專利名稱：特異性結(jié)合vcam-1并抑制白細胞與內(nèi)皮細胞之間粘附和變移的人重組單克隆抗體的制作方法
特異性結(jié)合VCAM-1并抑制白細胞與內(nèi)皮細胞之間粘附和變移的人重組單克隆抗體
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)以抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞變移的人重組單克隆抗體；和含有該人重組單克隆抗體的炎性疾病或癌癥的預防性和治療性組合物。
背景技木在從血流遷移至組織的過程中，包括白細胞在內(nèi)的免疫細胞經(jīng)過活化的內(nèi)皮細胞從而引起免疫應答，并且許多細胞粘附分子(CAM)，如整聯(lián)蛋白、選擇蛋白、ICAM(胞內(nèi)粘附分子)和VCAM(血管細胞粘附分子)，涉及白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附及其向組織的遷移。細胞粘附分子在功能上被分為涉及白細胞與內(nèi)皮細胞相互作用的選擇蛋白、涉及白細胞與內(nèi)皮細胞粘附的整聯(lián)蛋白和免疫球蛋白如ICAM和VCAM。這些細胞粘附分子在很多生理反應如免疫應答、炎癥和血栓形成中發(fā)揮重要作用。VCAM-I是血管內(nèi)皮細胞粘附分子其中之一，其與在大多數(shù)白細胞——不包括嗜中性粒細胞——的表面上表達的整聯(lián)蛋白(VLA-4)發(fā)生相互作用。VCAM-I通過炎性信號而被表達，并引起白細胞粘附于血管內(nèi)皮細胞，和隨后白細胞跨內(nèi)皮遷移至受損組織中。盡管近年來關(guān)注于VCAM-1-VLA-4的相互作用，但VCAM-I中和抗體的發(fā)展還未被積極地研究。雖然M/K-2. 7——抗小鼠VCAM-I的單克隆抗體——在近期已被開發(fā)，并在膠原蛋白引起的關(guān)節(jié)炎小鼠模型中顯示出對關(guān)節(jié)炎的抑制效果，但該抗體僅對小鼠模型具有特異性，因此應對該抗體的可用性進ー步測試以用于臨床應用。進一歩，VCAM-I由7個IgG樣結(jié)構(gòu)域組成，并且其結(jié)構(gòu)域1和4實質(zhì)上參與與其配體整聯(lián)蛋白(α4β1 或 α 4β 7)的結(jié)合(1995，PNAS，92 :ρ5714 ;1995，The journal of immunology,155 :p3135 %=)。在這方面，迫切需要開發(fā)如下完全人單克隆抗體其抑制VCAM-I抗原與整聯(lián)蛋白的相互作用從而有效抑制白細胞向內(nèi)皮細胞的粘附和變移，并使免疫原性的危險最小化。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題因此，本發(fā)明人已開發(fā)人VCAM-I特異性人重組單克隆抗體，其具有人源性重鏈 (VH)和輕鏈(VL)結(jié)構(gòu)域，其中該人重組單克隆抗體特異性識別人內(nèi)皮細胞表面上表達的 VCAM-1，并結(jié)合VCAM-I抗原的結(jié)構(gòu)域1或2，以顯示抑制U397前單核細胞白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間的相互作用的強活性，從而實現(xiàn)本發(fā)明。技術(shù)方案本發(fā)明的ー個目的是提供特異性結(jié)合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)以抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞變移的人重組單克隆抗體。本發(fā)明的另ー個目的是給出提供炎性疾病、心血管疾病或癌癥的診斷信息的方法，包括如下步驟檢測人重組單克隆抗體與疑患炎性疾病或癌癥的對象的生物樣本中的 VCAM-I之間的抗原-抗體反應。本發(fā)明的又ー個目的是提供利用人重組單克隆抗體抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞變移的方法。本發(fā)明的又ー個目的是提供用于炎性疾病、心血管疾病或癌癥的診斷性組合物， 其含有人重組單克隆抗體。本發(fā)明的又ー個目的是提供用于炎性疾病、心血管疾病或癌癥的預防性或治療性組合物，其含有人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體。本發(fā)明的又ー個目的是提供用于治療炎性疾病、心血管疾病或癌癥的方法，包括如下步驟給予用于炎性疾病或癌癥的預防性或治療性組合物。有利效果根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體對人內(nèi)皮細胞上表達的VCAM-I顯示強親和力，并有效抑制VCAM-I介導的白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞變移，從而被用于預防和治療炎性疾病，如哮喘和關(guān)節(jié)炎、移植排斥、心血管疾病和附圖描述

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施方式所述的人重組單克隆抗體可變區(qū)的氨基酸序列；圖2是ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗)的結(jié)果，顯示抗原特異性抗VCAM-I人單克隆抗體對抗原——根據(jù)其人VCAM-I結(jié)構(gòu)域——的親和力，其中VD2表示重組人VCAM-I結(jié)構(gòu)域D1-D2/FC嵌合體，VD4表示重組人VCAM-I結(jié)構(gòu)域D11_D44/Fc嵌合體，VD7表示重組人 VCAM-I結(jié)構(gòu)域Dl-D7/Fc嵌合體；圖3顯示人VCAM-I抗原特異性抗VCAM-I人單克隆抗體對抗原的結(jié)合能力或親和力，其中抗原-抗體親和カ通過1 1結(jié)合模式、利用BIAC0RE儀(BIACORE AB，Sweden)測定，從而計算抗原-抗體親和カ常數(shù)，KD值；圖4是分析抗VCAM-I人單克隆抗體對純化的人重組VCAM-I抗原與人白細胞之間粘附的抑制活性的結(jié)果，其中其抑制活性通過相比于非抗體治療組熒光強度的降低被確定；圖5是分析抗VCAM-I人單克隆抗體對人白細胞與TNF- α (腫瘤壞死因子-α )活化的人內(nèi)皮細胞之間粘附的抑制活性的結(jié)果，其中其抑制活性通過相比于非抗體治療組熒光強度的降低被確定；圖6是分析抗VCAM-I人單克隆抗體對人白細胞通過TNF- α (腫瘤壞死因子-α ) 活化的人內(nèi)皮細胞變移的抑制活性的結(jié)果，其中其抑制活性通過相比于非抗體治療組變移白細胞量的減少被測定；圖7是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式分析對I h0A(RaS同源基因家族，成員A)活性的抑制活性的結(jié)果；圖8是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式分析對ROS (活性氧物質(zhì))活性的抑制活性的結(jié)果；圖9是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式分析內(nèi)化的結(jié)果；
