專利名稱：制造l-肉毒堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制造L-肉毒堿的方法。
背景技術(shù)：
肉毒堿(維生素Bt ;3_羥基-4-三甲基銨基-丁酸鹽)是由氨基酸(賴氨酸和蛋氨酸)生物合成的季銨化合物。在活細(xì)胞中，需要其在分解脂類以產(chǎn)生代謝能量期間將脂肪酸從細(xì)胞溶質(zhì)運(yùn)輸至線粒體。其被用作營養(yǎng)補(bǔ)劑。肉毒堿以兩種立體異構(gòu)體形式存在。具生物活性的形式是L-肉毒堿，而其對映體 D-肉毒堿則不具生物活性。當(dāng)在エ業(yè)方法中制造L-肉毒堿時，期望以高純度制造具生物活性的L-形式。高純度的L-肉毒堿能夠通過微生物法獲得。EP 0195944公開了ー種微生物法，其中在生物反應(yīng)器中借助于特定的微生物由巴豆甜菜堿(crotonobetain)和丁酸甜菜堿產(chǎn)生L-肉毒堿。獲得光學(xué)純L-肉毒堿與丁酸甜菜堿的混合物。為了除去丁酸甜菜堿，將終產(chǎn)物用甲醇和異丁醇重結(jié)晶。另ー種獲得基本上純的L-肉毒堿的微生物法公開于DD 296702中。通過L-肉毒堿的電滲析和重結(jié)晶，耗盡培養(yǎng)溶液中的L-肉毒堿。在該微生物法中，基本上不產(chǎn)生D-肉毒堿，因此不需要對映體分離步驟。利用溶劑對L-肉毒堿進(jìn)行重結(jié)晶以除去其它物質(zhì)。利用非微生物法或非酶促法來獲得高純度L-肉毒堿更復(fù)雜。利用有機(jī)合成，通常獲得D-和L-肉毒堿的混合物。為了獲得純L-肉毒堿，DE 689 01 889T2教導(dǎo)在立體選擇性不對稱氫化反應(yīng)中使用釕膦配合物。該配合物相對復(fù)雜且昂貴，因此不適用于在エ業(yè)方法中大量制備L-肉毒堿。因此，已開發(fā)了從L-和D-肉毒堿的混合物中分離L-肉毒堿的方法。通常這些方法基于利用具光學(xué)活性的酸將肉毒堿轉(zhuǎn)化成鹽，以及利用L-和D-肉毒堿具有的不同的物理性質(zhì)(例如溶解度)將L-與D-肉毒堿分離。在這一方面，DD 93 347公開了ー種在樟腦酸、ニ苯甲酰基酒石酸或其組合的存在下從醇溶液中分離D-和L-肉毒堿的方法。由于鹽的不同溶解度，可將D-肉毒堿與L-肉毒堿分離。DE 35 36 093公開了由外消旋混合物制備L-肉毒堿的方法，其中利用ニ苯甲?；?L-酒石酸將D-和L-肉毒堿轉(zhuǎn)化成具光學(xué)活性的鹽，其后進(jìn)行分級結(jié)晶。然而，將肉毒堿轉(zhuǎn)化成具光學(xué)活性的鹽或酸的方法相對復(fù)雜，理由是它們包括添加分離劑和將其在分離エ序后除去的步驟。這樣導(dǎo)致整個方法具有相対的時間效率和勞動效率。本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明要解決的問題是提供能夠解決上述問題的制造L-肉毒堿的方法。該方法應(yīng)適于由包含L-和D-肉毒堿的對映體混合物制造高純度的L-肉毒堿。光學(xué)純度可藉此而顯著增加，且收率也應(yīng)當(dāng)高。該方法應(yīng)以簡易的方式進(jìn)行。具體而言，應(yīng)避免使用其后需被除去的其它化合物，例如具光學(xué)活性的助劑。此外，エ序步驟的數(shù)目應(yīng)相對少，且這些エ序應(yīng)該不需要復(fù)雜的裝置。總地來說，該方法應(yīng)具有成本效率和勞動效率。發(fā)明概述出乎意料地，本發(fā)明要解決的問題通過權(quán)利要求所述的方法得到解決。整個說明書中公開了本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式。本發(fā)明的主題是制造L-肉毒堿的方法，其包括以下步驟(a)提供在第一溶劑中包含至少5%(w/w)肉毒堿的溶液,其中所述肉毒堿是D-和L-肉毒堿的混合物，(b)任選地用L-肉毒堿晶體對該溶液進(jìn)行種晶，(c)添加第二溶剤，L-肉毒堿在所述第二溶劑中不溶或溶解度低，
