編譯的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫比較確定CDR和框架區(qū)(FR)的范圍，在所述數(shù)據(jù)庫中已根據(jù)序列間的變異性確定了這些區(qū)域。在本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括由較少的CDR組成的功能性抗原結(jié)合位點(S卩，其中通過3、4或5個⑶R確定結(jié)合特異性)。例如，低于6個⑶R完整集合數(shù)目的⑶R即可足以用于結(jié)合。有時，VH或VL結(jié)構(gòu)域就足夠了。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體還包含一種或多種免疫球蛋白類型的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白類型包括IgG，IgM, IgA, IgDjP IgE同種型，并且在IgG和IgA的情況下，包括其亞型。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體具有IgG型抗體的恒定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，但具有4個抗原結(jié)合位點。這是通過將2個完整的特異性結(jié)合DIG的抗原結(jié)合位點(例如單鏈Fv)與特異性結(jié)合靶蛋白的完整抗體的N-或C-端重或輕鏈連接實現(xiàn)的。4個抗原結(jié)合位點優(yōu)選地包含對于2種不同的結(jié)合特異性各有2個結(jié)合位點。如本文使用的，術(shù)語“單克隆抗體，，或“單克隆抗體組合物，，指具有單一氨基酸組成的抗體分子制劑。術(shù)語“嵌合抗體”指這樣的抗體，其包含來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)， 和來源于不同的來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，通常通過重組DNA技術(shù)制備。優(yōu)選包含鼠類可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明包含的另一種優(yōu)選的“嵌合抗體”形式是這樣的嵌合抗體，其中恒定區(qū)相比原始抗體已被修飾或改變以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的性能，特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的性能。這樣的嵌合抗體也被稱為“類別轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的 DNA區(qū)段的免疫球蛋白基因的表達產(chǎn)物。產(chǎn)生嵌合抗體的方法包括常規(guī)的重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，這是本領(lǐng)域熟知的。見，例如Morrison，S. L.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984)6851-6855 ；US 5，202，238 和 US 5,204,244。術(shù)語“人源化抗體”指這樣的抗體，其中框架或“互補決定區(qū)”(OTR)已被修飾，從而包含與原來的免疫球蛋白相比不同特異性的免疫球蛋白的CDR。在優(yōu)選的實施方案中， 將鼠類⑶R移植進人抗體的框架區(qū)以制備“人源化抗體”。見，例如Riechmarm，L.，等人， Nature 332 (1988) 323-327 ；和 Neuberger，Μ· S.，等人，Nature 314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDR與上面在嵌合抗體中提及的識別抗原的那些代表序列一致。本發(fā)明包含的“人源化抗體”的其他形式是這樣的抗體，其中原始抗體的恒定區(qū)已被另外修飾或改變以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的性能，特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的性能。如本文使用的，術(shù)語“人抗體”旨在包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。也可在能夠在免疫后產(chǎn)生人抗體的完整庫或選集并缺乏內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中產(chǎn)生人抗體。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移進這樣的種系突變小鼠將導(dǎo)致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體(見，例如 Jakobovits，Α.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551—2555 Jakobovits, Α.， 等人，Nature 362(1993)255-258 ；Bruggemann, Μ.,等人，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。 也可在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生人抗體(Hoogenboom，H. R.，和Winter，G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等人，J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole 等人和Boerner，等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(Cole，P. J.