圖10顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施方式的人重組單克隆抗體的重鏈和⑶R序列；圖11顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施方式的人重組單克隆抗體的輕鏈和⑶R序列；圖12顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施方式的動物實驗的概括；圖13是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式所述通過體外粘附試驗分析VCAM-IAb對炎性細胞粘附的抑制效應的結(jié)果，其中(A)顯示結(jié)合的單核細胞的數(shù)量圖，(B)顯示代表性照片；圖14是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式所述通過體外變移試驗分析VCAM-IAb對炎性細胞變移的抑制效應的結(jié)果，其中(A)顯示4hrs后變移細胞的數(shù)量圖，(B)顯示IShrs后變移細胞的數(shù)量圖；圖15是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式所述測試VCAM-lAb(7HT)的體內(nèi)結(jié)合能力的 en face共焦顯微鏡結(jié)果((A)PBS, (B)高劑量對照Ab，(C)低劑量VCAM-lAb，(D)高劑量 VCAM-IAb)；圖16是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式測量小鼠體重和供食消耗變化的結(jié)果；圖17是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式的小鼠血液的血液學分析結(jié)果((A)總膽固醇水平(T-CHO)、HDL-膽固醇水平(HDL-C)和LDL-膽固醇水平(LDL-C ； (B)甘油三酯水平(TG) 和葡萄糖水平(GLU) ； (C)谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶水平(GOT)和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶水平 (GPT) ； (D)白蛋白水平(ALB))；圖18是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式測量主動脈弓動脈粥樣硬化斑塊形成及其大小的結(jié)果；圖19是顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施方式所述En face法分析動脈中形成的動脈粥樣硬化斑塊的結(jié)果的圖；圖20是顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施方式所述En face法分析動脈中形成的動脈粥樣硬化斑塊的結(jié)果的圖；圖21是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式所述通過H&E染色對肝臟切片進行病理分析從而測試VCAM-I抗體注射的毒性的結(jié)果；圖22是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式所述通過H&E染色對腎臟切片進行病理分析從而測試VCAM-I抗體注射的毒性的結(jié)果；和圖23是根據(jù)本發(fā)明ー個實施方式所述通過H&E染色對脾臟切片進行病理分析從而測試VCAM-I抗體注射的毒性的結(jié)果。最佳實施方式下文中，將參考實施例對本發(fā)明進行詳細描述。但是，提供下列實施例僅以示例本發(fā)明為目的，因此其不意為限制本發(fā)明。在實現(xiàn)上述目的的一方面中，本發(fā)明涉及人重組單克隆抗體，其特征在于其特異性結(jié)合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)，從而抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間的粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞變移。提供以下術(shù)語描述是為了更好地理解說明書，并且提供本文所用的術(shù)語僅以示例為目的，并不意為本發(fā)明受限于這些術(shù)語。應當注意的是，如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用，除非上下文另外明確表示，単數(shù)物體意為包括多個對象。如本文所用，“抗體”包括參考對特定抗原具有免疫反應性的免疫球蛋白分子，并包括多克隆和單克隆抗體。該術(shù)語還包括基因工程改造的形式，如嵌合抗體(例如，人源化鼠抗體)和雜結(jié)合抗體(例如，雙特異性抗體)。術(shù)語“抗體”還包括抗體的抗原結(jié)合形式，包括具有抗原結(jié)合能力的片段(例如， Fab，、F(ab，)2、Fab、Fv和rlgG)。該術(shù)語還指重組單鏈Fv片段(scFv)。術(shù)語抗體還包括ニ價或雙特異性分子、雙抗體、三抗體和四抗體。ニ價和雙特異性分子被述及干，例如， Kostelny 等(1992，J. Immunol. 148 15467)、Pack 禾ロ Pluckthun (1992，Biochemistry 31 1579)、Hollinger 等(1993，supra)、Gruber 等(1994，J. Immunol. :5368)、Zhu 等(1997， Protein Sci. 6 :781)、Hu等(1996,Cancer Res. 56 :3055)、Adams等(1993,Cancer Res. 53 4026)和 McCartney 等(I995，Protein Eng. 8 :301)。此外，本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”，指已得自基本相同的抗體克隆的抗體分子， 其對于特異表位顯示單一的結(jié)合特異性和親和力。一般，免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。每條重鏈和輕鏈包含恒定區(qū)和可變區(qū)(該區(qū)域也被稱為“結(jié)構(gòu)域”)。輕鏈和重鏈可變區(qū)包含三個高變區(qū)，稱為“互補決定區(qū)”(下文中被稱為“⑶R”)和四個“框架”區(qū)。⑶R主要負責結(jié)合抗原表位。各鏈的⑶R—般被稱為 ⑶R1、⑶R2和⑶R3，從N端開始依次編號，并且還一般通過特定⑶R所在的鏈確定。如本文所用，術(shù)語“人源化抗體”是得自人免疫球蛋白的分子，并意為構(gòu)成抗體的全部氨基酸序列——包括互補決定區(qū)和框架區(qū)——由人免疫球蛋白組成。術(shù)語“人重組單克隆抗體”指單分子組成的抗體分子，得自人免疫球蛋白。人源化抗體用于人類治療一般具有至少三個潛在的優(yōu)勢。第一，其可與人免疫系統(tǒng)更好地進行相互作用，例如，從而通過補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)更有效地消滅目標細胞。第二，人免疫系統(tǒng)不識別抗體作為外源的。第三，在人體循環(huán)中的半衰期將類似于天然存在的人抗體，允許給予較小劑量或較低頻率的用藥。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的人單克隆抗體對人內(nèi)皮細胞上表達的VCAM-I顯示強親和力，并有效抑制白細胞粘附于表達VCAM-I的活化內(nèi)皮細胞。此外，由于其重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域均得自人細胞以顯示低免疫原性，根據(jù)本發(fā)明所述的人單克隆抗體可用于治療炎性疾病或癌癥，該炎性疾病可選自腫瘤壞死因子-α (TNF-α)介導的疾病、腸道疾病、動脈硬化和心肌梗塞， 并優(yōu)選選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)強直性脊椎炎、膿毒癥、內(nèi)毒素休克、血流動カ休克、膿毒癥綜合征、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、癌癥、自身免疫性疾病、AIDS相關(guān)的機會性感染、關(guān)節(jié)炎、類風濕性脊椎炎、痛風、關(guān)節(jié)強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發(fā)性硬化癥、麻風結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可含有重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含⑶Rl，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 2 ；⑶R2，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 3 ； 和⑶R3，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 4。