(d)分離包含L-肉毒堿的晶體。肉毒堿是兩性離子，其包含羧酸基和季銨基。步驟(a)中使用的肉毒堿優(yōu)選為該兩性離子性肉毒堿。然而，也可以使用鹽，例如氯化物鹽、硫酸鹽或硝酸鹽。步驟(a)中使用的肉毒堿優(yōu)選不是肉毒堿與具光學(xué)活性的陰離子的鹽。通過本發(fā)明的方法，以提高了的純度獲得L-肉毒堿。因此，本發(fā)明的方法也是純化L-肉毒堿的方法，或者是獲得高純度L-肉毒堿的方法，或者是提高L-肉毒堿的對映體過量的方法。根據(jù)本發(fā)明，由包含D-和L-肉毒堿的溶液獲得晶態(tài)L-肉毒堿。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(a)中的溶液基本上由溶劑和肉毒堿組成。在本發(fā)明的方法中，L-肉毒堿的對映體過量(e.e.)被提高。優(yōu)選地，對映體過量提高了多于1%或多于2%。對映體過量的增加取決于步驟(a)中初始溶液的對映體過量。對映體過量(e.e.)定義為各對映體的摩爾分?jǐn)?shù)之間以百分率表示的絕對差異值。舉例來說，含有90%L_異構(gòu)體和10%D_異構(gòu)體的樣品的對映體過量為80%L-異構(gòu)體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(a)中的肉毒堿包含大于50%、80%、90%、95%或98%(e. e.)的L-肉毒堿。優(yōu)選地，步驟(d)中分離所得的L-肉毒堿包含大于90%、98%、99%或99. 5%(e. e.)的L-肉毒堿。優(yōu)選地，當(dāng)步驟(a)中使用的溶液包含大于95%(e. e.)的L-肉毒堿時，在步驟(d)中，獲得包含大于99%(e. e.)的L-肉毒堿的晶體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一溶劑選自由こ醇、甲醇、水、こ腈及其混合物組成的組。所述溶劑是肉毒堿的良溶剤。這意味著肉毒堿在室溫下的溶解度為至少5%，優(yōu)選至少10%或至少20%(w/w)。優(yōu)選地，第一溶劑為こ醇。在具體實(shí)施方式
中，第一溶劑可包含不多于0. 5%、不多于2%或不多于5%(w/w)的水。因此，溶劑可以是エ業(yè)級的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(a)中的溶液是飽和溶液或過飽和溶液。還優(yōu)選該溶液接近飽和，這意味著肉毒堿的濃度為飽和濃度的80%以上或90%以上。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一溶劑中總?cè)舛緣A的濃度為5至75%。在こ醇中，該濃度優(yōu)選為10至50%或15至40%(w/w)。在甲醇中，該濃度優(yōu)選為20至70%(w/w)。優(yōu)選地，溶解在步驟(a)的溶液中的肉毒堿是純?nèi)舛緣A或高純的肉毒堿。在該實(shí)施方式中，步驟(a)的溶液僅包含少量其它物質(zhì)?；谌芤褐锌?cè)舛緣A(D-和L-)的量，其它物質(zhì)的量可小于0. 5、小于I或小于2%(w/w)。在另ー實(shí)施方式中，溶解在步驟(a)的溶液中的肉毒堿包含一定量的副產(chǎn)物或其它化合物，例如來自制造方法的起始化合物。在該實(shí)施方式中，步驟(a)的溶液可包含基于肉毒堿總量為不多于5%、不多于10%或不多于15%(w/w)的其它化合物。例如，合成的肉毒堿可包含小于l%(w/w)的輕基巴豆酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(a)的溶液基本不含水。這意味著肉毒堿和溶劑應(yīng)該是基本不含水或包含盡可能少的水。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法在僅存在少量水時更有效。優(yōu)選地，步驟(a)的溶液的總含水量小于2%、小于1%或小于0. 5% (w/w)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(a)包括將溶液加熱，優(yōu)選直至所有肉毒堿溶解，例如加熱至40° C以上或50° C以上的溫度。任選地，可以隨后例如通過過濾來除去殘余固體肉毒堿和/或殘余固體。在步驟(a)中，可以將溫度調(diào)節(jié)到40至80° C或50至75° C。該溫度的選擇取決于溶劑。當(dāng)使用こ醇時，優(yōu)選50至75° C的溫度，例如約65° C。在步驟(b)中，來自步驟(a)的溶液可以利用L-肉毒堿晶體進(jìn)行種晶。優(yōu)選地，進(jìn)行種晶的溶液是飽和或過飽和溶液。過飽和溶液可如下獲得在步驟(a)中于升高的溫度下制備飽和溶液，并且慢慢地冷卻飽和溶液，從而使肉毒堿不發(fā)生沉淀或結(jié)晶。 通過用L-肉毒堿晶體對溶液進(jìn)行種晶和培育，可引發(fā)晶體的生長。這樣，當(dāng)本發(fā)明的方法包括步驟(b)的種晶步驟時，最終獲得的晶體的平均尺寸會更高。然而，在步驟
