專利名稱：用于核酸分子檢測的方法、試劑和試劑盒的制作方法
用于核酸分子檢測的方法、試劑和試劑盒序列表計算機(jī)可讀形式的序列表全部以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
近來，已鑒定出一類稱為微小RNA(miRNA)的小型非編碼RNA，其在植物和動物的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起作用(Carrington和Ambrose, Science 301:336 (2003))。最初在線蟲(C. elegans)中被鑒定的miRNA通過與其祀mRNA的3’未翻譯區(qū)域(UTR)或編碼序列中的互補(bǔ)位點進(jìn)行堿基配對并且抑制它們的翻譯而發(fā)揮作用(Wang等，Nucleic. AcidsRes. 32:1688(2004))。盡管成熟miRNA長度僅為約22個核苷酸(nt)，但是其通過Dicer復(fù)合體的作用而 來源于約70聚體的前體(前體miRNA)序列的發(fā)夾區(qū)域(Lee等，EMBO J. 21:4663 (2002))。所述成熟miRNA隨后被并入miRNP，其為介導(dǎo)miRNA對基因調(diào)控的效果的核糖核蛋白復(fù)合體(Mourelatos 等，Genes Dev.16:720 (2002))。生物信息學(xué)研究預(yù)測在蠕蟲和果蠅基因組中編碼了約100種miRNA，并且脊椎動物基因組中編碼了約 250 種 miRNA (Lai 等,Genome Biol. 4:R42 (2003) ；Lim 等,GenesDev. 17:991(2003) ;Lim 等，Science 299:1540(2003))。這占到各基因組的經(jīng)過預(yù)測的蛋白質(zhì)編碼基因數(shù)量的約O. 5-1%，顯示了 miRNA作為ー類調(diào)控性基因產(chǎn)物的重要性(Brennecke 和 Cohen, Genome Biol.4:228 (2003))。miRNA牽涉到多種生物過程，包括植物中的花與葉的發(fā)育，蠕蟲中的幼蟲發(fā)育，果蠅中的凋亡和脂肪代謝，以及哺乳動物中的造血分化和神經(jīng)元發(fā)育(Bartel，Cell116:281 (2004)) 0此外，多種miRNA基因位于與癌癥關(guān)聯(lián)的人染色體區(qū)域(如，脆性位點、斷點、雜合性缺失區(qū)域、擴(kuò)增區(qū)域)(Calin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA101:2999 (2004))。多種miRNA還被顯示在體內(nèi)與脆性X智力低下蛋白(FMRP)相互作用(Jin等，Nat.Neurosci. 7:113 (2004))，這暗示了這些小RNA在人類健康和疾病中的作用。由于不同的細(xì)胞類型和疾病狀態(tài)與特定miRNA的表達(dá)有關(guān)聯(lián)，因此獲得miRNA的時間和空間表達(dá)特征是很重要的。Northern雜交已被用于測定miRNA的表達(dá)水平(參見，例如 Sempere 等,Genome Biol. 5: R13 (2004) ；Aravin 等,Dev. Cell 5:337(2003)；Grad 等，Mol. Cell 11:1253 (2003) ;Lim 等，Genes & Dev. 17:991 (2003))，但是這種方法對于高通量分析而言工作過于繁重?；赑CR的方法已被用于監(jiān)測miRNA的表達(dá)，但是這些方法需要使用高成本基因特異性引物(參見，例如Schmittgen等，Nucleic AcidsRes. 32 :e43 (2004))或需要進(jìn)行低效率的平端連接以將引物結(jié)合連接物結(jié)合于所述miRNA分子(參見，例如 Miska 等，Genome Biol. 5: R68 (2004) ;Grad 等，Mol. Cellll: 1253 (2003)；Lim等，Genes & Dev. 17:991 (2003))。此外，PCR可向所擴(kuò)增的靶miRNA分子群體中引入顯著的偏倚性。高通量的微陣列最近已被開發(fā)用于在多種組織和細(xì)胞類型中鑒定miRNA的表達(dá)模式(參見，例如 Babak 等，RNA 10:1813 (2004) ;Calin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA101:11755(2004) ;Liu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9740(2004) ;Mi ska 等，GenomeBiol. 5: R68 (2004) ;Sioud 和 R0Sok, BioTechniques 37:574(2004) ;Krichevsky 等，RNA9:1274 (2003)) 0微陣列的使用對于miRNA表達(dá)的檢測具有多種優(yōu)點，包括在單ー時間點在同一樣品內(nèi)檢測多種基因表達(dá)的能力、僅對少量RNA的需求以及對前體和成熟miRNA分子的表達(dá)進(jìn)行同時鑒定的潛力。但是，由于成熟miRNA僅長約22nt并且在任意給定組織內(nèi)僅以非常有限的量存在，因此這些小RNA對于微陣列標(biāo)記和檢測造成難題(Sioud和R.0Sok.., BioTechniques37:574(2004))。例如，熒光團(tuán)的共價連接可被用于直接標(biāo)記miRNA分子以用于微陣列分析(參見，例如 Babak 等，RNA 10:1813 (2004) ；MICR0MAX ASAP miRNA ChemicalLabeling Kit, Perkin Elmer, Waltham, MA ；Label 丨丁凡丨 μ ArrayLabeling Kit, Mirus BioCorp.，Madison, WI),但是這種方法缺 乏對稀少祀miRNA分子進(jìn)行檢測的靈敏度。直接標(biāo)記還可引起隨機(jī)并入的熒光團(tuán)的分子間沉默，這導(dǎo)致進(jìn)ー步降低的靈敏度。miRNA分子的隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄已被用于制備在微陣列分析中使用的經(jīng)過標(biāo)記的cDNA分子(參見，例如 Sioud 和 R0SOk, BioTechniques 37:574 (2004) ；Liu 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA101:9740 (2004))，但是這種方法并不產(chǎn)生原始全長miRNA群體的精確再現(xiàn)。已開發(fā)出顯著改善miRNA分析精確度和靈敏度的新的標(biāo)記方法(參見，例如共同待決的美國專利申請第10/979，052號，以美國專利公開第2006/0094025號公開)。但是，這些方法使用間接標(biāo)記連接并且需要多重雜交步驟以在所述分析中顯現(xiàn)信號。此外，這些方法受限于大捕獲試劑分子，其需要獨立的雜交步驟以改善所述結(jié)合動力學(xué)。雖然提供了良好結(jié)果，但這些方法不易適用于高通量分析并且需要頗為更多的時間以獲得理想結(jié)果。因此，迫切需要對用于微陣列和高通量分析的miRNA分子進(jìn)行標(biāo)記和檢測的快捷、靈敏和有效的方法。發(fā)明概述申請人:已經(jīng)發(fā)明了用于對靶miRNA分子進(jìn)行標(biāo)記的方法，其中核酸標(biāo)記分子被直接連接于所述miRNA分子的3’末端。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在無需PCR的情況下可通過優(yōu)化的核酸標(biāo)記分子的使用而降低沉默并且增強(qiáng)信號強(qiáng)度，從而產(chǎn)生用于miRNA分析尤其是高通量分析的改善的方法和試劑。所述優(yōu)化的核酸標(biāo)記分子優(yōu)選地是經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架，其上連接有能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的多個標(biāo)記分子。所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架可以是其上可連接標(biāo)記分子的任意聚合物，如，蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、多糖、脂類、月旨肪酸、核酸等。在優(yōu)選的實施方案中，所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架包含小DNA樹狀高分子，其包含20-1000個堿基的核酸，更為優(yōu)選的情況下包含300-750個堿基的核酸，并且包含一個可連接末端和10-15個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子。所述可連接末端具有5’磷酸，其可被連接于miRNA分子的3’末端。所述核酸標(biāo)記分子的體積小到足以實現(xiàn)在多種檢測平臺之上對miRNA分子進(jìn)行快速、有效的雜交，所述檢測平臺諸如微陣列和基于珠粒的分析。因此，本發(fā)明的ー個方面涉及經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架，其上連接有能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的多個標(biāo)記分子，其中所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架包含寡核苷酸尾，所述尾包含能夠與核酸序列雜交結(jié)合的5’磷酸基團(tuán)。在優(yōu)選的實施方案中，所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架具有約50至約350kDa的總分子量。在一些實施方案中，所述標(biāo)記分子包含ー個或多個熒光團(tuán)部分。在其它實施方案中，所述標(biāo)記分子包含ー個或多個生物素部分。