專(zhuān)利名稱(chēng)：包括通過(guò)分散的方式清洗的步驟的處理血漿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及處理血漿的方法，所述方法包括乙醇沉淀血漿或血漿組分的步驟，回收沉淀物的步驟，清洗所述沉淀物的步驟回收清洗的血漿糊并且溶解所述清洗的血漿糊的步驟。
背景技術(shù)：
纖維蛋白原是血液凝固所必需的蛋白質(zhì)，這是因?yàn)槠渚酆蠟椴豢扇艿睦w維蛋白(在控制血液凝固的反應(yīng)的級(jí)聯(lián)之后形成)，導(dǎo)致封閉引起流血的血管傷口的凝塊的形成。因此凝塊的形成對(duì)于停止流血來(lái)說(shuō)是必不可少的。此外，傷口位點(diǎn)處形成的纖維蛋白形成確保組織修復(fù)(愈合)的纖維狀網(wǎng)絡(luò)。先天性纖維蛋白原缺陷可導(dǎo)致嚴(yán)重的病變。為了治療這些缺陷，必須使得有纖維 蛋白原濃縮物可用，該纖維蛋白原濃縮物能夠提供給進(jìn)行治療的患者。其他的病變也可通過(guò)提供纖維蛋白原來(lái)治療，尤其是在大量失血(手術(shù)、外傷等)的情況下或在彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)之后。同樣，可通過(guò)作為主要成分的包含纖維蛋白原的凝血酶和凝血因子X(jué)III (FXIII)活化的生物膠被有效地用于臨床應(yīng)用例如皮膚移植、神經(jīng)或動(dòng)脈縫合中的組織修復(fù)，如例如專(zhuān)利 EP 0 305 243.FR 2 448 900 和 FR 2 448 901 中所描述的。這些產(chǎn)品中凝血因子X(jué)III或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的存在通過(guò)產(chǎn)生使纖維蛋白不可溶的互相交錯(cuò)(intercatenary)的共價(jià)鍵而有助于穩(wěn)定纖維蛋白。在一些實(shí)例中，這些產(chǎn)品使用相當(dāng)復(fù)雜的產(chǎn)生纖維蛋白原的方法來(lái)獲得，其需要外源加入純化的凝血因子X(jué)III以使得它們可以實(shí)現(xiàn)它們的治療功能。因此，提供纖維蛋白原、生物膠和凝血因子X(jué)III的濃縮物，尤其是用于治療目的，需要產(chǎn)生不僅充分地從各種類(lèi)型的污染物例如伴隨的或共沉淀的蛋白質(zhì)、抗體或蛋白酶純化而且另外從病毒的觀點(diǎn)來(lái)看也是安全的這些產(chǎn)物的純化技術(shù)。從血漿分離富含纖維蛋白原的任選地包含F(xiàn)XIII的組分是已知的并且最初描述于 Cohn 和 Nitschmann(Cohn et al,J. Am. Chem. Soc. ,68,459,1946 和 Kistler et al,VoxSang.，7，1962，414-424)的著作中。近年來(lái)的方法將不同來(lái)源的血漿的沉淀技術(shù)與過(guò)濾、層析、病毒失活等技術(shù)組合。例如，專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0 359593,US 5 099 003,EP 0 305243.FR 2 448 900 和 FR 2 448 901 已經(jīng)提及的。然而，似乎本領(lǐng)域中大多數(shù)已知的方法包括不同生產(chǎn)鏈以及因此產(chǎn)生纖維蛋白原、生物膠的濃縮物或組合物或者富含纖維蛋白原并含有其他伴隨蛋白質(zhì)例如凝血因子FXIII、凝血因子VIII、纖連蛋白、血管假性血友病因子等的濃縮物或組合物的不同方法的使用。大多數(shù)已知方法因此不太適于在工業(yè)水平上應(yīng)用，尤其是當(dāng)對(duì)生物膠、纖維蛋白原和凝血因子X(jué)III的需求同時(shí)存在時(shí)。當(dāng)感興趣的蛋白被預(yù)期用于治療用途且必須對(duì)其進(jìn)行病毒和其他不期望的污染物(例如蛋白酶?jìng)魅拘砸蜃?的失活和/或去除時(shí)，這些純化方法在工業(yè)規(guī)模上的復(fù)雜性實(shí)施進(jìn)一步增加。