(b)的種晶エ序中不添加種晶晶體也可以以聞收率獲得具聞純度的肉韋喊晶體。該肉韋喊晶體基本由し-肉毒堿組成或富含し-肉毒堿。種晶僅需要小量種晶晶體。種晶晶體應(yīng)具有高純度且非常細(xì)。優(yōu)選應(yīng)當(dāng)在溶液仍然清澈時(即在沒有或基本沒有晶體或沉淀物自發(fā)形成吋)添加種晶晶體。這可以通過在提高的溫度下種晶而實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，在種晶步驟(b)中，溶液的溫度為約25至50° C，優(yōu)選為30至45° C。然而，在種晶期間和之后且在添加第二溶劑之前，肉毒堿的溶解度仍然相當(dāng)高，且基本沒有觀察到晶體或僅觀察到晶體有限的快速形成。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在用晶體種晶后，溶液的溫度被降低。優(yōu)選地，溫度降低至10至30° C，例如至約20° C。在步驟(C)中，添加第二溶剤，L-肉毒堿在該第二溶劑中不溶或溶解度低。在添加第二溶劑期間和之后，觀察到L-肉毒堿結(jié)晶。在L-肉毒堿結(jié)晶期間，耗盡溶液中的L-肉毒堿，且其變成懸浮液。因此，結(jié)晶后，組合物可以被視為溶液或懸浮液。當(dāng)針對步驟(b)和后續(xù)步驟而提及"溶液"時，所指的是該溶液/懸浮液。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，第二溶劑選自丙酮、異丙醇、異丁醇、2-丙醇、I-戊醇、2-丁酮、こ酸甲酷、こ酸こ酷、こ酸丁酷、四氫呋喃、甲苯及其混合物。優(yōu)選地，第二溶劑為丙酮。第二溶劑是在其中L-肉毒堿不溶或溶解度低的溶剤。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，L-肉毒堿于25° C下在第二溶劑中的溶解度小于3%、小于2%或小于l%(w/w)。在添加第二溶劑時，溶液中肉毒堿的整體溶解度降低，且肉毒堿結(jié)晶。因此，在添加第二溶劑時，在溶液中形成固體肉毒堿晶體。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一溶劑是こ醇且第二溶劑是丙酮。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(C)中，第一溶劑與第二溶劑的比例為I: I至1:10 (w/w),更優(yōu)選為I: I. 5至1:6之間或1:2至l:4(w/w)。應(yīng)調(diào)節(jié)該比例,使得肉毒堿在溶劑混合物中的溶解度顯著降低，從而使總?cè)舛緣A中的大部分結(jié)晶。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，在任選的種晶步驟(b)之后，或在步驟(C)之前或期間，或在步驟(c)中添加第二溶劑之后，將溶液的溫度調(diào)節(jié)到10° C至30° C。然而，可以在降低溶液溫度之前或之后添加第二溶劑。優(yōu)選地，在步驟(C)中，慢慢地添加(例如滴加)第二溶剤。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(c)中，將第二溶劑在20分鐘至8小時或I小時至6小時的時間內(nèi)添加至溶液中。在添加丙酮和培育期間，L-肉毒堿結(jié)晶。通?？梢酝ㄟ^低溫培育來提高結(jié)晶的L-肉毒堿的量。優(yōu)選地，添加第二溶劑之后，組合物在降低的溫度下進(jìn)行培育。例如，可將溫度降低至5至20° C或低于15° C。組合物可以在該溫度下培育10分鐘至2天或30分鐘至24小吋。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(c)中添加第二溶劑之后，將組合物在低于20° C的溫度下培育10分鐘至2天。在步驟(d)中，通過已知的方法(例如過濾或沉淀)來分離固體晶體。任選地，將晶體洗滌，優(yōu)選用第二溶劑進(jìn)行洗滌。通過干燥(任選在減壓下)除去溶剤 。例如，可以通過在55° C下于IOObar以下的壓カ下除去丙酮。根據(jù)本發(fā)明，在步驟(d)中分離出來的總固體肉毒堿被稱為〃晶體"。發(fā)現(xiàn)這些固體具有晶態(tài)結(jié)構(gòu)。然而，特別是在迅速添加第二溶劑時，固體肉毒堿"晶體"可能還包含(至少部分包含)肉毒堿沉淀物?；谄鹗既芤褐锌侺-肉毒堿，L-肉毒堿的總收率優(yōu)選為80%以上或85%以上。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟(a)提供包含至少5%(w/w)肉毒堿的こ醇溶液，其中所述肉毒堿包含至少50%(e.e.)