專利名稱：殺蟲蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程、植物分子生物學(xué)以及蟲害控制領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及新穎的工程化CrylBa蛋白以及其表達(dá)產(chǎn)生了工程化CrylBa蛋白的核酸序列，以及制造和使用這些工程化CrylBa蛋白和相應(yīng)的核酸來控制昆蟲的方法。背景蘇云金芽孢桿菌(Bt)Cry蛋白(還被稱為δ-內(nèi)毒素或Cry毒素)是在芽孢桿菌屬中形成一種結(jié)晶基體的蛋白質(zhì)，已知這些蛋白質(zhì)當(dāng)被某些昆蟲攝入時具有殺蟲活性。已經(jīng)鑒定并且命名了在58個家族中的超過180全型Cry蛋白。已經(jīng)根據(jù)各種Cry蛋白的活性譜和序列同源性對它們進(jìn)行分類。在1990年以前，主要的分類是通過它們的活性譜定義的 (Hofte 和 Whitely，1989，微生物綜述(Microbiol. Rev) 53 :242-255)，但是最近發(fā)展了一種新的命名法，該法將Cry蛋白基于氨基酸序列的同源性而不是昆蟲的目標(biāo)特異性系統(tǒng)分類 (Crickmore 等人 1998，微生物分子生物綜述(Microbiol. Molec. Biol. Rev.) 62 :807-813)。大多數(shù)針對鱗翅目昆蟲的活性Cry蛋白在結(jié)晶基體中形成為130_140kDa的原毒素。在鱗翅目昆蟲中，腸的堿性PH溶解這種晶體并且然后腸蛋白酶將該原毒素加工成大約 60-70kDa的毒蛋白。已報道將原毒素加工成毒素是通過去除N端和C端的氨基酸而進(jìn)行的， 其中進(jìn)行加工的確切部位取決于特異性Cry蛋白以及所涉及的特異性昆蟲腸液(Ogiwara 等人，1992，J. Invert. Pathol. 60 :121-126)。Gry原生素的這種蛋白質(zhì)水解激活在確定其特異性方面能夠發(fā)揮重要作用。已經(jīng)闡明了一些Cry蛋白的三維結(jié)構(gòu)。針對鞘翅目昆蟲是活性的Cry3A蛋白質(zhì)具有三個結(jié)構(gòu)域N端的結(jié)構(gòu)域I (從殘基58至四0)由7個α螺旋組成；結(jié)構(gòu)域II (從殘基 291至500)，含有處于被稱為希臘鑰匙(Greek key)構(gòu)象的三個β -折疊；以及C端的結(jié)構(gòu)域ΠΙ(從殘基501至644)，它是處于被稱為果凍卷餅(jellyroll)構(gòu)象的一個β-三明治。 針對鱗翅目活性CrylAa毒素的三維結(jié)構(gòu)也已經(jīng)被解出(Grochulski等人，1995，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 254 :447-464)。CrylAa毒素也具有三個結(jié)構(gòu)域=N端的結(jié)構(gòu)域I (從殘基33至253)、結(jié)構(gòu)域II (從殘基265至461)、以及結(jié)構(gòu)域111(從殘基463至609)(在由殘基邪4至264形成的β-折疊之一中具有一個另外的外部鏈)。如果將Cry3A和CrylAa 的結(jié)構(gòu)投射至其他的Cryl序列上，則結(jié)構(gòu)域I從大約氨基酸殘基觀延伸至沈0，結(jié)構(gòu)域 II從大約260延伸至460，并且結(jié)構(gòu)域III從大約460延伸至600。參見Nakamura等人， 農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric. Biol. Chem. )54(3) :715-724(1990) ；Li 等人的自然(Nature) 353 815-821(1991) ；Ge 等人的生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 266 (27) :17954-17958(1991)；以及Honee等人的分子微生物學(xué)(Mol. Microbiol.) 5 (11) :2799-2806(1991)；以上文獻(xiàn)中每一篇均通過引用結(jié)合在此。因此，目前已知的是基于氨基酸序列同源性，所有的Bt Cry蛋白具有包含三個結(jié)構(gòu)域的相似三維結(jié)構(gòu)。基于該結(jié)構(gòu)，闡述了一種關(guān)于Cry蛋白的結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系的假設(shè)。通常認(rèn)為的是， 結(jié)構(gòu)域1(最N-端結(jié)構(gòu)域)主要負(fù)責(zé)在昆蟲腸膜中的孔形成O^azit & a!ai，1993，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(App 1. Environ. Microbiol.) 57 :2816-2820)，結(jié)構(gòu)域II主要負(fù)責(zé)與腸受體的相互作用，由此確定毒素特異性(Ge等人，1991，分子生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 32 3429-3436)并且結(jié)構(gòu)域III (最C-端的結(jié)構(gòu)域)可能主要涉及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性(Li等人 1991，上述)連同具有對離子通道活性的調(diào)節(jié)作用(Chen等人，1993，PNAS 90 :9041-9045)。 結(jié)構(gòu)域III還涉及確定特異性(美國專利6，204，M6，通過引用結(jié)合在此)。將鱗翅目活性毒素之間的結(jié)構(gòu)域III進(jìn)行交換，如通過編碼區(qū)之間的體內(nèi)重組，可以導(dǎo)致特異活性方面的變化。將使用此種雜交的結(jié)合實驗已經(jīng)展示，結(jié)構(gòu)域III涉及到目標(biāo)昆蟲上的推定的受體上的結(jié)合，表明結(jié)構(gòu)域III可以通過在受體識別方面的作用對特異性具有一定的影響。Bt Cry蛋白的毒素部分的特征還在于在它們的氨基酸序列上具有五個保守區(qū) (conserved block) (Hofte & Whiteley，上述)。保守區(qū)I(CBl)包括大約四個氨基酸。保守區(qū)2 (CB2)包括大約67個氨基酸。保守區(qū)3 (CB3)包括大約48個氨基酸。保守區(qū)4 (CB4) 包括大約10個氨基酸。保守區(qū)包括大約12個氨基酸。在這五個保守區(qū)之前和之后的的序列是高度可變的，并因此被命名為“可變區(qū)”Vl至V6。Bt Cry蛋白的結(jié)構(gòu)域I典型地包括可變區(qū)1的C末端部分、完整保守區(qū)1、整個可變區(qū)2、以及保守區(qū)2的N端的52 個氨基酸。結(jié)構(gòu)域II典型地包括保守區(qū)2的C端的大約15個氨基酸、可變區(qū)3、以及保守區(qū)3的N端的大約10個氨基酸。結(jié)構(gòu)域III典型地包括保守區(qū)3的C端的大約38個氨基酸、可變區(qū)4、保守區(qū)4、可變區(qū)5、以及保守區(qū)5。Cryl鱗翅目活性毒素(除其他Cry蛋白之外)還具有一個可變區(qū)6，該可變區(qū)具有橫向定位(lying)在結(jié)構(gòu)域III之內(nèi)的大約1至3 個氨基酸。一些Cry蛋白，例如CryIAb、CryIAc、CryIF和Cry2Ba已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因作物植物中表達(dá)并且在商業(yè)上被開發(fā)以控制某些鱗翅目蟲害。例如，表達(dá)CrylBa蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米雜交體在10多年來已經(jīng)是可商購的。在這些玉米雜交體中的CrylBa蛋白主要靶向歐洲玉米螟 (Ostrinia nubilalis)，美國玉米帶(US Corn Belt)中的主要鱗翅類害蟲。關(guān)于表達(dá)Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因作物部署產(chǎn)生的憂慮是蟲害是否將會變得抵抗Cry蛋白。已經(jīng)證明了昆蟲能夠產(chǎn)生針對含Cry蛋白的產(chǎn)物的抗性。在世界上的一些地區(qū)，已經(jīng)在小菜蛾(Plutella xylostella)以及其他蔬菜害蟲中產(chǎn)生了對商業(yè)Bt微生物噴霧劑(在有機耕作中廣泛使用)的抗性。在波多黎各島上證明了暴露于表達(dá)CrylF蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)種群的田間抗性的一個近期發(fā)生率(Morer等人， 2010. J. Econ. Entomol. 103 :1031-1038)。然而，從 1996 年以來，當(dāng)?shù)谝淮我氡磉_(dá) Cry 蛋白的轉(zhuǎn)基因作物時，在美國并不存在與暴露于轉(zhuǎn)基因作物的玉米或棉花害蟲的抗性田間種群有關(guān)的任何田間失效的情況。種子產(chǎn)業(yè)、大學(xué)研究員以及美國環(huán)境保護局已經(jīng)一起合作來制定管理計劃以幫助緩和昆蟲抗性的發(fā)生。它們主要是基于有關(guān)高劑量以及避護所策略。例如對于玉米中的歐洲玉米螟的一個高劑量策略是使用表單足夠高水平的Cry蛋白的玉米雜交體來殺死甚至部分抵抗的歐洲玉米螟?；A(chǔ)的假設(shè)是殺死部分抗性的ECB并且大力防止它們交配延遲了抗性的產(chǎn)生。一個高劑量策略的成功部分取決于Cry毒素對歐洲玉米螟的特異活性以及多少Cry毒素可以表達(dá)在這種轉(zhuǎn)基因玉米植物中。例如，針對害蟲的Cry毒素的特異活性越高，在一種轉(zhuǎn)基因植物中需要表達(dá)的Cry毒素的量就越少，從而實現(xiàn)一種高劑量策略。由于 CrylAb對于歐洲玉米螟很具毒性(即，高特異活性)，在轉(zhuǎn)基因植物中可實現(xiàn)的CrylAb表達(dá)水平很容易將這樣的玉米雜交體置于一種高劑量范疇中。
其他有可能的減輕抗性產(chǎn)生的方法包括在同一轉(zhuǎn)基因作物植物中累加 (pyramiding)多種Cry蛋白或者用新的產(chǎn)生不同Cry蛋白的產(chǎn)品來代替現(xiàn)有的成熟產(chǎn)品。 例如，隨著目前CrylAb蛋白玉米雜交體市場的成熟，可以引入新的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品具有與 CrylAb不同的Cry蛋白或除了 CrylAb之外其他Cry蛋白。有益的是，對于代替CrylAb的蛋白質(zhì)具有與CrylAb相同或類似的對歐洲玉米螟的特異活性。一種代替CrylAb的候選Cry毒素可以是CrylBa毒素。這種全型CrylBa毒素首次由 Brizzard 等人在 1988 年(核酸綜述(Nuc. Acids Res.) 16 :2723-2724)描述。隨后， 已經(jīng)鑒定了五種其他的CrylBa毒素，其中各自具有與該全型毒素大約99%的一致性。已經(jīng)報告了 CrylBa毒素具有針對某些鱗翅類害蟲的活性，例如紋白蝶(Pieris brassicae)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜紋夜蛾(Spodoptera littoralis)、甜菜夜娥(Spodoptera exigua)、以及歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)。然而，已經(jīng)報告了 CrylBa針對歐洲玉米螟的活性比CrylAb小2倍以上(例如，參見美國專利號5，628，995)并且還報告了它針對其他主要作物害蟲沒有活性，例如玉米螟蛉(Helicoverpa zea),(參見例如Karim等人 2000.殺蟲劑生物化學(xué)及生理學(xué)(Pestic. Biochem. Physiol.) 67 :198-216)以及草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)的NAFTA種群(參見例如，Monnerat等人，2006.應(yīng)用以及環(huán)境微生物學(xué)(Appl. Environ. Microbiol.) 72 :7029-7035)。針對至少歐洲玉米螟，CrylBa 不如 CrylAb活性的原因之一可以歸于其更低的溶解度特性。因此存在一種需要來改進(jìn)CrylBa 針對至少歐洲玉米螟的特異活性并且有可能擴展其活性譜，從而增加其在轉(zhuǎn)基因玉米中作為CrylAb的替代物的潛力。來自Bt的一種單獨的Cry毒素的殺蟲活性譜可能相當(dāng)窄，其中一種給定的Bt毒素僅對一個目之內(nèi)的一些種類是有活性的。例如，已知一種Cry3A蛋白對科羅拉多馬鈴薯甲蟲(L印tinotarsa decemlineata)具有很大的毒性，但對葉甲屬(Diabrotica)相關(guān)的甲蟲具有非常小的毒性或沒有毒性(Johnson等人，1993，J. Econ. Entomol. 86 :330-333)。此外，在一個Cry蛋白類別之內(nèi)的小的氨基酸序列改變可以影響殺蟲活性。例如，von Tersch 等人(1991，應(yīng)用及環(huán)境微生物學(xué)(Appl. Environ. Microbiol.) 57 =349-358)證明了通過改變七種氨基酸的CrylAc蛋白在其殺蟲活性譜上表現(xiàn)出顯著的差異。盡管主要考慮了鱗翅目活性毒素，還已經(jīng)報告了 CrylBa毒素針對某些鞘翅目昆蟲是具有活性的，包括科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)、黑楊葉甲蟲(Chrysomela scripta)以及咖啡果小蠹(Hypothenemus hampei)。Cry蛋白的特異性是以下不同步驟的效率的結(jié)果，這些步驟涉及產(chǎn)生一種活性毒素蛋白及其隨后的與昆蟲中腸中的上皮細(xì)胞的相互作用。為了殺蟲，大多數(shù)已知的Cry蛋白必須首先被昆蟲攝入并且被蛋白質(zhì)水解性激活以形成一種活性毒素。殺蟲晶體蛋白的激活是一個多步驟的過程。在攝入之后，這些晶體必須首先溶解在昆蟲的腸中。一旦被溶解， 這些Cry蛋白通過特異性蛋白酶剪切而被激活。昆蟲腸中的這些蛋白酶能夠通過確定在何處處理Cry蛋白而在特異性方面發(fā)揮作用。