專(zhuān)利申請(qǐng)EP I 739 093描述了從包含纖維蛋白原和凝血因子的溶解的血漿組分分離XIII纖維蛋白原蛋白質(zhì)、凝血因子X(jué)III和生物膠并產(chǎn)生所述蛋白的冷凍干燥的濃縮物制劑的單一的方法。申請(qǐng)EP I 739 093中描述的方法特別地包含在截留生物膠的條件下將溶解的血漿組分在弱堿型陰離子交換柱上層析純化，特異洗脫這一膠，通過(guò)加入至少一種化學(xué)劑沉淀劑沉淀FXIII而從纖維蛋白原分離FXIII，回收純化的纖維蛋白原上清液所得的溶液并將重置于溶液中的纖維蛋白原溶液、生物膠溶液和FXIII的溶液滲濾，之后將所述溶液冷凍干燥的步驟。專(zhuān)利申請(qǐng)EP I 739 093中描述的方法還可包括至少一個(gè)病毒失活處理步驟和/或除去病毒和污染物的步驟，所述處理選自化學(xué)病毒失活處理、納米過(guò)濾和用于病毒失活的干熱處理。然而，本領(lǐng)域已知的方法中使用的重懸技術(shù)不夠安全。事實(shí)上，本領(lǐng)域中已知的這些方法中，在重懸時(shí)發(fā)生的剪切現(xiàn)象可導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的降解。因此有對(duì)于能夠減少感興趣的蛋白質(zhì)降解并增加所提取的蛋白質(zhì)的純度的技術(shù)改進(jìn)的強(qiáng)烈需求
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)在例如專(zhuān)利申請(qǐng)EP I 739 093的方法中用作原料的溶解的血漿組分的最初制備階段中通過(guò)分散實(shí)行清洗步驟與僅描述了通過(guò)重置于懸浮液中的清洗步驟的本領(lǐng)域中的方法相比帶來(lái)了清洗品質(zhì)上的顯著提高。由此產(chǎn)生了通過(guò)分散實(shí)行清洗步驟導(dǎo)致在溶解的血漿組分中以及隨后例如來(lái)自實(shí)行申請(qǐng)EP I 739 093的方法所產(chǎn)生的纖維蛋白原和生物膠的濃縮物中纖維蛋白原純度上的增加。使用本發(fā)明所獲得的好處不限于僅有的申請(qǐng)EP I 739 093的方法主題，還將由使用乙醇組分(Cohn組分I)的方法獲得。因此本發(fā)明涉及處理血漿的方法，所述方法包括步驟a)血漿或血漿組分的乙醇沉淀；b)回收步驟a)形成的沉淀物；c)通過(guò)分散清洗所述沉淀物；d)回收清洗的血漿糊；以及e)將所述清洗的血漿糊溶解。步驟c)的通過(guò)分散的清洗優(yōu)選地使用轉(zhuǎn)子/定子型分散器進(jìn)行。有利地，所用的分散器是內(nèi)嵌式分散器，步驟b)的沉淀物被進(jìn)料至分散器的軸向入口而清洗的產(chǎn)物通過(guò)分散器的徑向出口排出。本發(fā)明的方法還可包括另外的步驟f)用氫氧化鋁處理所述溶解的血漿糊和/或低溫處理所述溶解的血漿糊；以及g)通過(guò)將步驟f)獲得的上清液澄清和/或滅菌過(guò)濾獲得可溶的血漿組分。本發(fā)明的方法可最終包括另外的步驟h)在截留生物膠的條件下，將步驟g)的可溶的血漿組分在用堿性pH值的預(yù)定離子強(qiáng)度的緩沖液預(yù)先平衡的弱堿型的陰離子交換型的樹(shù)脂上層析純化，通過(guò)增加所述緩沖液的離子強(qiáng)度洗脫所述生物膠；i)通過(guò)加入至少一種化學(xué)劑沉淀FXIII將FXIII從在步驟h)獲得的全部或部分生物膠的洗脫液中沉淀；
j)回收相應(yīng)于步驟i)的上清液的純化的纖維蛋白原的溶液；以及k)將重置于溶液中的纖維蛋白原和/或生物膠和/或FXIII的溶液滲濾，之后將所述溶液冷凍干燥。因此，包括通過(guò)分散實(shí)行清洗步驟的申請(qǐng)人所公開(kāi)的方法允許獲得冷凍干燥的、高度純化的、基本上不含共純化的蛋白質(zhì)和不期望的污染物的纖維蛋白原、凝血因子X(jué)III和/或生物膠的濃縮物。事實(shí)上，與如本領(lǐng)域中所描述的僅通過(guò)重置于懸浮液中來(lái)清洗相t匕，經(jīng)由分散的清洗步驟產(chǎn)生對(duì)包含感興趣的蛋白尤其是纖維蛋白原的初始血漿組分的更好的清洗并且?guī)?lái)本發(fā)明的整個(gè)隨后步驟中這些化合物的純度上的顯著增加。因此通過(guò)分散實(shí)行清洗步驟以簡(jiǎn)單、快速和低成本的方法帶來(lái)更高的純度并確保工業(yè)水平上原材料的增加的成本收益。因此使得生物膠、凝血因子X(jué)III和/或纖維蛋白原的生產(chǎn)顯著優(yōu)化，同時(shí)減少了相關(guān)的生產(chǎn)成本。本發(fā)明的方法還允許從優(yōu)選地包含纖維蛋白原和凝血因子X(jué)III的血漿原料獲得冷凍干燥并且高度純化的蛋白質(zhì)，同時(shí)與至少一種病毒失活處理和/或病毒以及其他的不期望的污染物(例如聚合物、聚集物或蛋白酶?jìng)魅拘砸蜃?的清除處理保持相容。