在優(yōu)選的實施方案中，能夠與所述延伸序列結(jié)合的核酸序列是橋聯(lián)寡核苷酸，其還能夠雜交于與所述聚合物骨架分離并且不同的核酸分子。合在一起，所述聚合物骨架和橋聯(lián)寡核苷酸構(gòu)成了用于標(biāo)記核酸分子的系統(tǒng)。優(yōu)選地，與所述聚合物骨架分離并且不同的核酸分子是RNA分子，更為優(yōu)選的情況下是非編碼或miRNA分子。5’磷酸基團(tuán)的存在使所述聚合物骨架得以被連接 于所述RNA分子的3’末端。DNA分子也可以這種方式進(jìn)行標(biāo)記。在優(yōu)選的實施方案中，所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架是具有多個單鏈區(qū)域的線型樹狀多核苷酸組合物，所述單鏈區(qū)域可與一個或多個經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行雜交；所述線型樹狀多核苷酸組合物包含第一、第二和第三多核苷酸單體，其通過以5’-3’定向的雜交而結(jié)合在一起；各多核苷酸單體在彼此雜交結(jié)合前均具有第一、第二和第三單鏈雜交區(qū)域；并且在所述線型樹狀多核苷酸組合物中所述第一多核苷酸單體的第三單鏈雜交區(qū)域與所述第二多核苷酸單體的第一單鏈雜交區(qū)域雜交結(jié)合，并且所述第二多核苷酸單體的第三單鏈雜交區(qū)域與所述第三多核苷酸單體的第一單鏈雜交區(qū)域雜交結(jié)合，其中所述第一多核苷酸單體的第一單鏈雜交區(qū)域能夠與核酸序列雜交結(jié)合，并且其中所述線型樹狀多核苷酸組合物中的第二單鏈雜交區(qū)域與一個或多個經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行雜交結(jié)合，所述經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸包含一個或多個標(biāo)記分子。本發(fā)明的另一方面涉及用于產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子的方法，其包括a)提供具有5’和3’末端的單鏈miRNA分子；b)將寡核苷酸尾連接于所述單鏈miRNA分子的3’末端；c)提供具有正義鏈和反義鏈的部分雙鏈核酸序列，其中所述正義鏈包含核酸標(biāo)記分子，所述核酸標(biāo)記分子在其3’末端包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子，并且所述反義鏈包含單鏈3’突出端，所述突出端包含與所述寡核苷酸尾互補(bǔ)的序列；d)通過與所述3’突出端序列進(jìn)行的互補(bǔ)堿基配對而使所述部分雙鏈核酸序列與所述寡核苷酸尾退火；以及e)將所述部分雙鏈核酸序列的正義鏈的5’末端與所述寡核苷酸尾的3’末端進(jìn)行連接，由此將包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子的核酸標(biāo)記分子連接于所述miRNA分子的3’末端，從而產(chǎn)生了經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子。在一些實施方案中，所述miRNA分子被提供于總RNA來源之中，而在其它的實施方案中，所述miRNA分子被提供于富含低分子量RNA分子的RNA來源之中。所述寡核苷酸尾在優(yōu)選的情況下是使用多聚A聚合酶連接的多聚dA尾。連接優(yōu)選地使用T4DNA連接酶實施。在優(yōu)選的實施方案中，所述部分雙鏈核酸序列包含所描述的經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架和橋聯(lián)寡核苷酸，更為優(yōu)選的情況下包含上文所描述的線型樹狀多核苷酸組合物。本發(fā)明的另一個方面涉及用于對固體支持物上的miRNA反義探針進(jìn)行檢測的方法，其包括a)將其上具有包含miRNA分子的互補(bǔ)核苷酸序列的反義探針的固體支持物與經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子接觸，所述經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子通過包括以下步驟的方法制備
i)提供具有5’和3’末端的單鏈miRNA分子ii)將寡核苷酸尾連接于所述單鏈miRNA分子的3’末端；iii)提供具有正義鏈和反義鏈的部分雙鏈核酸序列，其中所述正義鏈包含核酸標(biāo)記分子，所述核酸標(biāo)記分子在其3’末端包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物，并且所述反義鏈包含單鏈3’突出端，所述突出端包含與所述寡核苷酸尾互補(bǔ)的序列；iv)通過與所述3’突出端序列進(jìn)行的互補(bǔ)堿基配對而使所述部分雙鏈核酸序列與所述寡核苷酸尾退火；以及V)將所述部分雙鏈的核酸序列的正義鏈的5’末端與所述寡核苷酸尾的3’末端進(jìn)行連接，由此將包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物的核酸標(biāo)記分子連接于所述miRNA分子的3’末端，從而產(chǎn)生了經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子；以及b)將所述固體支持物和經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子在足以使所述經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子與所述miRNA反義探針雜交的時間和溫度下進(jìn)行孵育；c)洗滌所述固體支持物以去除未雜交的經(jīng)過標(biāo)記的靶mRNA ;以及d)檢測來自所述雜交的經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子的信號，從而檢測了固體支持物上的miRNA反義探針。在一些實施方案中，所述固體支持物是平面固體支持物，諸如微陣列或微滴度板，而在其它的實施方案中，所述固體支持物是珠粒。所述miRNA探針可對成熟或前體miRNA序列均具特異性或僅對前體miRNA序列具特異性。本發(fā)明的另一個方面涉及制備用于在miRNA分析中使用的經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子的試劑盒，所述試劑盒包含具有正義鏈和反義鏈的部分雙鏈核酸序列，其中所述正義鏈包含核酸標(biāo)記分子，所述核酸標(biāo)記分子包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物，并且所述反義鏈包含單鏈3’突出端，所述突出端包含與寡核苷酸尾互補(bǔ)的序列；以及說明資料，其用于通過使用所述部分雙鏈核酸序列產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含至少一種酶，其用于將寡核苷酸尾連接于靶miRNA分子的3’末端，其中所述寡核苷酸尾與所述部分雙鏈核酸序列的單鏈3’突出端序列互補(bǔ)；以及至少一種酶，其用于將所述部分雙鏈核酸序列的正義鏈的5’末端連接于所述靶miRNA分子的3’末端。在其它的實施方案中，提供能夠發(fā)射或產(chǎn)生不同可檢測信號的多個核酸標(biāo)記分子以使雙重或多重顏色分析得以進(jìn)行。在優(yōu)選的實施方案中，所述部分雙鏈核酸序列包含上文所描述的經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架和橋聯(lián)寡核苷酸。在更為優(yōu)選的實施方案中，所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架包含上文所描述的線型樹狀多核苷酸組合物。本發(fā)明的一個方面涉及核酸標(biāo)記分子，其上連接有一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物，其中所述核酸標(biāo)記分子包含寡核苷酸延伸序列，其包含能夠與核酸序列雜交的5’磷酸基團(tuán)。在一些實施方案中，所述核酸標(biāo)記分子包含DNA并且具有約5至約250kDa的總分子量。在優(yōu)選的實施方案中，所述核酸標(biāo)記分子包含單鏈DNA寡核苷酸,其具有約2至約2. 3kDa的總分子量。在一些實施方案中，所述標(biāo)記分子包含一個或多個突光團(tuán)部分。在其它實施方案中，所述標(biāo)記分子包含一個或多個生物素部分。所述標(biāo)記分子優(yōu)選地包含I至約15個標(biāo)記分子。所述核酸標(biāo)記分子可被用于上文所述的方法和試劑盒。
附圖