一旦Cry蛋白已經(jīng)被溶解并被處理，它與昆蟲的中腸上皮表面上的特異性受體相結(jié)合，隨后整合到刷狀緣膜的脂雙層中。然后，一些離子通道形成，擾亂中腸的正常功能最終導(dǎo)致昆蟲的死亡。在Cry蛋白的毒素部分的溶解度特性上存在完全不同。已經(jīng)工程化某些鱗翅目活性Cry蛋白以試圖改善特異活性或拓寬殺蟲活性譜。例如，將來自CrylAa的蠶蛾(Bombyx mori)特異性結(jié)構(gòu)域移動至ー種CrylAc蛋白，由此將 ー種新的殺蟲活性賦予至所生成的嵌合蛋白中(Ge等人，1989，PNAS 86:4037-4041)。還有Bosch等人1998 (美國專利5，736，131)創(chuàng)造了一種新的鱗翅類活性毒素，是通過用具有CrylC結(jié)構(gòu)域III取代CrylE的結(jié)構(gòu)域III，由此產(chǎn)生ー種具有更寬的鱗翅目活性譜的 CrylE-CrylC雜合毒素。仍需要設(shè)計新型并有效的蟲害控制劑，這些蟲害控制劑為農(nóng)民提供經(jīng)濟利益并且是環(huán)境可接受的。需要具有實質(zhì)上改變的特性的蛋白質(zhì)，例如本發(fā)明的工程化CrylBa蛋白，相比于天然CrylBa蛋白，它們具有更大的針對至少歐洲玉米螟(美國玉米中的ー種主要害蟲，可能對現(xiàn)有的昆蟲控制劑變得抵抗)的特異活性。此外，通過這些其使用使環(huán)境負(fù)擔(dān)最小化的工程化CrylBa蛋白(如通過轉(zhuǎn)基因植物)是令人希望的。通過增加對至少歐洲玉米螟的CrylBa特異活性，在一種玉米植物中應(yīng)該需要更少的CrylBa蛋白表達(dá)，因此降低了可能的CrylBa對植物的不利作用。此外，増加的特異活性允許這種工程化CrylBa針對ECB以高劑量策略來使用。概述考慮到這些需要，本發(fā)明的ー個目的是提供新穎的工程化eCrylBakCrylBa)蛋白，這些蛋白質(zhì)具有實質(zhì)上改變的特性，這些特性被改進(jìn)為優(yōu)于天然eCrylBa蛋白并且與其不同，特別是與對于玉米鱗翅目害蟲的殺蟲活性相關(guān)聯(lián)的生物化學(xué)特性，這些害蟲包括但不限于例如歐洲玉米螟(ECB ；Ostrinia nubilalis)、玉米螟蛉(CEff ；Helicoverpa zea))、西南玉米螟(SWCB ;Diatraea grandiosella)、甘蔗螟蟲(SCB ;Diatraea saccharalis)、大丑夜蛾(SBL ；Pseudoplusia inciudens)、黎丑夜蛾(VBC ；Anticarsia gemmatalis)、等等。根據(jù)本發(fā)明，如在此定義的通過取代ー種天然CrylBa蛋白序列或野生型CrylBa蛋白中的關(guān)鍵鑒定位置處的氨基酸，設(shè)計了相比于天然CrylBa的ー種具有實質(zhì)上改變的溶解度和/或殺蟲特性的eCrylBa蛋白。本發(fā)明進(jìn)一歩涉及編碼這些eCrylBa蛋白的核酸序列，并且涉及含有這些eCryIBa蛋白的組合物以及配制品，它們能夠抑制蟲害的生存、生長以及繁殖的能力或者能夠限制昆蟲相關(guān)的對作物植物的損害或損失。本發(fā)明進(jìn)ー步描繪了制造這些eCrylBa蛋白的ー種方法以及使用這些eCrylBa蛋白的多種方法， 例如，在轉(zhuǎn)基因植物中賦予免于昆蟲損害的保護。本發(fā)明的eCrylBa蛋白的這種實質(zhì)上改變的特性允許它們用于針對至少ECB的高劑量策略中，同時需要易于實現(xiàn)的在玉米植物中的表達(dá)水平。這些在此說明的新穎的eCrylBa蛋白對昆蟲是具有高度活性的。例如，本發(fā)明的 eCrylBa蛋白可以用來改進(jìn)對經(jīng)濟上重要的蟲害(如ECB或CEW)的控制，而不會不利地影響針對其他重要的玉米害蟲(例如SWCB以及SCB)的活性。本發(fā)明的eCrylBa蛋白可以單獨使用或與其他昆蟲控制策略組合使用以賦予具有最小環(huán)境影響的最大蟲害控制效率。表達(dá)本發(fā)明的eCrylBa蛋白的轉(zhuǎn)基因植物提供了ー種手段，通過這種手段栽培者可以控制主要作物(例如并不限于玉米和甘蔗)的鱗翅類害蟲。根據(jù)ー個方面，本發(fā)明包括ー種工程化CrylBakCrylBa)蛋白，其包括在結(jié)構(gòu)域I中的一個或多個氨基酸位置處的ー個突變，由此當(dāng)與天然的或野生型CrylBa蛋白相比吋，這種工程化CrylBa蛋白具有改進(jìn)的溶解度和/或?qū)怪辽贇W洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的殺蟲活性。
在另ー個方面，在一個或多個氨基酸位置處的突變位于結(jié)構(gòu)域I的α -螺旋4或 α-螺旋5中。在另外的方面，該突變位于相應(yīng)于SEQ ID NO 2的位置150、178、189或199的氨
基酸位置處。仍然在另ー個方面，該突變位于SEQ ID NO 5的位置150、178、189或199處。在另ー個方面，該突變位于相應(yīng)于SEQ ID NO :5的氨基酸2和150 ；或氨基酸2、 150和178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。在仍另ー個方面，該突變位于SEQ ID NO 5的氨基酸2和150 ；或氨基酸2、150和 178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。在ー個方面，本發(fā)明包括ー種工程化CrylBa(eCrylBa)蛋白，其包括一個氨基酸序列SEQ ID NO 6,其中在位置2處的X是任何氨基酸并且a)在位置150處的X是ftx)、 Phe,Trp或Lys，并且在位置189處的X是Leu并且在199處是kr ；或b)當(dāng)在位置150處的X是Lys吋，在位置189處的X是kr ；或c)當(dāng)在位置150處的X是Lys吋，在位置199 處的X是Lys。在另ー個方面，本發(fā)明的eCrylBa 蛋白包括 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 10的氨基酸序列。在還另ー個方面，本發(fā)明的eCrylBa蛋白具有針對鱗翅目或鞘翅目昆蟲，特別是鱗翅目昆蟲的活性。這樣的鱗翅目昆蟲的例子包括但不限于歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。本發(fā)明還包括其他變異體CrylBa(VCrylBa)蛋白，其中在位置150處的ー個酪氨酸(Tyr)或組氨酸(His) (Y150或H150)用ー個非Tyr或His的氨基酸取代。在ー個方面， 取代 Y150 或 H150 的氨基酸是 Lys、Phe、Trp、Pro、Thr、Leu、Ala、Val、Ser、Arg、Gly 或 Asp。在另ー個方面，本發(fā)明包括ー種含SEQ ID NO 3的vCrylBa蛋白。仍然在另ー個方面，本發(fā)明包括ー種vCrylBa蛋白，其中在位置150處的Tyr或 His用ー個非Tyr或His的氨基酸取代并且具有在位置81處用非Val的氨基酸取代的的纈氨酸(Val) (V81)；或在位置155(A155)處的丙氨酸(Ala)以及位置178(M178)處的甲硫氨酸(Met)分別用非Ala或Met的氨基酸取代。在另ー個方面，在位置81處的Val (V81)用一個色氨酸CTrp) (V81W)取代。在還另ー個方面，本發(fā)明的變異體CrylBa蛋白包含SEQ ID NO :11ο在ー個方面，本發(fā)明包括ー種具有任何其他氨基酸取代的Υ150的vCrylBa蛋白， 其中在位置155處的Ala(A150用ー個天冬氨酸(Asp) (A155D)取代并且在位置178處的 Met(Metl78)用一個絲氨酸(kr) (M178S)取代。在另ー個方面，本發(fā)明的變異體CrylBa蛋白包含 SEQ ID NO :12ο本發(fā)明的vCrylBa蛋白具有針對鱗翅目或鞘翅目昆蟲，特別是鱗翅目昆蟲的殺蟲活性。這樣的鱗翅目昆蟲包括但不限于歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。然而，這樣的vCrylBa蛋白與野生型CrylBa蛋白相比可能不具有増加的針對這些害蟲的活性。在另ー個方面，本發(fā)明包括ー種核酸，該核酸編碼本發(fā)明的ー種工程化 CrylBa(eCrylBa)蛋白或本發(fā)明的一種變異體CrylBa蛋白(vCrylBa)。
本發(fā)明還包括一種嵌合基因，該嵌合基因包括被可操作地連接到編碼ー種 eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白的核酸上的一種異源啟動子序列。本發(fā)明還包括ー種含有這樣的嵌合基因的重組載體。此外，本發(fā)明還包括ー種含有這樣的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因非人類宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的這個方面的ー種轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞包括但不限于ー種細(xì)菌細(xì)胞或一種植物細(xì)胞。這樣的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可以是ー種玉米細(xì)胞或ー種甘蔗細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了ー種包含這樣的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。這種eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白對于在其中易感蟲害是ー個問題的任何轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)是有用的。在本發(fā)明的另ー個方面，包括來自ー種轉(zhuǎn)基因植物的任何代的含有本發(fā)明的ー種核酸的子代植物、以及來自ー種轉(zhuǎn)基因植物的任何代的含有本發(fā)明的核酸的ー種繁殖體。在另ー個方面， 該轉(zhuǎn)基因植物是ー種玉米植物或甘蔗植物。仍然在另ー個方面，該繁殖體是ー種種子、節(jié)段 (sette；或插條。本發(fā)明還包括一種殺蟲組合物，該組合物包括一種有效的昆蟲控制量的eCrylBa 蛋白或一種根據(jù)本發(fā)明的vCrylBa蛋白以及另外地ー種可接受的農(nóng)用載體。這樣的農(nóng)用載體可以是例如一種可噴灑的配制品或ー種轉(zhuǎn)基因植物。在另ー個方面，本發(fā)明提供了ー種用于產(chǎn)生針對昆蟲是活性的eCrylBa蛋白或 vCrylBa蛋白的方法，包括(a)獲得包含一種嵌合基因的宿主細(xì)胞，該基因本身包含與本發(fā)明的ー種核酸分子可操作地連接的一種異源啟動子序列；以及(b)在該轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸，這產(chǎn)生了針對昆蟲是活性的至少ー種蛋白質(zhì)。在另ー個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生ー種抗昆蟲轉(zhuǎn)基因植物的ー種方法，包括將本發(fā)明的ー種核酸分子引入ー種植物中由此產(chǎn)生ー種轉(zhuǎn)基因植物，其中該核酸分子引起ー種 eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白在該轉(zhuǎn)基因植物中以有效控制昆蟲的量進(jìn)行表達(dá)。仍然在另一方面，這些昆蟲是鞘翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲。這樣的鱗翅目昆蟲包括但不限于歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。在另ー個方面，本發(fā)明包括一種制造工程化CrylBa(eCrylBa)蛋白的方法，包括 a)鑒定ー種具有結(jié)構(gòu)域I的CrylBa蛋白；b)將結(jié)構(gòu)域I的ー個位置處的至少ー個天然氨基酸用至少ー個其他的氨基酸取代；并且c)獲得該如此產(chǎn)生的eCrylBa蛋白，其中當(dāng)與一種天然CrylBa蛋白或野生型CrylBa相比時，該eCrylBa具有改進(jìn)的溶解度或針對至少歐洲玉米螟的殺蟲活性。仍然在另ー個方面，該天然氨基酸位于結(jié)構(gòu)域I中的α -螺旋4或 α -螺旋5。仍然在另ー個方面，本發(fā)明包括ー種用于控制鱗翅目昆蟲的方法，包括使該昆蟲與本發(fā)明的一個有效量的eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白接觸。根據(jù)另ー個方面，這樣的鱗翅目昆蟲包括但不限于歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。優(yōu)選地，該eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白通過ロ服遞送給昆蟲。在一方面，這些蛋白質(zhì)通過ー種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行ロ服遞送，該轉(zhuǎn)基因植物包含表達(dá)本發(fā)明的eCrylBa或 vCrylBa蛋白的ー個核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了ー種用于控制昆蟲的方法，其中包含一種編碼eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白的核酸的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)ー步包括ー種第二核酸序列或編碼至少ー種其他的殺蟲成分的多個核酸序列。在ー個方面，該第二核酸編碼了ー種不同于本發(fā)明的eCrylBa或vCrylBa蛋白的Cry蛋白，例如編碼了一種營養(yǎng)期殺蟲蛋白的那些核酸(分別披露于美國專利5，849，870以及5，877，012中，均通過引用結(jié)合在此)、或編碼ー種非蛋白殺蟲成分的產(chǎn)生途徑的那些核酸。在本發(fā)明的另一方面，該第二殺蟲成分是ー種Vip3蛋白。仍然在本發(fā)明的另ー個方面，提供了向栽培者提供ー種用于控制歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾的改進(jìn)的手段的方法，包括向該栽培者提供或銷售轉(zhuǎn)基因繁殖體，該繁殖體包括編碼ー種eCrylBa蛋白的核酸分子，該 eCrylBa蛋白在結(jié)構(gòu)域I內(nèi)的一個或多個氨基酸位置處具有ー個突變，該eCrylBa蛋白與一種天然的CrylBa蛋白相比時具有改進(jìn)的溶解度或針對至少歐洲玉米螟的殺蟲活性。在另 ー個方面，這種轉(zhuǎn)基因繁殖體是種子、節(jié)段或插條。根據(jù)本發(fā)明的以下說明的ー項研究以及非限制性實例，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言將變得清楚。附圖簡要說明