單個(gè)的圖I是轉(zhuǎn)子/定子分散器的圖示說(shuō)明。本發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述因此本發(fā)明涉及處理血漿的方法，所述方法包括步驟a)血漿或血漿組分的乙醇沉淀；b)回收步驟a)形成的沉淀物；c)通過(guò)分散清洗所述沉淀物；d)回收清洗的血漿糊；e)將所述清洗的血漿糊溶解。本發(fā)明的方法可使用多種來(lái)源的血漿原料以及尤其是來(lái)自包含纖維蛋白原和凝血因子X(jué)III的來(lái)源的血漿原料來(lái)實(shí)行。因此這一方法可使用Cohn的分餾法用冷乙醇直接從血楽■實(shí)行(Cohn 等人，J. Am. Chem. Soc.，68,459,1946 和 Kistler 等人，Vox Sang.，7,1962,414-424)。有利地，本發(fā)明的方法的步驟b)和d)通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行。就本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)“分散”是指乙醇沉淀物的顆粒的分離和它們?cè)谟汕逑淳彌_液形成的介質(zhì)中均質(zhì)的或基本上均質(zhì)的分布。這一分散與本領(lǐng)域中所描述的重懸的方法不同，尤其在于后者方法沒(méi)有允許顆粒均質(zhì)分布。 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法的步驟c)經(jīng)由分散的清洗步驟使用轉(zhuǎn)子/定子型分散器來(lái)進(jìn)行。轉(zhuǎn)子/定子型分散器通常包含至少一個(gè)有齒的轉(zhuǎn)子和至少一個(gè)有齒的定子，形成具有高剪切速度的組件。產(chǎn)物(在本文中是與清洗緩沖液混合的乙醇沉淀物)進(jìn)入帶齒轉(zhuǎn)子的槽和通過(guò)定子環(huán)的槽的葉片之間的分散區(qū)域，泵送作用由機(jī)器本身保證。內(nèi)部轉(zhuǎn)子環(huán)增加產(chǎn)物的通過(guò)速度，定子環(huán)導(dǎo)致其突然制動(dòng)，加速產(chǎn)物的精細(xì)分散。剪切槽中強(qiáng)烈的湍流將固體顆粒有效地研磨并分散為均質(zhì)分布。轉(zhuǎn)子和定子的幾何形狀可適于產(chǎn)物的分散條件。
所述分散器在唯一的附圖中說(shuō)明。因此分散器，尤其是內(nèi)嵌式轉(zhuǎn)子/定子分散器，允許乙醇沉淀在清洗緩沖液中非常精細(xì)的均質(zhì)或基本上均質(zhì)的分散而獲得均質(zhì)或基本上均質(zhì)的溶液并由此有助于除去更大比例的蛋白污染物。盡管本領(lǐng)域中已知轉(zhuǎn)子/定子分散器用于制備乳液、懸浮色素、將去污劑加入溶液，用于快速制造膠體溶液和用于將粉末以及其他類(lèi)似產(chǎn)物均質(zhì)化的用途，但是應(yīng)注意的是，就血漿蛋白質(zhì)的純化方法而言沒(méi) 有描述過(guò)所述分散器的用途。已廣為人知的是分散器的使用導(dǎo)致溶液或所制備的懸浮液的加熱并且所述分散器不能用于溫控箱。因此看來(lái)可能到本發(fā)明為止，用于制備血漿產(chǎn)物的方法中分散器的使用都被認(rèn)為將帶來(lái)溫度的增加由此導(dǎo)致血漿蛋白質(zhì)的降解。然而，申請(qǐng)人驚奇地觀察到分散器的使用減少了分散所需的時(shí)間并且實(shí)際上降低了其加熱。因此，與現(xiàn)有的技術(shù)上預(yù)先形成的觀點(diǎn)相反并且令人驚訝地，分散器的使用就其不會(huì)產(chǎn)生產(chǎn)物的任何降解而言被證明非常適于用于純化血漿蛋白質(zhì)的方法。此外，申請(qǐng)人還觀察到分散器的使用帶來(lái)污染蛋白質(zhì)的質(zhì)量上的顯著降低。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用嵌入式分散器進(jìn)行本發(fā)明的方法的步驟c)的經(jīng)由分散的清洗步驟。在這一特定的實(shí)例中，優(yōu)選地轉(zhuǎn)子/定子型的分散器與實(shí)行純化方法所需要的其他工業(yè)設(shè)備安裝在相同的生產(chǎn)線上。因此，步驟b)的沉淀物優(yōu)選地與清洗緩沖液一起被進(jìn)料至內(nèi)嵌式分散器的軸向入口而符合乙醇沉淀物在清洗緩沖液中基本上均質(zhì)分散的清洗產(chǎn)物向嵌入式分散器的徑向出口排出。嵌入式分散器的使用還提供了對(duì)無(wú)菌的每一種保證，這是因?yàn)闄C(jī)器被設(shè)計(jì)為簡(jiǎn)單拆下并容易清洗的并且可以整合到CIP系統(tǒng)(原位清潔)中。如上文所描述的，本發(fā)明的方法的步驟c)使用分散器清洗乙醇沉淀物導(dǎo)致獲得乙醇沉淀物在所使用的清洗緩沖液中均質(zhì)或基本上均質(zhì)的懸浮液(勻漿)、這一均質(zhì)或基本上均質(zhì)的懸浮液可通過(guò)能夠檢定懸浮液中不存在結(jié)塊的目視檢驗(yàn)來(lái)表征。