簡述圖la-d合并描述了根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行的靶miRNA分子的標(biāo)記以及miRNA分子探針的檢測。圖2描述了本發(fā)明的優(yōu)選的核酸標(biāo)記分子。圖3是顯示核酸標(biāo)記分子的長度與miRNA雜交分析中的平均信號強(qiáng)度之間的相關(guān)性的圖表。圖4顯示了用于miRNA雜交分析的一步標(biāo)記過程和兩步標(biāo)記過程之間的并列比較。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于RNA微陣列分析的核酸分子、方法和試劑盒。術(shù)語“RNA分子”、“miRNA分子”、“mRNA分子”、“DNA分子”、“cDNA分子”和“核酸分子”均意在涵蓋單一分子、單一種類的多個分子以及不同種類的多個分子。術(shù)語“miRNA分子”還意在涵蓋成熟和前體miRNA分子。與微陣列術(shù)語相一致，“祀miRNA”指的是待標(biāo)記的miRNA或互補(bǔ)cDNA序列，而“miRNA探針”指的是直接連接于固體支持物的未標(biāo)記的正義或反義miRNA序列。術(shù)語“核酸標(biāo)記分子”指的是能夠連接于miRNA分子的3’末端的任意非天然的核苷酸序列，如DNA樹狀高分子，并且其包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子。本發(fā)明的方法包含將核酸標(biāo)記分子連接于至少一種miRNA分子的3’末端，所述核酸標(biāo)記分子包含能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物。所產(chǎn)生的經(jīng)過標(biāo)記的miRNA分子隨后被用于檢測連接于固體支持物的miRNA探針，從而獲得miRNA的表達(dá)特征。通過使用經(jīng)過適當(dāng)標(biāo)記的祀分子以及適當(dāng)設(shè)計的探針，可獲得所述成熟和前體miRNA表達(dá)特征。本發(fā)明的方法區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，所述現(xiàn)有技術(shù)通過熒光團(tuán)的共價連接直接標(biāo)記靶miRNA分子或?qū)雖iRNA分子進(jìn)行隨機(jī)引物結(jié)合和反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的cDNA分子,兩者均缺乏在與miRNA探針雜交后足以檢測稀少靶miRNA分子的靈敏度。本發(fā)明的方法還區(qū)別于基于PCR的標(biāo)記技術(shù)，其可向經(jīng)過標(biāo)記的靶分子群體中引入擴(kuò)增偏倚性。本發(fā)明的方法使用了分子生物學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)工藝。公開了常用分子生物學(xué)方法的基礎(chǔ)教材包括 Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001 年第 3 版)和 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (1994)。本發(fā)明的方法使用了 RNA分子來源。優(yōu)選地，所述來源富含miRNA分子。盡管通篇使用了“miRNA”和“富含”，但應(yīng)當(dāng)了解本文所公開的方法可被用于標(biāo)記具有3’末端的任意核酸分子，無論其富含與否，其包括具有經(jīng)過修飾的3’末端的RNA分子，諸如在植物和細(xì)菌中可見的經(jīng)過修飾的3’末端的RNA分子。可對任意RNA分子進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明的方法還可被拓展用以結(jié)合酶類而標(biāo)記具有可用3’末端的DNA分子，所述酶類在脫氧核糖核苷酸存在下在所述3’末端合成聚合體尾。能夠在脫氧核糖核苷酸存在下合成聚合體尾的酶的一個實例是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)。
存在用于從總RNA中富集miRNA分子的大量方法和商業(yè)試劑盒。實例包括 miRvana miRNA 分離試劑盒(Ambion, Austin, TX)、PureLink miRNA 分離試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)、mirPremier 微小 RNA 分離試劑盒(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)和 miRNeasy Mini 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA),在變性 PAGE 凝膠中進(jìn)行純化(參見，例如Miska等，Genome Biol. 5 :R68 (2004)),使用適當(dāng)大小分子量截留的濾器進(jìn)行的離心(例如，Microcon YM過濾器裝置，Millipore, Billerica, MA)，以及醋酸鈉/乙醇沉淀(參見，例如 Wang 等，Nucleic Acids Res. 32:1688 (2004)) 所述miRNA可獲自包含miRNA的任意組織或細(xì)胞來源，其包括在任意生物或環(huán)境樣品中可見的病毒顆粒、植物和動物來源。優(yōu)選地，所述來源是動物組織，更為優(yōu)選的情況下是哺乳動物組織，最為優(yōu)選的情況下是人組織。所述RNA也可使用RNA提取試劑盒從臨床FFPE樣品中純化，所述試劑盒從而如RecoverAll 總核酸分離試劑盒(Ambion，AustinTx) ο所述RNA可經(jīng)受擴(kuò)增過程。RNA擴(kuò)增試 劑盒的實例包括但不限于，SenseAMPRNA 擴(kuò)增試劑盒(Genisphere, Hatfield, PA) Λ MessageAmp RNA 擴(kuò)增試劑盒(Ambion, Austin, TX)、Ovation RNA 擴(kuò)增系統(tǒng)(NuGen Technologies, San Carlos, CA)，等
坐寸O參照圖I，單鏈寡核苷酸尾被連接于單鏈miRNA分子的3’末端(參見圖Ia)?？赏ㄟ^將核苷酸連接于單鏈RNA的任意方法并入所述寡核苷酸尾。優(yōu)選地，使用多聚(A)聚合酶(PAP)或其它適當(dāng)?shù)拿冈谶m當(dāng)?shù)暮塑账岽嬖诘那闆r下在適當(dāng)?shù)木彌_液中將所述寡核苷酸尾連接于所述單鏈cDNA。優(yōu)選地，所述寡核苷酸尾是同聚體核苷酸尾(即，多聚A、多聚G、多聚C或多聚T)。優(yōu)選地，所述寡核苷酸尾是多聚A尾，其長度一般介于約3與超過500個核苷酸之間，在優(yōu)選的情況下其長度介于約20與約100個核苷酸之間。當(dāng)使用PAP時，優(yōu)選的緩沖液是Tris-HCl，pH 8. O (或其它適當(dāng)?shù)木彌_液)，其同時包含鎂離子和錳離子。例如，所述緩沖液可包含 I 至 IOOmM Tris-HCl, pH 8. 0，I 至 20mM MgCl2 和 I 至 20mM MnCl2,以及0. 01至20mM ATP。所述加尾反應(yīng)(tailing reaction) 一般在37°C下進(jìn)行5至60分鐘。為制備經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子，通過連接反應(yīng)將包含正義鏈的部分雙鏈脫氧核酸序列連接于所述3’寡核苷酸尾，所述正義鏈包含核酸標(biāo)記分子，所述核酸標(biāo)記分子在其3’末端包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物(參見圖Ib)。這通過所述3’寡核苷酸尾與所述部分雙鏈的脫氧核酸序列的反義鏈3’末端的突出端序列之間的互補(bǔ)堿基配對而促進(jìn)，所述突出端序列包含與所述寡核苷酸尾互補(bǔ)的脫氧核苷酸序列。例如，如果所述寡核苷酸尾是多聚A尾，所述部分雙鏈的脫氧核酸序列的3’突出端應(yīng)在其3’末端包含脫氧胸苷序列，其長度一般介于約3與超過50個核苷酸之間，在優(yōu)選的情況下長度介于約10與約30個核苷酸之間。對于被認(rèn)為是彼此互補(bǔ)的序列，所述3’突出端序列的特定核苷酸序列并非必須與所述3’寡核苷酸尾的特定核苷酸序列完全(即，100%)互補(bǔ)，所述3’突出端序列的長度亦非必須完全等于所述3’寡核苷酸尾的長度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，全部所需的是在所述兩種序列之間存在充足的互補(bǔ)性以使所述3’突出端可與所述3’寡核苷酸尾退火，由此而將所述捕獲序列適當(dāng)?shù)囟ㄎ挥谒鰉iRNA分子的3’末端?！┍贿m當(dāng)?shù)囟ㄎ?所述核酸標(biāo)記分子通過連接反應(yīng)被連接于所述3’寡核苷酸尾。這些突出端或“交錯(staggered)”連接反應(yīng)比平端連接反應(yīng)更為有效并且可以在更高的溫度下進(jìn)行。此外，寡聚脫氧核苷酸尾的使用實現(xiàn)了脫氧核酸標(biāo)記分子DNA與所述DNA尾的連接，這比DNA與miRNA的直接連接更為有效。在所述連接反應(yīng)中可使用任意DNA連接酶。優(yōu)選地，所述DNA連接酶是T4DNA連接酶。當(dāng)使用T4DNA連接酶時，優(yōu)選的緩沖液是1/10 稀釋的 10X 連接緩沖液(660mM Tris-HCl,pH 7. 5,50mM MgCl，IOmM DTT，IOmM ATP)，其由Roche Applied Science, Indianapolis, IN提供。所述反應(yīng)優(yōu)選地通過加入EDTA而終止。如上所述，所述miRNA分子的加尾和所述尾與所述標(biāo)記分子的連接反應(yīng)在獨立的反應(yīng)中實施，或者在單一反應(yīng)混合物中實施。這樣的“一步”過程析之間的重現(xiàn)性。所述單一反應(yīng)混合物一般在18-37°C下孵育30-45分鐘。在所述連接反應(yīng)中使用的核酸標(biāo)記分子優(yōu)選地是經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架，其上連接有能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的多個標(biāo)記分子。所述骨架還包含寡核苷酸延伸序列，所述延伸序列包含5’磷酸基團(tuán)以用于與所述3’加尾的miRNA分子的連接(參見圖lb)。所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架可以是其上可連接標(biāo)記分子的任意聚合物，如蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物、多糖、脂類、脂肪酸、核酸等。所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架的總分子量在優(yōu)選的情況下為約50至約350kDa。所述聚合物骨架在優(yōu)選的情況下包含約2-100個標(biāo)記分子，其被間隔分離以使沉默被降低或消除和/或?qū)崿F(xiàn)對大檢測分子(如，鏈霉親和素)的接近。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)已有文獻(xiàn)測定所述標(biāo)記分子的適當(dāng)間隔。