圖1示出了已知的天然CrylBa蛋白的氨基酸序列的比對。在位置150處的氨基酸是粗體的。圖2示出了天然全長CrylAb和CrylBa蛋白的氨基酸序列的比對。結(jié)構(gòu)域I和II 以及結(jié)構(gòu)域I的α-螺旋4和5通過箭頭來表示。在序列表中的序列的簡要說明SEQ ID NO 1是ー種天然全長cryIBa編碼序列。SEQ ID NO 2是ー種天然全長CrylBa蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO 3 是ー種突變的全長 CrylBa。SEQ ID NO :4 是ー種 crylBa_T25 編碼序列。SEQ ID NO 5 是ー種 CrylBa_T25 野生型蛋白。SEQ ID NO 6 是 eCrylBa_X150 蛋白。SEQ ID NO :7 是 eCrylBa_T2AY150K 蛋白。SEQ ID NO 8 是 eCrylBa-T2AY150KM178S 蛋白。SEQ ID NO 9 是 eCrylBa-T2AY150KL189S 蛋白。SEQ ID NO 10 是 eCrylBa-T2AY150KS199K 蛋白。SEQ ID NO :11 是變異體 CrylBa_TM21。SEQ ID NO :12 是變異體 CrylBa_TM90。SEQ ID NO :13是編碼eCrylBa_T2AY150KL189S蛋白的玉米優(yōu)化的核酸序列。SEQ ID Nos :14-41是在本發(fā)明中有用的引物。SEQ ID NO 42 是截短的天然 CrylBa。SEQ ID NO :43 是變異體 CrylBa_TM69。SEQ ID NO :44 是變異體 CrylBa_TM61。定義為了清晰起見，對在本說明書中所使用的某些術(shù)語進(jìn)行定義并呈現(xiàn)如下本發(fā)明的eCrylBa蛋白的“活性”表示eCrylBa蛋白作為ロ服活性昆蟲控制劑發(fā)揮作用，具有ー種毒性作用、或者能夠干擾或阻止昆蟲攝食，這可能引起或者可能不引起昆蟲的死亡。當(dāng)本發(fā)明的eCrylBa蛋白被遞送至昆蟲時，這種結(jié)果典型地是該昆蟲的死亡，或者該昆蟲不以使該eCrylBa蛋白可供該昆蟲利用的來源為食。“與之相關(guān)聯(lián)/可操作地連接”指物理上或功能上相關(guān)的兩種核酸序列。例如，一個啟動子或調(diào)節(jié)DNA序列據(jù)說是與對ー種RNA或ー種蛋白進(jìn)行編碼的ー個DNA序列“相關(guān)聯(lián)”的(若這兩個序列被操作性地連接)、或被定位為使得該調(diào)節(jié)DNA序列將影響該編碼或結(jié)構(gòu)DNA序列的表達(dá)水平。—種“嵌合基因”或“嵌合構(gòu)建體”是ー個重組核酸序列，其中一個啟動子或調(diào)節(jié)核酸序列被可操作地連接至ー個核酸序列上、或與其結(jié)合，該核酸序列編碼ー種mRNA或者被表達(dá)為ー種蛋白質(zhì)，這樣使得該調(diào)節(jié)核酸序列能夠調(diào)節(jié)該結(jié)合的核酸編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。該嵌合基因的調(diào)節(jié)核酸序列通常不被可操作地連接至如在自然界所發(fā)現(xiàn)的該結(jié)合的核酸序列上。ー個“編碼序列”是被轉(zhuǎn)錄成RNA (如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正義RNA或反義 RNA)的ー個核酸序列。優(yōu)選地，該RNA然后在ー個生物體中被翻譯以產(chǎn)生ー種蛋白質(zhì)?！翱刂啤崩ハx表示通過ー種毒性作用來抑制害蟲存活、生長、攝食、和/或繁殖的能力，或限制與昆蟲有關(guān)的損害或作物植物的損失?！翱刂啤崩ハx可能表示或可能不表示殺死這些昆蟲，盡管它優(yōu)選地表示殺死這些昆蟲。如在此所使用，術(shù)語“玉米”表示玉蜀黍(Zea mays)或玉蜀黍(maize)并且包括所有的可以用玉米繁殖的植物品種，包括野生玉蜀黍種類。在本發(fā)明的背景下，“相應(yīng)于”表示在將CrylB蛋白的氨基酸序列彼此比對吋，“相應(yīng)于”本發(fā)明中的某些列舉的位置的氨基酸是與天然CrylBa毒素(SEQ ID N0:2)中的這些位置比對的那些，但不必然是在相對于本發(fā)明的具體的CrylBa氨基酸序列的這些確切數(shù)字位置。例如在截短的CrylBa蛋白(SEQ ID NO 42)的位置1處的甲硫氨酸將與該全長 CrylBa (SEQ ID NO 2)的位置22處的甲硫氨酸比對。因此，根據(jù)本發(fā)明，序列SEQ ID NO: 42氨基酸129 “相應(yīng)干” SEQ ID NO 2的氨基酸數(shù)目150?！斑f送” ー種毒素表示使該毒素與ー種昆蟲相接觸，從而產(chǎn)生ー種毒性作用以及對昆蟲的控制。這種毒素可以按照許多公認(rèn)的方式進(jìn)行遞送，例如，通過昆蟲經(jīng)ロ攝入或通過經(jīng)由轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)、一種或多種配制的蛋白質(zhì)組合物、ー種或多種可噴灑的蛋白質(zhì)組合物、ー種餌基、或任何其他的領(lǐng)域公認(rèn)的毒素遞送系統(tǒng)與昆蟲接觸?！坝行У睦ハx控制量”表示ー種毒素的濃度，它通過ー種毒性作用抑制了害蟲存活、生長、攝食、和/或繁殖的能力，或限制與昆蟲有關(guān)的損害或作物植物的損失。“有效的昆蟲控制量”可能表示或可能不表示殺死昆蟲，盡管它優(yōu)選地是表示殺死這些昆蟲。本發(fā)明的ー種“工程化CrylBa” (eCrylBa)蛋白是指ー種CrylBa衍生的蛋白質(zhì)， 其具有至少ー個在結(jié)構(gòu)域I中的突變，這種突變并不已知天然發(fā)生于CrylBa蛋白中。一種eCrylBa蛋白不是天然發(fā)生的，而是通過人工合成的，包括一種與已知發(fā)生在蘇云金芽孢桿菌中的蛋白質(zhì)不同的氨基酸序列。與天然CrylBa蛋白相比，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)工程化的 CrylBa蛋白具有實質(zhì)上改變的并且改進(jìn)的特性。具體地，與本發(fā)明的ー種天然CrylBa、野生型CrylBa或變異體CrylBa蛋白相比，本發(fā)明的eCrylBa蛋白具有改進(jìn)的溶解度或針對至少歐洲玉米螟的殺蟲活性。根據(jù)本發(fā)明的ー種“工程化crylBa基因”(ecrylBa)是指包括eCrylBa蛋白編碼序列的ー種核酸。這種工程化crylBa基因可以衍生于ー種天然crylBa基因或ー種合成crylBa 基因。如在此所用的“表達(dá)盒”表示能夠在ー個適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中指導(dǎo)ー個特定的核酸序列的表達(dá)的ー個核酸序列，包含一個啟動子，該啟動子可操作地連接至所感興趣的核酸序列上，該核苷酸序列可操作地連接至終止信號上。它還典型地包含正確翻譯該核酸序列所需要的序列。包含該感興趣的核酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，意味著至少ー個它的組分相對于至少ー個它的其他組分是異源的。該表達(dá)盒還可以是ー種天然發(fā)生的表達(dá)盒，但已經(jīng)是以在對異源表達(dá)有用的一個重組體形式而獲得的。然而，典型地，該表達(dá)盒相對于該宿主而言是異源的，即該表達(dá)盒的特定核酸序列不是天然發(fā)生于該宿主細(xì)胞中，并且必須已經(jīng)通過ー個轉(zhuǎn)化事件引入到該宿主細(xì)胞或該宿主細(xì)胞的祖先(ancestor)中。在該表達(dá)盒中的核酸序列的表達(dá)可以是在ー個組成型啟動子或一個誘導(dǎo)型啟動子的控制之下，該啟動子只有當(dāng)該宿主細(xì)胞暴露于某ー特定的外界刺激時才引發(fā)轉(zhuǎn)錄。在多細(xì)胞生物體(如一種植物)的情況下，該啟動子還可能對于特定組織、或器官、或者發(fā)育階段是特異性的。ー個“基因”是ー個定義的區(qū)域，該區(qū)域位于ー個基因組之內(nèi)并且，除了前述的編碼核酸序列之外，它包含其他(主要是調(diào)控性的)負(fù)責(zé)編碼部分的表達(dá)(也就是轉(zhuǎn)錄和翻譯)的控制的核酸序列。ー個基因也可包含其他5'和3'未轉(zhuǎn)譯序列以及終止序列。其他可能存在的元件是，例如，內(nèi)含子。“感興趣的基因”是指當(dāng)被轉(zhuǎn)移至ー個植物時賦予該植物ー種所希望的特征的任何基因，該特征如抗生素抗性、病毒抗性、抗蟲性、抗病性，或者對其他害蟲的抗性、除草劑耐受性、改進(jìn)的營養(yǎng)價值、以及在ー個エ業(yè)過程改進(jìn)的性能或者改變的繁殖能力。“感興趣的基因”還可以是這樣ー個基因，該基因被轉(zhuǎn)入植物用于在該植物中產(chǎn)生商業(yè)上有價值的酶或代謝產(chǎn)物。如在此使用的，術(shù)語“栽培者”表示參與農(nóng)業(yè)中培養(yǎng)用于食品或原材料的活的生物體(例如作物)的人或?qū)嶓w。一種“腸蛋白酶”是在昆蟲的消化道內(nèi)自然發(fā)現(xiàn)的ー種蛋白酶。這種蛋白酶通常涉及所攝入的蛋白質(zhì)的消化。一個“異源”核酸序列是這樣ー個核酸序列，該序列與將其引入的ー個宿主細(xì)胞并非天然結(jié)合，包括ー個天然發(fā)生的核酸序列的非天然發(fā)生的多個拷貝。ー個“同源”核酸序列是與它被引入到其中的ー個宿主細(xì)胞天然結(jié)合的ー個核酸序列?！巴粗亟M”是在多個同源核酸分子之間的核酸片段的相互交換?！皻⑾x的”被定義為ー種能夠控制昆蟲(優(yōu)選是通過殺死它們)的毒性生物活性?！胺蛛x的”核酸分子是通過人工從其天然環(huán)境中分開而存在的ー種核酸分子或蛋白質(zhì)并因此不是自然的產(chǎn)物。一種分離的核酸分子或蛋白質(zhì)可以按照ー種純化的形式而存在、或可存在于ー種非天然環(huán)境(例如像，一種重組宿主細(xì)胞)中。例如，不分離在蘇云金芽孢桿菌中天然發(fā)生的ー種天然Cry蛋白，但是分離在ー種轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌菌株或 ー種轉(zhuǎn)基因植物中的相同的Cry蛋白。如在此使用的ー種“天然的” CrylBa蛋白是指ー種大約140kDa的蘇云金芽孢桿菌(Bt)鞘翅目昆蟲或鱗翅目活性蛋白，例如SEQ ID NO :2，連同可衍生自ー種天然CrylBa 蛋白的、具有自然發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的截短的較低分子量的蛋白質(zhì)。這種較低分子量的蛋白質(zhì)可以通過天然CrylBa蛋白的天然發(fā)生蛋白酶識別位點的蛋白酶裂解或通過與編碼該天然CrylBa蛋白(例如SEQ ID N0:2的M22)的翻譯起始密碼子處于同一框架中的ー個第 ニ翻譯起始密碼子獲得。ー種天然CrylBa蛋白的氨基酸序列以及由其衍生的較低分子量的蛋白質(zhì)可以在天然發(fā)生在Bt中的蛋白質(zhì)中找到。例如，六種天然CrylBa蛋白已經(jīng)被命名并且具有以下 Genbank 登錄號CrylBal = CAA29898 ；CrylBa2 = CAA65003 ；CrylBa3 = AAK63251 ；CrylBa4 = AAK51084 ；CrylBa5 = AB020894 ；CrylBa6 = ABL60921。在圖 1 中示出了六種CrylBa蛋白的序列比對。ー種天然CrylBa蛋白可以由ー個天然Bt核苷酸序列 (如在SEQ ID NO :1中)或者由ー個合成的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列編碼?！昂怂岱肿印被颉昂怂嵝蛄小笔强梢詮娜魏蝸碓捶蛛x的單鏈或雙鏈DNA或RNA的一個線性片段。在本發(fā)明的背景中，該核酸分子或核酸序列優(yōu)選地是ー個DNA片段?！爸参铩笔翘幱谌魏伟l(fā)育階段的任何植物，特別是種子植物?！爸参锛?xì)胞”是ー種植物的結(jié)構(gòu)和生理単位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以處于一種分離的單細(xì)胞或一種培養(yǎng)細(xì)胞的形式，或者是作為較高級的組織單位(例如， 植物組織、植物器官、或整株植物)的一部分?！爸参锛?xì)胞培養(yǎng)物”表示植物単位的培養(yǎng)物，像例如原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞、 植物組織中的細(xì)胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子以及處于不同發(fā)育階段的胚?！爸参锊牧稀笔侵溉~、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細(xì)胞、合子、種子、節(jié)段、 切條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或植物的任何其他部分或產(chǎn)物。“植物器官”是植物的ー個獨特的、并且具有可見結(jié)構(gòu)的、并且已分化的部分，如根、莖、葉、花芽、或胚。如在此所使用的“植物組織”是指被組織成為ー種結(jié)構(gòu)和功能単位的多個植物細(xì)胞的ー個組。包括在培養(yǎng)物或在植物中的任何植物組織。本術(shù)語包括但不局限干整株植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)物以及被組織成結(jié)構(gòu)和/或功能単元的任何植物細(xì)胞群。本術(shù)語與如以上所列出的任何特異類型的植物組織一起(或在其缺乏下)使用、或通過由這項定義所涵蓋含的其他方式的使用并非_在排除任何其他類型的植物組織?！皢幼印笔签`種編碼區(qū)上游的非翻譯DNA序列，它含有針對RNA聚合成酶的結(jié)合位點并啟動該DNA的轉(zhuǎn)錄。啟動子區(qū)域也可包括充當(dāng)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物的多個其他的元件。