同吋，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可通過如下制備使已知治療性抗體的框架區(qū)(FR)連接于互補決定區(qū)(CDR)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID NO. 1限定的重鏈氨基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖1)。進一歩，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可含有輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含⑶町，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 6 ；⑶R2，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 7 ；和氨基酸序列SEQ ID N0. 8。同吋，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可通過如下制備使已知治療性抗體的框架區(qū)(FR)連接于互補決定區(qū)(CDR)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID NO. 5限定的輕鏈氨基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖1)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可以是包含所有輕鏈和重鏈可變區(qū)的人單克隆抗體。也就是說，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可包括重鏈可變區(qū)——其包含SEQ ID NO. 2限定的重鏈CDRl ；SEQ ID NO. 3限定的重鏈CDR2 ；和SEQ ID NO. 4限定的重鏈CDR3—— 和輕鏈可變區(qū)——其包含SEQ ID NO. 6限定的輕鏈⑶Rl ；SEQ ID NO. 7限定的輕鏈⑶R2 ； 和SEQ ID NO. 8限定的輕鏈⑶R3。同吋，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可通過如下制備使已知治療性抗體的框架區(qū)(FR)連接于互補決定區(qū)(CDR)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID NO. 1限定的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO. 5限定的輕鏈氨基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖1)。此外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可含有重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含⑶Rl，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 10 ；⑶R2，具有氨基酸序列SEQ ID NO. 11 ；和⑶R3，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 12。同吋，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可通過如下制備使已知治療性抗體的框架區(qū)(FR)連接于互補決定區(qū)(CDR)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID N0. 9限定的重鏈氨基酸序列的人重組單克隆抗體 (參見圖10)。進一歩，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可含有輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含⑶R1，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 14 ；⑶R2，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 15 ；和氨基酸序列SEQ ID N0. 16。同吋，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可通過如下制備使已知治療性抗體的框架區(qū)(FR)連接于互補決定區(qū)(CDR)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID N0. 13限定的輕鏈氨基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖11)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可以是包含所有輕鏈和重鏈可變區(qū)的人單克隆抗體。也就是說，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可含有重鏈可變區(qū)——其包含SEQ ID NO. 10限定的重鏈CDRl ；SEQ ID NO. 11限定的重鏈CDR2 ；和SEQ ID NO. 12限定的重鏈 ⑶R3——和輕鏈可變區(qū)——其包含SEQ ID N0. 14限定的輕鏈⑶Rl ；SEQ ID N0. 15限定的輕鏈⑶R2;和SEQ ID N0. 16限定的輕鏈⑶R3。同吋，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可通過如下制備使已知治療性抗體的框架區(qū)(FR)連接于互補決定區(qū)(CDR)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可以是包含SEQ ID N0. 9限定的重鏈氨基酸序列和SEQ ID N0. 13限定的輕鏈氨基酸序列的人重組單克隆抗體(參見圖11)。在這方面，人重組單克隆抗體提供對人VCAM-I的親和力，根據(jù)ー個優(yōu)選的實施方式，人重組單克隆抗體與人VCAM-I抗原的締合/解離常數(shù)(KD值)可以是0.1 X KTi3M至 7. 0 X IO-9M,其可通過利用BIAC0RE分析測定各抗體與人VCAM-I抗原的締合/解離常數(shù)(KD 值)而得到。也就是說，人VCAM-I抗原作為配體被固定于傳感器芯片(傳感器芯片CM5， BIAC0RE, BR-1003-99)，然后各抗體稀釋液利用BIAC0RE儀被施加于固定的配體，以引起抗原與抗體的締合和解離，從而測定締合(Ka)/解離(Kd)常數(shù)KD值和卡方△ (x2)值—— 即與可信度相關(guān)的統(tǒng)計學值。本發(fā)明的人重組單克隆抗體可通過用于生成單克隆抗體的公知方法容易地生成。 例如，制備單克隆抗體的方法可通過利用得自免疫動物的B白細胞生成雜交瘤(Koeher andMilstein, 1976, Nature, 256 :495)或利用噬菌體展示法進行，但不限于此。