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，使用裝配有抗絮凝葉片型的攪拌裝置的箱進(jìn)行本發(fā)明的步驟C)。這一攪拌裝置允許形成初級(jí)分散，其形成抗絮凝的糊但是其不是均質(zhì)的。攪拌裝置與內(nèi)嵌式分散器偶聯(lián)，允許形成二級(jí)分散產(chǎn)生精細(xì)并均質(zhì)的懸浮液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟b)進(jìn)行的沉淀物的回收和/或步驟d)進(jìn)行的血漿糊的回收通過(guò)離心來(lái)完成。優(yōu)選地，步驟d)的血漿糊的回收通過(guò)使用噴射離心來(lái)獲得。在這一特定的實(shí)例中，步驟c)通過(guò)分散清洗的沉淀物通過(guò)噴嘴的方式放入工業(yè)離心機(jī)中，所述噴嘴的直徑相對(duì)于懸浮液中的顆粒的大小來(lái)標(biāo)定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，噴嘴離心機(jī)是Sharpless AS 16型或者Westfalia Separator型,具有相對(duì)于所使用的分離器(2至4_)標(biāo)定的特定的噴嘴。在步驟c)經(jīng)由分散清洗允許獲得清洗緩沖液中包含非常精細(xì)的乙醇沉淀物顆粒的懸浮液。結(jié)果，所形成的基本上均質(zhì)的懸浮液就其有利地避免了離心噴嘴的堵塞而言被證明是非常適于噴嘴離心機(jī)使用的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，血漿糊的溶解在包含O. 06-0. 18M氯化鈉、O. 005-0. 02M檸檬酸三鈉和O. 02-0. 08M精氨酸，pH 7. 3至7. 5的緩沖液中進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，乙醇沉淀形成的沉淀物用由O. 5-1. 5M甘氨酸、O.01-0. IM檸檬酸三鈉和5. 0-8. 0% (v/v)乙醇，pH6. 7-6. 9的混合物組成的緩沖液通過(guò)分
散來(lái)清洗。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括另外的步驟f)用氫氧化鋁處理所述溶解的血漿糊和/或低溫處理所述溶解的血漿糊；以及g)通過(guò)將步驟f)獲得的上清液澄清和/或滅菌過(guò)濾獲得可溶的血漿組分。在步驟f)加入氫氧化鋁特別地確保不期望的蛋白質(zhì)例如凝血因子II(FII)、VII (FVII)、IX(FIX)和X(FX)的消除。從對(duì)溶解的血漿糊的處理獲得的上清液，在本申請(qǐng)中也稱(chēng)為“可溶的血漿組分”，通過(guò)至少一次澄清和/或滅菌過(guò)濾來(lái)純化?？扇艿难獫{組分還可經(jīng)歷深度過(guò)濾以便截留氫氧化鋁。澄清過(guò)濾允許去除不可溶的污染顆粒。澄清和滅菌過(guò)濾通常使用例如O. 8至
O.Ium的濾器進(jìn)行。有利地，以采用纖維素纖維的O. 65 μ m濾器上過(guò)濾的形式進(jìn)行至少一次澄清過(guò)濾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用O. 2 μ m的濾器進(jìn)行至少一次滅菌過(guò)濾。步驟g)之后獲得的可溶的血漿組分可被直接使用或者當(dāng)需要時(shí)其可被冷凍直到實(shí)行任選的另外的純化步驟。實(shí)行包含經(jīng)由分散的清洗步驟的用于處理血漿的方法有利地使得所獲得的可溶血漿組分中纖維蛋白原的純度為至少80%、優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90%。清洗步驟期間內(nèi)嵌式分散系統(tǒng)的使用特別地增加在可溶血漿分離階段纖維蛋白原的富集。這一技術(shù)允許就在清洗步驟的內(nèi)嵌分散和纖維蛋白原富集時(shí)以及由此后續(xù)步驟中懸浮液的均質(zhì)性以及沒(méi)有感興趣的蛋白質(zhì)經(jīng)歷任何降解而言獲得確定并且可重復(fù)的結(jié)果O在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的用于處理血漿的方法包括另外的步驟h)在截留生物膠的條件下，將步驟g)的可溶的血漿組分在用預(yù)定離子強(qiáng)度且堿性PH值的緩沖液預(yù)先平衡的弱堿型的陰離子交換型的樹(shù)脂上層析純化，通過(guò)增加所述緩沖液的離子強(qiáng)度洗脫所述生物膠；i)通過(guò)加入至少一種化學(xué)劑沉淀FXIII將FXIII從全部或部分生物膠的洗脫液中沉淀；j)回收相應(yīng)于步驟i)的上清液的純化的纖維蛋白原的溶液；以及k)將重置于溶液中的纖維蛋白原和/或生物膠和/或FXIII的溶液滲濾，之后將所述溶液冷凍干燥?？