，等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；禾口 Boerner, P.,等人’ J. Immunol. 147(1991)86-95)。如在根據(jù)本發(fā)明的嵌合和人源化抗體中已經(jīng)提到的，如本文使用的術(shù)語“人抗體”也包含這樣的抗體，其在恒定區(qū)中被修飾以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的性能， 特別是有關(guān)Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合的性能，例如通過“類別轉(zhuǎn)換”，即Fc部分的改變或突變(例如從IgGl至IgG4和/或IgGl/IgG4突變)。如本文使用的，術(shù)語“重組人抗體”旨在包括所有的通過重組手段制備、表達、創(chuàng)造或分離的人抗體，例如從宿主細(xì)胞(例如NSO或CHO細(xì)胞)或從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中分離的抗體，或使用轉(zhuǎn)染進宿主細(xì)胞的重組表達載體表達的抗體。這樣的重組人抗體具有重排形式的可變和恒定區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的重組人抗體已經(jīng)歷了體內(nèi)體細(xì)胞超變。因此，重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，其盡管源自人種系VH 和VL序列并與其相關(guān)，但可能不天然存在于體內(nèi)的人抗體種系庫中。如本文使用的，“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域，重鏈(VH)的可變結(jié)構(gòu)域)表示直接涉及抗體與抗原結(jié)合的每對輕和重鏈。人輕和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，且每個結(jié)構(gòu)域包含4個序列大幅保守的框架(FR)區(qū)，通過3個“高變區(qū)”(或互補決定區(qū)，⑶R)連接FR?？蚣軈^(qū)采用β-折疊構(gòu)象，且⑶R可形成連接β-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。 每條鏈中的CDR通過框架區(qū)維持其三維結(jié)構(gòu)并與其他鏈中的CDR —起形成抗原結(jié)合位點。 抗體重和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中發(fā)揮特別重要的作用， 并因此提供了本發(fā)明的另一個目的。術(shù)語“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”當(dāng)在本文中使用時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含“互補決定區(qū)”或稱“CDR”的氨基酸殘基?！翱蚣堋被颉癋R”區(qū)是除了本文定義的高變區(qū)殘基以外的可變結(jié)構(gòu)域。因此，抗體的輕和重鏈從N-至C-端包含 FRl，CDRl，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，和FR4結(jié)構(gòu)域。每條鏈上的CDR3通過這樣的框架氨基酸分隔開。特別地，重鏈的⑶R3是對抗原結(jié)合貢獻最大的區(qū)域。根據(jù)Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義確定 CDR 和 FR 區(qū)。如本文使用的，術(shù)語“結(jié)合”或“特異性結(jié)合”指抗體與抗原表位在體外測定中，優(yōu)選在使用表達野生型抗原的CHO細(xì)胞的基于細(xì)胞的ELISA中的結(jié)合。結(jié)合指10-8M或更低， 優(yōu)選 IO-I3M to IO-9M 的結(jié)合親和力(KD)?？赏ㄟ^ BIAcore 測定(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)研究抗體與抗原或Fc γ RIII的結(jié)合。結(jié)合親和力通過術(shù)語ka (抗體 /抗原復(fù)合物中抗體的結(jié)合速率常數(shù))、kD (解離常數(shù))和KD(kD/ka)定義。如本文使用的，術(shù)語“連接的，，特定地指抗體_半抗原相互作用，通過此相互作用使地高辛配基化的治療或診斷有效負(fù)載與本發(fā)明的雙特異性抗體非共價地結(jié)合。如本文使用的，術(shù)語“小分子，，或“小化合物，，指合成的或天然存在的有機或無機分子，其一般具有低于10，000克/摩爾的分子量，任選地低于5，000克/摩爾，和任選地低
于2，000克/摩爾。如本文使用的，術(shù)語“肽”指通過一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基之間的酰胺形成產(chǎn)生的任意聚合化合物。如本文使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”指超過約50個殘基的特定序列多肽。如本文使用的，術(shù)語“核酸”指由核苷酸，例如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成的寡聚物或聚合物，或可與天然存在的核酸以類似2個天然存在的核酸的序列特異性方式 (例如可參與Watson-Crick堿基配對相互作用)雜交的通過合成產(chǎn)生的化合物(例如，在美國專利號5，948，902和其中引用的參考中描述的PNA)。非天然存在的核酸是包含不天然存在的核堿基序列的寡聚物或聚合物，或包含天然存在的核堿基、糖或糖間連接的功能等同物的類別，如肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TNA)、鎖核酸(LNA)或甘油核酸(GNA)。