專利名稱：膠原新表位抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以識(shí)別膠原新表位的單克隆抗體，基于所述抗體的免疫測(cè)定、基于所述抗體的測(cè)定方法、基于所述抗體的篩選方法、基于所述抗體的患者鑒別方法和基于所述抗體的試劑盒。
背景技術(shù)：
軟骨降解是骨關(guān)節(jié)炎(OA)和慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等關(guān)節(jié)疾病的主要特征。 監(jiān)控此類疾病中軟骨丟失的進(jìn)展情況為管理疾病(包括預(yù)后、診斷和處置)提供有效的信息。目前，通過(guò)X射線檢測(cè)關(guān)節(jié)腔變小來(lái)監(jiān)控軟骨丟失。但是，X射線診斷不能同時(shí)滿足檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。而且，X射線只顯示過(guò)去發(fā)生過(guò)軟骨丟失，而不顯示現(xiàn)在的軟骨降解情況。因此，監(jiān)控各種關(guān)節(jié)疾病中的軟骨破壞的進(jìn)展情況的替代方法是非常有價(jià)值的。目前已知軟骨中的膠原分解是通過(guò)被稱為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的一組酶進(jìn)行的。特別地，鑒于只有膠原酶(MMP-1、MMP_8和MMP-13)負(fù)責(zé)切斷未變性的II型膠原的3重螺旋，認(rèn)為膠原酶在975-976位的氨基酸殘基之間的切斷是之后由明膠酶等多種蛋白酶造成II型膠原從軟骨基質(zhì)脫離的關(guān)鍵事件。此外，此處的氨基酸殘基參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù) C0L2A1 (登錄號(hào)NP001835)的全長(zhǎng)序列。降解后的胞外基質(zhì)蛋白的片段從軟骨釋放到滑液中(SF)，之后通過(guò)血液在全身循環(huán)。因而，雖然血清或尿中的軟骨基質(zhì)蛋白質(zhì)片段的水平通常低于SF中的水平，但如果可以對(duì)其檢測(cè)，則能夠更簡(jiǎn)便地評(píng)估OA和RA中的軟骨降解。關(guān)于測(cè)定全身II型膠原片段存在2個(gè)主要問(wèn)題。第一，關(guān)節(jié)軟骨中的II型膠原的周轉(zhuǎn)(turnover)通常非常低，因而血清或尿中的II型膠原片段的水平也非常低。即使 OA軟骨中II型膠原的轉(zhuǎn)換增加，所述增加也不是明顯容易檢測(cè)的非常大的變化。因而需要靈敏度非常高的測(cè)定。第二個(gè)問(wèn)題是構(gòu)成膠原的大部分脯氨酸和賴氨酸殘基被羥基化修飾。特別地，由于脯氨酸是占膠原蛋白約3成的主要組成成分，在膠原酶切割位點(diǎn)附近也存在羥化脯氨酸，已知該羥化對(duì)結(jié)合親和力具有很大影響。包含在膠原中的脯氨酸的羥基化是由脯氨酰4-羥化酶以依賴于鐵離子和維生素 C的方式催化的，因此，羥基化程度易受膠原合成時(shí)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等的影響，不是恒定的。因而，期望的是用于測(cè)定II型膠原片段的抗體的結(jié)合親和力不受脯氨酸有無(wú)羥基化的影響。迄今為止，已經(jīng)發(fā)明了若干測(cè)定由膠原酶產(chǎn)生的II型膠原片段的系統(tǒng)，但無(wú)一具有足夠的靈敏度、準(zhǔn)確度。例如在Robin Poole等人的應(yīng)用單克隆抗體C0L2-3/4C long(專利文獻(xiàn)1)的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法中，對(duì)于膠原酶切割端結(jié)構(gòu)的特異性低，且對(duì)于切割位點(diǎn)上游第5位(從N末端起第971位)的脯氨酸的非羥基化形式幾乎沒(méi)有反應(yīng)性(非專利文獻(xiàn)1)。 此外，對(duì)于使用Otterness等人的單克隆抗體9A4 (專利文獻(xiàn)2)的夾心ELISA方法，對(duì)于膠原酶切割端結(jié)構(gòu)的特異性高，但由于從切割端起上游第5個(gè)殘基(從N末端起第971位)的脯氨酸的羥基化，結(jié)合親和力降低至約1/90 (非專利文獻(xiàn)2)。因此，對(duì)于大部分為羥基化形式的II型膠原片段的檢測(cè)靈敏度低。由此可見，目前為止的任一種抗體都易于受膠原酶切割位點(diǎn)緊鄰的脯氨酸羥基化修飾的影響，不能正確地測(cè)定羥基化形式和非羥基化形式混合存在的生物樣品中的膠原片段的量。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利f獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1 特許第四99416號(hào)專利文獻(xiàn)2 特許第3258630號(hào)。非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1 J Immunol Methods 294 (2004)第 145-153 頁(yè)非專利文獻(xiàn) 2 J Immunol Methods 247 (2001)第 25_；34 頁(yè)。發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明要解決的課題是正確地測(cè)定生物樣品中由膠原酶消化產(chǎn)生的膠原片段(膠原新表位)的量。用于解決課題的手段
本發(fā)明人深入研究了針對(duì)膠原新表位的單克隆抗體的制備，結(jié)果制備出新的單克隆抗體，即使新表位的脯氨酸變?yōu)榱u基化形式，所述抗體的結(jié)合能力也不變化，從而完成了本發(fā)明。換言之，本發(fā)明涉及
(1)特異性結(jié)合膠原新表位片段的單克隆抗體，所述抗體結(jié)合序列號(hào)20所示氨基酸序列的962位至975位，其在包含于所述表位中的脯氨酸為非羥基化形式的情況下的結(jié)合親和力與該脯氨酸為羥基化形式情況下的結(jié)合親和力實(shí)質(zhì)上相同；
(2)上述(1)記載的單克隆抗體，其中上述(1)記載的脯氨酸是序列號(hào)20所示氨基酸序列中的971位的脯氨酸；
(3)上述(1)記載的單克隆抗體，其中表位存在于序列號(hào)20所示氨基酸序列的957位至975位的區(qū)域中；
(4)上述(2)記載的抗體，在使由序列號(hào)14、17或18所示氨基酸序列組成的肽競(jìng)爭(zhēng)以便抑制所述抗體與由序列號(hào)2所示氨基酸序列組成的肽的免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定中，對(duì)任一種肽的所述免疫反應(yīng)的50%抑制濃度在0. 04 μ M以下；
(5)單克隆抗體，其具有
1)互補(bǔ)決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)KYGIN(序列號(hào)5)、 WINTYSGMTTYADDFKG (序列號(hào) 6)和 SLGYDYGGFAY (序列號(hào) 7)，以及
2)互補(bǔ)決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)RSGQTLVHDNENTYFH(序列號(hào)8)、 KISNRFS (序列號(hào) 9)和 SQNTHVPFT (序列號(hào) 10)；