ー種“繁殖體”是用于植物繁殖目的的任何植物材料。例如但不限干，種子、以及插條或節(jié)段分別是玉米和甘蔗的繁殖體。ー種“原生質(zhì)體”是ー種沒有細(xì)胞壁或僅具有部分細(xì)胞壁的分離的植物細(xì)胞?！罢{(diào)控元件”是指參與控制核酸序列表達(dá)的序列。調(diào)控元件包括ー個可操作地連接至感興趣的核酸序列上的啟動子和終止信號。它們還典型地涵蓋了正確翻譯該核酸序列所需要的序列。如在此使用的，“特異活性”是指具有殺蟲效果所需要的蛋白質(zhì)的量。因此，當(dāng)ー種第一蛋白質(zhì)具有比ー種第二蛋白質(zhì)更高的特異活性吋，表示該第一蛋白質(zhì)比第二蛋白質(zhì)采取更少的量而具有對同一百分比的昆蟲的殺蟲效果。如在此使用的“溶解度”是指在相同環(huán)境條件下天然CrylBa毒素、野生型CrylBa 或eCrylBa毒素或vCrylBa毒素可以溶解在ー種特定的液體(例如ー種緩沖劑、水或昆蟲腸液)中的量。因此，如在此使用的與ー種天然或野生型CrylBa毒素相比，ー種eCrylBa 毒素具有“改進(jìn)的溶解度”或“溶解度増加”，表示在相同條件下一種給定體積的液體可以容納的eCrylBa毒素的量比天然或野生型CrylBa毒素更多。根據(jù)本發(fā)明，天然CrylBa以及野生型CrylBa毒素具有低的溶解度并且某些CrylBa毒素相對于彼此具有高的溶解度。“轉(zhuǎn)化”是將異源核酸引入至ー種宿主細(xì)胞或生物中的ー個過程。具體地說，“轉(zhuǎn)化”表示將ー個DNA分子穩(wěn)定整合進(jìn)ー種感興趣的生物的基因組中。“轉(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)基因的/重組的”是指已經(jīng)引入了一個異源核酸分子的ー種宿主生物，如一種細(xì)菌或ー種植物。該核酸分子可以被穩(wěn)定地整合到該宿主的基因組中，或者該核酸分子還可以作為ー種染色體外分子存在。這樣ー種染色體外分子能夠自動復(fù)制。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或者植物應(yīng)當(dāng)理解為不僅包含ー個轉(zhuǎn)化過程的終產(chǎn)物，還包含其轉(zhuǎn)基因子代。一個“非轉(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”、或“非重組的宿主”是指ー種野生型生物，例如，一種細(xì)菌或植物，其不含異源核酸分子。ー種“變異體CrylBa(VCrylBa) ”蛋白是ー種非天然突變蛋白，它與本發(fā)明的ー種野生型CrylBa蛋白相比具有更低的針對至少歐洲玉米螟的特異活性。ー種“野生型CrylBa”蛋白是ー種非天然突變蛋白，其具有與ー種天然CrylBa類似的殺蟲特性，例如針對昆蟲如西南玉米螟、甘蔗螟蟲或歐洲玉米螟的特異活性或生物化學(xué)特性(如溶解度)。核酸通過其堿基由以下標(biāo)準(zhǔn)縮寫進(jìn)行表示腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶 (T)、以及鳥嘌呤(G)。氨基酸也由以下標(biāo)準(zhǔn)縮寫表示丙氨酸(Ala ；Α)、精氨酸(Arg ；R)、天冬酰胺(Asn ；N)、天冬氨酸(Asp ；D)、半胱氨酸(Cys ；C)、谷氨酰胺(Gln ；Q)、谷氨酸(Glu ； E)、甘氨酸(Gly ；G)、組氨酸(His ;H)、異亮氨酸(lie ;1)、亮氨酸(Leu ;L)、賴氨酸(Lys ； K)、甲硫氨酸(Met ；Μ)、苯丙氨酸(Phe ；F)、脯氨酸(Pro ；P)、絲氨酸(Ser ；S)、蘇氨酸(Thr ； T)、色氨酸(Trp ；W)、酪氨酸(Tyr ；Y)、以及纈氨酸(Val ；V)。詳細(xì)說明本發(fā)明的ー個目的是提供具有實質(zhì)上改變的特性的新穎的エ程化 eCrylBa(eCrylBa)蛋白，這些特性優(yōu)于并且區(qū)別于天然eCrylBa蛋白而改進(jìn)，特別是與對于玉米的鱗翅目害蟲的殺蟲活性相關(guān)聯(lián)的生物化學(xué)特性，這些害蟲包括但不限于歐洲玉米螟(ECB ;0strinia nubilalis)、玉米螟齡(CEff ；He licoverpa zea))西南玉米 _ (SffCB ；Diatraea grandiosella) >(SCB ；Diatraea saccharalis) > ^(SBL ；Pseudoplusia includens)、黎丑夜蛾(VBC ；Anticarsia gemmatalis)、等等。，通過突變在根據(jù)本發(fā)明的天然CrylBa蛋白序列中的關(guān)鍵鑒定位置處的氨基酸，設(shè)計了ー種與如在此定義的天然CrylBa或野生型CrylBa相比具有實質(zhì)上改變的溶解度和/或殺蟲特性的eCrylBa?？梢詫⒕幋a該eCrylBa蛋白的核酸序列用于例如轉(zhuǎn)基因作物中以引起該 eCrylBa蛋白的表達(dá)從而控制蟲害，如歐洲玉米螟(ECB ；Ostrinia nubilalis)、玉米螟蛉 (CEff ；Helicoverpa zea))西南玉米螟(SWCB ;Diatraea grandiosella)、甘蔗螟蟲(SCB ； Diatraea saccnaralis)、大丑夜蛾(SBL ；Pseudoplusia includensノ、黎丑夜蛾(VBC ； Anticarsia gemmatalis)、等等。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了ー種工程化CrylBa(eCrylBa)蛋白，其包括在結(jié)構(gòu)域I中的一個或多個氨基酸位置處的ー個突變，由此當(dāng)與天然或野生型CrylBa蛋白相比吋，這種eCrylBa蛋白具有改進(jìn)的溶解度或至少對抗歐洲玉米螟的殺蟲活性。在另ー個實施方案中，該ー個或多個氨基酸位置處的突變位于結(jié)構(gòu)域I的α-螺旋4或α -螺旋5內(nèi)。某些Cry蛋白(如Cry lAa、CrylAb、和CrylAc)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究已經(jīng)包括了結(jié)構(gòu)域I的α -螺旋4和5的誘變(Saraswathy等人，2004，生物技術(shù)電子雜志(Electron. J.Biotech.) 7 :178-188)。這些實驗的結(jié)果涉及在離子通道形成和電導(dǎo)中的α -螺旋4和5。不清楚ー種Cry蛋白(特別是CrylBa)的結(jié)構(gòu)域I中的任何一種突變或突變的組合對溶解度以及特異活性是否會具有影響。因此，ー種CrylBa蛋白的結(jié)構(gòu)域I， 特別是在α -螺旋4或5位置處，是突變分析的目標(biāo)，以確定ー種天然CrylBa蛋白的溶解度是否可以改進(jìn)和/或針對ー種目標(biāo)昆蟲的特異活性是否可以增加，目標(biāo)昆蟲包括歐洲玉米螟(ECB)、西南玉米螟(SWCB)、甘蔗螟蟲(SCB)、玉米螟蛉(CEW)、大豆夜蛾(SBL)以及黎豆夜蛾(VBC)，連同其他昆蟲?；谛蛄斜葘Γ珻rylBa的α螺旋4包括SEQ ID NO 2的氨基酸143-163。α螺旋5組成了大部分的保守區(qū)1并且包括SEQ ID NO 2氨基酸176-199。 這六種已知的天然CrylBa蛋白僅在位置150處的α螺旋4處的ー個氨基酸不同。這六種中的四種在位置150處具有酪氨酸(Tyr ；Y)并且其他兩個在位置150處具有組氨酸(His ； H)。本披露現(xiàn)在證明了在位置150處的氨基酸在CrylBa蛋白的毒性中起關(guān)鍵性作用并且在α螺旋4和α螺旋5內(nèi)的突變對蛋白質(zhì)的溶解度、針對ー種具體害蟲的特異活性可能具有顯著影響并且増加CrylBa的活性譜。在另ー個實施方案中，本發(fā)明包括多個突變，這些突變位于相應(yīng)于SEQ ID Ν0:2的位置150、178、189或199的氨基酸位置處。仍然在另ー個實施方案中，該突變位于SEQ ID NO 5 的位置 150、178、189 或 199 處。仍然在另ー個實施方案中，本發(fā)明包括CrylBa中的多個突變，這些突變位于相應(yīng)于SEQ ID NO 5的氨基酸2和150 ；或氨基酸2、150和178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。在另ー個實施方案中，該突變位于SEQ ID NO :5的氨基酸2和 150 ；或氨基酸2、150和178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。在一個實施方案中，本發(fā)明包括ー種工程化CrylBa(eCrylBa)蛋白，其包括ー個氨基酸序列SEQ ID NO :6，其中在位置2處的Xaa是任何氨基酸并且a)在位置150處的)(aa 是ftx)、Phe、Trp或Lys，并且在位置189處的Xaa是Leu并且在199處是kr ；或b)當(dāng)在位置150處的Xaa是Lys吋，在位置189處的Xaa是kr ；或c)當(dāng)在位置150處的Xaa是 Lys時，在位置199處的Xaa是Lys。在另ー個實施方案中，本發(fā)明包括ー種eCrylBa蛋白，其包括氨基酸序列SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO :10。仍然在另ー個實施方案中，本發(fā)明的eCrylBa蛋白具有針對鱗翅目或鞘翅目昆蟲，特別是針對鱗翅目昆蟲的活性。這樣的鱗翅目昆蟲的例子包括但不限于歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。本發(fā)明的工程化CrylBa蛋白還具有針對玉米螟蛉(ー種天然CrylBa對其沒有活性的ー種昆蟲害蟲)的活性。仍然在另ー個實施方案中，本發(fā)明包括ー種eCrylBa蛋白，其具有比ー種天然 eCrylBa蛋白至少高3X的針對至少歐洲玉米螟的特異活性。在另ー個實施方案中，本發(fā)明還包括變異體CrylBa(VCrylBa)蛋白，其中在位置 150處的ー個酪氨酸(Tyr)或組氨酸(His) (Y150或H150)用ー個非Tyr或His的氨基酸取代。在一個方面，Y150 或 H150 取代的氨基酸是 Lys、Phe、Trp, Pro、Thr、Leu、Ala、Val、Ser> Arg、Gly 或 Asp。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種突變的CrylBa蛋白，其包含SEQ ID NO :3。仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種VCrylBa蛋白，其中在位置150處的Tyr或His(Y150或H150)用一個非Tyr或His的氨基酸取代并且具有在位置81處用非Val的氨基酸取代的纈氨酸(Val) (V81)；或在位置155(A155)的丙氨酸(Ala)以及在位置178(M178)處的甲硫氨酸(Met)分別用非Ala或Met的氨基酸取代。在另一個實施方案中，在位置81處的Val(VSl)用一個色氨酸(Trp)(VSlW)取代。仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種變異體CrylBa蛋白，其包含SEQ ID NO: 11。在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種在150處的Tyr(Y150)用任何其他氨基酸取代的vCrylBa蛋白，其中在位置155處的Ala(A155)用一個天冬氨酸(Asp) (A155D)取代并且在位置178處的Met(M178)用一個絲氨酸6er) (M178S)取代。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種含SEQ ID NO 12的vCrylBa蛋白。本發(fā)明包含的vCrylBa蛋白具有針對鱗翅目或鞘翅目昆蟲的殺蟲活性。這樣的鱗翅目昆蟲包括但不限于歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。vCrylBa蛋白的活性典型地小于本發(fā)明的野生型CrylBa蛋白的活性。這樣的變異體CrylBa蛋白的一個優(yōu)點是它們在不需要高的特異活性的情況下的有效性。技術(shù)人員將認(rèn)識到這樣的變異體CrylBa蛋白的其他用途和優(yōu)點。本發(fā)明的eCrylBa蛋白以及vCrylBa蛋白的昆蟲控制特性進(jìn)一步展示在實例2、4、5、6以及9中。在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種編碼本發(fā)明的eCryIBa蛋白或編碼本發(fā)明的vCrylBa蛋白的核酸。在另一個實施方案中，該核酸包括SEQ ID N0:13。本發(fā)明還包括一種嵌合基因，該嵌合基因包括被可操作地連接到編碼eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白的核酸上的一個異源啟動子序列。在一個實施方案中，該異源啟動子是選自下組，該組由以下各項組成玉米泛素、夜香樹屬病毒(cestrum virus, cmp)、玉米TrpA、水稻肌動蛋白、噬菌體T3基因9 5' UTR、玉米金屬硫蛋白(mtl)、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脫氫酶1、玉米捕光復(fù)合物、玉米熱休克蛋白、豌豆小亞基RuBP羧化酶、Ti質(zhì)粒冠癭堿合成酶、Ti質(zhì)粒胭脂堿合成酶、牽?；ū交蚁┩悩?gòu)酶、大豆富含甘氨酸蛋白1、馬鈴薯patatin、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。本發(fā)明還包括多種重組載體，這些重組載體包含本發(fā)明的核酸序列。這樣的載體包括但不限于一種質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、人工染色體、噬菌體或病毒載體。在這樣的載體中，這些核酸序列優(yōu)選包含在以下表達(dá)盒中，這些表達(dá)盒包括用于使這些核酸序列表達(dá)在一種能夠表達(dá)這些核酸序列的宿主細(xì)胞中的多個調(diào)控元件。這樣的調(diào)控元件通常包括啟動子和終止信號，并且還優(yōu)選地包括多種元件，這些元件允許有效翻譯由本發(fā)明的核酸序列所編碼的多肽。包含這些核酸序列的載體通常能夠優(yōu)選作為染色體外分子在多種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制，并且因此用來在這些宿主細(xì)胞中擴增本發(fā)明的核酸序列。