利用噬菌體展示的抗體庫是以直接得自B淋巴細胞的抗體基因在噬菌體表面表達抗體的方法，而無需制備雜交瘤。與通過B細胞無限増殖化生成單克隆抗體相關(guān)的很多困難可通過噬菌體展示法克服。常規(guī)的噬菌體展示包括1)將具有隨機序列的寡核苷酸插入相應于噬菌體衣殼蛋白pill(或pIV)N端的區(qū)域；幻表達天然衣殼蛋白和所述具有隨機序列的寡核苷酸編碼的多肽的融合蛋白；3)處理可結(jié)合于所述寡核苷酸編碼的多肽的受體物質(zhì)；4)利用低pH 或具有結(jié)合競爭力的分子洗脫結(jié)合于受體的肽-噬菌體顆粒ホ)擴增宿主細胞中通過淘選洗脫的噬菌體；6)重復所述步驟以得到所需量的噬菌體；和7)由通過淘選而選擇的噬菌體克隆的DNA測序確定活性肽的序列。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的人重組單克隆抗體的制備方法可通過噬菌體展示法進行。本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通過參考公知的噬菌體展示技術(shù)可容易地進行上述步驟，所述公知噬菌體展示技術(shù)公開于，例如，Barbas等(METHODS :A Companion to Methods in Enzymology 2 :119,1991 and J. Virol.2001 Jul ；75(14) :6692-9)和 Winter 等(Ann. Rev. Immunol. 12 :433,1994)?？捎糜跇?gòu)建抗體庫的噬菌體可以是絲狀噬菌體，例如，fd、 M13、Π、IfU Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pfl和Pf3，但不限于此。同樣，可用于異源基因在絲狀噬菌體表面表達的載體可以是噬菌體載體，如fUSE5、fAFFl、fd-CATl或fdtetDOG ；或噬菌粒載體,如pHEm、pComb3、pComb8或pSEX，但不限于此。進一歩，輔助噬菌體，其可用于提供成功再感染重組噬菌體所需的天然衣殼蛋白， 可由Mi;3K07或VSCM13示例，但不限于此。在本發(fā)明的具體實施例中，對人VCAM-I具有特異性的人抗體通過噬菌體展示技術(shù)被作為scFv獲得，并作為單噬菌體克隆篩選得到，從而獲得對人VCAM-I具有特異性的20 種單克隆噬菌體。在本發(fā)明的具體實施例中，檢查通過重組技術(shù)獲得的VCAM-I的分子量和純度，然后用于制備單克隆抗體。VCAM-I與來自具有多祥性的人天然scFv庫細胞的庫噬菌體發(fā)生反應，然后淘選和篩選牢固結(jié)合VCAM-I抗原的單克隆抗體(參見表1)。所選單克隆抗體通過指紋分析得到確認，然后經(jīng)測序確定抗體VH和VL的⑶R區(qū)。通過NCBI網(wǎng)站(http:// www, ncbi. nlm. nih. Rov/iRblast/)的IgBLAST程序檢查上述抗體與種系抗體組之間的同源性。因此，得到20種對VCAM-I具有特異性的噬菌體抗體。進一歩，根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，構(gòu)建表達載體，該表達載體包含編碼所選20 種人抗體噬菌體的重鏈和輕鏈的多核苷酸或其片段，具有免疫活性。在構(gòu)建表達載體吋，表達調(diào)控元件如啟動子、終止子和增強子；靶向膜或分泌的序列可結(jié)合目的被適當?shù)剡x擇和聯(lián)合應用，其取決于意圖生成人抗體輕鏈和重鏈或其片段的宿主細胞。本發(fā)明的表達載體包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、細菌噬菌體載體、病毒載體或類似物，但不限于此。適當?shù)谋磉_載體包括靶向膜或分泌的信號序列或前導序列以及表達調(diào)控元件如啟動子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷酸化信號和增強子，并可取決于其目的以多種形式構(gòu)建。進一歩，根據(jù)本發(fā)明一個實施方式，本發(fā)明提供鑒定結(jié)合人重組單克隆抗體的人 VCAM-I抗原結(jié)構(gòu)域位置的方法。已報告VCAM-I由7個IgG樣結(jié)構(gòu)域組成，并且其結(jié)構(gòu)域1和4實質(zhì)上參與與其配體——整聯(lián)蛋白(α4β1或α4β7)——的結(jié)合。因此，為確定對于根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體來說具有特異性的VCAM-I抗原表位，在具體實施例中進行下列程序。本發(fā)明人在表達和純化人VCAM-I抗原的各結(jié)構(gòu)域(VD2、VD4、VD7)后通過ELISA 分析了 20種抗體的抗原結(jié)合區(qū)。因此，抗原結(jié)合區(qū)取決于抗體類型而不同，其中，獲得結(jié)合結(jié)構(gòu)域1或2的抗體Η6和7ΗΤ (參見圖2)。進一歩，根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體提供了對人VCAM-I抗原的親和力。 在本發(fā)明的具體實施例中，抗體與人VCAM-I抗原的締合/解離常數(shù)(KD值)通過BIAC0RE 分析被測定，從而確定親和力。發(fā)現(xiàn)抗體Η6和7ΗΤ對人VCAM-I具有強親和力(參見圖3)。 因此，發(fā)現(xiàn)Η6抗體對人VCAM-I抗原具有優(yōu)越的結(jié)合能力，達約0. 6ηΜ的水平，并且7ΗΤ抗體對人VCAM-I抗原具有結(jié)合能力，達約6. 3ηΜ的水平。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體可用于檢測VCAM-I的組合物和方法， 包括如下步驟檢測人重組單克隆抗體與生物樣本中的VCAM-I之間的抗原-抗體反應。進一歩，在本發(fā)明的具體實施例中，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體(Η6)抑制人白細胞(U937細胞)與用重組人VCAM-I或人TNF-α刺激的人內(nèi)皮細胞 (HUVEC)之間的粘附，因為白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間的相互作用由VCAM-I介導。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，用不同濃度的抗體處理人VCAM-I固定的固體支撐板或HUVEC單層板。為檢查抗體是否抑制熒光標記的U937細胞和抗原的結(jié)合，測量熒光強度。結(jié)果，抗體顯示對于粘附的抑制活性。特別是，發(fā)現(xiàn)抗體即使在低濃度下也呈現(xiàn)強抑制活性(參見圖 4 禾ロ 5)。此外，在本發(fā)明中，確定在人白細胞(U937細胞)與人TNF-a刺激的人內(nèi)皮細胞 (HUVEC)之間的相互作用中，根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體抑制人白細胞進入人內(nèi)皮細胞單層的滲透性，因為白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間的相互作用由VCAM-I介導。在本發(fā)明的實施例中，用抗體處理在跨孔板(transwell plate)鋪的HUVEC單層，然后通過計數(shù)跨孔底部收集的U937細胞來確定HUVEC單層的U937細胞滲透性。結(jié)果，上述抗體對于滲透性顯示出強抑制活性(參見圖6)。進一歩，確定在用VCAM-I抗體(7HT)處理表達VCAM-I的小鼠的動脈內(nèi)皮細胞吋， 炎性細胞的粘附和變移被有效抑制。其后，還確定在將抗體腹膜內(nèi)注射到高脂肪飲食喂養(yǎng)的小鼠中吋，VCAM-I抗體(7HT)特異性結(jié)合動脈內(nèi)皮細胞(圖11)。為檢查VCAM-I抗體 (7HT)對心血管疾病的治療效果，將ApoE-/-小鼠分為四組。第1組給予PBS，并以正常飲食喂養(yǎng)一周兩次；第2組給予對照抗體，4BT(10mg/kg)，并以高脂肪飲食喂養(yǎng)一周兩次；第 3組給予VCAM-I抗體，7HT (低劑量lmg/kg)，并以高脂肪飲食喂養(yǎng)一周兩次；以及第4組給予VCAM-I抗體，7HT (高劑量10mg/kg)，并以高脂肪飲食喂養(yǎng)一周兩次，進行12周。然后， 對主動脈損傷實施en-face技術(shù)以分析動脈硬化，發(fā)現(xiàn)第4組的動脈硬化相比于第2組顯著減輕(圖17和18)。此外，隨后制備和分析冷凍心臟切片以觀察主動脈弓中形成的動脈硬化。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第3和4組的動脈硬化減輕(圖19至21)。通過血液學分析，確定該結(jié)果并非歸因于膽固醇代謝/排泄(圖15)。實驗期間體重和消耗的飼料量沒有明顯差異(圖 14)。實驗后，進行毒性測試以檢查抗體的肝臟毒性(圖15)。經(jīng)確定VCAM-I抗體(7HT)抑制VCAM-I的功能，導致動脈硬化緩解。