(6)單克隆抗體，其具有
1)具有序列號(hào)3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和
2)具有序列號(hào)4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；
(7)上述(1)-(6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體，其是被標(biāo)記的；(8)使用上述(1)- (6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體的免疫測(cè)定；
(9)使用上述(1)-(6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定膠原新表位片段含量的方法；
(10)測(cè)定膠原酶活性的方法，其以使用上述(1)-(6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定的膠原新表位片段的含量為指標(biāo)；
(11)篩選膠原酶抑制劑的方法，其以使用上述(1)-(6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定的膠原新表位片段的含量為指標(biāo)；
(12)鑒別膠原酶相關(guān)性疾病的患者的方法，包括使用上述(1)-(6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定生物樣品中含有的膠原新表位片段的含量的步驟；
(13)包含上述(1)-(6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體的試劑盒；
(14)診斷膠原酶相關(guān)性疾病的方法，包括使用上述(1)-(6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定生物樣品中含有的膠原新表位片段的含量的步驟；和
(15)上述(1)-(6)的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體，其用于診斷膠原酶相關(guān)性疾病。發(fā)明的效果
本發(fā)明的單克隆抗體可以特異性識(shí)別新表位末端結(jié)構(gòu)，不受脯氨酸羥基化修飾的影響，因而可以正確地檢測(cè)、定量生物體中的膠原新表位片段量。
圖1 顯示了膠原酶切割位點(diǎn)，其在三聚螺旋結(jié)構(gòu)的纖維狀膠原(I型、II型和III 型)的示意圖中的氨基末端起2/3的位置。下方顯示了各種動(dòng)物的II型膠原的膠原酶切割位點(diǎn)及其前后的氨基酸序列。從上至下是人、牛、狗、大鼠、小鼠的順序。用星號(hào)顯示了切割位點(diǎn)是975-976氨基酸殘基之間，相當(dāng)于人II型膠原的954-980位。圖2 顯示了利用具有20A10的各種C末端結(jié)構(gòu)的肽片段的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定的結(jié)^ ο圖3 上部分的圖顯示了利用膠原酶消化和未消化的膠原對(duì)20A10的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定的結(jié)果。下方的表顯示膠原酶消化引起的特異性的改變以及I型、II型和III型膠原片段之間的交叉反應(yīng)性。圖4 顯示了利用與II性膠原特異性單克隆抗體組合的夾心免疫測(cè)定的結(jié)果。圖5 顯示了在添加1. 2 ng/孔MMP-13引起的II性膠原降解反應(yīng)中，在添加各種濃度的MMP抑制劑的情況下，膠原新表位片段濃度的測(cè)定值。圖6 顯示了在存在1 ng/ml白介素1的牛軟骨外植體培養(yǎng)中，在添加各種濃度的 MMP抑制劑的情況下，膠原新表位片段濃度的測(cè)定值。圖7 顯示了 20A10的可變區(qū)的氨基酸序列。上部分是重鏈的可變區(qū)，下部分是輕鏈的可變區(qū)。此外，分別附有下劃線的序列表示互補(bǔ)決定區(qū)的位置。具體實(shí)施方案 I.抗體
作為纖維狀膠原的I型、II型和III型膠原是由3條肽鏈螺旋狀卷曲在一起形成的， 膠原酶(例如，MMP-I、MMP-8和MMP-13)在自N末端3 1的位置(975-976位氨基酸殘基之間)切割未變性狀態(tài)的這些纖維狀膠原的三重螺旋。并且將新生成N末端四分之三片段的 C末端、和C末端四分之一片段的N末端的末端結(jié)構(gòu)稱為“新表位”(圖1)。此外，將切割生成的膠原酶片段稱為“膠原新表位片段”。其中，已知人II型膠原(登錄號(hào)NP_001835) C端的新表位部分(對(duì)應(yīng)于969-975位；下文中也稱為C末端新表位)的7個(gè)氨基酸殘基 Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly(序列號(hào)1)在從人到小鼠的動(dòng)物物種之間是保守的。此外， 膠原是以高羥脯氨酸含量為特征的蛋白質(zhì)之一，其序列自C端第5位(或者自N端第971位) 的脯氨酸殘基在大部分情況下成為羥基化形式(下文中也稱為羥化形式或羥脯氨酸)，(序列號(hào)2 =Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Gln-Gly,Hyp是羥脯氨酸)其比例易受膠原合成時(shí)的健康狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響，并非恒定，因而被認(rèn)為阻礙膠原新表位片段的正確定量。因此，如果在免疫學(xué)測(cè)定膠原降解的情況下，檢測(cè)新表位的抗體的特性固有地期望可以同等程度地免疫特異性識(shí)別羥基化形式和非羥基化形式(脯氨酸)。本發(fā)明的單克隆抗體具有這樣的特征，即使包含在C末端具有新表位的II型膠原新表位片段(序列號(hào)20)中的脯氨酸變?yōu)榱u基化形式，所述單克隆抗體的結(jié)合親和力也不發(fā)生改變。在此，“結(jié)合親和力不發(fā)生改變”意指在構(gòu)成新表位的氨基酸殘基是脯氨酸(非羥基化形式)的情況下以及在羥脯氨酸(羥基化形式)的情況下，結(jié)合親和力實(shí)質(zhì)上相同。“結(jié)合親和力”一般指免疫球蛋白分子與該免疫球蛋白分子特異性的抗原之間產(chǎn)生的類型為非共價(jià)結(jié)合的相互作用的強(qiáng)度或親和力，通?？梢杂媒怆x常數(shù)(Kd)表示?！皩?shí)質(zhì)上相同”具體意指羥基化形式(羥脯氨酸)的結(jié)合親和力是在非羥基化形式的結(jié)合親和力數(shù)值的80%-120%的范圍內(nèi)，優(yōu)選在90%-110%的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在95%-105% 的范圍內(nèi)。此外還意指在非羥基化形式(脯氨酸)的情況下和羥基化形式的情況下的交叉反應(yīng)性是80%以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上?？梢酝ㄟ^(guò)已知的方法，例如使用ELISA 測(cè)定的katchard分析(例如，Campbell, 1991 ；Segel, 1976)確定抗體的結(jié)合親和力。此類單克隆抗體的代表性實(shí)例可列舉20A10。圖6顯示了 20A10的可變區(qū)的氨基酸序列。上部分表示重鏈(序列號(hào)3)的序列，下部分表示輕鏈(序列號(hào)4)的序列。此外，下劃線部分表示互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)(序列號(hào)5-10)。