在一個實施方案中，用于這樣的載體的宿主細(xì)胞是微生物，例如細(xì)菌，包括但不限于大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、農(nóng)桿菌屬或假單胞菌屬。在另一個實施方案中，用于這樣的重組載體的宿主細(xì)胞是內(nèi)生菌或附生菌。在另一個實施方案中，針對這樣的載體的宿主細(xì)胞是一種真核細(xì)胞，如一種植物細(xì)胞。本發(fā)明包括的這樣的植物細(xì)胞的實例包括但不限于高粱、小麥、向日葵、番茄、馬鈴薯、油菜作物、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜、以及一種玉米細(xì)胞。在另一個實施方案中，這樣的載體是病毒載體并且被用于在特定的宿主細(xì)胞(例如昆蟲細(xì)胞或植物細(xì)胞)中復(fù)制該核酸序列。重組載體還可用于將本發(fā)明的核酸序列轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，由此這些核酸序列被穩(wěn)定地整合到這些宿主細(xì)胞的DNA中。在一個實施方案中，這些宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在另一個實施方案中，這些宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。在另一個實施方案中，植物細(xì)胞是玉米細(xì)胞。在一個實施方案中，本發(fā)明包括含有本發(fā)明的編碼根據(jù)本發(fā)明的eCryIBa蛋白或vCrylBa蛋白的核酸的轉(zhuǎn)基因植物。這種eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白對于在其中易感蟲害是一個問題的任何轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)是有用的。這樣的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。在一個實施方案中，這些單子葉植物轉(zhuǎn)基因植物包括玉米、小麥、燕麥、水稻、大麥、甘蔗、高粱、草坪草以及牧場草植物。在另一個實施方案中，這些雙子葉植物包括大豆、以及其他豆科植物、棉花、向日葵、油菜作物以及其他蔬菜、甜菜、煙草以及油菜。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種來自轉(zhuǎn)基因植物的任何代的子代植物，其中該子代包括本發(fā)明的核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種來自轉(zhuǎn)基因植物的任何代的繁殖體，其中該繁殖體包括本發(fā)明的核苷酸。仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明的繁殖體是選自下組，該組由以下各項組成種子、節(jié)段以及插條。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種來自本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的一種生物樣品，其中該生物樣品包括本發(fā)明的一種eCrylBa蛋白并且該eCrylBa蛋白能夠控制蟲害。這樣的生物樣品的實例包括但不限于任何包括蛋白質(zhì)(如含eCryIBa蛋白的玉米面或玉米粉)的玉米副產(chǎn)物，其中該eCrylBa蛋白繼續(xù)執(zhí)行它在該生物樣品從中衍生的轉(zhuǎn)基因作物中所具有的這種殺蟲功能。本發(fā)明還包括一種殺蟲組合物，該組合物包括一種根據(jù)本發(fā)明的eCrylBa蛋白或根據(jù)本發(fā)明的vCrylBa蛋白以及一種可接受的農(nóng)用載體。在一個實施方案中，這種農(nóng)用載體可以是一種液體、粉末或一種轉(zhuǎn)基因植物，例如但不限于一種玉米植物或一種甘蔗植物。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括了一種用于產(chǎn)生針對昆蟲是活性的eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白的方法，包括(a)獲得包含一種嵌合基因的宿主細(xì)胞，該基因本身包含與本發(fā)明的一種核酸分子可操作地連接的一種異源啟動子序列；以及(b)在該轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸，這產(chǎn)生了本發(fā)明的針對昆蟲是活性的至少一種蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，這些昆蟲是鞘翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲。仍然在另一個實施方案中，這些鱗翅目昆蟲是選自下組，該組由以下各項組成歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種產(chǎn)生抗昆蟲轉(zhuǎn)基因植物的一種方法，包括將本發(fā)明的一種包括核酸的表達(dá)盒引入一種植物中由此產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因植物，其中該表達(dá)盒引起在該轉(zhuǎn)基因植物中以有效控制昆蟲的量表達(dá)本發(fā)明的一種蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，這些昆蟲是鞘翅目或鱗翅目昆蟲。本發(fā)明包括的這些鱗翅目昆蟲包括但不限于歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種制造eCrylBa蛋白的方法，包括a)鑒定一種具有結(jié)構(gòu)域I的CrylBa蛋白；b)將結(jié)構(gòu)域I中的一個位置處的至少一個天然氨基酸用至少一個其他的氨基酸取代；并且c)獲得該如此產(chǎn)生的eCrylBa蛋白，其中當(dāng)與一種天然CrylBa蛋白相比時，該eCrylBa具有改進(jìn)的溶解度和/或針對至少歐洲玉米螟的殺蟲活性。在另一個實施方案中，該CrylBa蛋白是具有以下Genbank登錄號的CrylBal :CAA29898,CrylBa2 (CAA65003)、CrylBa3 (AAK63251)、CrylBa4 (AAK51084)、CrylBa5 (AB020894)或CrylBa6 (ABL60921)。仍然在另一個方面，CrylBa中的天然氨基酸位于結(jié)構(gòu)域I的α -螺旋4或α -螺旋5內(nèi)。仍然在另一個實施方案中，該氨基酸位于相應(yīng)于SEQ ID NO 2的位置150、178、189或199的位置處。仍然在另一個實施方案中，該氨基酸位于SEQ ID NO 5的位置150、178、189或199的位置處。仍然在另一個實施方案中，CrylBa中的氨基酸位于相應(yīng)于SEQ ID NO 5的氨基酸2和150 ；或氨基酸2、150和178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。在另一個實施方案中，該氨基酸位于SEQ ID NO 5的位置2和150 ；或位置2、150和178 ；或位置2、150和189 ；或位置2、150和199的位置處。仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明包括一種用于控制鱗翅目昆蟲的方法，包括向昆蟲遞送本發(fā)明的一個有效量的eCry IBa蛋白或vCry IBa蛋白或使昆蟲與其接觸。根據(jù)這個實施方案，這些昆蟲是鞘翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲。這樣的鱗翅目昆蟲包括但不限于歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。優(yōu)選地，該eCrylBa蛋白或VCrylBa蛋白通過口服遞送給昆蟲。在另一個實施方案中，這些蛋白質(zhì)通過一種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行口服遞送，該轉(zhuǎn)基因植物包含表達(dá)本發(fā)明的eCrylBa蛋白或VCrylBa蛋白的一個核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步包括一種控制昆蟲的方法，其中本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步包含編碼一種第二殺蟲成分的第二核酸序列或多組核酸序列。在一個實施方案中，該第二核酸序列是編碼一種不同于本發(fā)明的eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白的Cry蛋白的那些，例如編碼一種營養(yǎng)期殺蟲蛋白質(zhì)的那些(分別披露于美國專利5，849，870以及5，877，012中，均通過引用結(jié)合在此)、或編碼一種非蛋白質(zhì)成分的產(chǎn)生途徑的那些。在另一個實施方案中，該第二核苷酸序列編碼一種Vip3蛋白質(zhì)。技術(shù)人員將認(rèn)識到許多不同的殺蟲成分可以與本發(fā)明的eCrylBa或vCrylBa蛋白結(jié)合使用。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括向一個栽培者提供一種控制至少歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的改進(jìn)的手段的方法，包括向該栽培者提供或銷售該轉(zhuǎn)基因繁殖體，該繁殖體包括編碼一種eCryIBa蛋白的核酸，該蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)域I中的一個或多個氨基酸位置處具有一個突變，該eCryIBa蛋白與一種天然CrylBa蛋白相比時具有改進(jìn)的溶解度和/或針對至少歐洲玉米螟的殺蟲活性。在另一個實施方案中，該轉(zhuǎn)基因繁殖體是選自下組，該組由以下各項組成種子、節(jié)段以及插條。在另外的實施方案中，通過將隨機突變結(jié)合至已知的技術(shù)(如體外重組或DNA改組)中，可對本發(fā)明的核酸序列進(jìn)行進(jìn)一步修飾。這項技術(shù)說明于Memmer等人，(自然)Nature 370 =389-391(1994)以及美國專利5，605，793中，二者均通過引用結(jié)合在此。一種核酸序列的數(shù)百萬突變體拷貝是基于本發(fā)明的最初的一種核酸序列而產(chǎn)生的，并且對具有改進(jìn)的特性(例如提高的殺蟲活性、增強的穩(wěn)定性、或不同的特異性)或靶蟲害范圍的變異體進(jìn)行回收。該方法包括從包含本發(fā)明的一種核酸序列的一個模板雙鏈多核酸形成一種誘變的雙鏈多核酸，其中該模板雙鏈多核酸已經(jīng)被切割成具有所希望的大小的多個雙鏈隨機片段；并且包括以下步驟將一個或多個單鏈或雙鏈寡核酸添加至生成的雙鏈隨機片段群中，其中所述寡核酸包含與該雙鏈模板多核酸具有同一性的一個區(qū)域和具有異質(zhì)性的一個區(qū)域；使生成的雙鏈隨機片段與寡核酸的混合物變性成單鏈片段；在導(dǎo)致所述單鏈片段在所述同一性的區(qū)域進(jìn)行退火以形成多個退火片段對的條件下用一種聚合酶孵育生成的多個單鏈片段群，所述同一性的區(qū)域足以使一個片段對中的一員引導(dǎo)另一個成員進(jìn)行復(fù)制，由此形成一種誘變的雙鏈多核酸；并且將第二和第三個步驟再重復(fù)至少兩個循環(huán)，其中在另一個循環(huán)的第二個步驟中生成的混合物包括來自前面的循環(huán)的第三個步驟的誘變的雙鏈多核酸，并且該另外的循環(huán)形成了另外的誘變的雙鏈多核酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，在多個雙鏈隨機片段群中的一個單一種類的雙鏈隨機片段的濃度按總DNA的重量計小于1%。在另一個實施方案中，該模板雙鏈多核酸包含至少大約100個種類的多核酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該雙鏈隨機片段的大小是從大約5bp至51Λ。仍然在另一個優(yōu)選的實施方案中，該方法的第四個步驟包括將第二和第三個步驟重復(fù)至少10個循環(huán)。在異源微生物中的核酸序列的表達(dá)作為生物性昆蟲控制劑，這些殺蟲eCrylBa蛋白是通過在能夠表達(dá)這些核酸序列的異源宿主細(xì)胞中表達(dá)這些核酸序列而產(chǎn)生的。在一個第一實施方案中，制造了包含本發(fā)明的一種核酸序列的修飾的蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。這樣的修飾包括存在的調(diào)控元件的突變或缺失，因此導(dǎo)致該核酸序列的表達(dá)改變，或摻入了控制該核酸序列表達(dá)的新的調(diào)控元件。在另一個實施方案中，通過插入至染色體中或通過引入包含這些核酸序列的染色體外復(fù)制分子而將一種或多種核酸序列的多個另外的拷貝添加至蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞中。在另一個實施方案中，將本發(fā)明的核酸序列中的至少一個插入一個適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)盒中(包含一個啟動子和終止信號)。該核酸序列的表達(dá)是組成型的，或使用相應(yīng)于各種類型的起始轉(zhuǎn)錄的刺激的一種誘導(dǎo)型啟動子。在一個優(yōu)選的實施方案中，其中表達(dá)了該蛋白質(zhì)的細(xì)胞是一種微生物，如一種病毒、細(xì)菌或真菌。在一個實施方案中，一種病毒(如桿狀病毒)在其基因組中包含本發(fā)明的一種核酸序列并且在感染了適當(dāng)?shù)恼婧思?xì)胞(適合于病毒復(fù)制以及該核酸序列的表達(dá))之后表達(dá)了大量相應(yīng)的殺蟲eCrylBa蛋白或vCrylBa蛋白。由此產(chǎn)生的殺蟲蛋白用作一種殺蟲劑。可替代地，被工程化以包含該核酸序列的桿狀病毒被用來體內(nèi)感染昆蟲并通過該殺蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)或通過病毒感染與該殺蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)的組合而將其殺死。細(xì)菌細(xì)胞也是用于表達(dá)本發(fā)明的核酸序列的宿主。