因此，由于本發(fā)明的人重組單克隆抗體對人內(nèi)皮細胞上表達的VCAM-I具有強親和力，其可用于需要VCAM-I抗原識別的任何應用。特別是，其有效抑制白細胞至活化內(nèi)皮細胞的粘附和變移，從而提供有效的對于VCAM-I介導的疾病如炎性疾病、心血管疾病和癌癥的診斷和治療方法。因此，根據(jù)另ー個實施方式，本發(fā)明給出了提供炎性疾病、心血管疾病或癌癥的診斷信息的方法，包括如下步驟檢測人重組單克隆抗體與疑患炎性疾病或癌癥的對象的生物樣本中的VCAM-I之間的抗原-抗體反應；和用于炎性疾病、心血管疾病或癌癥的診斷性組合物。也就是說，含有特異性結(jié)合人VCAM-I的單克隆抗體的診斷性組合物可用于診斷 VCAM-I表達相關(guān)的疾病或VCAM-I介導的疾病，例如，炎性疾病、心血管疾病或癌癥。炎性疾病可選自腫瘤壞死因子-a (TNF- α )介導的疾病和腸道疾病，但不限于此。優(yōu)選地，腫瘤壞死因子_α (TNF-α)介導的疾病可選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)強直性脊椎炎、膿毒癥、內(nèi)毒素休克、血流動カ休克、膿毒癥綜合征、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相關(guān)的機會性感染、關(guān)節(jié)炎、類風濕性脊椎炎、痛風、關(guān)節(jié)強直性痛風、 克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發(fā)性硬化癥、麻風結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。進一歩，心血管疾病可選自心肌梗塞、心臟病發(fā)作、中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。進一歩，癌癥可選自腦瘤和脊髄瘤、頭部和頸部癌癥、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、間皮瘤、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、肉瘤、惡性黑素瘤和皮膚癌。進一歩，診斷性組合物可包含根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體。如本文所用，術(shù)語“生物樣本”可以是組織、細胞、全血、血清、血漿液、組織解剖樣本(腦、皮膚、淋巴結(jié)、脊髄)、細胞培養(yǎng)物上清液、破碎的真核生物細胞和細菌表達系統(tǒng)，但不限于此。通過使經(jīng)處理或未經(jīng)處理的生物樣本與本發(fā)明抗體發(fā)生反應，可檢測VCAM-I或 VCAM-I相關(guān)疾病的存在。如本文所用，術(shù)語“抗原-抗體復合物”指樣本中的VCAM-I抗原與識別抗原的本發(fā)明單克隆抗體的組合物質(zhì)。這種抗原-抗體復合物的形成可通過選自如下的任意方法檢測比色法、電化學方法、熒光法、發(fā)光法、顆粒計數(shù)法、目測評估和閃爍計數(shù)法。但是，該方法不限于上述實例，并且具有多種應用。在本發(fā)明中，多種標記可用于檢測抗原-抗體復合物。其具體實例可選自酶、熒光物質(zhì)、配體、發(fā)光物質(zhì)、微粒和放射性同位素，但不限于此。適合用作標記的物質(zhì)實例包括乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、β -D-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶和β -內(nèi)酰胺酶，作為酶；熒光素、Eu3+、Eu3+螯合物和穴狀化合物，作為熒光劑；生物素衍生物，作為配體；吖啶酷、異氨基苯ニ酰胼衍生物，作為發(fā)光劑；膠體金、有色乳膠，作為微粒；和57Co、3H、125I、125I-Bonton Hunter試劑，作為放射性同位素。優(yōu)選地，通過利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)可檢測抗原-抗體復合物。ELISA技術(shù)包括直接ELISA，其利用識別粘附于支撐體的抗原的標記抗體；間接ELISA，其利用標記的第二抗體，該標記的第二抗體識別抗原-抗體復合物的捕獲抗體，其中抗原粘附于支撐體；直接夾心ELISA，其利用另ー種標記的抗體，該標記的抗體識別粘附于支撐體的抗原-抗體復合物的抗原；和間接夾心ELISA，其利用另ー種標記的第二抗體，該標記的第二抗體在與識別粘附于支撐體的抗原-抗體復合物的抗原的抗體反應后識別抗體。單克隆抗體可具有可檢測的標記，否則可通過處理可捕獲單克隆抗體并具有可檢測標記的另ー種抗體來檢測抗原-抗體復合物。本發(fā)明的人重組單克隆抗體，其特異性結(jié)合人VCAM-1，可単獨或與常規(guī)的載體一起以藥物組合物的形式用于預防和治療炎性疾病、心血管疾病或癌癥。因此，在還有另一個實施方式中，本發(fā)明提供了炎性疾病、心血管疾病或癌癥的預防性或治療性組合物，包含人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體；和治療炎性疾病、心血管疾病或癌癥的方法，包括向?qū)ο蠼o予所述組合物的步驟。如本文所用，術(shù)語“對象”包括馬、狗、貓、豬、山羊、兔、倉鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、
蜥蜴、蛇、綿羊、牛、魚和鳥，并且意為任何動物(例如，人)。如本文所用，術(shù)語“預防”意為通過給予含有根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體的組合物來使疾病的出現(xiàn)受限或延緩的所有行為。如本文所用，術(shù)語“治療”意為通過給予含有根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體的組合物來使疾病轉(zhuǎn)好或有益地改變的所有行為。本發(fā)明的人重組單克隆抗體也可與其他抗體、生物活性劑或生物活性物質(zhì)聯(lián)合應用，以用于多種用途。例如，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可在以內(nèi)皮中VCAM-I表達為特征的疾病的治療中與其他抗VCAM-I抗體聯(lián)合應用?；蛘?，本發(fā)明的人重組單克隆抗體可與識別炎性事件中所確定的其他內(nèi)皮細胞受體(例如，ELAMU ICAMl等)的抗體和已知的炎性疾病治療藥物聯(lián)合應用。炎性疾病可選自腫瘤壞死因子-a (TNF- α )介導的疾病和腸道疾病，但不限于此。