扇苎獫{組分的層析純化(步驟h))可針對(duì)以與弱堿型陰離子交換基團(tuán)連接的天然或合成聚合物、樹(shù)脂或凝膠為基礎(chǔ)的任何基質(zhì)進(jìn)行，例如DEAE。這一類(lèi)型的常規(guī)層析載體可以 DEAE-S印harose CL-6B、DEAE-Trisacryl LS、Fractogel TSK-DEAE 650M 或 S、DEAE-Macroprep (Bio-Rad, France)等商品名獲得。陰離子交換柱的平衡緩沖液具有預(yù)定的離子強(qiáng)度并且必須具有堿性的pH值。離子強(qiáng)度通常小于O. 2的值并且優(yōu)選地其位于從O. 06至O. 2，特別地O. 08至O. 15的值的范圍內(nèi)。這優(yōu)選地通過(guò)加入堿金屬或堿土金屬或其混合物的無(wú)機(jī)鹽(最優(yōu)選地方式堿金屬的無(wú)機(jī)鹽，特別地氯化鈉)來(lái)調(diào)節(jié)。選擇平衡緩沖液的最大pH值以避免所討論的產(chǎn)物的任何降解，也就是說(shuō)，其為約IOo有利地，pH位于高于7并直到9，優(yōu)選地7. 5至8. 2的值的范圍內(nèi)。作為實(shí)例，這一緩沖液于pH值7. 9-8. I由氯化鈉組成，具有O. 06M的濃度并且可最優(yōu)選地還包括O. OllM的優(yōu)選濃度的檸檬酸三鈉。同樣可能的是使用以氯化鈉或者堿金屬或堿土金屬的無(wú)機(jī)鹽為基礎(chǔ)并且包含對(duì)于感興趣的產(chǎn)物來(lái)說(shuō)非變性的其他生物可相容的化合物的任何其他的緩沖液。當(dāng)可溶的血漿組分已經(jīng)被用于陰離子交換柱時(shí)，操作條件是使得生物膠被截留在 載體上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在生物膠的洗脫步驟之前，本發(fā)明的方法可包括使用所述平衡緩沖液直到去除蛋白質(zhì)和非截留的污染物的陰離子交換柱清洗步驟。這一清洗步驟，經(jīng)由載體上清洗緩沖液的滲透，允許包含纖維蛋白原的溶液中存在的蛋白質(zhì)例如免疫球蛋白G(IgG)、A(IgA)和M(IgM)以及白蛋白通過(guò)進(jìn)入濾液，而污染物(例如化學(xué)的病毒失活劑)則不被交換柱截留或僅被交換柱弱截留。清洗時(shí)間通過(guò)在280nm的波長(zhǎng)測(cè)量濾液的光密度(OD)來(lái)確定。事實(shí)上，對(duì)應(yīng)基線的OD值是有效去除上文所提到的化合物的良好指
/Jn ο在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的清洗緩沖液對(duì)應(yīng)于柱的平衡緩沖液并且優(yōu)選地由O. 02-0. IM氯化鈉和O. 005-0. 02M檸檬酸三鈉形成，pH 7. 8-8. 2。當(dāng)返回基線后，通過(guò)增加pH值優(yōu)選地設(shè)置為7. 4-7. 6的平衡或清洗緩沖液的離子強(qiáng)度進(jìn)行生物膠的洗脫。選擇這一離子強(qiáng)度的值以便獲得生物膠的有效洗脫同時(shí)注意這一值沒(méi)有破壞所討論的產(chǎn)物的性質(zhì)。有利地，洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度的值在O. 5和I. 3之間，特別地在O. 9和I. I之間。離子強(qiáng)度上的這一增加通過(guò)加入上文定義的任何鹽或鹽的混合物尤其是氯化鈉來(lái)獲得。洗脫緩沖液還可包含其他的賦形劑例如包含檸檬酸三鈉(10至12g/l)、賴(lài)氨酸(I至5g/l)、甘氨酸(I至5g/l)、Tris鹽(2至5g/l)、精氨酸(25至50g/l)和異亮氨酸5至15g/l)的稱(chēng)為混合物A的成分的混合物。洗脫液中的蛋白質(zhì)濃度通常為4g/l級(jí)。所獲得的生物膠洗脫液的量的至少一部分之后可經(jīng)歷預(yù)期將伴隨纖維蛋白原的FXIII分離的處理。這一分離經(jīng)由通過(guò)向步驟h)的洗脫液加入沉淀化學(xué)劑導(dǎo)致FXIII的沉淀來(lái)進(jìn)行，可能地以適當(dāng)濃度的水溶液的形式加入以獲得凝血因子X(jué)III的沉淀。優(yōu)選地，沉淀化學(xué)劑是含有IM的檸檬酸鹽例如檸檬酸鈉尤其是檸檬酸三鈉的水溶液。