例如，美國專利第 6，762，292號、第6，072，043號和第6，046，038號描述了用于對熒光標(biāo)記分子與核酸骨架的連接的最佳間隔進(jìn)行測定的方法。一般情況下，在核酸骨架中所述標(biāo)記分子至少分離IOnt的間隔是足夠的?？蓳?jù)此而測定其它類型的骨架中的間隔。圖2描述了本發(fā)明的優(yōu)選的經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架。所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架包含具有5’磷酸基團(tuán)的寡核苷酸延伸序列，其能夠與核酸序列雜交結(jié)合。在本實施方案中，所述核酸序列是圖2中所示的橋聯(lián)寡核苷酸，其5’部分與所述聚合物骨架的寡核苷酸尾互補(bǔ)，并且其3’部分與所述miRNA分子的3’寡核苷酸尾互補(bǔ)。合在一起，所述聚合物骨架和橋聯(lián)寡核苷酸構(gòu)成了用于標(biāo)記所述miRNA分子的系統(tǒng)。所述寡核苷酸尾的5’磷酸基團(tuán)使所述聚合物骨架得以連接于所述miRNA分子。在所述連接反應(yīng)期間，所述橋聯(lián)寡核苷酸一般對于所述聚合物骨架的寡核苷酸尾是摩爾過量的，在優(yōu)選的情況下約I. 8-2. 6倍摩爾過量。所述雜交橋聯(lián)寡核苷酸/聚合物骨架寡核苷酸尾合并形成了上文所描述的部分雙鏈脫氧核酸序列，由此而構(gòu)成了用于標(biāo)記所述miRNA分子的系統(tǒng)。此外，應(yīng)當(dāng)了解在圖2中所示的序列僅為示例性的，并且能夠雜交的任意序列均可使用。在優(yōu)選的實施方案中，所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架是小線型樹狀多核苷酸組合物，其包含20-1000個核酸堿基，更為優(yōu)選的情況下包含300-750個核酸堿基，并且包含一個可連接末端和10-15個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子。根據(jù)上文所討論，所述可連接末端具有5’磷酸，其可被連接于所述加尾的miRNA分子。在一些實施方案中，所述線型樹狀多核苷酸組合物是小3DNA Dendrimer Capture Reagent (GenisphereInc.，Hatfield, Pa.)。樹狀高分子是高度分支化的核酸分子，在其表面包含兩種類型的單鏈雜交“臂”以用于標(biāo)記分子和捕獲序列的連接。由于單一的樹狀高分子均可具有各類型的多個臂，因此通過雜交所獲得的信號被大大增強(qiáng)。使用樹狀高分子試劑進(jìn)行的信號增強(qiáng)被描述于 Nilsen 等,J. Theor. Biol. 187:273 (1997) ；Stears 等,Physiol. Genomics3:93 (2000);美國專利第 5，175，270 號、第 5，484，904 號、第 5，487，973 號、第 6，072，043 號、第6，110，687號和第6，117，631號；以及美國專利公開第2002/0051981號。使用最佳設(shè)計的樹狀高分子使得所述標(biāo)記分子被放置以降低或消除沉默。此外，在所述標(biāo)記分子中的信號可被擴(kuò)增或增強(qiáng)而不對所述靶核酸分子自身進(jìn)行引入偏倚性的擴(kuò)增。
所述線型樹狀多核苷酸組合物可包含第一、第二和第三多核苷酸單體，其通過以5’ _3’定向的雜交而結(jié)合在一起，各多核苷酸單體在彼此雜交結(jié)合前均具有第一、第二和第三單鏈雜交區(qū)域。所述第一多核苷酸單體的第三單鏈雜交區(qū)域與所述第二多核苷酸單體的第一單鏈雜交區(qū)域雜交結(jié)合，并且所述第二多核苷酸單體的第三單鏈雜交區(qū)域與所述第三多核苷酸單體的第一單鏈雜交區(qū)域雜交結(jié)合。所述線型樹狀多核苷酸組合物的第一多核苷酸單體的第一單鏈雜交區(qū)域被設(shè)計用于與核酸序列雜交結(jié)合。當(dāng)用于本文所述的標(biāo)記方法中時，所述核酸序列是圖2中所示的橋聯(lián)寡核苷酸序列，其用于將所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架連接于所述3’加寡核苷酸尾的miRNA分子。 用于組裝所述線型樹狀多核苷酸組合物的各個多核苷酸單體中的所述第二單鏈雜交區(qū)域均被設(shè)計用于與一個或多個經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸雜交結(jié)合。所述經(jīng)過標(biāo)記寡核苷酸包含一個或多個標(biāo)記分子。優(yōu)選地，所述第三多核苷酸單體的第三單鏈雜交區(qū)域還與或多個經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸雜交結(jié)合。所述經(jīng)過標(biāo)記的線型樹狀多核苷酸組合物優(yōu)選地在組裝之后使用例如補(bǔ)骨脂化學(xué)反應(yīng)這樣的方法被交聯(lián)。在其它的實施方案中，所述核酸標(biāo)記分子(亦稱為核酸標(biāo)記試劑)是多核苷酸，其上連接有一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子，其中所述核酸標(biāo)記分子包含寡核苷酸延伸序列，其包含能夠與核酸序列雜交的5’磷酸基團(tuán)。在優(yōu)選的實施方案中，所述核酸標(biāo)記分子包含DNA并且具有約5至約250kDa的總分子量。所述標(biāo)記分子優(yōu)選地包含I至約15個標(biāo)記分子。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述核酸標(biāo)記分子包含單鏈DNA寡核苷酸，其不計所述標(biāo)記分子情況下具有高至約為5kDa的總分子量并且在其3’末端包含單一標(biāo)記分子。在其它的實施方案中，所述單鏈DNA寡核苷酸的分子量是約2至約2. 3kDa，不計任何標(biāo)記分子。所述核酸標(biāo)記分子上的標(biāo)記分子可以是能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的任意分子。這些分子包括，直接發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的分子，諸如放射活性分子、熒光分子和化學(xué)反光分子，以及用于比色分析的酶類，諸如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和半乳糖苷酶。這些分子還包括并不直接產(chǎn)生可檢測信號但結(jié)合于產(chǎn)生可檢測信號的系統(tǒng)的分子，諸如生物素/鏈霉親和素、抗原/抗體和其它半抗原組合。優(yōu)選地，所述信號產(chǎn)生分子是直接發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的分子，更為優(yōu)選的情況下是熒光團(tuán)，最為優(yōu)選的情況下是Cy3或 Cy5 染料(GE Healthcare, Piscataway, NJ)、0yster!<-550或C)yStei,.R-650染料(DenovoBiolabels, Miinster, Germany)或其它適當(dāng)?shù)娜玖?，諸如 Alexa Fluor 555 或 647 染料(Molecular Probes, Eugene, OR)。使用標(biāo)記分子制備經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸在本領(lǐng)域中是為人所熟知的。所述經(jīng)過標(biāo)記的miRNA分子隨后與包含miRNA探針的固體支持物(參見圖Ic)接觸。根據(jù)本文所述，“固體支持物”意在包括任意包含核酸探針的固體支持物，其包括載片、芯片、膜、珠粒和微滴度板。用于將miRNA探針連接于固體支持物的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(參見，例如 Babak 等，RNA 10:1813 (2004) ;Calin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA101:11755(2004) ;Liu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9740(2004) ;Miska 等，GenomeBiol. 5: R68 (2004) ；Sioud 和 R0Sok, BioTechniques 37:574 (2004) ；Krichevsky 等，RNA9:1274(2003))。或者，平面和珠粒形式的miRNA微陣列均可購自，例如Invitrogen,Carlsbad, CA(NCode miRNA Microarray)、Exiqon, Woburn, MA (miRCURY miRNA Array)、CombiMatrix, Mukilteo, WA(miRNA CustomArray )和 Luminex, Austin, TX (FlexmiR miRNA Panel)。所述經(jīng)過標(biāo)記的miRNA分子也可被用于酶聯(lián)寡聚吸附分析(enzyme-linkedoligosorbent assays) (ELOSA)。針對經(jīng)過標(biāo)記的祀miRNA分子的情況,所述固體支持物應(yīng)包含反義miRNA探針。所述探針可被設(shè)計用于同時檢測成熟和前體miRNA序列，或者所述探針可對于前體miRNA序列具有特異性。進(jìn)行比較可給出所述前體和成熟序列的特征。可使用已知的miRNA和前體miRNA序列而設(shè)計miRNA探針，所述miRNA和前體miRNA序列可公開獲得于，例如 miRBase Sequence Database(http://microma. sanger. ac. uk/sequences, The WellcomeTrust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, UK(Griffiths-Jones 等，Nucleic Acids. Res. 34:D140 (2006)。