用于制備本發(fā)明的單克隆抗體的免疫原可以是例如通過(guò)徹tibodies:A Laboratory Manual (1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)等i己載的方法帝[J備的。免疫方法可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行，例如將免疫原通過(guò)靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)注射等施用到哺乳動(dòng)物體內(nèi)。更具體的是，例如用含有生理鹽水的磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水等將免疫原稀釋到恰當(dāng)?shù)臐舛?，按需要與常規(guī)的佐劑組合使用，以2-3周的時(shí)間間隔分若干次施用到受試動(dòng)物體內(nèi)。在使用小鼠的情況下，每次的施用量是一只50-100μ g 左右。在本文中，佐劑是指與抗原共同施用時(shí)，非特異性地增加對(duì)于抗原的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。常用的佐劑可列舉百日咳疫苗、弗氏佐劑等。通過(guò)在最后免疫后第3-10天對(duì)哺乳動(dòng)物采血，可以獲得抗血清?？扇缦聦?shí)施單克隆抗體的制備方法，制備用免疫原免疫的哺乳動(dòng)物的漿細(xì)胞(免疫細(xì)胞)和哺乳動(dòng)物的漿細(xì)胞瘤細(xì)胞(骨髓瘤細(xì)胞)的融合細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)，從雜交瘤細(xì)胞選擇產(chǎn)生識(shí)別5-脫氧-5-甲硫腺苷的期望單克隆抗體的克隆，培養(yǎng)所述克隆。所述單克隆抗體的制備基本可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。在所述方法中，考慮與細(xì)胞融合中使用的漿細(xì)胞瘤細(xì)胞的相容性來(lái)選擇用免疫原免疫的哺乳動(dòng)物是理想的，可使用小鼠、大鼠等。免疫方法與制備多克隆抗體的情況是相同的。但在最后免疫后第3-10天從免疫動(dòng)物中采集脾細(xì)胞。為了從所獲得的免疫細(xì)胞獲得雜交瘤，可以通過(guò)例如“分子細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法”(南江堂堀江武一等人，1994年出版)等記載的方法，以形成可以傳代培養(yǎng)的細(xì)胞為目的，在存在例如仙臺(tái)病毒或聚乙二醇的條件下，使?jié){細(xì)胞瘤細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞融合，獲得雜交瘤。在本文中使用的漿細(xì)胞瘤細(xì)胞期望使用同一恒溫動(dòng)物或同種恒溫動(dòng)物來(lái)源的漿細(xì)胞瘤細(xì)胞，例如，在與以小鼠為免疫動(dòng)物獲得的脾細(xì)胞融合的情況下，優(yōu)選使用小鼠雜交瘤細(xì)胞。可以利用P3x63-Ag8. UI等公知的漿細(xì)胞瘤細(xì)胞?？梢匀缦芦@得雜交瘤，通過(guò)HAT培養(yǎng)基(補(bǔ)充了次黃嘌呤、氨喋呤、胸苷的培養(yǎng)基) 選擇，在確認(rèn)有克隆的階段，通過(guò)檢查(篩選)分泌到培養(yǎng)基上清液中的抗體與抗原的結(jié)合， 獲得產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤。篩選方法可列舉例如斑點(diǎn)法、凝聚反應(yīng)法、Western印跡法、ELISA法等一般用于檢測(cè)抗體的各種方法，優(yōu)選例如下述實(shí)施例中詳細(xì)描述的，對(duì)雜交瘤的培養(yǎng)上清液實(shí)施以與新表位肽的反應(yīng)性為指標(biāo)的ELISA方法。根據(jù)所述篩選，可以篩選出與新表位肽特異性反應(yīng)的目標(biāo)抗體生產(chǎn)株?？寺?0A10是基于該過(guò)程獲得的克隆的示例。作為篩選結(jié)果所獲得的可以生產(chǎn)目標(biāo)抗體的株的克隆可以通過(guò)常規(guī)的有限稀釋法、軟瓊脂法等來(lái)實(shí)施。必要時(shí)，可以用血清培養(yǎng)基或無(wú)血清培養(yǎng)基大量培養(yǎng)克隆的雜交瘤。通過(guò)所述培養(yǎng)，可以以培養(yǎng)上清液的方式獲得較高純度的所需抗體。此外，可以在與雜交瘤相容的哺乳動(dòng)物例如小鼠等的腹腔中接種雜交瘤，以小鼠腹水的方式大量回收所需抗體。含有產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤的培養(yǎng)上清液和小鼠腹水可以不進(jìn)行純化或修飾地作為粗制抗體溶液使用。此外，可以通過(guò)使上述培養(yǎng)上清液或腹水接受飽和硫酸銨、離子交換層析(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱等親和柱層析等，對(duì)單克隆抗體進(jìn)行分離、純化。此外，本發(fā)明的單克隆抗體可以使用重組抗體，所述重組抗體是通過(guò)克隆抗體基因、整合到合適的載體中、將所述載體導(dǎo)入宿主中，利用基因重組技術(shù)產(chǎn)生的(例如，Carl等人，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，1990 年出版)。具體而言，合成編碼目標(biāo)抗體(例如20A10)的可變區(qū)(例如，如果是20A10的話，是序列號(hào) 3 和 4)的 cDNA。cDNA 的合成和擴(kuò)增可使用 5' -Ampli FINDER RACEKitCClonetech 生產(chǎn))和利用 PCR 的 5' -RACE 方法(Frohman, Μ. A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988，第85卷，第8998頁(yè)等)。從獲得的PCR產(chǎn)物中純化目標(biāo)DNA片段，與載體DNA連接。 進(jìn)一步如此制備重組載體，導(dǎo)入大腸桿菌等中挑選克隆，制備所需的重組載體。通過(guò)公知的方法例如雙脫氧方法確定目標(biāo)DNA的堿基序列。一旦獲得編碼目標(biāo)抗體的V區(qū)的DNA，就將其與編碼所需的抗體恒定區(qū)(C區(qū))的 DNA連接，將連接產(chǎn)物整合到表達(dá)載體中。此外，也可以將編碼抗體的V區(qū)的DNA整合到包含抗體C區(qū)的DNA的表達(dá)載體中。為了制備本發(fā)明中使用的抗體，將抗體基因整合到表達(dá)載體中以便在表達(dá)控制區(qū)例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。之后，可以通過(guò)該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)抗體。對(duì)于抗體基因的表達(dá)，可以將抗體的重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)分別整合到表達(dá)載體中并同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主，或者也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA整合到單個(gè)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化宿主(參考 W094/11523)。