所形成的FXIII的沉淀物之后從高度富含纖維蛋白原的上清液分離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)XIII的沉淀物可經(jīng)由通過(guò)5 μ m濾器的過(guò)濾來(lái)回收。由此回收的FXIII的沉淀物之后被重置于溶液中，優(yōu)選地在水或緩沖液中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)XIII的沉淀物溶解于包含10至12g/l檸檬酸三鈉、I至5g/l賴(lài)氨酸、I至5g/l甘氨酸、2至5g/l Tris、25至50g/l精氨酸和5至15g/l異亮氨酸的混合物，調(diào)節(jié)至6. 9和7. I之間的pH值的緩沖液中，以便凝血因子X(jué)III的濃度相應(yīng)于比正常血漿的活性高約100倍的活性。
在這一方面中，F(xiàn)XIII的沉淀物可被溶解例如以便其具有約I至5g全蛋白/I的濃度。根據(jù)本發(fā)明，生物膠的溶液(即從步驟h)獲得的生物膠的洗脫液)和纖維蛋白原的溶液(富含纖維蛋白原的上清液)可有利地通過(guò)超濾來(lái)濃縮，直到內(nèi)含物通常包含15和25g之間的全蛋白/1，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)測(cè)量確定。所獲得的，任選地濃縮的，纖維蛋白原、凝血因子X(jué)III和生物膠的三種溶液之后經(jīng)歷滲濾步驟。滲濾步驟允許除去所使用的任何過(guò)量的無(wú)機(jī)鹽以獲得具有不超過(guò)O. 2M的離子強(qiáng)度的溶液并除去重置于溶液中的沉淀物中存在的沉淀劑。應(yīng)當(dāng)注意的是生物膠洗脫所需的大量存在的無(wú)機(jī)鹽可對(duì)冷凍干燥以及經(jīng)由干熱的病毒失活的過(guò)程的功效以及對(duì)適合的納米濾器的病毒截留能力具有有害影響。

滲濾步驟還可被用于一方面摻入足夠的賦形劑例如穩(wěn)定劑和/或保護(hù)劑以使得纖維蛋白原、FXIII和生物膠可以干燥加熱而無(wú)變性的風(fēng)險(xiǎn)并且另一方面使得冷凍干燥物可以在通常3至8分鐘內(nèi)迅速溶解。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，滲濾緩沖液含有混合物A (包含10至12g/l檸檬酸三鈉、I至5g/l賴(lài)氨酸、I至5g/l甘氨酸、2至5g/l Tris、25至50g/l精氨酸和5至15g/l異亮氨酸的混合物)并且具有6. 9-7. I的pH值。有利地，包含混合物A的滲濾緩沖液與用于從陰離子交換樹(shù)脂洗脫生物膠的緩沖液一樣。在這一優(yōu)選的實(shí)施方案中，滲濾和本發(fā)明的方法的實(shí)行被由此簡(jiǎn)化并且優(yōu)化。根據(jù)需要可使用不同組成的滲濾緩沖液，只要它們滿足上文列出的標(biāo)準(zhǔn)。上文提及的超濾步驟也可在所述方法的這一階段在相同的條件下實(shí)行。任選地通過(guò)超濾濃縮的滲濾的溶液按照常規(guī)方法和常用條件冷凍干燥，即在-40°C和_30°C之間冷凍干燥約48小時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括例如至少一個(gè)病毒失活和/或病毒及污染物(諸如蛋白酶?jìng)魅拘砸蜃?的去除處理的步驟。這一處理可選自由化學(xué)病毒失活處理、納米過(guò)濾和干熱病毒失活形成的組。當(dāng)病毒失活處理是化學(xué)處理時(shí)，其有利地相當(dāng)于溶劑-去污劑處理，按照專(zhuān)利EPO 131 740中描述的方法。所使用的病毒失活化學(xué)劑優(yōu)選地相當(dāng)于Tween-TnBP的混合物，和更優(yōu)選地Triton(辛苯昔醇)-TnBP的混合物，其通常的濃度分別為O. 3% (v/v)和1%(w/v)。經(jīng)由化學(xué)處理的病毒失活可被整合至所述方法的任何階段，但是其明智地在步驟h)的層析純化之前進(jìn)行。以這一方式，層析純化將有助于有效去除失活劑。在所述方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，還可提供超濾步驟以除去病毒，尤其是無(wú)包膜的病毒和其他外源污染物，除了上文描述的化學(xué)病毒失活處理之外還使用所述步驟。納米過(guò)濾可有利地在具有35nm和/或15nm的孔隙率的濾器上進(jìn)行，盡管就過(guò)濾時(shí)間和病毒截留的功效被優(yōu)化而言其他的納米濾器可被使用。納米過(guò)濾有利地在從步驟h)獲得的洗脫液上或當(dāng)可用時(shí)在重置于溶液中的纖維蛋白原、生物膠或FXIII的滲濾的溶液上進(jìn)行(在其冷凍干燥之前)。