新 miRNA 序列也可被用于設(shè)計 miRNA 探針并且其可使用計算方法進(jìn)行鑒定(參見，例如Ambros等，Curr. Biol. 13:807 (2003)；Grad 等，Mol. Cellll; 1253(2003) ;Lai 等，Genome Biol. 4:R42 (2003) ;Lim 等，Genes &Dev. 17:991(2003) ;Lim 等，Science 299:1540(2003))或使用 miRNA 克隆策略進(jìn)行鑒定(參見，例如 Wang 等，Nucleic Acids Res. 32:1688 (2004) ;Lagos_Quintana 等，Science294:853(2001) ;Lau 等，Science294:858 (2001) ;Lee 等，Science 294:862 (2001))，其為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。所述固體支持物和所述經(jīng)過標(biāo)記的miRNA分子被孵育于雜交緩沖液中，所孵育的時間和溫度足以使所述經(jīng)過標(biāo)記的miRNA分子與所述miRNA探針雜交。適當(dāng)?shù)幕陉嚵械碾s交緩沖液包括2X基于SDS的緩沖液(2XSSC，4XDenhardt氏溶液，1%SDS，0. 5M憐酸鈉，2mM EDTA, ρΗ8· 0)以及 2Χ 增強(qiáng)雜交緩沖液(Enhanced Hybridization Buffer)(ExpressHyb , BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA),其使用無核酸酶的水稀釋至75%。適當(dāng)?shù)幕谥榱５姆治鼍彌_液包含4-4. 5M TMAC、5-15%去離子甲酰胺、0. 1_2%BSA、0. 25-lmg/ml 鮭魚精 DNA。優(yōu)選地，所述固體支持物和所述經(jīng)捕獲序列標(biāo)記的核酸分子被孵育約0. 5-72小時，優(yōu)選地為18-24小時，孵育在約25-65°C下進(jìn)行，優(yōu)選地為在45-65°C下進(jìn)行?？赏ㄟ^在預(yù)暖于25-60°C下，優(yōu)選地預(yù)暖于50-55°C下的2XSSC，0. 2%SDS洗滌緩沖液中洗滌15分鐘，室溫下在2X SSC中洗滌10-15分鐘，并且在室溫下在0. 2X SSC中洗滌10-15分鐘而去除過量的未雜交的經(jīng)過標(biāo)記的miRNA分子。所述固體支持物隨后受到分析，一般通過掃描進(jìn)行(參見圖id)。基于微陣列的分析可使用適當(dāng)?shù)膬x器進(jìn)行分析，諸如配以GenePix Pro 3· O 軟件的 GenePix ' 4000Β 微陣列掃描儀(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)或 ScanArray 5000 (PerkinElmer, Waltham, MA)。基于珠粒的分析可使用 LuminexCorporation (Austin, TX)提供的儀器和軟件和本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的類似設(shè)備進(jìn)行分析。本發(fā)明的方法和試劑可方便地以試劑盒的形式進(jìn)行包裝。這些試劑盒可被用于多種研究和診斷應(yīng)用。例如，本發(fā)明的方法和試劑盒可被用于促進(jìn)在不同細(xì)胞或組織、相同細(xì)胞或組織的不同亞群體、相同細(xì)胞或組織的不同生理狀態(tài)、相同細(xì)胞或組織的不同發(fā)育階段或相同組織的不同細(xì)胞群體中進(jìn)行的對一種或多種miRNA表達(dá)的比較性分析。這些分析可揭示miRNA表達(dá)水平上的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，根據(jù)受分析的細(xì)胞或組織，所述差異可隨后被用于促進(jìn)多種疾病狀態(tài)的診斷、疾病發(fā)展的預(yù)后以及對疾病治療目標(biāo)的甄別。
根據(jù)本發(fā)明可制備廣泛多種的試劑盒。例如，用于制備經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子的試劑盒可包括部分雙鏈核酸序列，其具有正義鏈和反義鏈，其中所述正義鏈包含核酸標(biāo)記分子，所述核酸標(biāo)記分子包含一個或多個發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物，并且所述反義鏈包含單鏈3’突出端，所述突出端包含與所述寡核苷酸尾互補(bǔ)的序列；以及說明資料，其用于通過使用所述部分雙鏈的核酸序列產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子。在優(yōu)選的實施方案中，所述部分雙鏈的核酸序列包含上文所描述的經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架和橋聯(lián)寡核苷酸。在其它優(yōu)選的實施方案中，所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架是上文描述的線型樹狀多核苷酸組合物。雖然所述說明資料一般包含書面或打印資料，但它們并不限于這些。本發(fā)明涵蓋了能夠存儲這些說明并使其傳達(dá)給終端用戶的任何媒介。這些媒介包括但不限于，電子存儲介質(zhì)(如，磁盤、磁帶、磁片盒、芯片)、光儲介質(zhì)(如，CD ROM)等等。這些媒介可包含提供這些說明資料的互聯(lián)網(wǎng)站的網(wǎng)址。所述試劑盒還可包含以下一種或多種用于制備本發(fā)明的經(jīng)過標(biāo)記的miRNA分子的組分或試劑=RNA酶抑制劑；用于將寡核苷酸尾連接于單鏈RNA分子的酶(如，多聚(A)聚合酶)；用于將寡核苷酸尾連接于單鏈DNA分子的酶(如，TdT);反轉(zhuǎn)錄酶；以及用于將所述部分雙鏈的核酸序列連接于所述寡核苷酸尾的酶(如，T4DNA連接酶)。所述試劑盒還可包含在miRNA分析中應(yīng)用所述經(jīng)過標(biāo)記的miRNA所需的組分和試劑以及說明資料，其包括雜交和洗滌溶液、孵育容器、蓋玻片，以及多種信號檢測用、信號產(chǎn)生用、信號增強(qiáng)用和細(xì)胞保存用試劑。此外，所述試劑盒可包括緩沖液、核苷酸、鹽類、無RNA酶水、容器、玻瓶、反應(yīng)管等等，這些與本發(fā)明的經(jīng)過標(biāo)記的miRNA分子的制備和應(yīng)用相匹配。所述成分和試劑可以提供于具有適當(dāng)?shù)膬Υ娼橘|(zhì)的編號容器中。根據(jù)本發(fā)明的方法的特定實施方案在此被描述于以下實施例中。所述實施例僅為說明性的，并且并非意在以任何方式對本發(fā)明的其它部分進(jìn)行限制。
實施例實施例I總RNA中的miRNA分子的標(biāo)記以及與反義miRNA探針的雜交線型樹狀多核苷酸核酸標(biāo)記分子的制備根據(jù)上文所述制備了三聚線型樹狀多核苷酸核酸標(biāo)記分子。所述標(biāo)記分子具有165kDa的分子量，包含間隔為10-15nt的15個熒光團(tuán)部分并且在組裝之后使用三甲沙林在UV-A存在下進(jìn)行交聯(lián)。所述標(biāo)記分子包含圖2中所示的5’磷酸化寡核苷酸延伸序列(5，-TTC AGT AAT ATG CCS1 ；SEQ ID NO: I)。使用MicroconliYM-30微濃縮管，根據(jù)廠商(Millipore, Billerica, MA)說明來純化所述經(jīng)過UV照射的制劑。包含所述線型樹狀多核苷酸核酸標(biāo)記分子的連接混合物的制備42μ I的所述純化標(biāo)記分子(2，380ng/yl)結(jié)合12. 3 μ I圖2所示的橋聯(lián)寡核苷酸(904ng/μ I) (5，-GGC ATA TTA CTG AAT TTT TTT TTT T-3/ ；SEQ ID NO: 2)和35 μ I IOX 連接緩沖液(660mM Tris-HCl, pH 7. 5,50mM MgCl，IOmM DTT, IOmM ATP ；RocheApplied Science, Indianapolis, IN),最終體積為210μ I。所述橋聯(lián)寡核苷酸被設(shè)計用以 同時與圖2所示的5’ -磷酸化寡核苷酸延伸序列和下文所述的3’多聚A加尾的miRNA分子雜交結(jié)合，這使得所述標(biāo)記分子和所述加尾miRNA分子連接在一起。在O. 30L水浴中加熱所述混合物至60°C持續(xù)10分鐘，所述水浴在I升的燒杯之中加以制備。隨后將盛有所述連接混合物的燒杯冷卻至室溫。加入140 μ I的IOX連接緩沖液并且所述試管通過振蕩進(jìn)行混合。隨后將所述混合物儲存于_20°C下直至使用。miRNA分子的加尾I. 5 μ g大鼠腦總RNA和I. 5 μ g大鼠肝臟總RNA (Ambion, Austin, TX)被分別使用無核酸酶水溶至 ο μ I。通過加入I. 5μ I IOX反應(yīng)緩沖液(50mMTr i S-HCl，pH 8. O, IOmMMgCl2)、I. 5 μ I 25mM MnCl2U μ I 0. 02mM ATP 和 I μ I 多聚 A 聚合酶(5U/ μ I)并且在 37°C下加熱15分鐘而對所述總RNA進(jìn)行了多聚A加尾。miRNA 的連接通過加入4 μ I的所述連接混合物和2 μ I T4DNA連接酶(2U/ μ I)并且在室溫下孵育30分鐘而對所述多聚A加尾的RNA分子進(jìn)行了連接。通過加入2. 5 μ I終止溶液(O. 25ΜEDTA)而終止反應(yīng)。所述大鼠腦RNA被連接于包含()yster'R-550標(biāo)記分子的樹狀高分子，所