優(yōu)選地，腫瘤壞死因子-a (TNF-α)介導的疾病可選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)強直性脊椎炎、膿毒癥、內(nèi)毒素休克、血流動カ休克、膿毒癥綜合征、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相關(guān)的機會性感染、關(guān)節(jié)炎、類風濕性脊椎炎、痛風、關(guān)節(jié)強直性痛風、 克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發(fā)性硬化癥、麻風結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。進一歩，心血管疾病可選自心肌梗塞、心臟病發(fā)作、中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。進一歩，癌癥可選自腦瘤和脊髄瘤、頭部和頸部癌癥、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、間皮瘤、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、肉瘤、惡性黑素瘤和皮膚癌。含有本發(fā)明的人重組單克隆抗體的組合物可以以藥學上有效的量以單劑或多劑給予。在此方面，組合物可以以溶液、粉末、氣溶膠、膠囊、腸溶片劑或膠囊或栓劑形式給予。 多種給予方式被考慮，包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、ロ服、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和直腸內(nèi)，但本發(fā)明不限于這些示例性給予方式。但是，由于肽在ロ服給予時被分解，ロ服給予的組合物的活性成分應被包被或配制成以防止在胃中降解。此外，藥物組合物可利用某種能夠?qū)⒒钚猿煞州斔椭聊繕思毎械脑O(shè)備給予。含有本發(fā)明的人重組單克隆抗體的組合物可以藥學有效量被給予。“藥學有效量” 指在可適用于醫(yī)療或預防的合理利益/危險比下足以預防或治療疾病的量。有效劑量水平可根據(jù)如下確定疾病的嚴重程度；藥物活性；患者的年齢、重量、健康狀況和性別；患者的藥物敏感性；給予時間、途徑和釋放速率；治療持續(xù)時間；或包括與本發(fā)明組合物混合或同時施用的藥物的因素或其他醫(yī)學領(lǐng)域公知的因素。此外，含有本發(fā)明單克隆抗體的組合物可単獨或聯(lián)合其他治療劑給予，或者也可以相繼或同時的方式與常規(guī)的治療劑一起給予。在以藥學有效量給予本發(fā)明藥物組合物的情況下，本發(fā)明的人重組單克隆抗體， 其對VCAM-I具有強親和力，特異性結(jié)合內(nèi)皮細胞上表達的VCAM-I并導致VCAM-I被中和。 最終，本發(fā)明的人重組單克隆抗體抑制白細胞與白細胞粘附和白細胞通過內(nèi)皮細胞變移， 從而治療炎性疾病、心血管疾病和癌癥。炎性疾病可選自腫瘤壞死因子-α (TNF-α)介導的疾病和腸道疾病，但不限于此。優(yōu)選地，腫瘤壞死因子-a (TNF-a)介導的疾病可選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)強直性脊椎炎、膿毒癥、內(nèi)毒素休克、血流動カ休克、膿毒癥綜合征、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相關(guān)的機會性感染、關(guān)節(jié)炎、類風濕性脊椎炎、痛風、關(guān)節(jié)強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發(fā)性硬化癥、麻風結(jié)節(jié)性紅斑 (ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。進一歩，心血管疾病可選自心肌梗塞、心臟病發(fā)作、中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。進一歩，癌癥可選自腦瘤和脊髄瘤、頭部和頸部癌癥、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、間皮瘤、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、膽囊癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、生殖細胞腫瘤、卵巢癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、肉瘤、惡性黑素瘤和皮膚癌。進一歩，根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了利用根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞變移的方法。也就是說，VCAM-I結(jié)合炎癥和免疫排斥中活化的白細胞上表達的VLA-4(非常晩期的抗原-4)和 α4β1整聯(lián)蛋白，并在促進內(nèi)皮細胞與白細胞——包括單核細胞和T細胞——的相互作用中具有關(guān)鍵作用。根據(jù)本發(fā)明所述的單克隆抗體特異性結(jié)合VCAM-1，從而抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間的粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞變移。本文引用了多個出版物，在此將其全部內(nèi)容引入作為參考。通過常規(guī)的實驗，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道或理解，本文考慮多種等同的實施方式。因此這種等同方式被意為包括在權(quán)利要求中。發(fā)明方式下文中，將參考實施例更詳細地描述本發(fā)明。但是，提供下列實施例僅為示例本發(fā)明的目的，因此其不意為本發(fā)明受限于此。1.制備人和小鼠的VCAM-I抗原1. 1.克隆人 VCAM-I
包含人VCAM-I 基因的質(zhì)粒(hMU012650) (Kugi # IRAU_75_G02)購自 KUGI (Korean UniGene ^formation)，由韓國生物科學與生物技術(shù)研究所(KRIBB)人類基因組功能分析中心提供。該質(zhì)粒用作模板DNA，并且為了僅表達VCAM-I的D1-D2結(jié)構(gòu)域和D1-D4結(jié)構(gòu)域， 對于 VCAM-I 的 D1-D2 結(jié)構(gòu)域各基因用正向引物(5，-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACC ACCCC-3，)和反向引物(5，-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTGCAATTCTTTTACAGCCTG-3，)擴增，對于 VCAM-I 的 D1-D4 結(jié)構(gòu)域各基因用正向引物(5，-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACCACCC C-3，)和反向引物(5，-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGAGCTCCACCTGGATTCCCT-3')擴增。在 sfil 處理后，用連接酶分別將基因克隆到pI602-Fc載體和僅pI602-His載體(通過KRIBB構(gòu)建的載體)中。在下列PCR條件下得到PCR產(chǎn)物對于50 μ 1的總反應體積，IOOng模板在 94°C下反應2min，然后在94°C下反應30sec，在55°C下反應30sec，和在72°C下反應Imin和 30sec(Dl-D4)和45sec (D1-D2)，進行30個循環(huán)，然后在72°C下反應lOmin。