應(yīng)當(dāng)注意的是，為了有效的實(shí)行，納米過(guò)濾技術(shù)需要控制影響回收的所過(guò)濾的化合物的產(chǎn)量同時(shí)避免濾器的堵塞以及各種病毒和污染物的通過(guò)的物理化學(xué)參數(shù)。這些參數(shù)，例如離子強(qiáng)度、溶液的pH值和過(guò)濾操作條件，強(qiáng)加了特定的實(shí)行條件，這些特定的實(shí)行條件還取決于待過(guò)濾溶液中存在的化合物的類(lèi)型。 對(duì)于化學(xué)層析的化學(xué)參數(shù)和滲濾的化學(xué)參數(shù)的明智的選擇使得納米過(guò)濾可以進(jìn)行而不破壞性能水平。最后，干熱病毒失活處理有利地在冷凍干燥步驟之后獲得的纖維蛋白原、生物膠和FXIII的冷凍干燥物上進(jìn)行，使用80°C 72小時(shí)的常規(guī)條件以將未通過(guò)上文的兩個(gè)病毒失活和/或病毒去除步驟中的至少一個(gè)失活和/或去除的無(wú)包膜的病毒失活。干燥加熱的冷凍干燥物之后可在與臨床使用相容的水性介質(zhì)優(yōu)選地在注射用水中重構(gòu)或者直接通過(guò)靜脈途經(jīng)注射。因此，本方法的實(shí)行產(chǎn)生生物膠的和纖維蛋白原的高度純化的濃縮物的冷凍干燥物，它們各自的纖維蛋白原含量相對(duì)于總蛋白質(zhì)含量為約80% -90%。不使用內(nèi)嵌式分散器，纖維蛋白原含量相對(duì)于總蛋白質(zhì)含量為70%和77%之間(參見(jiàn)表A)。此外，生物膠和纖維蛋白原的濃縮物中凝血因子的活性分別為約5U/ml和約
I.5U/ml ο所獲得的凝血因子X(jué)III的濃縮物不含污染物蛋白質(zhì)并且根據(jù)需要具有根據(jù)重置于溶液中的FXIII沉淀物的濃度和/或超濾之后獲得的濃度獲得的在從約30U/ml至約700U/ml，優(yōu)選地從100U/ml至400U/ml的值的范圍內(nèi)的活性。此外，本發(fā)明的方法中至少一種病毒失活處理步驟和/或病毒和污染物的去除步驟的存在使得能夠用本發(fā)明的方法獲得適于醫(yī)療用途的生物膠、纖維蛋白原和凝血因子X(jué)III的濃縮物。下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案但并不限制其范圍。
實(shí)施例使用不含冷凍沉淀物的12001的人類(lèi)血漿。這一血漿在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件下按照Cohn法經(jīng)歷乙醇沉淀，以使所討論的血漿中乙醇的濃度是8% (v/v)并且由此獲得的混合物的溫度為_(kāi)3°C至_5°C。之后將由此獲得的上清液和沉淀物離心。獲得8和12kg之間的乙醇沉淀物，其形成Cohn粗制組分I。Cohn粗制組分I被重新懸浮并且用3001的“Blombach”緩沖液(BlomMck B,Blomback M Purification of human and bovine fibrinogen(人類(lèi)和牛纖維蛋白原的純化).Ark Kem 10 :415-443,1956)清洗，所述“Blombach” 緩沖液由 IM 甘氨酸、O. 055M 檸檬酸三鈉和6. 5%乙醇(v/v)的混合物形成，pH值6. 8。使用Z66型內(nèi)嵌式分散系統(tǒng)(Ystral)進(jìn)行清洗。在具有標(biāo)定為3mm的噴嘴的Sharpless AS 16離心機(jī)上離心之后，回收約8kg的清洗的血漿糊(Cohn純化組分I)，其于37°C的溫度溶解于由0. 12M氯化鈉、0. 010M檸檬酸三鈉和0. 05M精氨酸的混合物形成的pH值7. 4的601緩沖液中。之后由此獲得的溶解的血漿糊于25°C和6. 9-7. I的pH值經(jīng)歷使用108g每kg血漿糊的比率的氧化鋁凝膠的處理。
一旦使用氧化鋁凝膠的處理結(jié)束，溶液經(jīng)歷使用O. 65 μ m纖維素纖維(Seitz，type K700)的濾器的深度透鏡過(guò)濾和使用O. 2 μ m濾器的滅菌過(guò)濾。根據(jù)EP O 131 740中描述的方法，這一溶液然后在Tween-TnBP (其分別濃度為