述大鼠肺RNA被連接于包含0yste/-650標(biāo)記分子的樹狀高分子。經(jīng)過標(biāo)記的miRNA的微陣列雜交在制備微陣列雜交混合物之前融化并重懸2 X增強(qiáng)雜交緩沖液(使用無核酸酶水將 ExpressHyb 緩沖液(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)稀釋至 75%)。所述經(jīng)過標(biāo)記的RNA分子結(jié)合5 μ I 10%BSA和2 X增強(qiáng)雜交緩沖液直至終濃度為I X。所述雜交混合物被施用于NCode 微陣列(Invitrogen, Carlsbad, CA),以玻璃蓋片覆蓋并且在52°C下孵育過夜。對于單色分析，僅僅一種經(jīng)過標(biāo)記miRNA群體被包含于所述選定雜交混合物中，其余的體積由無核酸酶水構(gòu)成。通過在預(yù)暖于52°C下的2 X SSC, O. 2%SDS洗滌緩沖液中洗滌所述微陣列而除去所述蓋片。所述微陣列依次在預(yù)暖于52°C下的2 X SSC, O. 2%SDS洗滌緩沖液中洗滌15分鐘，在室溫下的2 X SSC中洗滌10-15分鐘，并且在室溫下O. 2 X SSC中洗滌10-15分鐘。所述微陣列被轉(zhuǎn)移至干燥的50mL離心管內(nèi)，調(diào)整載片以使任何粘性條碼或標(biāo)記處于所述離心管下部。包含所述微陣列的離心管立即在無蓋情況下以800-1000RPM進(jìn)行離心以干燥所述微陣列。從所述離心管中去除所述微陣列，小心勿接觸所述微陣列表面。使用配以GenePix*Pro 3. O 軟件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)的GenePix* 4000B 微陣列掃描儀對所述陣列進(jìn)行所描，由此而產(chǎn)生了所述原始樣品內(nèi)所述miRNA序列的表達(dá)特征。對腦和肝臟特征進(jìn)行比較以確立多種miRNA的差異特征。miR122被觀察到主要存在于肝臟中并且miR124a和miR9主要存在于腦中。miR16和miRlet7a_f以及其它miRNA在腦和肝臟均有表達(dá)但是顯示了組織特異性特征。實施例2富集RNA中的miRNA分子的標(biāo)記以及與反義miRNA探針的雜交除所述大鼠腦總RNA和大鼠肝臟總RNA在微陣列雜交之前進(jìn)行了對低分子量RNA的富集處理之外，遵循了實施例I中的程序。I. 5μ g大鼠腦總RNA和大鼠肝臟總RNA以IOmM Tris, pH 8. O分別稀釋至100 μ 1，加熱至80°C持續(xù)3分鐘，并在冰上冷卻。對于各RNA 樣品，Microcon1' YM-100 微濃縮管(Millipore, Billerica, MA)通過加入 δ0 μ I IOmMTris,pH 8. O并且在13，OOORPM下離心3分鐘進(jìn)行了預(yù)濕處理。將濃縮柱置入新的收集管內(nèi)并各加入100 μ I樣品并在13，000RPM下離心7分鐘。包含低分子量RNA分子的各穿流物(約 95 μ I)使用Microcon Κ'ΥΜ-3 微濃縮管(Millipore, Billerica, MA)通過 13，000RPM下離心30分鐘而進(jìn)行了濃縮。隨后向各樣品儲池中加入5μ I的IOmM Tris, pH 8. O并且通過彈擊所述濃縮柱的側(cè)壁進(jìn)行輕柔混合。各樣品儲池被隨后倒置放入新的收集管內(nèi)并且在13，000RPM下離心3分鐘以收集所述濃縮富集RNA(回收約5_10 μ I)。隨后使用無核酸酶水將各富集RNA樣品調(diào)至10 μ I。根據(jù)上文對所述富集RNA分子進(jìn)行多 聚A加尾、連接并且與NCode 微陣列雜交。在雜交之后，根據(jù)上文洗滌并掃描所述陣列，由此而產(chǎn)生了所述原始樣品中的miRNA序列表達(dá)特征。當(dāng)將來自實施例I的數(shù)據(jù)(總RNAlog2 (肝臟/腦))和實施例2的數(shù)據(jù)(富集RNA log2(肝臟/腦))進(jìn)行比較時，觀察到了 O. 933的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。實施例3ELOSA平板涂覆Co StarK (Coming, Lowell1MA)微滴度板通過向各孔中加入IXPBS中的100 μ I1μ g/mL 人 miR122 反義 DNA 寡核苷酸(5，-CAA ACA CCA TTG TCA CAC TCC A-3’ ；SEQ IDNO: 3)而進(jìn)行涂覆。所述平板使用微平板壓封膜(PerkinElmer, Waltham, MA)進(jìn)行覆蓋并且在室溫下被孵育過夜。隨后使用I XPBS，0. 05%Tween-20洗滌所述平板2次并且吸干。平板封閉和miRNA標(biāo)記向各孔中加入處于IXPBS中的200 μ I 4%BSA。平板被覆蓋并且在室溫下被孵育
1-2小時。在所述平板封閉期間，對總RNA和富集RNA中的miRNA分子進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)上文實施例2中所述，使用Microcon YM-100微濃縮管(Millipore，Billerica，MA)并繼之以使用Microcon YM-3 微濃縮管(Millipore, Billerica, MA)進(jìn)行濃縮而從 I μ g、0. 75 μ g、0. 5 μ g和0. 25 μ g大鼠肝臟總RNA中(Ambion, Austin, TX)富集低分子量RNA。所述富集RNA樣品，以及I μ g、0. 75 μ g、0. 5 μ g和0. 25 μ g大鼠肝臟總RNA根據(jù)上文實施例I所述進(jìn)行多聚A加尾。通過加入4 μ I的連接混合物和2 μ I T4DNA連接酶(2U/ μ I)并且在室溫下孵育30分鐘而對所述加尾的RNA分子進(jìn)行了連接。除所述線型樹狀多核苷酸核酸標(biāo)記分子包含生物素部分而非熒光團(tuán)部分之外，所述連接混合物類似于實施例I中的連接混合物。通過加入2. 5 μ I終止溶液(0. 25Μ EDTA)終止反應(yīng)以產(chǎn)生23. 5 μ I的生物素化RNA。封閉完成之后，使用I XPBS，0. 05%Tween-20洗滌所述平板2次并且吸干。樣品雜交向各23. 5 μ I的生物素化RNA樣品中加入19 μ I TMAC溶液(4. 5ΜTMAC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 75mM Tris, pH 8，0.15% 十二 烷基肌氨酸鈉(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO),6mM EDTA(Ambion, Austin, TX),26 μ I 去離子甲酸胺(EMD, Gibbstown, NJ)，5 μ I 10%BSA和I. 5 μ I無核酸酶水，終體積為75 μ I。各樣品被輕柔混合、離心并且施用于經(jīng)過涂覆的封閉孔內(nèi)。所述樣品在室溫下于所述平板內(nèi)進(jìn)行3-4小時雜交。雜交之后，所述平板首先使用預(yù)暖于52°C下的2XSSC，0. 2%SDS洗滌緩沖液洗滌2次，隨后使用2 X SSC在室溫下洗滌2次，并且隨后使用0. 2 X SSC在室溫下洗滌2次。鏈霉親和素-HRP雜交
根據(jù)制造商的建議，使用I XPBS 中的 4%BSA(Equitech_Bio, Kerrville, TX)稀釋鏈霉親和素-HRP(SA-HRP, R&D Systems, Minneapolis, MN)。向各孔內(nèi)加入 50 μ I 稀釋的SA-HRP并且所述平板在室溫下通過輕柔振蕩被孵育I小時。隨后使用1XPBS，O. 05%Tween-20洗滌所述平板2-4次并且吸干。信號顯色向各孔內(nèi)加入100 μ I TMB底物(Pierce, Rockford, IL)并在室溫下孵育所述平板
I至 15 分鐘。向各孔內(nèi)加入 100 μ I BioSource 終止緩沖液(Invitrogen, Carlsbad, CA)。在 Victor3 Multilabel Plate Reader (PerkinElmer, Waltham, MA)上在 450nm 下讀取吸收值。對于富集RNA和總RNA均觀察到輸入RNA和觀察到信號之間的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為O. 985和O. 973。miR122的檢測限度測定為低于O. 25 μ g富集miRNA或總RNA的總量RNA。實施例4 miRNA分子的Luminex珠粒檢測來自大鼠腦和肝臟的總RNA樣品(Ambion, Austin, TX)經(jīng)過多聚A加尾并且根據(jù)上文實施例3所描述與生物素化樹狀多核苷酸核酸標(biāo)記分子連接。包含不同量的兩種熒光染料以通過所述兩種熒光染料的比率而實現(xiàn)珠粒類型之間的辨別的多種Luminex牌羧化微珠粒制備物(Luminex, Austin, TX)通過Luminex程序被共價連接于多種胺化22聚體反義miRNA探針(IDT technologies),其對應(yīng)于選定的成熟大鼠miRNA序列(miRBaseSequence Database ；http://microma. sanger. ac. uk/sequences)。為進(jìn)行設(shè)計用于同時檢測多種miRNA特異性的多個檢測分析，17 μ I的經(jīng)過連接的RNA樣品被加入包含于33 μ I緩沖液中的多種Luminex珠粒類型的多個組合之內(nèi)，所述緩沖液包含10%甲酰胺、4. 5M TMAC,0. 1%BSA以及25ng/ μ I鮭魚精DNA。在47°C下將所述珠粒-RNA混合物在500 μ I聚丙烯管內(nèi)伴以300RPM下的水平攪拌而孵育過夜。所述珠粒被轉(zhuǎn)移至濾器微平板內(nèi)并且使用預(yù)暖至56°C的2XSSC，20%甲酰胺通過真空抽濾進(jìn)行洗滌，隨后使用2XSSC、0. 2 X SSC和IXPBS在室溫下進(jìn)行洗滌。IXPBS中(2ng/yl)的100 μ I鏈霉親和素藻紅蛋白偶聯(lián)物(Invitrogen, Carlsbad, CA)被加至各個珠?；旌衔镏胁⑶以?7°C下伴以300RPM的攪拌被孵育30分鐘。所述珠粒以I XPBS洗滌三次，重懸浮于125 μ I IXPBS之中并且在Luminex100IS系統(tǒng)上根據(jù)制造商的建議進(jìn)行分析。特異性miRNA探針的平均熒光強(qiáng)度(MFI)值2X于背景值顯示了在所述經(jīng)過連接的RNA制備物內(nèi)對miRNA分子的特異性檢出。所述腦和肝臟miRNA特征與實施例I和2中的miRNA陣列所觀察到的結(jié)果進(jìn)行比較。對于在所述Luminex平臺上測試的所有miRNA，均在平臺間觀察到了類似的肝臟/腦特征。實施例5用于直接標(biāo)記祀miRNA分子以與反義miRNA探針進(jìn)行雜交的試劑盒用于經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子的制備和微陣列雜交的試劑盒以下列組分進(jìn)行組裝0ystep-550和650連接混合物(250ng/ μ I線型樹狀多核苷酸組合物和31. 7ng/μ I 橋聯(lián)寡核苷酸)(Genisphere, Hatfield, PA)；10X 反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl, pH 8. O, IOmM MgCl2)MnCl2 (25mM)；