使用抗體進(jìn)行如下所述的免疫測(cè)定(免疫學(xué)測(cè)定方法)等時(shí)，為了可以檢測(cè)抗體的行為，一般用各種物質(zhì)標(biāo)記抗體本身。本發(fā)明的單克隆抗體的優(yōu)選形式，可列舉標(biāo)記的單克隆抗體。標(biāo)記抗體可以通過(guò)使用例如“分子細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法”(南江堂堀江武一等人，1994年出版)等記載的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。各種物質(zhì)可列舉化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、熒光物質(zhì)、有色珠子、放射性同位素、元素、金屬、生物素等。下文示例了具體實(shí)例，但不限于此?；瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)指例如魯米諾和吖啶酯等。酶指例如半乳糖苷酶、堿性磷酸酶和過(guò)氧化物酶等。熒光物質(zhì)指例如銪的穴狀化合物(europium cryptate)、FITC和RITC等。著色珠子指例如蛋白A珠子、小麥胚芽凝聚素(WGA)珠子、鏈霉親和素珠子等。放射性同位素指例如 14C、125I和3H等。元素指例如銪等鑭系元素。金屬指例如鐵蛋白和金膠粒等。II.免疫測(cè)定
本發(fā)明的單克隆抗體可以特異性識(shí)別膠原新表位片段的C末端新表位結(jié)構(gòu)。此外，該新表位是不依賴于膠原類型的。因此，例如，通過(guò)與能夠識(shí)別各種膠原的特異性表位的抗體 (制備方法參見上文)組合進(jìn)行夾心測(cè)定，可以對(duì)任何膠原定量膠原新表位片段。對(duì)各類型膠原的特異性序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，可列舉以下序列。I 型膠原特異性序列Gly4er-Pro-Gly-Ala-Asp-Gly-Pro-Ala (序列號(hào) 11)
II型膠原特異性序列Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro4er (序列號(hào) 12)
III型膠原特異性序列Gly-Glu-Lys-Gly-kr-Pro-Gly-Ala-Gln (序列號(hào) 13)。不論本發(fā)明的單克隆抗體是否被標(biāo)記，其都可用于免疫測(cè)定(免疫學(xué)測(cè)定方法) 中。使用本發(fā)明的單克隆抗體的免疫測(cè)定可以是競(jìng)爭(zhēng)性的測(cè)定，也可以是非競(jìng)爭(zhēng)性的測(cè)定。 “在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，抗體的免疫反應(yīng)的50%抑制濃度在0. 04 μ M以下”意指，例如當(dāng)添加了 0. 04 μ M的由序列號(hào)14、17或18所示氨基酸序列組成的肽時(shí)，由序列號(hào)2所示氨基酸序列組成的肽與抗體的結(jié)合的抑制率在50%以上(實(shí)施例2)。50%抑制濃度優(yōu)選在0. 04 μ M以下，更優(yōu)選在0.022 μ M以下。此外，可以是均質(zhì)測(cè)定法(由均質(zhì)的體系測(cè)定)，也可以是異質(zhì)測(cè)定法(由非均質(zhì)的體系測(cè)定)。具體而言，可列舉例如酶免疫測(cè)定法(ΕΙΑ)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、熒光免疫測(cè)定法(FIA)、放射性免疫測(cè)定法(RIA)、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定 (TR-FIA)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法、免疫印跡法、Wfestern印跡法、免疫染色法、SPA法、熒光偏振測(cè)定法(FP)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)等。本發(fā)明的免疫測(cè)定的優(yōu)選形式可列舉ELISA法。ELISA法是使用酶標(biāo)記的抗體或抗原通過(guò)標(biāo)記酶的活性定量抗體或抗原的量的方法。該方法使用用酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物與游離的標(biāo)記抗原，或用于分離抗體的固相化抗體或抗原。固相可利用瓊脂、微量滴定板的內(nèi)表面、乳膠粒子等。ELISA法具體可列舉競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定或夾心免疫測(cè)定等。此外，標(biāo)記的酶可列舉辣根過(guò)氧化物酶(下文也稱為HRP)、堿性磷酸酶等。III.實(shí)用性
本發(fā)明的單克隆抗體和免疫測(cè)定可用于各種用途中。例如，本發(fā)明的單克隆抗體和免疫測(cè)定可用于測(cè)定MMP等膠原酶的活性中。已知三類膠原酶可以切割未變性狀態(tài)下的作為纖維狀膠原的I型、II型、III型膠原的三重螺旋鏈(Pendas AM等人，Genomics (1995) 26: 615-8 ；和 Mitchell PG 等人，J Clin Invest (1996) 97: 761-8)。本發(fā)明的單克隆抗體可以特異性識(shí)別由膠原酶切割產(chǎn)生的新表位片段，因此可以測(cè)定所述片段的量，可評(píng)估膠原酶的活性。此外，本發(fā)明的單克隆抗體和免疫測(cè)定可用于以膠原酶新表位片段的含量為指標(biāo)的篩選方法中。此類篩選是在存在測(cè)試物質(zhì)時(shí)，將通過(guò)表達(dá)載體等制備的重組膠原酶(純化或部分純化的)維持在可以與所述酶的底物(膠原)結(jié)合的條件下(例如0. 1 M磷酸緩沖溶液，PH 7. 4，室溫)，研究測(cè)試物質(zhì)是否抑制該酶與底物結(jié)合，換言之定量膠原新表位片段。此時(shí)，測(cè)試物質(zhì)可以是肽、蛋白質(zhì)、非肽類化合物、合成化合物(低分子化合物等)、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動(dòng)物組織提取液等的任一種。此外也可以是含有上述物質(zhì)的樣品。通過(guò)篩選，作為膠原酶抑制劑鑒別出的候選物質(zhì)可以作為已知與膠原酶相關(guān)的疾病(例如骨關(guān)節(jié)炎、以癌癥為首的增殖性疾病、骨質(zhì)疏松、阿茲海默氏病、高血壓)的預(yù)防、治療劑。此外，本發(fā)明的單克隆抗體和免疫測(cè)定可用于疾病患者的鑒別方法，所述方法包括測(cè)定包含在生物樣品中的膠原新表位片段含量的步驟。例如，本發(fā)明的免疫測(cè)定可以測(cè)定來(lái)自患者的生物樣品(在臨床采樣中一般被測(cè)試的任何生物學(xué)液體。例如血液、尿、唾液和汗等體液，且包括細(xì)胞和/或組織的提取物和上清液)中的膠原表位片段的含量。此外， 生物樣品是對(duì)患者沒(méi)有危險(xiǎn)、易于獲得的，而且測(cè)定是簡(jiǎn)單且便宜的。