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用了能夠在植物組織內(nèi)生活并復(fù)制的非致病性共生細(xì)菌(所謂的內(nèi)生菌)，或能夠定植在葉際或根際的非致病性共生細(xì)菌(所謂的附生菌)。這樣的細(xì)菌包括以下屬的細(xì)菌農(nóng)桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、固氮螺菌屬、定氮菌屬、芽孢桿菌屬、棒形桿菌屬、腸桿菌屬、歐文菌屬、黃桿菌屬、克雷白菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、沙雷菌屬、鏈霉菌屬、以及黃單胞菌屬。共生性真菌(如木霉屬以及膠枝霉屬)也是為了相同目的表達(dá)本發(fā)明的核酸序列的可能宿主。這些基因操作技術(shù)對于不同的可供使用的宿主而言是特異性的并且在本領(lǐng)域中是已知的。例如，表達(dá)載體PKK223-3以及PKK223-2可以用來在大腸桿菌中(在轉(zhuǎn)錄或翻譯融合中)在tac或trc啟動子之后表達(dá)異源基因。為了表達(dá)編碼多個ORF的操縱子，最簡單的操作是在轉(zhuǎn)錄融合中將該操縱子插入一種載體(如pKK223-;3)中，允許對該異源基因的同源核糖體結(jié)合位點進(jìn)行利用。在革蘭氏陽性種類(如芽孢桿菌屬)中的過表達(dá)技術(shù)在本領(lǐng)域中也是已知的，并且可在本發(fā)明的背景中使用(Quax等人.In IndustrialMicroorganisms :Basic and Applied Molecular Genetics,Eds. Baltz et al·,AmericanSociety for Microbiology，Washington(1993))。用于過表達(dá)的替代性系統(tǒng)依賴于(例如)酵母載體，并包括畢赤酵母屬、酵母屬、以及克魯維酵母屬的使用(Sreekrishna，InIndustrial microorganisms :basic and applied molecular genetics, Baltz,Hegeman,and Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993) ；Dequin& Barre，Biotechnology L2 173-177 (1994) ；van den Berg et al.，Biotechnology 8 135-139(1990))ο植物轉(zhuǎn)化在一個實施方案中，本發(fā)明的這些殺蟲eCrylB蛋白質(zhì)或vCrylBa蛋白中至少有一種是在一種高級生物(例如，一種植物)中表達(dá)的。在這種情況下，表達(dá)有效量的這些eCrylBa或vCrylBa蛋白的轉(zhuǎn)基因植物保護這些植物其本身免受蟲害。在該昆蟲開始以這種轉(zhuǎn)基因植物為食時，它也攝取了這種已表達(dá)的eCrylBa或vCrylBa蛋白。這將妨礙昆蟲進(jìn)一步咬食植物組織或者甚至可以傷害或殺死昆蟲。本發(fā)明的一種核酸序列被插入到一種表達(dá)盒中，然后該表達(dá)盒被優(yōu)選穩(wěn)定地整合到所述植物的基因組中。在另一個實施方案中，該核酸序列被包含在一種非致病性自我復(fù)制病毒中。跟據(jù)本發(fā)明所轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，并且包括但不限于玉米、小麥、大麥、黑麥、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、卷心菜、花椰菜、西蘭花、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、胡椒(P印per)、芹菜、小南瓜(squash)、大南瓜(pumpkin)、大麻、西葫蘆、蘋果、梨、榲梓、甜瓜、李子(plum)、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三葉草、煙草、胡蘿卜、棉花、苜蓿、水稻、馬鈴薯、茄子、黃瓜、擬南芥屬，以及木本植物，如針葉樹以及落葉樹。一旦一種令人希望的核酸序列已經(jīng)被轉(zhuǎn)化到一種特定的植物種類中，使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)可以將其在該種類中繁殖或?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到相同種類的其它品種中，特別包括商業(yè)品種。本發(fā)明的一種核酸序列優(yōu)選地表達(dá)于轉(zhuǎn)基因植物中，因此引起相應(yīng)的eCrylBa或vCrylBa蛋白在該轉(zhuǎn)基因植物中的生物合成。通過這種方式產(chǎn)生了對昆蟲具有增強的抗性的轉(zhuǎn)基因植物。為了其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，本發(fā)明的這些核酸序列可能需要其他的修飾和優(yōu)化。盡管在許多情況下，來自微生物生物體的基因能夠在植物中高水平表達(dá)而無需修飾，在轉(zhuǎn)基因植物中的低水平表達(dá)可能是由于微生物的核酸序列的緣故，這些序列具有在植物種并不優(yōu)選的密碼子。在本領(lǐng)域中已知的是所有生物都具有特定的密碼子使用偏好，而且在本發(fā)明中所說明的這些核酸序列的密碼子可以被改變以符合植物偏好，同時維持由其編碼的這些氨基酸。此外，在植物中高表達(dá)最好是由以下編碼序列實現(xiàn)的，這些編碼序列具有至少大約35%、優(yōu)選大于約45%、更優(yōu)選大于約50%、并且最優(yōu)選大于約60%的GC含量。具有低GC含量的微生物核酸序列在植物中也許表達(dá)欠佳，這是由于存在著可能使信息不穩(wěn)定的ATTTA基序，以及可導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)亩嗑巯佘账峄腁ATAAA基序。盡管優(yōu)選的基因序列均可以在單子葉植物和雙子葉植物種類中充分表達(dá)，還可以對序列進(jìn)行修飾以便解決單子葉植物或雙子葉植物特定的密碼子偏好以及GC含量偏好，因為這些偏好已經(jīng)被證明是不同的(Murray et al. Nucl. Acids Res. 17 :477-498 (1989))。此外，針對不正常剪接位點的存在來篩選這些核酸序列，這些位點可能導(dǎo)致信息平截(message truncation)。使用熟知的位點定向誘變、PCR、以及合成基因的構(gòu)建，使用說明于公開的專利申請EP0 385 962 (授予 Monsanto)、EP 0 359472 (授予 Lubrizol)、以及 WO 93/07278(授予Ciba-Geigy)中的方法，對在這些核酸序列之內(nèi)所有需要做出的變化(如以上所說明的那些變化)進(jìn)行改變。在本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)在美國專利5，625，136(通過引用結(jié)合在此)中所披露的操作來制造一種eCrylBa編碼序列。在這個操作中，使用了玉米偏愛的密碼子，即最頻繁地編碼玉米中的氨基酸的單一密碼子。針對一種特定的氨基酸的玉米偏愛的密碼子可源自(例如)來自玉米的已知基因序列。針對來自玉米植物的觀個基因的玉米密碼子使用發(fā)現(xiàn)于 Murray et al.，Nucleic Acids Research 17:477-498(1989)中，其披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。使用玉米優(yōu)化的密碼子制造的合成序列列出在SEQ ID N0:13中。以這種方式，為了在任何植物中進(jìn)行表達(dá)可以對這些核酸序列進(jìn)行優(yōu)化。認(rèn)識到的是該基因序列的所有或任何部分可以是優(yōu)化的或合成的。即，還可以使用合成的或部分優(yōu)化的序列。為了有效的翻譯起始，可能需要修飾與起始甲硫氨酸相鄰的序列。例如，它們可以通過包含已知在植物中有效的序列而被修飾。Joshi已經(jīng)提出了針對植物的一種合適的共有序列(NAR 15 :6643-6653(1987)),并且Clonetech提出了另一個共有翻譯起始子(1993/1994目錄，210頁)。這些共有序列適宜與本發(fā)明的核酸序列一起使用。將這些序列添加至包含核酸序列的構(gòu)建體中，達(dá)到ATG并且包括ATG(同時保持不修飾第二個氨基酸)，或者可替代地達(dá)到ATG后的GTC并且包括ATG后的GTC(具有修飾該轉(zhuǎn)基因的第二個氨基酸的可能性)。在轉(zhuǎn)基因植物中這些核酸序列的表達(dá)是由在植物中發(fā)揮作用的啟動子所推動的。啟動子的選擇將依賴于表達(dá)的時間和空間需要而變化，并且還依賴于目標(biāo)種類而變化。因此，本發(fā)明的核酸序列在葉、柄(stalk)或莖(stem)、穗、花序(例如穗狀花序、圓錐花序、穗軸、等等)、根、和/或籽苗中的表達(dá)是優(yōu)選的。然而在許多情況下，尋求針對多于一種類型蟲害的保護，并且因此在多個組織中的表達(dá)是令人希望的。盡管已經(jīng)顯示來自雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可操作的并且反之亦然，理想的是選擇雙子葉植物啟動子用于在雙子葉植物中的表達(dá)，并且選擇單子葉植物啟動子用于在單子葉植物中的表達(dá)。然而，對所選擇的啟動子的起源并沒有限制，足夠的是它們在推動核酸序列在所希望的細(xì)胞中的表達(dá)中是操作性的。被組成型表達(dá)的啟動子包括來自編碼肌動蛋白或泛素的基因的啟動子以及CaMV35S和19S啟動子。本發(fā)明的核酸序列也可以在被化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動子的調(diào)節(jié)下表達(dá)。這使得eCrylBa或變異體CrylBa蛋白僅在用誘導(dǎo)性化學(xué)品處理作物植物時能夠被合成。用于基因表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)的優(yōu)選技術(shù)詳述于公開申請EP O 332 104(授予Ciki-Geigy)以及美國專利5，614，395中。用于化學(xué)誘導(dǎo)的一種優(yōu)選啟動子是煙草PR-Ia啟動子。另一類啟動子是創(chuàng)傷可誘導(dǎo)的啟動子。已經(jīng)說明了數(shù)量眾多的在創(chuàng)傷部位并且還在植物病原菌感染的部位表達(dá)的啟動子。理想的是，這種啟動子應(yīng)當(dāng)僅在感染部位是局部活性的，并且以這種方式這些殺蟲eCrylBa或變異體CrylBa蛋白僅在需要合成這些殺蟲eCrylBa或變異體CrylBa蛋白的細(xì)胞中積累以殺死入侵的蟲害。優(yōu)選的這類啟動子包括由 Manford 等人 Mol. Gen. Genet. 215 :200-208 (1989)、Xu 等人 Plant Molec. Biol. 22 573-588(1993)、Logemann 等人 Plant Celll 151-158 (1989) > Rohrmeier & Lehle, PlantMolec. Biol. 22 :783-792 (1993)、Firek 等人 Plant Molec. Biol. 22 :129-142 (1993)、以及Warner 等人 Plant J. 3 191-201 (1993)所說明的啟動子。用于在植物(特別是玉米)中表達(dá)編碼eCrylBa或變異體CrylBa蛋白的基因的組織特異性的或組織優(yōu)先的啟動子是那些直接在根、髓、葉或花粉(特別是根)中表達(dá)的啟動子。這樣的啟動子(例如從PEPC或trpA中分離的那些)披露于美國專利號5，625，136中、或MTL，披露于美國專利號5，466，785中。這兩篇美國專利以其全文通過引用結(jié)合在此。另外的優(yōu)選實施方案是以一種創(chuàng)傷可誘導(dǎo)的方式或病原體感染可誘導(dǎo)的方式表達(dá)核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。除了啟動子外，使用本發(fā)明的eCrylBa或變異體CrylBa蛋白基因、許多轉(zhuǎn)錄終止子可供在嵌合基因構(gòu)建中使用。轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)責(zé)在該轉(zhuǎn)基因及其正確的聚腺苷酸化之外的轉(zhuǎn)錄的終止。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子是那些已知在植物中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄終止子，包括CaMV35S終止子、tml終止子、胭脂堿合成酶終止子、豌豆rbcS E9終止子、以及本領(lǐng)域中已知的其他啟動子。這些終止子可以在單子葉植物和雙子葉植物中使用。任何一種已知在植物中發(fā)揮功能的可供使用的終止子均可以在本發(fā)明的背景下使用?？梢詫?shù)量眾多的其他序列摻入本發(fā)明中所說明的表達(dá)盒中。這些序列包括已經(jīng)顯示出增強表達(dá)的序列，如內(nèi)含子序列(例如，來自Adhl和bronzel)以及病毒的前導(dǎo)序列(例如，來自TMV、MCMV,以及AMV)。將本發(fā)明的核酸序列靶向到植物中的不同細(xì)胞定位的表達(dá)可能是更優(yōu)選的。在某些情況下，在胞質(zhì)溶膠中的定位可能是令人希望的，而在其他情況下，在某個亞細(xì)胞器中的定位可能是優(yōu)選的。使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)進(jìn)行編碼酶類的轉(zhuǎn)基因的亞細(xì)胞定位。典型地，處理編碼來自一種已知靶向細(xì)胞器的基因產(chǎn)物的目標(biāo)肽的DNA并將其融合在該核酸序列的上游。針對葉綠體的許多這樣的靶序列是已知的并且已經(jīng)證明了它們在異源構(gòu)建體中的功能。還將本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)靶向至宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或液泡。實現(xiàn)這個目的的技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的。適合于植物轉(zhuǎn)化的載體說明于在本說明書的其他地方。