此術(shù)語包括包含天然存在的核酸核堿基腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶 (U)的寡聚物，以及包含堿基類似物或修飾的核堿基的寡聚物。核酸可源自多種天然來源， 例如病毒、細(xì)菌和真核DNA和RNA。其他核酸可源自合成來源，并包括被制造用作研究試劑、 診斷劑或潛在和確定的治療劑的多種寡核苷酸中的任一種。所述術(shù)語包括包含單鏈核酸或雙鏈核酸的寡聚物。術(shù)語“表位”包括任意能夠特異性結(jié)合抗體的任意多肽決定簇。在某些實施方案中，表位決定簇包括具有化學(xué)活性的表面分子基團，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?和在某些實施方案中，表位決定簇可能具有特定的三級結(jié)構(gòu)特征，和或特定的電荷特征。表位是抗原被抗體結(jié)合的區(qū)域。在某些實施方案中，當(dāng)抗體優(yōu)先識別蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中的其靶抗原時，將其稱為特異性結(jié)合抗原。在本發(fā)明的一個實施方案中，雙特異性抗體包含全長抗體作為支架。術(shù)語“全長抗體”表示，抗體由2條“全長抗體重鏈”和2條“全長抗體輕鏈”組成?！叭L抗體重鏈”是從 N-端至C-端方向由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)、抗體恒定結(jié)構(gòu)域1 (CHl)、抗體鉸鏈區(qū)、抗體恒定結(jié)構(gòu)域2 (CH2)、抗體恒定結(jié)構(gòu)域3 (CH3)和任選地，在IgE亞類抗體的情況下，抗體恒定結(jié)構(gòu)域4(CH4)組成的多肽?！叭L抗體輕鏈”是從N-端至C-端方向由抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)和抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成的多肽。全長抗體鏈通過CL-結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域之間的和全長抗體重鏈的鉸鏈區(qū)之間的多肽間的二硫鍵連接。根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合位點可分別由2個可變結(jié)構(gòu)域?qū)?，即一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域形成?？贵w中的最小結(jié)合位點決定區(qū)是重鏈CDR3區(qū)。在二硫化物穩(wěn)定的單鏈抗體的一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體包含的單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵獨立地選自下述位置，以用于每一種單鏈抗體的i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位，ii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第105位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第43位，或iii)重鏈可變結(jié)構(gòu)域第101位至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體包含的單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域第44位和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第100位之間。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體包含的單鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵在重鏈可變結(jié)構(gòu)域第105位和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域第43位之間。
在另一個實施方案中，所述四價雙特異性抗體的特征在于，所述單特異性二價抗體是人IgGl亞類，或具有L234A和L235A突變的人IgGl亞類。在另一個實施方案中，所述四價雙特異性抗體的特征在于，所述單特異性二價抗體是人IgG2亞類。在另一個實施方案中，所述四價雙特異性抗體的特征在于，所述單特異性二價抗體是人IgG3亞類。在另一個實施方案中，所述四價雙特異性抗體的特征在于，所述單特異性二價抗體是人IgG4亞類，或具有另外的S228P突變的IgG4亞類。在另一個實施方案中，雙特異性抗體的特征在于——由單特異性二價抗體的2對重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域分別形成2個抗原結(jié)合位點，并結(jié)合相同的表位，——通過一種單鏈抗體的重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域分別形成另外的2個抗原結(jié)合位
點，——單鏈抗體通過肽接頭分別連接一條重鏈或一條輕鏈，其中每個抗體鏈末端僅連接單鏈抗體。如本發(fā)明中使用的術(shù)語“肽接頭”表示，具有優(yōu)選地為合成來源的氨基酸序列的肽。這些根據(jù)本發(fā)明的肽接頭用于將不同的抗原結(jié)合位點和/或最終包含不同抗原結(jié)合位點的抗體片段(例如單鏈Fv、全長抗體、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域、Fab、(Fab) 2和Fc部分)連接在一起以形成根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體。肽接頭可包含一個或多個以下表1中所列的氨基酸序列，以及其他任意選擇的氨基酸。表1-肽接頭氨基酸序列