ATP 混合物(IOmM);多聚A聚合酶(5υ/μ I);2 X 基于 SDS 的雜交緩沖液(2 X SSC，4 X Denhardt 氏溶液，1%SDS，0. 5M磷酸鈉，2mMEDTA,pH 8.O)；2X增強(qiáng)雜交緩沖液(以無核酸酶水預(yù)稀釋至75%的ExpressHyb 緩沖液(BDBiosciences Clontech, Palo Alto, CA))；T4DNA 連接酶(2υ/μ I)；以及無核酸酶水。這些組分被置于編號的瓶中并且置于具有打印說明手冊的容器內(nèi)，所述手冊用于通過所述試劑盒的組分進(jìn)行經(jīng)過標(biāo)記的靶miRNA分子的制備和微陣列雜交。實施例6總RNA中的miRNA分子的標(biāo)記以及與反義miRNA探針的雜交線型樹狀多核苷酸核酸標(biāo)記分子的制備根據(jù)上文所述通過將一種或多種生物素化寡核苷酸在包含緩沖劑(IOmMTris-HCl, pH 8.0)和鹽(IOOmM NaCl)的溶液內(nèi)進(jìn)行結(jié)合而制備多核苷酸核酸標(biāo)記分子。所述標(biāo)記多核苷酸分子具有5-250kDa的分子量(不計任何標(biāo)記分子)，并且包含I至15個標(biāo)記分子(生物素或熒光團(tuán)染料)。熒光團(tuán)部分以10_15nt的間隔被置入。標(biāo)記多核苷酸在組裝之后使用三甲沙林在UV-A存在下進(jìn)行交聯(lián)。所述標(biāo)記分子包含圖2中所示的5’磷酸化寡核苷酸延伸序列(5，-TTC AGT AAT ATG CC-3' ；SEQ ID NO: I)。使用Microcon YM-30微濃縮管根據(jù)廠商(Millipore，Billerica, MA)說明來純化所述UV照射制劑。包含所述線型樹狀多核苷酸核酸標(biāo)記分子的連接混合物的制備純化的標(biāo)記分子結(jié)合圖2中所示的橋聯(lián)寡核苷酸(5’-GGC ATA TTA CTG AATTTT TTT TTT T-3’ ；SEQ ID NO:2)和 35 μ I IOX 連接緩沖液(660mM Tris-HCl, pH 7· 5，50mM MgCl, IOmM DTT, IOmM ATP ；Roche Applied Science, Indianapolis, IN),最終體積為210 μ I。使用相對于所述標(biāo)記多核苷酸摩爾過量的所述橋聯(lián)寡聚物。所述橋聯(lián)寡核苷酸被設(shè)計用以同時與圖2所示的5’ -磷酸化寡核苷酸延伸序列和下文所述的3’多聚A加尾的miRNA分子雜交結(jié)合,這使得所述標(biāo)記分子和所述加尾miRNA分子連接在一起。在0. 30L水浴中加熱所述混合物至60°C持續(xù)10分鐘，所述水浴在I升的燒杯之中加以制備。隨后將盛有所述連接混合物的燒杯冷卻至室溫。加入140 μ I的10Χ連接緩沖液并且所述試管通過振蕩進(jìn)行混合。隨后將所述混合物儲存于_20°C下直至使用。miRNA分子加尾和連接的兩步過程Iyg大鼠腦總RNA和I μ g大鼠肝臟總RNA(Ambion, Austin, TX)被分別使用無核酸酶水溶至10 μ I。通過加入1.5μ I 10Χ反應(yīng)緩沖液(50mMTr i s-HCl，pH 8. O, IOmMMgCl2)、I. 5 μ I 25mM MnCl2U μ I 0. 02mM ATP 和 I μ I 多聚 A 聚合酶(5U/ μ I)并且在 37°C下加熱15分鐘而對所述總RNA進(jìn)行了多聚A加尾。通過加入4 μ I的所述連接混合物和2 μ I T4DNA連接酶(2U/ μ I)并且在室溫下孵育30分鐘而對所述多聚A加尾的RNA分子進(jìn)行了連接。通過加入2. 5 μ I終止溶液(0. 25ΜEDTA)而終止反應(yīng)。所述大鼠腦RNA被連接于包含Oysterii-SSO標(biāo)記分子的樹狀高分子，所述大鼠肺RNA被連接于包含Oysteri^SO標(biāo)記分子的樹狀高分子。、
一步過程I μ g大鼠腦總RNA和I μ g大鼠肝臟總RNA (Ambion, Austin, TX)被分別使用10 μ I無核酸酶水溶至10 μ I。所述總RNA通過加入I. 5 μ I 25mM MnCl2,4 μ I所述連接混合物、
2μ I T4DNA連接酶(2U/ μ I)和I μ I多聚A聚合酶(5U/ μ I)并且在25-37°C下孵育45分鐘而進(jìn)行標(biāo)記。通過加入2. 5μ I終止溶液(O. 25Μ EDTA)而終止反應(yīng)。與所述兩步過程相同，所述大鼠腦RNA被連接于包含OysterR-550標(biāo)記分子的樹狀高分子，所述大鼠肺RNA被連接于包含OysteZ-650標(biāo)記分子的樹狀高分子。熒光標(biāo)記miRNA的微陣列雜交在制備微陣列雜交混合物之前融化并重懸2 X增強(qiáng)雜交緩沖液(使用無核酸酶水稀釋 ExpressHyb 緩沖液(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)至 75%)。所述經(jīng)過標(biāo)記的RNA分子結(jié)合5 μ I 10%BSA和2 X增強(qiáng)雜交緩沖液直至終濃度為I X。所述雜交混合物被施用于NCode 微陣列(Invitrogen, Carlsbad, CA),以玻璃蓋片覆蓋并且在52°C下孵育過夜。對于單色分析，僅僅一種經(jīng)過標(biāo)記的miRNA群體被包含于所述選定雜交混合物中，其余的體積由無核酸酶水構(gòu)成。通過在預(yù)暖于52°C下的2XSSC，0. 2%SDS洗滌緩沖液洗滌所述微陣列而除去所述蓋片。所述微陣列依次在預(yù)暖于52°C下的2 X SSC, O. 2%SDS洗滌緩沖液中洗滌15分鐘，室溫下在2 X SSC中洗滌10-15分鐘，并且在室溫下在O. 2 X SSC中洗滌10-15分鐘。所述微陣列被轉(zhuǎn)移至干燥的50mL離心管內(nèi)，調(diào)整載片以使粘性條碼或標(biāo)記處于所述離心管下部。包含所述微陣列的離心管立即在無蓋情況下以800-1000RPM進(jìn)行離心以干燥所述微陣列。從所述離心管中去除所述微陣列，小心勿接觸所述微陣列表面。使用配以GenePix^iPro 3.0軟件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)的GenePix* 4000B微陣列掃描儀對所述陣列進(jìn)行所描，由此而產(chǎn)生了所述原始樣品內(nèi)所述miRNA序列的表達(dá)特征。對腦和肝臟特征進(jìn)行比較以確立多種miRNA的差異特征。miR122被觀察到主要存在于肝臟中并且miR124a和miR9主要存在于腦中。miR16和miRlet7a_f以及其它miRNA在腦和肝臟均有表達(dá)但是顯示了組織特異性特征。 生物素標(biāo)記miRNA的微陣列雜交所述標(biāo)記RNA分子結(jié)合50 μ I 2XGeneChip雜交緩沖液(GeneChip Hyb WasStain Kit, Affymetrix, Santa Clara, CA), 5 μ I 100% 甲酸胺(VWR), 10 μ 1DMS0 (GeneChipHyb Was Stain Kit, Affymetrix, Santa Clara,CA),5 μ 120 X Eukaryotic HybControls(GeneChip Hyb Control Kit, Affymetrix, Santa Clara,CA), I.7 μ I ControlB2 (Affymetrix, Santa Clara. CA)以及 10 μ I 無核酸酶水(Ambion, Austin, Tx)。所述雜交混合物被施用于GeneChip 0微小RNA微陣列(Affymetrix, Santa Clara, CA),并且根據(jù)制造商的建議在47°C下孵育過夜(16小時)。使用Fluidics Script, FS450003在Affymetrix Fluidics Station上對所述陣列進(jìn)行洗漆并染色。結(jié)果:取決于給定實驗中所使用的生物素標(biāo)記多核苷酸標(biāo)記試劑，所述標(biāo)記標(biāo)簽的估計大小介于長約100與700個堿基之間(這一長度包含所述寡核苷酸尾的長度和所述標(biāo)記試劑的長度)。圖3總結(jié)了在Affymetrix GeneChipTMD微小RNA陣列上觀察到的結(jié)果,對不同大小的多核苷酸標(biāo)記試劑進(jìn)行比較。不依賴于每試劑上生物素分子的數(shù)量，較小的標(biāo)記試劑表現(xiàn)得顯著優(yōu)于較大的分子。使用熒光標(biāo)記的多核苷酸進(jìn)行的兩步和一步標(biāo)記過程之間的并列比較顯示，所述一步過程具有明顯更為簡易的工作流程并且易于對大量的樣品進(jìn)行并行處理。陣列結(jié)果(圖4)顯示，所述兩步和一步程序之間存在平均較小差異直至無差異，這暗示了無論分開實施或合并于同一反應(yīng)混合物中所述兩酶學(xué)步驟(多聚A加尾和連接)均以相似的效率進(jìn)行。此外，使用所述一步過程具有比所述兩步過程更高的重現(xiàn)性。本說明書中所引用的全部公布，專利公布和非專利公布均包括在內(nèi)，均表明本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域中的技術(shù)人員的水平。所有這些公布均以引用的形式完全并入本文，其引用程度如同將各個公布特定且個別地表明通過引用的方式并入。