因此，可以大量日常地診斷以膠原新表位片段的含量為進(jìn)展指標(biāo)的疾病(例如，骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，和其他產(chǎn)生骨的良性腫瘤和惡性腫瘤、軟骨破壞的疾病)。進(jìn)一步地，本發(fā)明的單克隆抗體和免疫測(cè)定能夠用于確定患不同類型的骨關(guān)節(jié)炎或慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中的進(jìn)行性軟骨膠原降解的程度。此外，本發(fā)明的試劑盒的特征是含有本發(fā)明的單克隆抗體作為用于檢測(cè)被測(cè)樣品中的膠原新表位片段的結(jié)合劑。此類試劑盒更通常含有1個(gè)以上用于執(zhí)行測(cè)定所需的構(gòu)成要素。構(gòu)成要素可以是標(biāo)準(zhǔn)品、試劑(稀釋液、緩沖液等)、容器/或裝置。例如，試劑盒內(nèi)的 1個(gè)容器可含有結(jié)合膠原類型特異性的序列(例如，序列號(hào)11-13)的單克隆抗體。此類抗體可以附著在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何支持材料(例如，微量滴定板中的孔、硝酸纖維素等合適的膜)上提供。進(jìn)一步的，可以含有應(yīng)該在測(cè)定中使用的構(gòu)成要素(例如，試劑或緩沖液)?？蛇x地，此類試劑盒還可以用適合直接檢測(cè)或間接檢測(cè)抗體結(jié)合的上述物質(zhì)來(lái)標(biāo)記。在下文中，通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于下列實(shí)施例。另外， 除非另夕卜指定，貝lJ使用記載在 ^KwocAeffli1Sizy in Practice (Blackwe 11 Scientific Publications)中的方法作為抗體制備方法。此外，除非另外指定，基因工程學(xué)技術(shù)使用 i己載 ^ Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(Cold Spring Harbor Laboratory)中白勺^ti。實(shí)施例1 制備膠原新表位抗體 (1)抗原免疫
合成含有Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Gln-Gly (序列號(hào)2)所示羥脯氨酸的新表位肽 (Greiner Bio-one生產(chǎn))。將IOmg合成的新表位肽溶解在Iml含有5mM EDTA的0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，將IOmg的巨匙孔血藍(lán)蛋白(馬來(lái)酰亞胺化KLH，PIERCE公司生產(chǎn))溶解在Iml純化水中，將上述溶液混合，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，再在4°C反應(yīng)過(guò)夜。用蒸餾水透析上述混合液后，冷凍干燥，獲得13mg新表位肽-KLH復(fù)合物。將0. Img該肽-KLH復(fù)合物與弗氏完全佐劑一起施用到7只4周齡的A/J JmsSlc 雌性小鼠的腹腔內(nèi)，作為首次免疫。之后，在21天后、42天后和63天后，將0. Img肽-KLH 復(fù)合物與弗氏不完全佐劑一起加強(qiáng)免疫，再在71天后，將0. Img該肽-KLH復(fù)合物懸浮在 0. Iml生理鹽水中的溶液施用到腹腔內(nèi)，作為最終免疫。(2 )新表位肽的生物素標(biāo)記
將0. 2mg合成的新表位肽溶解在0. 4ml含有5mM EDTA的0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 6. 0) 中，將0. 6mg的PEO-馬來(lái)酰亞胺活化的生物素(PIERCE公司生產(chǎn))溶解在0. Iml蒸餾水中， 將上述溶液混合，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，用反相HPLC純化生物素標(biāo)記的新表位肽。(3)制備雜交瘤
在最終免疫后的第3天，摘出脾臟，回收脾細(xì)胞。用50%聚乙二醇4000將脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(p3X63-Ag8.Ul，東京腫瘤研究所)融合，用含有次黃嘌呤、氨喋呤和胸苷的培養(yǎng)基選擇。(4)選擇新表位抗體
在細(xì)胞融合10天后，使用如下說(shuō)明的ELISA篩選特異性抗體的生產(chǎn)細(xì)胞。在384孔微量滴定板(頭)公司生產(chǎn))的各孔中，添加35 μ 1含0. 35 μ g抗小鼠IgG抗體(Shibayagi 公司生產(chǎn))的Tris緩沖液(50mM Tris_HCl，pH7. 5)，4°C下固定16小時(shí)。用90 μ 1洗滌溶液(含0.01% Tween20的生理鹽水)洗滌這些孔1次后，添加90μ1 Block Ace (大日本制藥公司生產(chǎn))，在室溫放置2小時(shí)，進(jìn)行封閉(抗小鼠IgG抗體固相化平板)。用90 μ 1洗滌溶液洗滌1次各孔后，將含有15 μ 1雜交瘤培養(yǎng)上清液的10 μ 1緩沖液A (含0. 5%牛血清白蛋白、0. 01% Tween80、0. 05% Proclinl50、0. 15M NaCl 的 50mM Tris 緩沖液，pH7. 4)和含有0. 05ng生物素標(biāo)記的新表位肽和2ng鏈霉親和素-HRP (PIERCE公司生產(chǎn))的10 μ 1緩沖液A混合，在4°C下反應(yīng)16小時(shí)。之后，用90 μ 1洗滌溶液洗滌3次各孔后，添加25 μ 1的TMB-Substrate Chromogen (DAK0公司生產(chǎn))，室溫下生色30分鐘后，添加25 μ 1的0. 05Μ硫酸，終止反應(yīng)， 測(cè)量450nm下的吸光度。根據(jù)篩選的結(jié)果，在與含羥脯氨酸的新表位肽反應(yīng)的9個(gè)雜交瘤克隆中，選擇3個(gè)與不含羥脯氨酸的新表位肽也表現(xiàn)出親和力的雜交瘤克隆。在所獲得的克隆中，選擇1個(gè)克隆，所述克隆不論有無(wú)羥基化都對(duì)新表位肽表現(xiàn)出強(qiáng)親和力，且膠原酶消化的II型膠原抑制它與上述新表位肽的結(jié)合，將其命名為20A10。使用小鼠單克隆抗體同種分型ELISA試劑盒(BD Biosciences公司生產(chǎn))研究20A10同種型，結(jié)果是IgGl/κ。實(shí)施例2
使用合成肽解析新表位抗體(20Α10)的表位
使用具有以下氨基酸序列的新表位肽，通過(guò)以下方法進(jìn)行對(duì)新表位抗體(20Α10)的新表位識(shí)別特異性的研究。Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-HyP-Gly-Pro-Gln-Gly (對(duì)應(yīng)于序列號(hào) 20所示氨基酸序列的962-975位，序列號(hào)14)
Gly-Pro-Gln-Gly (對(duì)應(yīng)于 972-975 位，序列號(hào)15)
Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-Arg (對(duì)應(yīng)于序列號(hào) 20 所示氨基酸序列的969-980位，序列號(hào)16)
Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-HyP-Gly-Pro-Gln-G Iy (對(duì)應(yīng)于序列號(hào)20所示氨基酸序列的957-975位，序列號(hào)17)
Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gln-G Iy (對(duì)應(yīng)于序列號(hào)20所示氨基酸序列的957-975位，序列號(hào)18)。在96孔微量滴定板(頭)公司生產(chǎn))中添加150 μ 1含有1. 5 μ g抗小鼠IgG抗體(力" < 公司生產(chǎn))的1^18緩沖液(50!111 Tris-HCl，pH7. 5)，4°C下固定過(guò)夜。用0. 3ml 洗滌溶液(含0. 01% Tween20的生理鹽水)洗滌1次各孔后，添加0. 3ml Block Ace (大日本制藥公司生產(chǎn))，在室溫放置2小時(shí)，進(jìn)行封閉(抗小鼠IgG抗體固相化平板)。用0. 3ml洗滌溶液洗滌1次各孔后，將含有0. 001-125 μ M的上述各新表位肽的50 μ 1緩沖液Α，與含有 0. Ing生物素標(biāo)記的新表位肽(序列號(hào)2)和4ng鏈霉親和素-HRP4的50 μ 1緩沖液Α，和含有0. 5ng新表位抗體(20Α10)的50 μ 1緩沖液A分別混合，在4°C下反應(yīng)16小時(shí)。之后，用 0. 3ml洗滌溶液洗滌3次各孔后，添加0. Iml的TMB-Substrate Chromogen，室溫下生色30 分鐘后，添加0. Iml的0. 05M硫酸，終止反應(yīng)，測(cè)量450nm下的吸光度。其結(jié)果是，新表位肽的975位的甘氨酸殘基的羧基端是與抗新表位抗體20A10的結(jié)合必需的，以及從該末端起上游5個(gè)殘基以上是必需的(圖2的上部分的圖和下部分的表格)。此外，使用這樣的肽按上述方法進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定，所述肽是在由19個(gè)殘基組成的II型膠原的C端新表位部分的肽中第971位是羥脯氨酸的肽、和第971位是脯氨酸的肽。其結(jié)果是，非羥基化形式的交叉反應(yīng)性為91%，確定幾乎不受自末端起上游第5位的脯氨酸殘基是否羥基化的影響(圖2的中部的圖和下部分的表格)。已報(bào)道，人軟骨膠原中的第 971位脯氨酸殘基以81%的比例被羥基化修飾的例子。此外，已報(bào)道了被現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道過(guò)的新表位抗體9A4對(duì)同一位置的脯氨酸羥基化形式的親和力比對(duì)非羥基化形式的親和力低 90 倍以上(Downs JT 等人，Journal of Immunological methods, 247: 25-34 (2001))。 與之相對(duì)，20A10可以以相等的親和力結(jié)合非羥基化形式和羥基化形式中的任一種，因此對(duì)新表位片段的檢測(cè)靈敏度高，即使羥基化修飾的比例發(fā)生改變也能夠正確地定量。實(shí)施例3
在10μ g/ΙΟμ 1的人I型、II型或III型膠原溶液(Chondrex公司生產(chǎn))中，添加10 μ 1 的 2 χ 酶反應(yīng)緩沖液(含有 0. 3Μ NaClUOmM CaCl2、0. 005% Bri j35 的 50mM Tris 緩沖液， pH7. 6)進(jìn)行中和，添加0. 2μ g人活化MMP13 (將人Pro-MMP 13 (Calbiochem公司生產(chǎn))在 ImM APMA中37°C下孵育2小時(shí)活化而成)，37°C下反應(yīng)過(guò)夜。之后，加入終止液(EDTA，終濃度5mM)，形成天然型新表位溶液。在384孔微量滴定板(頭、y ”公司生產(chǎn))中，添加35 μ 1含0. 35 μ g抗小鼠IgG-Fc 抗體(Jackson Immuno Research 公司生產(chǎn))的 Tris 緩沖液(50mM Tris_HCl，pH7. 5)，4°C下固定過(guò)夜。用90 μ 1洗滌溶液(含0. 01% Tween20的生理鹽水)洗滌1次各孔后，添加0. Iml Block Ace (大日本制藥公司生產(chǎn))，在室溫放置2小時(shí)，進(jìn)行封閉(抗小鼠IgG抗體固相化平板)。用90 μ 1洗滌溶液洗滌1次各孔后，將含有6. 4-250ηΜ的天然型新表位溶液的10 μ 1緩沖液Α、和含有l(wèi)ng/ml生物素標(biāo)記的新表位肽(序列號(hào)2)和200ng/ml鏈霉親和素-HRP的10 μ 1緩沖液Α、和含有15ng/ml的新表位抗體(20A10)的10 μ 1緩沖液A分別混合，在4°C下反應(yīng)16小時(shí)。之后，用90 μ 1洗滌溶液洗滌3次各孔后，添加25 μ 1的TMB-Substrate Chromogen (DAK0公司生產(chǎn))，室溫下生色30分鐘后，添加25 μ 1的0. 05Μ硫酸，終止反應(yīng)， 測(cè)量450nm下的吸光度。其結(jié)果是，確認(rèn)抗新表位抗體20A10不與MMP13未消化的膠原反應(yīng)，但與含有新表位末端的、MMP13消化的膠原特異性反應(yīng)。此外，可確認(rèn)20A10以幾乎相同的親和力與I型、 II型或III型膠原的任一種的新表位結(jié)合(圖3)。因此，即使所述抗體與大量未消化的膠原共存，也不產(chǎn)生背景，可以高靈敏度地檢測(cè)膠原的消化片段，因而能夠正確地定量膠原酶活性。此外，通過(guò)作為夾心抗體(捕獲抗體)與能夠識(shí)別I型或III型膠原中的特異性部位的抗體組合，也可以測(cè)定I型和III型膠原的分解。實(shí)施例4
構(gòu)津測(cè)定II型膠原特異件新表位的體系
為了測(cè)定II型膠原，以對(duì)應(yīng)于C末端具有新表位的II型膠原新表位的一部分(對(duì)應(yīng)于序列號(hào)20所示氨基酸序列的957-965位)的合成肽Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-S er (序列號(hào)12)作為免疫原，在氨基末端添加半胱氨酸接頭，將羧基末端酰胺化。將2. Img 該合成肽溶解在Iml含5mM EDTA的0. IM磷酸鹽緩沖液(ρΗ6. 0)中，將8mg的巨匙孔血藍(lán)蛋白(馬來(lái)酰亞胺化KLH，PIERCE公司生產(chǎn))溶解在3ml含5mM EDTA的0. IM磷酸鹽緩沖液 (ρΗ6. 0)中，將上述溶液混合，室溫下反應(yīng)3小時(shí)。用蒸餾水透析上述混合液后，冷凍干燥，獲得8mg II型膠原特異性內(nèi)部序列肽-KLH復(fù)合物。將0. 004mg該肽-KLH復(fù)合物與弗氏完全佐劑一起施用到4周齡的A/J Jms Slc和Balb/c雌性小鼠各4只的腹腔內(nèi)，作為首次免疫。之后，在21天后、42天后和63天后，將0. Img肽-KLH復(fù)合物與弗氏不完全佐劑一起加強(qiáng)免疫，再在71天后，將0. Img該肽-KLH復(fù)合物懸浮在0. Iml生理鹽水中的溶液施用到腹腔內(nèi)，作為最終免疫。將0. 2mg合成肽溶解在0. Iml含有5mM EDTA的0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，將0. 25mg的HPDP-生物素(PIERCE公司生產(chǎn))溶解在0. Iml 二甲基甲酰胺中，將上述溶液混合，4°C下反應(yīng)過(guò)夜后，用反相HPLC純化生物素標(biāo)記的肽。在最終免疫后的第3天，摘出脾臟，回收脾細(xì)胞。用50%聚乙二醇4000將脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(p3 X 63_Ag8. Ul，東京腫瘤研究所)融合，用含有次黃嘌呤、氨喋呤和胸苷的培養(yǎng)基選擇。