權(quán)利要求
1.特異性針對半抗原和靶蛋白的雙特異性抗體，其包含結(jié)合半抗原的第一抗原結(jié)合位點和結(jié)合靶蛋白的第二抗原結(jié)合位點，其中半抗原與核酸綴合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的雙特異性抗體，其中所述半抗原選自生物素和聚乙二醇(PEG)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的雙特異性抗體，其中半抗原是地高辛配基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的雙特異性抗體，包含a)由2條全長抗體重鏈和2條全長抗體輕鏈組成的單特異性二價抗體，其中每條鏈僅包含一個可變結(jié)構(gòu)域，b)2個肽接頭，c)2個單特異性單價單鏈抗體，每種抗體由抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域、抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、和在所述抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域和所述抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的單鏈接頭組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的雙特異性抗體，其中所述特異性結(jié)合DIG的抗原結(jié)合位點包含選自 SEQ ID NO. 3，具有 S49A、I57A 和 A60P 突變的 SEQ ID NO. 3，或 SEQ ID NO. 2 的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和包含選自SEQ ID N05或SEQ. ID NO. 1的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5任一項的雙特異性抗體，其中所述特異性結(jié)合DIG的抗原結(jié)合位點包含SEQ. ID NO. 4或SEQ. ID NO. 36作為重鏈Fd片段(VH和CHl)，和包含SEQ. ID NO. 6 或 SEQ. ID NO. 37 作為 L 鏈。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的雙特異性抗體，其中所述抗體是人源化的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項的雙特異性抗體，其中所述靶蛋白是細(xì)胞表面抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的雙特異性抗體，其中所述細(xì)胞表面抗原是腫瘤抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的雙特異性抗體，其中所述靶蛋白選自Her2，IGFlR， CD22, CD33, LeY, VEGFRl, Her2 (Lieberman)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項的雙特異性抗體，其中所述核酸是治療或診斷劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項的雙特異性抗體，其中所述核酸是雙鏈RNA。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項的雙特異性抗體，其中所述核酸與轉(zhuǎn)染試劑綴合。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的雙特異性抗體，其中所述轉(zhuǎn)染試劑是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑或轉(zhuǎn)染肽。
15.權(quán)利要求1-14中任一項的雙特異性抗體，其中核酸與內(nèi)體逃逸或破壞模塊連接。
16.權(quán)利要求15的雙特異性抗體，其中核酸與介導(dǎo)內(nèi)體逃逸或破壞的肽連接。
17.權(quán)利要求15的雙特異性抗體，其中內(nèi)體逃逸或破壞模塊包含動態(tài)多聚綴合物 (DPC)。
18.權(quán)利要求1-17中任一項的雙特異性抗體在將核酸遞送至靶細(xì)胞或組織中的用途。
19.權(quán)利要求1-18中任一項的雙特異性抗體用于靶向基因療法的用途。
20.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-19中任一項的雙特異性抗體，且所述雙特異性抗體與地高辛配基化的治療或診斷核酸相連接。
21.權(quán)利要求20的藥物組合物用于靶向基因療法的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對靶蛋白和半抗原的雙特異性抗體和抗體片段，其中所述半抗原為PEG或生物素，最優(yōu)選地高辛配基，并涉及其生產(chǎn)方法，其作為治療或診斷劑的遞送平臺的用途，包含所述抗體的藥物組合物及其用途。
文檔編號C07K16/44GK102481367SQ201080039430
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者A·哈斯, B·布拉姆利奇, E·霍夫曼, G·喬治斯, J·O·施特拉克, K·雅恩-霍夫曼, L·M·艾肯斯坦, M·格羅特, M·約翰, O·穆恩迪格爾, R·克羅斯代爾, S·迪爾, S·麥茨, U·布林克曼, W·多邁爾, W·舒爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司