的L-肉毒堿,其中將溶液加熱,直至所有肉毒堿溶解，(al)將溶液的溫度調(diào)節(jié)到25至50° C，(b)用L-肉毒堿晶體對溶液進(jìn)行種晶，(b I)任選地將溫度調(diào)節(jié)到10至30° C，(c)添加丙酮，丙酮的添加量使得こ醇/丙酮的比例為I: I至1:10 (w/w)，(Cl)任選地將組合物冷卻至低于20° C的溫度，(d)優(yōu)選通過過濾分離包含L-肉毒堿的晶體。在上述方法中，步驟(a)至(d)連續(xù)地進(jìn)行。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，利用步驟(d)獲得的晶體重復(fù)進(jìn)行本發(fā)明的整個方法。在該實(shí)施方式中，制備晶體在第一溶劑中的溶液。當(dāng)重復(fù)整個方法兩次或更多次時，甚至可以從對映體純度低的肉毒堿獲得高純的L-肉毒堿。本發(fā)明的方法解決了上述問題。通過本發(fā)明的方法，可由D-和L-肉毒堿混合物獲得高純的L-肉毒堿。在分離D-和L-肉毒堿的混合物時，不需要如DE 35 36 093或DD93 347所公開的那樣添加具光學(xué)活性的化合物。在本發(fā)明的方法中，肉毒堿在中間步驟中沒有轉(zhuǎn)化成具光學(xué)活性的鹽。出乎意料地是，本發(fā)明的方法很高效，原因是本領(lǐng)域中通常假定沒有具光學(xué)活性的添加劑時難以有效分離兩性離子(見DD 93 347，第2欄，第8-11行)。因此，難以設(shè)想通過本發(fā)明相對簡易的方法能夠獲得顯著增加的L-對映體形式?？梢砸詳?shù)目小的エ序步驟和簡易的方式實(shí)施本發(fā)明的方法。該方法不需要進(jìn)行L-肉毒堿的具光學(xué)活性的鹽的沉淀，通過額外的結(jié)晶步驟進(jìn)行的分離和分解。該方法以高的對映體純度和高的收率提供L-肉毒堿。與本領(lǐng)域已知的方法相比，本發(fā)明的方法成本和勞動密集度更少。本發(fā)明的方法可用于純化來自對映體混合物(例如通過エ業(yè)合成方法獲得的對映體混合物)的L-肉毒堿。
實(shí)施例實(shí)施例I向?qū)嶒?yàn)室反應(yīng)器中投入IOOg肉毒堿和300gこ醇。將反應(yīng)器加熱至65° C，并攪拌直至所有肉毒堿溶解。其后，將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為37° C。在37° C下，添加純L-肉毒堿種晶晶體。以-0. 2K/min的速率將反應(yīng)器的溫度冷卻至20° C。在20° C下，于2小時內(nèi)添加900g丙酮。其后，將懸浮液冷卻至10° C。在10° C下，分離固體，并用丙酮洗漆，在55° C和〈lOOmbar下干燥。結(jié)果，獲得86. Ig晶態(tài)的白色干燥固體。該固體包含99. 036%(w/w)的總?cè)舛緣A。其對映體純度為99. 60% (e. e.)。殘余溶劑的含量為349mg/kgこ醇和386mg/kg丙酮。L-肉毒堿的總收率為88. 6%。實(shí)施例2向?qū)嶒?yàn)室反應(yīng)器中投入60. 2g肉毒堿和60g甲醇。將反應(yīng)器加熱至50° C，并攪拌直至所有肉毒堿溶解。其后，將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為25° C。在25° C下，添加0. 74g純L-肉毒堿種晶晶體。以-0. 2K/min的速率將反應(yīng)器的溫度冷卻至20° C。在20° C下，于I小時內(nèi)添加180g丙酮。其后，將懸浮液在50分鐘內(nèi)冷卻至10° C。在該溫度下繼續(xù)攪拌懸浮液30分鐘。之后,通過Nutsch過濾器(Nutsch filter)將固體過濾,用大約60g的丙酮洗滌兩次，隨后在55° C和250mbar的壓カ下干燥8小時。結(jié)果，獲得45. 78g晶態(tài)的白色干燥固體。該固體包含98. 94%(w/w)的總?cè)舛緣A。其對映體純度為99. 78% (e. e.)。實(shí)施例3向?qū)嶒?yàn)室反應(yīng)器中投入30. Ig肉毒堿和90gこ醇。將反應(yīng)器加熱至65° C，并攪拌直至所有肉毒堿溶解。其后，將反應(yīng)器的溫度設(shè)定為37° C。在37° C下，添加0.91g純L-肉毒堿種晶晶體。以-0. 2K/min的速率將反應(yīng)器的溫度冷卻至20° C。在20° C下，于I小時內(nèi)添加270gこ酸こ酷。其后，在50分鐘內(nèi)將懸浮液冷卻至10° C。在該溫度下繼續(xù)攪拌懸浮液30分鐘。之后，通過Nutsch過濾器將固體過濾，用大約30g的こ酸こ酯洗滌兩次，隨后在55° C和250mbar的壓カ下干燥8小時。結(jié)果，獲得28. 66g晶態(tài)的白色干燥固體。該固體包含98. 51%(w/w)的總?cè)舛緣A。其對映體純度為99. 46% (e. e.)。權(quán)利要求