0.3% (v/v)和1% (w/v))存在的條件下受到通過(guò)溶劑-去污劑進(jìn)行的第一次病毒失活處理。表A將實(shí)行包含經(jīng)由內(nèi)嵌式分散的清洗步驟的方法(例如上文描述的)獲得的纖維蛋白原、蛋白質(zhì)的濃度以及纖維蛋白原的純度與其中在內(nèi)嵌式分散系統(tǒng)不存在的條件下進(jìn)行清洗步驟的相似方法的那些相比較。應(yīng)當(dāng)注意的是，表A中給出的結(jié)果對(duì)應(yīng)于分別從用于不包括經(jīng)由分散的任何清洗步驟的所述方法的2個(gè)不同批次的血漿獲得的平均值和包含經(jīng)由分散的清洗步驟的方法的3個(gè)不同批次的血漿獲得的平均值。除了在清洗乙醇沉淀時(shí)使用轉(zhuǎn)子/定子型內(nèi)嵌式分散器之外，表A中描述的方法是完全相當(dāng)?shù)?包括所使用的所有緩沖液和溫度)
表A-生產(chǎn)過(guò)程中的對(duì)照結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種處理血漿的方法，所述方法包括步驟 a)血漿或血漿組分的こ醇沉淀； b)回收步驟a)形成的沉淀物； c)通過(guò)分散清洗所述沉淀物； d)回收清洗的血漿糊；以及 e)將所述清洗的血漿糊溶解。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的處理血漿的方法，其中，步驟c)的所述通過(guò)分散清洗使用轉(zhuǎn)子/定子型分散器進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的處理血漿的方法，其中步驟c)的所述通過(guò)分散清洗使用內(nèi)嵌式分散器進(jìn)行，步驟b)的所述沉淀物被進(jìn)料至所述分散器的軸向入口而清洗的產(chǎn)物在所述分散器的徑向出ロ排出。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的處理血漿的方法，其中步驟b)的所述沉淀物的回收和/或步驟d)的所述血漿糊的回收通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的處理血漿的方法，其中步驟d)的所述血漿糊的回收使用噴嘴離心機(jī)來(lái)進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的處理血漿的方法，其中步驟c)清洗的所述產(chǎn)物是基本上均質(zhì)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的處理血漿的方法，所述方法包括另外的步驟 f)用氫氧化鋁處理所述溶解的血漿糊和/或低溫處理所述溶解的血漿糊； g)通過(guò)將步驟f)獲得的上清液澄清和/或滅菌過(guò)濾獲得可溶的血漿組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中的一項(xiàng)所述的處理血漿的方法，其中步驟c)的所述通過(guò)分散清洗用由O. 5-1. 5M甘氨酸、O. 01-0. IM檸檬酸三鈉和5. 0-8. 0% (v/v)こ醇的混合物構(gòu)成的pH值6. 7-6. 9的緩沖液進(jìn)行。
9.一種處理血漿的方法，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求I至8所述的方法并包括另外的步驟 h)在截留生物膠的條件下，將步驟g)的所述可溶的血漿組分在用堿性pH值的預(yù)定離子強(qiáng)度的緩沖液預(yù)先平衡的弱堿型的陰離子交換型的樹(shù)脂上層析純化，通過(guò)增加所述緩沖液的離子強(qiáng)度洗脫所述生物膠； i)通過(guò)加入至少ー種化學(xué)劑沉淀FXIII將FXIII從在步驟h)獲得的全部或部分生物膠的洗脫液中沉淀； j)回收相應(yīng)于步驟i)的上清液的純化的纖維蛋白原的溶液；以及 k)將重置于溶液中的纖維蛋白原和/或生物膠和/或FXIII的溶液滲濾，之后將所述溶液冷凍干燥。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法包括至少ー個(gè)病毒失活處理步驟和/或病毒和污染物的去除步驟，所述處理選自由化學(xué)病毒失活處理、納米過(guò)濾和經(jīng)由干燥加熱的病毒失活處理形成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法包括在滲濾步驟k)之前或在所述步驟之后在冷凍干燥之前進(jìn)行的濃縮超濾步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及處理血漿的方法，所述方法包括乙醇沉淀血漿或血漿組分的步驟，回收沉淀物的步驟，清洗所述沉淀物的步驟，回收清洗的血漿糊并且使得所述清洗的血漿糊可以溶解的步驟。
文檔編號(hào)C07K1/36GK102639554SQ201080052250
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者蒂埃里·特魯斯尼奇 申請(qǐng)人:Lfb生物制藥公司