此外，檢查克隆的 pYK602-FC-VCAM-l-Dl-D2、pYK602-His-VCAM-l-Dl-D2, pYK602-FC-VCAM-l-Dl-D4 和 pYK602-His-VCAM-l-Dl-D4 載體的堿基序列。1. 2.表達和純化VCAM-I蛋白質(zhì)在多種蛋白質(zhì)中，包含hVCAM-Fc-嵌合體(R&D系統(tǒng)，cat# :862_VC)和mVCAM-l_Fc 嵌合體(R&D系統(tǒng)，Cat# :643-VM)的整個分子是商業(yè)采購的，并如下進行具有各VCAM-I結(jié)構(gòu)域的片段的表達和純化。首先，將5Χ1(^93Ε細胞在10個150mm直徑板中鋪平板，并在第二天， 用 PEI Q3966 =Polysciences, Inc, USA)處理克隆的 pYK602-VCAM-l-Dl_D2 載體和 PYK602-VCAM-1-D1-D4載體各20 μ g，以進行轉(zhuǎn)染。第二天，將培養(yǎng)基更換為無血清DMEM，然后每隔一天收集上清液，然后在10% SDS-PAGE凝膠中進行電泳并進行蛋白質(zhì)印跡以分析表達水平。將上清液-其中 hVCAM-l-Dl-D2-Fc 和 hVCAM-l-Dl-D4_Fc 的表達被確定-
收集，并用0. 22μπι Top-過濾器(Millipore, Cat# =SCGP T05 RE)過濾，得到足量的蛋白質(zhì)。在使用前如下純化蛋白質(zhì)。首先，用PBS洗滌Econo-柱(Bio-Rad Cat. No 737-1006， 1 X5cm)，裝填500 μ 1蛋白質(zhì)A(Amersham Cat. No. 17-1279-30)。在進行裝填的過程中，將 10ml PBS (pH 7. 4)施加于柱以洗滌小珠，并施加30ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)作為結(jié)合緩沖液。隨后，用蠕動泵(Bio-Rad Cat. No. 73ト8142)以0. 5ml/min的流速對其施加得到的上清液。結(jié)合至柱后，用PBS以aiil/min的流速將其洗滌lhr，然后進行洗脫。用 500 μ 1 0. IM甘氨酸-HCl (pH 2. 5)進行洗脫，并添加1/10體積的IM Tris-HCl (pH 9. 0)以進行中和。在6個洗脫餾分中，蛋白質(zhì)主要在#1和#2餾分中被洗出。將這兩餾分置于10Κ 透析膜，然后在4L PBS中進行ο/η透析。上述過程均在4°C冷室中進行。定量后，將產(chǎn)物等分并儲存于_70°C下。純化后，在10% SDS-PAGE凝膠上確定產(chǎn)物。得到hVCAM-l-Dl-D2_Fc
和 hVCAM-l-Dl-D4-Fc，其量分別為 2. 8mg禾Π 800 μ g。將上清液-其中 hVCAM-l-Dl-D2_his
和hVCAM-l-Dl-D4-his 的表達被確定——收集，用 0. 22 μ m iTop-過濾器(Millipore，Cat# SCGP T05 RE)過濾，并用實驗室規(guī)模 TFF 系統(tǒng)(LabScale TFF System) (Millipore, Cat# XX42LSS11)的 pellicon XL 膜(Millipore, 8K, cat# :ΡΧΒ0 08A 50)濃縮至 1/10 體積。將 10倍體積的IMAC緩沖液(300mM KCl、50mM KH2P04、5mM咪唑，pH 8.0)加至該濃縮液，并用 IMAC緩沖液更換。根據(jù)制造商的說明，用ftOfiniaTM蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(Bio-Rad)的生物規(guī)模的微型試驗 IMAC 盒(Bio-kle Mini profinity IMAC cartridge) (cat# :732-4610) 以lml/min的速率進行純化。將洗脫液在4°C下利用膜(10K，132574 :SPECTRAP0R, USA) 在4LPBS溶液中透析4hr或更長，然后再在4L預先冷卻的PBS溶液中透析過夜。ο/η透折后，將所得物轉(zhuǎn)移至e-管，并通過Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。因此，得到400 μ g hVCAM-l-Dl-D4-his 和 hVCAM-l-Dl-D2_Fc 蛋白，并在 10% SDS-PAGE 凝膠中進行檢查。2.構(gòu)建庫噬菌體將具有多祥性的2. 7X 101°人scFv庫細胞在包含50 μ g/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的SB培養(yǎng)基(30g細菌用胰蛋白胨、20g酵母提取物、IOg MOPS, pH 7.0)中于37°C下培養(yǎng)2-;3hrS (0D600 = 0. 5)。然后，用VCSM13輔助噬菌體感染該細胞，接著在包含70 μ g/ ml卡那霉素(kanamycin)和ImM IPTG的培養(yǎng)基中于30°C下培養(yǎng)16hrs。對細胞進行離心 (4500rpm, 15min, 4°C )，并得到上清液，該上清液被溶于補充4% PEG 6000和3% NaCl的溶液中，然后在冰中反應lhr。再次離心反應物(8000rpm，20min，4°C )。將小球溶于PBS，再次離心(12000rpm，10min,4°C )。由此，得到包含庫噬菌體的上清液，該上清液被轉(zhuǎn)移至新管中，并儲存于4°C。3.通過噬菌體展示進行生物淘選當由7個IgG樣結(jié)構(gòu)域組成的VCAM-I結(jié)合其配體α 4β1整聯(lián)蛋白(α 4 β 1整聯(lián)蛋白)吋，已知其結(jié)構(gòu)域1和4充當結(jié)合基序。因此，利用人VCAM-l-Dl-D4(hVCAM-l-Dl-D4) 和整個VCAM-I分子進行淘選。在此實施例中，將對hVCAM-l-Dl-D4的淘選方法和結(jié)果進行
fejdio3. 1.對 hVCAM-l-Dl-D2 和 hVCAM-l_Dl_D4 抗原的生物淘選首先將涂有10 μ g/ml人重組VACM-I (R&D系統(tǒng)，809-VR)抗原的免疫吸附管 (Nunc 470319)用脫脂乳/PBS封閉，并與制備的庫噬菌體(1 XlO12Cfu) —起在室溫下培養(yǎng) Ι-airs。用TBST (0. 05% )將該管洗滌三次。將結(jié)合的噬菌體用Iml新制的IOOmM三乙胺溶液在室溫下洗脫lOmin。將洗脫的噬菌體用IM Tris (pH 7.4)中和，并感染進大腸桿菌 (E. coli) (ER2537)，和在37°C下培養(yǎng)lhr。將被感染的大腸桿菌在包含2%葡萄糖和氨芐青霉素的LB-瓊脂糖培養(yǎng)基板(直徑15cm)上鋪平板，并在37°C下培養(yǎng)16hr。將培養(yǎng)的大腸桿菌分散在5mL SB中，并將其50ml接種在20ml SB-氨芐青霉素-葡萄糖中，得到包含根據(jù)<1.構(gòu)建庫噬菌體〉的方法所述的結(jié)合噬菌體的溶液，然后用于下輪淘選。對于第1輪淘選后的第2-4輪淘選，免疫吸附管分別涂有hVCAM-l-Dl-D2和hVCAM_l_Dl_D4抗原中每一種，并進行每一輪淘選(參見表1)。表1hVCAM-1-Dl-D 和 hVCAM-l_Dl_D4 抗原的淘選結(jié)果
權(quán)利要求
