專利名稱：水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的制作方法
技術領域：
本申請涉及水解糖蛋白上的甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接(linkage)的方法，更特別的涉及使用甘露糖苷酶水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接，脫帽糖蛋白上的磷酸-6-甘露糖殘基。背景、
目前研發(fā)中的大部分生物藥(例如，重組蛋白)的生產需要高性能的表達系統(tǒng)。許多這類生物藥的生物學活性依賴于它們的翻譯后修飾(例如，磷酸化或糖基化)?；诮湍傅谋磉_系統(tǒng)組合了遺傳操作的簡便與能夠分泌和修飾蛋白質的微生物發(fā)酵組合。然而，在酵母細胞中生產的重組糖蛋白主要表現(xiàn)出異質的高甘露糖和超甘露糖聚糖結構，對蛋白質功能、下游加工和后續(xù)的治療用途是有害的，特別是當糖基化作用發(fā)揮重要的生物學作用時。美國系列申請?zhí)?2/062，469通過引用全文整合。概述本發(fā)明至少部分的基于發(fā)現(xiàn)了能夠水解糖蛋白上的甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的甘露糖苷酶。藉此，甘露糖苷酶可用于獲得還有脫帽末端甘露糖-6-磷酸殘基的糖蛋白。本文中描述了獲得此類糖蛋白的體外和體內方法。遺傳改造過的細胞可用于方法中，生產具有脫帽末端甘露糖-6-磷酸殘基的靶分子。在一個方面，本文件的特征是脫帽寡糖上的甘露糖-6-磷酸殘基的方法。方法包括提供具有甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的寡糖；和將寡糖與能夠水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶接觸。接觸步驟可以使用純化的甘露糖苷酶、重組的甘露糖苷酶、含有所述重組的甘露糖苷酶的細胞裂解物，或者含有所述重組的甘露糖苷酶的真菌細胞來實施。甘露糖苷酶可以包括靶向序列。寡糖可以與蛋白質(例如，在真菌生物中表達的人蛋白)連接。在另一個方面，本文件的特征是生產具有末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白的方法。方法包括提供經(jīng)過遺傳改造的真菌細胞，所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能夠水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖；和向所述細胞導入編碼靶蛋白的核酸，其中所述細胞生產包括所述末端的磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白。 本文件的特征還是在真菌生物中生產具有末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白的方法。方法包括提供經(jīng)過遺傳改造的真菌細胞，所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能夠水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖，且所述真菌細胞進一步包括編碼靶蛋白的核酸；和分離具有所述末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白。真菌細胞進一步包括編碼能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽的核酸，和/或經(jīng)過遺傳改造缺少OCHl活性。本文件的特征還是經(jīng)過遺傳改造生產包含末端磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白的分離的真菌細胞。所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸，其中甘露糖苷酶在真菌細胞中的表達產生了包含末端磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白。真菌細胞還可以包括編碼靶糖蛋白的核酸。在另一個方面，本文件的特征是解脂耶氏酵母、畢赤酵母、多形漢遜酵母、Arxulaadeninivorans、甲醇畢赤酵母、Oogataea minuta或黑曲霉細胞的基本純的培養(yǎng)物,其大部分被遺傳改造為生產包括末端磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白，所述細胞包括編碼能夠水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸。在本文描述的任何實施方案中，真菌生物可以是解脂耶氏酵母(YairowiaIipolytica)或Arxula adeninivorans。真菌生物可以是甲基營養(yǎng)型酵母，例如畢赤酵 母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、Oogataea minuta 或多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)。真菌生物可以是絲狀真菌(例如，選自淺藍灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergilluscarneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、彎頭曲霉(Aspergillus deflectus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、赫曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、Aspergillus penicilloides、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、醬油曲霉(Aspergillus so jae)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、Aspergillus tamari、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)和花斑曲霉(Aspergillusversicolor)的絲狀真菌)。在本文描述的任何實施方案中，蛋白質可以是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結合片段，或融合蛋白。溶酶體蛋白可以是溶酶體酶(例如，與溶酶體貯積癥(LSD)相關的溶酶體酶，如酸性a葡萄糖苷酶或a半乳糖苷酶)。LSD可以是費波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GMl-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、泰-薩二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、異染性腦白質營養(yǎng)不良、尼曼-匹克病(Fabry’s disease, mucopolysaccharidosis I, Farber disease, Gaucher disease, GMl-gangliosidosis, Tay-Sachs disease, Sandhoff disease, GM2 activatordisease,Krabbe disease, metachromatic leukodystrophy, Niemann-Pick disease)、V型粘多糖病(Scheie disease)、II型粘多糖病(Hunter disease)、IV型粘多糖病(Sanfilippo disease)、莫奎歐氏癥(Morquio disease)、VI 型粘多糖病(Maroteaux-Lamydisease)、透明質酸酶缺乏癥、天冬氨酰葡萄糖胺尿癥、巖藻糖代謝病、甘露糖苷貯積癥、辛德勒病、I型唾液腺病、龐貝氏癥、骨密質發(fā)育不全、蠟樣脂褐質沉積癥、膽固醇酯沉積病、沃爾曼病、多種硫酸酯酶缺乏癥、半乳糖涎酸貯積癥、粘脂沉積癥、胱氨酸病、唾液酸忙積功能障礙、具有Marinesco- Sj6greil綜合征的乳糜微滴滯留病、Hermansky-Pudlak綜合征、Chediak-Higashi綜合征、Danon氏病或Geleophysic發(fā)育不良。