在細(xì)胞融合10天后，使用如下說(shuō)明的ELISA篩選特異性抗體的生產(chǎn)細(xì)胞。在384孔微量滴定板(3 > ”公司生產(chǎn))的各孔中，添加35μ 1含0. 35 μ g抗小鼠IgG抗體(ν <公司生產(chǎn))的Tris緩沖液(50mM Tris-HCl， pH7. 5)，4°C下固定16小時(shí)。用90 μ 1洗滌溶液(含0.01% Tween20的生理鹽水)洗滌1次這些孔后，添加90μ1 Block Ace(大日本制藥公司生產(chǎn))，在室溫放置2小時(shí)，進(jìn)行封閉(抗小鼠IgG抗體固相化平板)。用90 μ 1洗滌溶液洗滌1次各孔后，將含有15 μ 1雜交瘤培養(yǎng)上清液的 10 μ 1 緩沖液 A (含 0. 5% 牛血清白蛋白、0. 01% Tween80、0. 05% Proclinl50、0. 15M NaCl的50mM Tris緩沖液，pH7. 4)和含有0. 05ng生物素標(biāo)記的肽和2ng鏈霉親和素-HRP (PIERCE公司生產(chǎn))的10 μ 1緩沖液A混合，在4°C下反應(yīng)16小時(shí)。
12
之后，用90 μ 1洗滌溶液洗滌3次各孔后，添加25 μ 1的TMB-Substrate Chromogen (DAK0公司生產(chǎn))，室溫下生色30分鐘后，添加25 μ 1的0. 05Μ硫酸，終止反應(yīng)， 測(cè)量450nm下的吸光度。根據(jù)篩選的結(jié)果，選擇4個(gè)與II型膠原的免疫原肽(序列號(hào)12) 表現(xiàn)出強(qiáng)親和力、但不與其他類型的膠原反應(yīng)的雜交瘤克隆。在所獲得的克隆中，選擇1個(gè)與天然II型膠原反應(yīng)，但不與I型、III型膠原反應(yīng)的克隆，將其命名為6G4。6G4不與未變性的II型膠原反應(yīng)，但與膠原酶消化后的變性II型膠原反應(yīng)。誦i寸喪心ELISA方法構(gòu)律定量測(cè)丨定II型膠原新表擬的彳本系
合成含有新表位和膠原類型特異性的內(nèi)部序列的、由22個(gè)殘基組成的合成肽Gly-Glu -Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Asp-Asp-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Gln-Gly(對(duì)應(yīng)于954-975位，序列號(hào)19)，作為校正標(biāo)準(zhǔn)肽。制備HRP標(biāo)記的20A10。S卩，在0. 5ml 含有Img 20A10的IgG級(jí)分和5mM EDTA的0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 6. 0)中，添加0. IM巰基乙胺(mercaptoethylamine)水溶液0. 05ml，37 °C下反應(yīng)1. 5小時(shí)后，通過(guò)PD-IO柱(GE Healthcare公司生產(chǎn))進(jìn)行凝膠過(guò)濾，分級(jí)分離還原型IgG級(jí)分。在0. 2ml含有Img過(guò)氧化物酶(辣根來(lái)源的，Roche公司生產(chǎn)，HRP)和5mM EDTA的0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 6. O)中，添加Sulfo-SMCC(PIERCE公司生產(chǎn))，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，通過(guò)PD-IO柱(GE Healthcare公司生產(chǎn))進(jìn)行凝膠過(guò)濾，分級(jí)分離馬來(lái)酰亞胺化的HRP級(jí)分。在HRP級(jí)分中加入上述20A10 的還原型IgG級(jí)分，4°C下反應(yīng)過(guò)夜，進(jìn)行高速凝膠過(guò)濾(附帶用含有5mM EDTA的0. IM磷酸鹽緩沖液PH 6. O平衡的TSK-GEL G3000柱(東^ 一公司生產(chǎn))的LC-6A系統(tǒng)(島津公司生產(chǎn)))，分級(jí)分離約0. 5mg HRP標(biāo)記的20A10級(jí)分。在96孔微量滴定板(D ”公司生產(chǎn)) 的各孔中，添加150 μ 1含有1. 5 μ g的II型膠原內(nèi)部序列特異性抗體6G4的Tris緩沖液 (50mM Tris-HCl，pH7. 5)，4°C下固定 16 小時(shí)。用 300 μ 1 洗滌溶液(含 0. 01% Tween20 的生理鹽水)洗滌1次這些孔后，添加150μ 1 Block Ace (大日本制藥公司生產(chǎn))，在室溫放置2 小時(shí)，進(jìn)行封閉。用300μ 1洗滌溶液洗滌1次各孔后，將含有10-500ρΜ標(biāo)準(zhǔn)肽或測(cè)試樣品的 50 μ 1 緩沖液 AC^O. 5% 牛血清白蛋白、0. 01% Tween80、0. 05% Proclinl50、0. 15M NaCl 的50mM Tris緩沖液，pH7. 4)與含有0. 05ng HRP標(biāo)記的新表位抗體20A10的100 μ 1緩沖液A混合，在4°C下反應(yīng)16小時(shí)。之后，用300 μ 1洗滌溶液洗滌3次各孔后，添加100 μ 1的 TMB-Substrate Chromogen (DAK0公司生產(chǎn))，室溫下生色30分鐘后，添加100 μ 1的0. 05Μ 硫酸，終止反應(yīng)，測(cè)量450nm下的吸光度。其結(jié)果是，抗體只與膠原酶消化的II型膠原反應(yīng)，最低檢測(cè)限度為IOpM (圖4)。 與對(duì)上述羥基化形式親和力低的新表位抗體9A4不同，所述抗體20A10對(duì)非羥基化形式和羥基化形式的任一種都以相同的親和力結(jié)合，因而不需要以脯氨酸/羥脯氨酸比例換算測(cè)量值，而且能夠不受羥基化修飾的影響正確地定量新表位濃度。實(shí)施例5
體外膠原酶活件的測(cè)定體系
在96孔微量滴定板(NUNC公司生產(chǎn))中添加5ng/ml的人II型膠原溶液(Chondrex公司生產(chǎn))，在4°C孵育過(guò)夜后，用洗滌緩沖液(0. 05M Tris-HCl,pH7. 6)洗滌2次，形成膠原包被的平板。在預(yù)孵育用的平板(Costar公司生產(chǎn))中，加入酶反應(yīng)緩沖液(含有0. 3M NaCl, IOmM CaC12、0. 005% Bri j35的50mM Tris緩沖液，ρΗ7· 6)和作為一種人II型膠原酶的人活化ΜΜΡ13和MMP抑制劑，室溫下孵育30分鐘后，按上述實(shí)施例4說(shuō)明的，通過(guò)夾心ELISA系統(tǒng)測(cè)定酶反應(yīng)溶液中的膠原新表位的量。其結(jié)果是，新表位測(cè)量值依賴于所添加的MMP13的用量而增加，而MMP抑制劑用量依賴性地抑制通過(guò)該MMP13的新表位產(chǎn)生(圖5)。實(shí)施例6