盡管本發(fā)明在此通過特定的實施方案進(jìn)行描述，應(yīng)當(dāng)了解這些實施方案僅為本發(fā)明的原理和應(yīng)用的示例。因此應(yīng)當(dāng)了解可對所述示例性實施方案進(jìn)行大量的調(diào)整，并且應(yīng)當(dāng)了解可在不脫離根據(jù)下列權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下設(shè)計其它配置。
權(quán)利要求
1.ー種核酸標(biāo)記分子，其上連接有ー個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子，其中所述核酸標(biāo)記分子包含含有能夠與核酸序列雜交的5’磷酸基團(tuán)的寡核苷酸延伸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸標(biāo)記分子，其具有約5kDa至約250kDa的分子量。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸標(biāo)記分子，其包含I至約15個標(biāo)記分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸標(biāo)記分子，其中所述標(biāo)記分子由生物素或熒光團(tuán)組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸標(biāo)記分子，其呈具有高至約5kDa的分子量并且在其3’末端具有単一生物素分子的單鏈DNA寡核苷酸的形式。
6.ー種用于產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的靶RNA分子的方法，其包括 a)提供具有5’和3’末端的單鏈RNA分子； b)將寡核苷酸尾連接于所述單鏈RNA分子的3’末端； c)提供具有正義鏈和反義鏈的部分雙鏈核酸序列，其中所述正義鏈包含核酸標(biāo)記分子，所述核酸標(biāo)記分子在其3’末端包含ー個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子，并且所述反義鏈包含單鏈3’突出端，所述突出端包含與所述寡核苷酸尾互補(bǔ)的序列； d)通過與所述3’突出端序列進(jìn)行的互補(bǔ)堿基配對而使所述部分雙鏈核酸序列與所述寡核苷酸尾退火；以及 e)將所述部分雙鏈核酸序列的正義鏈的5’末端與所述寡核苷酸尾的3’末端進(jìn)行連接，由此將包含ー個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子的核酸標(biāo)記分子連接于所述RNA分子的3’末端，從而產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的靶RNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述單鏈RNA分子是miRNA分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述核酸標(biāo)記分子是經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架，其上連接有能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的多個標(biāo)記分子，其中所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架包含寡核苷酸延伸序列，所述寡核苷酸延伸序列包含5’磷酸基團(tuán)并且能夠與所述部分雙鏈核酸序列的反義鏈雜交結(jié)合，其中所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架是具有多個單鏈區(qū)域的樹狀多核苷酸組合物，所述單鏈區(qū)域可與一個或多個經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸雜交，所述樹狀多核苷酸組合物基本由兩個或更多個通過以5’ -3’定向的雜交而結(jié)合在一起的多核苷酸單體構(gòu)成，并且其中所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架具有約50至約350kDa的總分子量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架是具有多個單鏈區(qū)域的三聚線型樹狀多核苷酸組合物，所述單鏈區(qū)域可與一個或多個經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行雜交；所述線型樹狀多核苷酸組合物基本由通過以5’ -3’定向的雜交而結(jié)合在一起的第一、第二和第三多核苷酸單體構(gòu)成；各多核苷酸單體在彼此雜交結(jié)合之前均具有第一、第ニ和第三單鏈雜交區(qū)域；并且在所述線型樹狀多核苷酸組合物中，所述第一多核苷酸單體的第三單鏈雜交區(qū)域與所述第二多核苷酸單體的第一單鏈雜交區(qū)域雜交結(jié)合，并且所述第ニ多核苷酸單體的第三單鏈雜交區(qū)域與所述第三多核苷酸單體的第一單鏈雜交區(qū)域雜交結(jié)合，其中所述第一多核苷酸單體的第一單鏈區(qū)域能夠與所述部分雙鏈核酸序列的反義鏈雜交結(jié)合，并且其中所述線型樹狀多核苷酸組合物中的第二單鏈雜交區(qū)域與ー個或多個經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行雜交結(jié)合，所述經(jīng)過標(biāo)記的寡核苷酸包含一個或多個標(biāo)記分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述部分雙鏈核酸序列的反義鏈包含橋聯(lián)寡核苷酸，所述寡核苷酸與所述經(jīng)過多重標(biāo)記的聚合物骨架的寡核苷酸延伸序列和所述單鏈RNA分子的3’末端的寡核苷酸尾均能夠雜交結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述核酸標(biāo)記分子之上連接有一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子，其中所述核酸標(biāo)記分子包含寡核苷酸延伸序列，所述寡核苷酸延伸序列包含能夠與所述部分雙鏈核酸序列的反義鏈雜交結(jié)合的5’磷酸基團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述核酸標(biāo)記分子具有約5kDa至約250kDa的分子量。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述核酸標(biāo)記分子包含I至約15個標(biāo)記分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述標(biāo)記分子由生物素或熒光團(tuán)組成。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述核酸標(biāo)記分子呈具有約5kDa的分子量并且 在其3’末端具有單一生物素分子的單鏈DNA寡核苷酸的形式。
16.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述步驟a)-e)在單一反應(yīng)混合物中進(jìn)行。
17.一種用于對固體支持物上的RNA反義探針進(jìn)行檢測的方法，其包括 a)將其上具有包含RNA分子的互補(bǔ)核苷酸序列的反義探針的固體支持物與通過根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法產(chǎn)生的經(jīng)過標(biāo)記的靶RNA分子接觸； b)將所述固體支持物和經(jīng)過標(biāo)記的靶RNA分子在足以使所述經(jīng)過標(biāo)記的靶RNA分子與所述RNA反義探針雜交的時間和溫度下進(jìn)行孵育； c)洗滌所述固體支持物以去除未雜交的經(jīng)過標(biāo)記靶mRNA;以及 d)檢測來自所述雜交的經(jīng)過標(biāo)記靶RNA分子的信號，從而檢測了固體支持物上的RNA反義探針。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述經(jīng)過標(biāo)記的靶RNA分子是miRNA分子。
19.一種用于產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的靶DNA分子的方法，其包括 a)提供具有5’和3’末端的單鏈DNA分子； b)將寡核苷酸尾連接于所述單鏈DNA分子的3’末端； c)提供具有正義鏈和反義鏈的部分雙鏈核酸序列，其中所述正義鏈包含核酸標(biāo)記分子，所述核酸標(biāo)記分子在其3’末端包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子，并且所述反義鏈包含單鏈3’突出端，所述突出端包含與所述寡核苷酸尾互補(bǔ)的序列； d)通過與所述3’突出端序列進(jìn)行的互補(bǔ)堿基配對而使所述部分雙鏈核酸序列與所述寡核苷酸尾退火；以及 e)將所述部分雙鏈核酸序列的正義鏈的5’末端與所述寡核苷酸尾的3’末端進(jìn)行連接，從而將包含一個或多個能夠發(fā)射或產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記分子的所述核酸標(biāo)記分子連接于所述DNA分子的3’末端，從而產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的靶DNA分子。
全文摘要
提供用于產(chǎn)生經(jīng)過標(biāo)記的核酸分子以及在其檢測分析中使用的方法、試劑和試劑盒，其中標(biāo)記分子被直接連接于所述核酸分子的3'末端。
文檔編號C07H21/00GK102630228SQ201080052815
公開日2012年8月8日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者J·卡杜山, J·鮑爾, R·C·蓋茨 申請人:詹尼斯費爾公司