1.制造L-肉毒堿的方法，其包括如下步驟 (a)提供在第一溶劑中包含至少5%(w/w)肉毒堿的溶液,其中所述肉毒堿是D-和L-肉毒堿的混合物， (b)任選地用L-肉毒堿晶體對所述溶液進(jìn)行種晶， (c)添加第二溶剤，L-肉毒堿在所述第二溶劑中不溶或溶解度低， (d)分離包含L-肉毒堿的晶體。
2.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中所述第一溶劑選自由こ醇、甲醇、水、こ腈及其混合物組成的組。
3.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中在步驟(a)中，總?cè)舛緣A在所述第一溶劑中的濃度為5至75% (w/w)。
4.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中在步驟(a)中，肉毒堿包含大于80%(e. e.)的L-肉毒堿，且在步驟(d)中，所述晶體包含大于95%(e. e.)的L-肉毒堿。
5.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中步驟(a)包括將溶液加熱至40°C以上的溫度。
6.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中所述第二溶劑選自丙酮、異丙醇、異丁醇、2-丙醇、I-戊醇、2-丁酮、こ酸甲酷、こ酸こ酷、こ酸丁酷、四氫呋喃、甲苯及其混合物。
7.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中L-肉毒堿于25°C下在所述第二溶劑中的溶解度小于2%(w/w)。
8.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中在種晶步驟(b)中，所述溶液的溫度為 25 至 50° C。
9.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中在步驟(c)中，所述第一溶劑與所述第 二溶劑的比例為I: I至1:10 (w/w)。
10.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中在種晶步驟(b)之后、在步驟(C)之前或期間、或在步驟(C)中添加所述第二溶劑之后，將所述溶液的溫度調(diào)節(jié)到10° C至30。Co
11.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法,其中在步驟(c)中，在20分鐘至24個小時的時間跨度內(nèi)，向所述溶液中添加所述第二溶剤。
12.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中在步驟(c)中添加所述第二溶劑之后，將組合物在低于20° C的溫度下培育10分鐘至2天。
13.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中在步驟(d)中，所述晶體包含大于99% (e. e.)的L-肉毒堿。
14.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中在步驟(d)中，通過過濾或沉淀來分離所述晶體。
15.如前述權(quán)利要求中至少之一所述的方法，其中所述第一溶劑為こ醇，且所述第二溶劑為丙酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及制造L-肉毒堿的方法，其包括以下步驟(a)提供在第一溶劑中包含至少5%(w/w)肉毒堿的溶液，其中肉毒堿是D-和L-肉毒堿的混合物，(b)任選地用L-肉毒堿晶體對該溶液進(jìn)行種晶，(c)添加第二溶劑，L-肉毒堿在所述第二溶劑中不溶或溶解度低，(d)分離包含L-肉毒堿的晶體。
文檔編號C07C227/42GK102656139SQ201080051331
公開日2012年9月5日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者格薩·帕拉迪斯, 湯瑪斯·比希納 申請人:隆薩有限公司