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，二元載體或攜帶至少一個T-DNA邊界序列的載體是適合的，而對于直接基因轉(zhuǎn)移，任何載體都是適合的，并且僅含有感興趣的構(gòu)建體的線性DNA也許是優(yōu)選的。在直接基因轉(zhuǎn)移的情況下，可以使用以單一 DNA種類的轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化Gchocher等人Bi0techn0l0gy4 1093-1096(1986))。對于直接基因轉(zhuǎn)移以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化這二者，轉(zhuǎn)化通常(但不是必需的)用一種選擇標(biāo)記進(jìn)行，這種選擇標(biāo)記可以提供針對一種抗生素(卡那霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤)或一種除草劑(Basta)的抗性。包含對本發(fā)明的eCryIBa或變異體CryIBa蛋白基因的植物轉(zhuǎn)化載體還可能如美國專利5，767，378和5，994，629中所披露的，包含提供轉(zhuǎn)基因植物陽性選擇的基因(如磷酸甘露糖異構(gòu)酶；pmi)(通過引用將其合并在此)或提供對除草劑草銨膦(草丁膦)耐受性的草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)。然而，選擇標(biāo)記的選擇對于本發(fā)明并不是至關(guān)重要的。在另一個實施方案中，直接將編碼本發(fā)明的一種eCrylBa或vCrylBa蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化進(jìn)入質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化的一種主要優(yōu)點在于質(zhì)體通常能夠表達(dá)細(xì)菌基因而無需實質(zhì)性的密碼子優(yōu)化，而且質(zhì)體能夠在一種單一啟動子的控制下表達(dá)多個開放閱讀框。在美國專利號 5，451，513,5, 545，817、以及 5，545，818、在 PCT 申請?zhí)?WO 95/16783、并且在 McBride 等人(1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91，7301-7305 中廣泛說明了質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)?；镜娜~綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)涉及將位于一種選擇標(biāo)記側(cè)翼的克隆的質(zhì)體DNA區(qū)連同所感興趣的基因一起引入到一種適合的靶組織中，這是(例如)通過生物射彈(biolistics)或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如，氯化鈣或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)來進(jìn)行的。這些1至1. 5kb的側(cè)翼區(qū)(被命名為靶向序列)促進(jìn)了與質(zhì)體基因組的同源重組，并且因而允許置換或修飾該原質(zhì)體(plastome)的特定區(qū)域。最初，將葉綠體16S rRNA和rps 12基因(賦予了針對大觀霉素和/或鏈霉素的抗性)的點突變用作選擇標(biāo)記用于轉(zhuǎn)化(Svab, Z.，Hajdukiewicz, P.，and Maliga，P. (1990)Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87,8526-8530 ；Staub,J.Μ. , and Maliga,P. (1992)Plant Cell 4,39-45)。這以大約每100次靶葉轟擊大約1個的頻率產(chǎn)生穩(wěn)定的同質(zhì)轉(zhuǎn)化株。在這些標(biāo)記之間克隆位點的存在允許建立一種質(zhì)體靶向載體用于外源基因的引入(Staub, J.M.，and Maliga, P. (1993)EMBO J. 12,601-606) 轉(zhuǎn)化頻率的實質(zhì)性增加是通過用一種顯性選擇標(biāo)記(細(xì)菌aadA基因，它編碼了大觀霉素-detoxifying酶-氨基糖苷-3'-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)來置換這些隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因(Svab，Ζ.，and Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90,913-917) 之前，這種標(biāo)記已經(jīng)被成功地用于萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)這種綠藻的質(zhì)體基因組的高頻率轉(zhuǎn)化(Goldschmidt-Clermont, Μ. (1991)Nucl. AcidsRes. 19 :4083-4089)。用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的其他選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域所已知的，并且包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。典型地，轉(zhuǎn)化之后需要大致15-20個細(xì)胞分裂循環(huán)以便達(dá)到一種同質(zhì)狀態(tài)。質(zhì)體表達(dá)(其中多種基因通過同源重組被插入到在每個植物細(xì)胞中存在的所有數(shù)千個環(huán)狀質(zhì)體基因組的拷貝中)利用了超過核表達(dá)的基因的龐大的拷貝數(shù)目的優(yōu)點，以便允許能夠很容易超過總的可溶性植物蛋白的10%的表達(dá)水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，將本發(fā)明的一種核酸序列插入至一種質(zhì)體靶向的載體中并且轉(zhuǎn)化至一種所希望的植物宿主的質(zhì)體基因組中。獲得了包含本發(fā)明的一種核酸序列的對于質(zhì)體基因組同型的植物，并且這些植物優(yōu)選地能夠高表達(dá)該核酸序列。昆蟲控制成分的組合本發(fā)明的eCrylBa或vCrylBa蛋白可以與其他Bt Cry蛋白或其他殺蟲成分組合使用以增加害蟲的目標(biāo)范圍。此外，本發(fā)明的eCrylBa或vCrylBa蛋白與具有不同性質(zhì)的其他Bt Cry蛋白或其他殺蟲成分結(jié)合使用對于預(yù)防和/或處理昆蟲抗性的具有特殊效用。其他的殺蟲成分包括例如凝集素、α -淀粉酶、過氧化物酶、以及膽固醇氧化酶。營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因，如viplA(a)和vip2A(a)或vip3在本發(fā)明中也是有用的。在一個實施方案中，將被命名為 eCrylBa-T2AY150KL189S(SEQ IDNO 9)的 eCrylBa 蛋白與一種 Vip3A 蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中組合。這種轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出與eCrylBa和Vip3均相關(guān)聯(lián)的組合的殺蟲活性譜。仍然在另一個實施方案中，該轉(zhuǎn)基因植物是一種玉米植物或甘蔗植物?？梢詫⒁环N植物遺傳工程化以包含并表達(dá)所有的在所謂的分子堆積(molecularstack)中必需的基因來實現(xiàn)一種以上的殺蟲成分在同一個轉(zhuǎn)基因植物中的共表達(dá)?？商娲兀梢詫⒁环N植物(親本1)遺傳工程化，用于本發(fā)明的基因的表達(dá)?？梢詫⒁环N第二植物(親本遺傳工程化，用于一種補充性昆蟲控制成分的表達(dá)。通過將親本1與親本2雜交，獲得了表達(dá)被引入至親本1和親本2中的所有基因的子代植物。例如而并非限制，親本1可以包含一種eCrylBa編碼序列并且親本2可以包含一種Vip3A編碼序列。親本1與親本2雜交的某一子代將包含該eCrylBa編碼序列以及Vip3A編碼序列這兩者。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子還可以用一種殺蟲的種子包衣進(jìn)行處理，如在美國專利號5，849，320以及5，876，739中所說明，通過引用結(jié)合在此。其中本發(fā)明的殺蟲種子包衣與轉(zhuǎn)基因種子針對同一種目標(biāo)昆蟲是具有活性的，該組合(i)在用于增強本發(fā)明的一種eCrylBa蛋白針對目標(biāo)昆蟲的活性的方法中以及(ii)在用于通過提供針對該目標(biāo)昆蟲的一種第二作用機制而防止對本發(fā)明的eCrylBa蛋白產(chǎn)生抗性的一種方法中是有用的。因此，本發(fā)明提供了一種增強活性的方法，這種活性對抗或防止在一種目標(biāo)昆蟲(例如，玉米根蟲)中產(chǎn)生抗性，該方法包括將一種殺蟲性種子包衣施用至包含本發(fā)明的一種或多種eCrylBa蛋白的一種轉(zhuǎn)基因種子上。這樣的化學(xué)處理可以包括殺蟲劑、殺真菌劑或殺線蟲劑。這樣的殺蟲劑的實例包括但不限于呋蟲胺，如噻蟲嗪、吡蟲啉、啶蟲脒、烯蟲靈、呋蟲胺(nidinotefuran)、溴蟲腈、吡螨胺、蟲酰胼、甲氧蟲酰胼、氯蟲酰胼、唑蚜威、阿維菌素、多殺菌素、氟蟲腈(fiprinol)、乙酰甲胺磷、苯線磷、二嗪農(nóng)、毒死蜱、甲基毒死蜱(chlorpyrifon-methyl)、馬拉硫磷、甲萘威、涕滅威、蟲螨威、硫雙威以及殺線威。即使其中該殺蟲性種子包衣針對一種不同的昆蟲是具有活性的，該殺蟲性種子包衣可用于擴展昆蟲控制的范圍，例如通過將一種具有針對鱗翅目昆蟲活性的殺蟲性種子包衣加入本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子(具有針對鞘翅目昆蟲活性)中，經(jīng)包被的轉(zhuǎn)基因種子產(chǎn)生了對鱗翅目以及鞘翅目蟲害這兩者的控制。實例通過參考以下具體的實例可以進(jìn)一步描述本發(fā)明。這些實例僅僅是出于說明性目的而提供的，并且并不旨在進(jìn)行限制，除非另外指明。這里所使用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA以及分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，并且由J. Sambrook, et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual,3d Ed. , Cold Spring Harbor, NY : Co Id Spring HarborLaboratoryPress (2001) ；T. J. Silhavy, M. L. Berman, and L. W. Enquist, Experiments with GeneFusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)以及Ausubel,F. Μ. et al. , Current Protocols in Molecular Biology,New York, John Wiley 以及SonsInc. , (1988), Reiter, et al. , Methods in Arabidopsis Research, World ScientificPress (1992),以及 Schultz et al. ,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer AcademicPublishers (1998)進(jìn)行了說明。實例1.使用PCR突變CrylBa編碼序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是核酸序列的一種重復(fù)性的、酶促的、引發(fā)的合成。這種操作是熟知的并且經(jīng)常被本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用(參見燦11化，美國專利號4，683，195、4, 683, 202、4，800, 159 ；Saiki, Randall K. ， Stephen Scharf, Fred Faloona, KaryB. Mullis，Glenn Τ. Horn,Henry Α. ErIich，Norman Arnheim[1985]“用于診斷鐮狀細(xì)胞性貧血β珠蛋白基因組序列以及限制位點分析(Enzymatic Amplification of. beta. -GlobinGenomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle CellAnemia)”科學(xué)(Science) 230 :1350-1354.)。PCR是基于一種感興趣的DNA片段的酶促擴增，該DNA片段的側(cè)翼是與靶序列的相反鏈進(jìn)行雜交的兩種寡核酸引物。這兩種引物用指向彼此的3'端而定向。模板的熱變性的重復(fù)循環(huán)、將這些引物退火至其互補序列、以及用DNA聚合成酶對退火的引物進(jìn)行延伸導(dǎo)致了由PCR引物的5'端所限定的區(qū)段的擴增。由于每個引物的延伸產(chǎn)物可以充當(dāng)另一個引物的模板，每個循環(huán)基本上使在之前的循環(huán)中所產(chǎn)生的DNA片段的量加倍。這導(dǎo)致了特定目標(biāo)片段的指數(shù)型累積，在幾小時內(nèi)高達(dá)幾百萬倍。通過使用一種熱穩(wěn)定的DNA聚合成酶(如Taq聚合成酶，它分離自嗜熱菌棲熱水生菌)，該擴增過程可以是完全自動化的。根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明使用快速變化位點定向誘變試劑盒(QuickChangeSite-Directed Mutagenesis Kit) (Stratagene, La Jolla, CA) 1 1 Φ7^ W7^M性引物的組合來構(gòu)建在以下實例中描述的突變體CrylBa編碼序列。基于本申請，技術(shù)人員將認(rèn)識到可以使用其他的引物對來突變?nèi)魏蜟rylBa編碼序列。表1.用來制造編碼eCrylBa蛋白的突變編碼序列的引物