在96孔培養(yǎng)平板(住友《一々7 ^卜公司生產(chǎn))中添加lOng/ml的人II型膠原溶液， 在4°C孵育過(guò)夜后，用培養(yǎng)基(含有0. lmg/ml BSA、ITS,50 μ M L-抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)基) 洗滌1次，形成膠原包被的平板。在包被的平板中，每孔接種4 χ IO4個(gè)正常人來(lái)源的軟骨細(xì)胞(Chondrex公司)， 用培養(yǎng)基在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)。1天后，更換培養(yǎng)液，添加lng/ml人白介素1β (Genzyme公司生產(chǎn))和10ng/ml制癌蛋白(Oncostatin) M (Sigma公司生產(chǎn))以及各種濃度的作為測(cè)試對(duì)象的MMP抑制劑，再培養(yǎng)2天。4天后，在添加反應(yīng)終止液(EDTA，終濃度 5mM)后回收培養(yǎng)上清液，通過(guò)上述實(shí)施例4記載的夾心ELISA系統(tǒng)測(cè)定其中包含的膠原新表位濃度，從而測(cè)量MMP抑制劑的活性。其結(jié)果確認(rèn)了，通過(guò)IL-I β刺激，誘導(dǎo)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表達(dá)ΜΜΡ13，促進(jìn)II型膠原降解，MMP抑制劑用量依賴性地抑制軟骨細(xì)胞的膠原降解(圖6)。由此可知，本測(cè)定體系可用于測(cè)定檢測(cè)對(duì)象的MMP抑制劑。實(shí)施例7
20Α10的氨基酸序列解析
從建系的雜交瘤細(xì)胞中，使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN公司生產(chǎn))進(jìn)行RNA提取。 使用用于快速擴(kuò)增cDNA末端的5，RACE Syatem, 2. 0版(Invitrogen公司生產(chǎn))，從1 μ g提取的RNA中，擴(kuò)增DNA片段。所擴(kuò)增的片段用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司生產(chǎn)) 克隆，用 Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems 公司生產(chǎn)) 解析堿基序列。由此指明可變區(qū)的氨基酸序列(圖7)。工業(yè)實(shí)用性
根據(jù)本發(fā)明，可以按I型、II型、III型膠原的膠原類型分別正確地檢測(cè)、定量新表位， 不受隨健康、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)而變化的脯氨酸羥基化修飾的影響。特別是在以膠原酶切割I(lǐng)I型膠原作為軟骨代謝指標(biāo)的骨關(guān)節(jié)炎等軟骨病變中，可用于評(píng)估病情進(jìn)展或治療效果的診斷方法或試劑盒。此外，膠原酶切割I(lǐng)型膠原作為全身的結(jié)締組織胞外基質(zhì)代謝的指標(biāo)，可用于評(píng)估各種內(nèi)臟的纖維化進(jìn)展和抗纖維化治療效果的診斷方法或試劑盒。
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合膠原新表位片段的單克隆抗體，所述抗體結(jié)合序列號(hào)20所示氨基酸序列的962位至975位，其在包含于所述表位中的脯氨酸為非羥基化形式的情況下的結(jié)合親和力與該脯氨酸為羥基化形式情況下的結(jié)合親和力實(shí)質(zhì)上相同。
2.權(quán)利要求1記載的單克隆抗體，其中權(quán)利要求1記載的脯氨酸是序列號(hào)20所示氨基酸序列中的971位的脯氨酸。
3.權(quán)利要求1記載的單克隆抗體，其中表位存在于序列號(hào)20所示氨基酸序列的957位至975位的區(qū)域中。
4.權(quán)利要求2記載的抗體，在使由序列號(hào)14、17或18所示氨基酸序列組成的肽競(jìng)爭(zhēng)以便抑制所述抗體與由序列號(hào)2所示氨基酸序列組成的肽的免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定中，對(duì)任一種肽的所述免疫反應(yīng)的50%抑制濃度在0. 04 μ M以下。
5.單克隆抗體，其具有1)互補(bǔ)決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)KYGIN(序列號(hào)5)、 WINTYSGMTTYADDFKG (序列號(hào) 6)和 S LGYDYGGFAY (序列號(hào) 7)，以及2)互補(bǔ)決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)RSGQTLVHDNENTYFH (序列號(hào)8)、 KISNRFS (序列號(hào) 9)和 SQNTHVPFT (序列號(hào) 10)。
6.單克隆抗體，其具有1)具有序列號(hào)3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和2)具有序列號(hào)4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
7.權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體，其是被標(biāo)記的。
8.使用權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體的免疫測(cè)定。
9.使用權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定膠原新表位片段含量的方法。
10.測(cè)定膠原酶活性的方法，其以使用權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定的膠原新表位片段的含量為指標(biāo)。
11.篩選膠原酶抑制劑的方法，其以使用權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定的膠原新表位片段的含量為指標(biāo)。
12.鑒別膠原酶相關(guān)性疾病的患者的方法，包括使用權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定生物樣品中含有的膠原新表位片段的含量的步驟。
13.包含權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體的試劑盒。
14.診斷膠原酶相關(guān)性疾病的方法，包括使用權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體測(cè)定生物樣品中含有的膠原新表位片段的含量的步驟。
15.權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)記載的單克隆抗體，其用于診斷膠原酶相關(guān)性疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的單克隆抗體和使用所述新單克隆抗體的免疫測(cè)定、測(cè)定方法、試劑盒等，所述單克隆抗體對(duì)膠原片段的C端新表位具有特異性，在所述新表位含有的脯氨酸是非羥基化形式的情況下的結(jié)合親和力與羥基化形式情況下的結(jié)合親和力實(shí)質(zhì)上相同。不受新表位中有無(wú)脯氨酸羥基化形式的影響，可以定量生物樣品中由于膠原酶消化產(chǎn)生的膠原片段。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102482348SQ20108004139
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者前田朋子, 小野田順二, 山內(nèi)晃, 山根昌治, 沼田義人 申請(qǐng)人:鹽野義制藥株式會(huì)社