1.人重組單克隆抗體，其特異性結(jié)合人血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)以抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間的粘附和白細胞通過所述活化的內(nèi)皮細胞變移。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體結(jié)合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)的結(jié)構(gòu)域1或2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO. 2限定的重鏈⑶Rl、SEQ ID NO. 3限定的重鏈⑶R2 和SEQ ID NO. 4限定的重鏈⑶R3;和輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO. 6限定的輕鏈CDRUSEQ ID NO. 7限定的輕鏈CDR2和SEQ ID NO. 8限定的輕鏈CDR3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有SEQID NO. 1限定的重鏈氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有SEQID NO. 5限定的輕鏈氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體與人VCAM-I 抗原的締合/解離常數(shù)(KD值)為0. 1 X 10、至7. OX 10—1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO. 10限定的重鏈⑶R1、SEQ ID NO. 11限定的重鏈⑶R2 和SEQ ID N0. 12限定的重鏈⑶R3 ；和輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0. 14限定的輕鏈CDRU SEQ ID N0. 15限定的輕鏈CDR2和SEQ IDN0. 16限定的輕鏈CDR3。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有SEQID N0. 9限定的重鏈氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人重組單克隆抗體，其中所述人重組單克隆抗體含有SEQID N0. 13限定的輕鏈氨基酸序列。
10.提供炎性疾病、心血管疾病或癌癥的診斷信息的方法，包括如下步驟檢測權(quán)利要求1-9中任一項所述的人重組單克隆抗體與疑患炎性疾病或癌癥的對象的生物樣本中的 VCAM-I之間的抗原-抗體反應。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述炎性疾病選自腫瘤壞死因子-α(TNF-a) 介導的疾病和腸道疾病。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述腫瘤壞死因子-a(TNF-a)介導的疾病選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)強直性脊椎炎、膿毒癥、內(nèi)毒素休克、血流動カ休克、膿毒癥綜合征、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、癌癥、自身免疫性疾病、AIDS相關(guān)的機會性感染、關(guān)節(jié)炎、類風濕性脊椎炎、痛風、關(guān)節(jié)強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發(fā)性硬化癥、麻風結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述心血管疾病選自心肌梗塞、心臟病發(fā)作、中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。
14.抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞變移的方法，其利用權(quán)利要求1-9中任一項所述的人重組單克隆抗體。
15.用于炎性疾病、心血管疾病或癌癥的診斷性組合物，其含有權(quán)利要求1-9中任ー項所述的人重組單克隆抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述炎性疾病選自腫瘤壞死因子-a (TNF- α )介導的疾病和腸道疾病。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述腫瘤壞死因子-α(TNF-α)介導的疾病選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)強直性脊椎炎、膿毒癥、內(nèi)毒素休克、血流動カ休克、膿毒癥綜合征、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、癌癥、自身免疫性疾病、AIDS相關(guān)的機會性感染、關(guān)節(jié)炎、類風濕性脊椎炎、痛風、關(guān)節(jié)強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發(fā)性硬化癥、麻風結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述心血管疾病選自心肌梗塞、心臟病發(fā)作、 中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。
19.用于炎性疾病、心血管疾病或癌癥的預防性或治療性組合物，其含有權(quán)利要求1-9 中任一項所述的人重組單克隆抗體和藥學可接受的載體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述炎性疾病選自腫瘤壞死因子-a (TNF- a )介導的疾病和腸道疾病。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述腫瘤壞死因子-a(TNF-α)介導的疾病選自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、關(guān)節(jié)強直性脊椎炎、膿毒癥、內(nèi)毒素休克、血流動カ休克、膿毒癥綜合征、缺血再灌注損傷、瘧疾感染、分枝桿菌感染、腦膜炎、銀屑病、充血性心臟衰竭、纖維化疾病、Kachexie、移植排斥、癌癥、自身免疫性疾病、AIDS相關(guān)的機會性感染、關(guān)節(jié)炎、類風濕性脊椎炎、痛風、關(guān)節(jié)強直性痛風、克羅恩病、潰瘍性膀胱三角炎、多發(fā)性硬化癥、麻風結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)、輻射損傷和高氧引起的肺泡損傷。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述心血管疾病選自心肌梗塞、心臟病發(fā)作、 中風、心率失常、高血壓、高血脂和動脈硬化。
23.治療炎性疾病、心血管疾病或癌癥的方法，包括如下步驟向?qū)ο蠼o予權(quán)利要求19 所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及人重組單克隆抗體，其特異性結(jié)合人血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)以抑制白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞的變移；和涉及包含該人重組單克隆抗體的用于炎性疾病或癌癥的預防性和治療性組合物。根據(jù)本發(fā)明所述的人重組單克隆抗體對人內(nèi)皮細胞上表達的VCAM-1顯示強親和力，并有效抑制VCAM-1介導的白細胞與活化的內(nèi)皮細胞之間粘附和白細胞通過活化的內(nèi)皮細胞的變移，從而被用于預防和治療炎性疾病如哮喘和關(guān)節(jié)炎、移植排斥、心血管疾病和癌癥。
文檔編號C07K16/18GK102574916SQ201080047819
公開日2012年7月11日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者姜慶在, 尹志容, 成炳濟, 文慶德, 李東垠, 李東憲, 李廷泰, 柳修娟, 沈炫輔 申請人:韓華石油化學株式會社