權(quán)利要求
1.一種工程化CrylBa(eCrylBa)蛋白，包括在結(jié)構(gòu)域I中的一個或多個氨基酸位置處的一個突變，當(dāng)與天然或野生型CrylBa蛋白相比時，所述工程化蛋白具有改進(jìn)的溶解度或至少對抗歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的殺蟲活性。
2.如權(quán)利要求1所述的eCrylBa蛋白，其中該突變位于結(jié)構(gòu)域I的α-螺旋4或α-螺旋5內(nèi)。
3.如權(quán)利要求2所述的eCrylBa蛋白，其中該突變位于相應(yīng)于SEQID NO :2的位置 150、178、189或199的氨基酸位置處。
4.如權(quán)利要求3所述的eCrylBa蛋白，其中該突變位于SEQID NO :5的位置150、178、 189 或 199 處。
5.如權(quán)利要求4所述的eCrylBa蛋白，其中該突變位于相應(yīng)于SEQID NO 5的氨基酸 2和150 ；或氨基酸2、150和178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。
6.如權(quán)利要求5所述的eCrylBa蛋白，其中該突變位于SEQID NO :5的氨基酸2和 150 ；或氨基酸2、150和178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。
7.如權(quán)利要求6所述的eCryIBa蛋白，包括SEQID NO :6的氨基酸序列，其中在位置2 處的X是任何氨基酸并且a)在位置150處的X是Pro、Phe、Trp或Lys，并且在位置189處的X是Leu并且在199 處是kr ；或b)當(dāng)在位置150處的X是Lys時，在位置189處的X是kr；或c)當(dāng)在位置150處的X是Lys時，在位置199處的X是Lys。
8.如權(quán)利要求7所述的eCrylBa蛋白，其中該蛋白質(zhì)包括一個氨基酸序列SEQID NO 7、SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO :10。
9.如權(quán)利要求1至8的任一項所述的eCrylBa蛋白，其中該蛋白質(zhì)具有針對鱗翅目或鞘翅目昆蟲的活性。
10.如權(quán)利要求9所述的eCrylBa蛋白，其中這些鱗翅目昆蟲是西南玉米螟、甘蔗螟蟲、 玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。
11.如權(quán)利要求1所述的eCrylBa蛋白，其中所述eCrylBa蛋白的特異活性比一種天然 eCrylBa蛋白高至少3倍。
12.—種變異體CrylBa蛋白，其中在位置150處的一個酪氨酸(Y)或組氨酸(H)用一個非Y或H的氨基酸取代。
13.如權(quán)利要求13所述的CrylBa蛋白，其中該氨基酸是LysJheJrpJroJhr、Leu、 Ala、Val> Ser> Arg、Gly 或 Asp。
14.如權(quán)利要求13所述的CrylBa蛋白，其中該蛋白質(zhì)包括SEQID NO :3。
15.如權(quán)利要求12所述的CrylBa蛋白，其中在位置81處的一個纈氨酸(Val)用一個非Val的氨基酸取代；或在位置155處的一個丙氨酸(Ala)以及在位置178處的一個甲硫氨酸(Met)分別用非Ala或Met的氨基酸取代。
16.如權(quán)利要求15所述的CrylBa蛋白，其中該V81用一個色氨酸(W)取代。
17.如權(quán)利要求16所述的CrylBa蛋白，包括SEQID NO :11。
18.如權(quán)利要求15所述的CrylBa蛋白，其中在位置155處的該丙氨酸(A)用一個天冬酰胺(Asp)取代并且在位置178處的甲硫氨酸(Met)用一個絲氨酸(kr)取代。
19.如權(quán)利要求18所述的CrylBa蛋白，包括SEQID NO :12。
20.如權(quán)利要求12至19的任一項所述的CrylBa蛋白，其中該蛋白質(zhì)具有針對鱗翅目或鞘翅目昆蟲的活性。
21.如權(quán)利要求20所述的CrylBa蛋白，其中該鱗翅目昆蟲是歐洲玉米螟、西南玉米螟或甘蔗螟蟲。
22.一種核酸分子，包括編碼如權(quán)利要求1-21的任一項所述的蛋白質(zhì)的核酸序列。
23.一種嵌合基因，包括一個異源啟動子序列，該啟動子序列可操作地連接至如權(quán)利要求22所述的核酸分子上。
24.如權(quán)利要求23所述的嵌合基因，其中所述啟動子是一種植物可表達(dá)的啟動子。
25.如權(quán)利要求M所述的嵌合基因，其中所述植物可表達(dá)的啟動子是選自下組，該組由以下各項組成泛素、011 、11印4、1^1、噬菌體13基因9 5' UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脫氫酶1、玉米捕光復(fù)合物、玉米熱休克蛋白、豌豆小亞基RuBP羧化酶、Ti質(zhì)粒冠癭堿合成酶、Ti質(zhì)粒胭脂堿合成酶、牽?；ū交蚁┩悩?gòu)酶、大豆富含甘氨酸蛋白1、馬鈴薯 patatin、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。
26.一種重組載體，該重組載體包括如權(quán)利要求23至25的任何一項所述的一種嵌合基因。
27.如權(quán)利要求沈所述的載體，進(jìn)一步定義為一種質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、人工染色體、噬菌體或病毒載體。
28.一種轉(zhuǎn)基因非人類宿主細(xì)胞，包括如權(quán)利要求23所述的嵌合基因或如權(quán)利要求沈所述的重組載體。
29.如權(quán)利要求觀所述的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，進(jìn)一步限定為一種細(xì)菌細(xì)胞或一種植物細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求四所述的宿主細(xì)胞，其中該細(xì)菌細(xì)胞是一種大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、農(nóng)桿菌屬或一種假單胞菌屬細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求四所述的宿主細(xì)胞，其中該植物細(xì)胞是高粱、小麥、向日葵、番茄、馬鈴薯、油菜作物、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜、以及玉米細(xì)胞。
32.—種轉(zhuǎn)基因植物，包括一種如權(quán)利要求31所述的植物細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求32所述的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步限定為一種單子葉植物。
34.如權(quán)利要求33所述的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步限定為一種玉米、小麥、燕麥、水稻、大麥、草坪草、甘蔗或牧場草植物。
35.如權(quán)利要求34所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是一種玉米植物。
36.如權(quán)利要求34所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是一種甘蔗植物。
37.如權(quán)利要求32所述的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步限定為一種雙子葉植物。
38.如權(quán)利要求37所述的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步限定為一種大豆、其他豆科植物、棉花、 向日葵、油菜作物以及其他蔬菜、甜菜、煙草或油菜。
39.如權(quán)利要求32至38的任一項所述的任一代植物的子代，其中該子代包括該核酸分子。
40.一種來自如權(quán)利要求32至39的任一項所述的任一代轉(zhuǎn)基因植物的繁殖體，其中該繁殖體包括該核酸分子。
41.如權(quán)利要求40所述的繁殖體，進(jìn)一步限定為一種種子、節(jié)段或插條。
42.—種殺蟲組合物，包括如權(quán)利要求1至21的任一項所述的工程化CrylBa蛋白以及一種可接受的農(nóng)用載體。
43.如權(quán)利要求42所述的組合物，其中該農(nóng)用載體是一種表達(dá)eCrylBa蛋白的植物。
44.一種產(chǎn)生抗昆蟲轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將如權(quán)利要求22所述的核酸分子引入一種植物中，由此產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因植物，其中該核酸分子引起以一個控制昆蟲的量表達(dá)蛋白質(zhì)。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中這些昆蟲是鱗翅目昆蟲。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中這些鱗翅目昆蟲是選自下組，該組由以下各項組成歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。
47.一種用于制造eCrylBa蛋白的方法，包括a)鑒定一種具有所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域I的CrylBa蛋白；b)將結(jié)構(gòu)域I中的一個位置處的至少一個天然氨基酸用至少一個其他的氨基酸取代；并且c)獲得如此產(chǎn)生的eCrylBa蛋白，其中當(dāng)與一種天然CrylBa蛋白相比時，該eCrylBa 具有改進(jìn)的溶解度或針對至少歐洲玉米螟的殺蟲活性。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中結(jié)構(gòu)域I中的該位置是在α-螺旋4或α -螺旋 5內(nèi)。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中該突變位于相應(yīng)于SEQID NO :2的位置150、178、 189或199的氨基酸位置處。
50.如權(quán)利要求47所述的方法，其中該突變位于SEQID NO 5的位置150、178、189或 199 處。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中該突變位于相應(yīng)于SEQID NO 5的氨基酸2和 150 ；或氨基酸2、150和178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中該突變位于SEQID NO :5的氨基酸2和150 ；或氨基酸2、150和178 ；或氨基酸2、150和189 ；或氨基酸2、150和199的位置處。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中該eCrylBa蛋白包括包括SEQID NO 6的氨基酸序列，其中在位置2處的X是任何氨基酸并且a)在位置150處的X是Pro、Phe、Trp或Lys，并且在位置189處的X是Leu并且在199 處是kr ；或b)當(dāng)在位置150處的X是Lys時，在位置189處的X是kr；或c)當(dāng)在位置150處的X是Lys時，在位置199處的X是Lys。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中該eCrylBa蛋白包括一個氨基酸序列SEQID NO 7、SEQ ID NO :8,SEQ ID NO :9 或 SEQ ID N0:10。
55.如權(quán)利要求47至M的任一項所述的方法，其中該eCrylBa蛋白具有針對鱗翅目或鞘翅目昆蟲的活性。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中這些鱗翅目昆蟲是歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。
57.一種用于控制鱗翅目昆蟲的方法，包括使該昆蟲與一個有效量的eCrylBa蛋白接觸，該eCrylBa蛋白在所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域I中具有至少一個氨基酸突變，當(dāng)與一種天然 CrylBa蛋白相比時，該蛋白質(zhì)具有改進(jìn)的溶解度或針對一種鱗翅目昆蟲的殺蟲活性。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中該鱗翅目昆蟲是歐洲玉米螟、西南玉米螟、甘蔗螟蟲、玉米螟蛉、大豆夜蛾以及黎豆夜蛾。
59.一種向栽培者提供控制至少歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的一種手段的方法，包括向該栽培者提供或銷售轉(zhuǎn)基因種子，該轉(zhuǎn)基因種子包括編碼一種工程化CrylBa蛋白(eCrylBa)的核酸分子，該CrylBa蛋白在結(jié)構(gòu)域I中的一個或多個氨基酸位置處具有一個突變，當(dāng)與一種天然CrylBa蛋白相比時，該eCrylBa蛋白具有改進(jìn)的溶解度或針對至少歐洲玉米螟的殺蟲活性。
全文摘要
在此提供了多種用于控制害蟲的改進(jìn)的組合物和方法。具體地，提供了對鱗翅目昆蟲害蟲具有改進(jìn)的毒性的新穎的工程化Cry1Ba(eCry1Ba)蛋白。通過取代Cry1Ba蛋白的結(jié)構(gòu)域I中的至少一個氨基酸，設(shè)計了一種具有實質(zhì)上改變的殺蟲特性的工程化Cry1Ba蛋白。此外，披露了一種制造工程化Cry1Ba蛋白的方法以及例如在表達(dá)eCry1B蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中使用ecry1Ba核酸序列來賦予免受昆蟲損害的保護的多種方法。
文檔編號C07K14/325GK102596988SQ201080044606
公開日2012年7月18日 申請日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月2日
發(fā)明者J·康威爾, 陳政雄, 高燕 申請人:先正達(dá)參股股份有限公司