例如，LSD可以是龐貝氏癥或費波瑞病(hyaluronidase deficiency, asparty Iglucosaminuria,fucosidosis, mannosidosis, Schindler disease, sialidosis type I, Pompedisease,Pycnodysostosis, ceroid lipofuscinosis, cholesterol ester storagedisease, Wolman disease, Multiple sulfatase deficiency, galactosialidosis, mucolipidosis, cystinosis, sialic acid storage disorder, chylomicron retention diseasewith Marinesco- Sjogren syndrome, Hermansky-Pudlak syndrome, Chediak-Higashisyndrome, Danon disease, or Geleophysic dysplasia. Forexample, the LSD can be Pompedisease or Fabry’ s disease)。在本文描述的任何實施方案中，對于甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5 A偏差以內。在本文描述的任何實施方案中，甘露糖苷酶可以包括與SEQ ID NO:50的I至774位殘基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少90%同一性(例如，至少95%或98%同一性)的氨基酸序列。在本文描述的任何實施方案中，甘露糖苷酶可以包括以下氨基酸序列，所述序列 具有(i)GVGXXGXGG 基序，其中 X 是 Gly，Ala, Ser, Thr 或 Cys ; (ii) VRXE 基序，其中 X 是除Pro 以外的任何氨基酸；(iii) X1YQGX2 基序,其中 X1 是 Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr 或 Met,其中X2是Thr，Ser或Asn ;或(iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。在本文描述的任何實施方案中，甘露糖苷酶可以是C.cellulans、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)或變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)的甘露糖苷酶。在本文描述的任何實施方案中，真菌細胞可以進一步包括編碼促進甘露糖基磷酸化的多肽的核酸(例如，MNN4多肽,如解脂耶氏酵母、釀酒酵母、Ogataea minuta、畢赤酵母或白色念珠菌的多肽)和/或可以經(jīng)過遺傳改造缺少OCHl活性。例如，能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽是畢赤酵母PNOl多肽。在本文描述的任何實施方案中，甘露糖苷酶可以進一步包括分泌信號和/或靶向信號，將甘露糖苷酶靶向到胞內區(qū)室。靶蛋白和甘露糖苷酶可以是共同分泌的。本文件的特征還是包含末端磷酸-6-甘露糖殘基的分離的糖蛋白，其中蛋白是由本文描述的方法生產的。在仍然另一個方面，本文件的特征是包含糖蛋白的組合物，其中糖蛋白上至少47%的N-聚糖具有末端磷酸-6-甘露糖殘基。例如，糖蛋白上至少50%、75%、80%、85%或90%的N-聚糖可具有末端磷酸-6-甘露糖殘基。本文件的特征還是分離的核酸，所述核酸包括SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ IDNO: 10、SEQ ID NO: 12 或SEQ ID NO: 14所述核苷酸序列，或者與 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14至少90%相同的核苷酸序列。本文件的特征還是這樣的載體，所述載體包括與上述核酸有效連接的啟動子，其中所述核酸編碼甘露糖苷酶。核酸可以進一步包括分泌信號或靶向信號，將甘露糖苷酶靶向到胞內區(qū)室。除非另外定義，則本文中使用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。雖然與本文所述相似或等價的方法和材料可用于實踐或測試本發(fā)明，但下文仍描述了示例性的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利、Genbank 登錄號和其他參考文獻都通過引用全文整合到本文中。在發(fā)生沖突的情況下，由本申請，包括定義主導。材料、方法和實例都只是示例性的，并非意在限制。根據(jù)下列詳細的說明和權利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點是顯而易見的。
附圖簡介圖I是pYLTmAX和pYLTmAXMnn4構建體的示意圖。圖2 是描述 MTLY60 A ochl (Mnn4 的 I 個野生型拷貝)、MTLY60 A ochl+Hp4dMnn4(1WT+Mnn4的I個額外拷貝)和MTLY60 A ochl+Hp4dMnn4+TEFMnn4的糖分析的一系列electroferogram。P表不單憐酸化峰。PP表不二憐酸化峰，而Man8表不Man8GlcNAc2峰。圖3是哺乳動物和酵母的聚糖磷酸化通路的示意圖。哺乳動物的聚糖磷酸化通路涉及由GlcNAc磷酸轉移酶催化向Man8GlcNAc2聚糖添加磷酸化-GlcNAc,然后通過剝離酶(uncovering enzyme)脫帽GlcNAc暴露磷酸。相反，酵母的聚糖磷酸化涉及向Man8GlcNAc2聚糖添加磷酸-甘露糖，但不存在內源性的酶脫帽甘露糖來暴露磷酸。
圖4是描述源自菌株MTLY60 A ochl+Hp4dMnn4+TEFMnn4的N聚糖的一系列electroferogram,所述菌株用C. celIulans培養(yǎng)基的上清液處理了不同的時間段(7hr、8hr或過夜(ON))。圖5是描述源自MNN4過表達菌株的N聚糖的一系列electroferogram,所述菌株用C. cellulans上清液(SN)以及有或無磷酸酶(CIP)抑制劑處理過。圖6是在指定的麗的洗脫級分的吸光值單位(mAU)的圖。每個洗脫級分含"500u I。圖7是在硅膠凝膠過濾(將250 ill各級分D0C/TCA沉淀)的洗脫級分電泳后的SDS聚丙烯酰胺凝膠的展示。將框住的條帶切出，使用串聯(lián)質譜(MS/MS)進行肽質量指紋識別和重新測序。圖8A是編碼CcManl (S卩，C. Cellulans的甘露糖苷酶候選物)的核苷酸序列(SEQID N0:6)(在重疊群1003)，CcManl是在MS/MS重新測序中鑒別出的。圖8B是CcMan I的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)，包括信號序列(粗體)。沒有信號肽的CcMan I多肽的預測分子量是 92. 6kDa。圖9A是編碼CcMan2的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)(在重疊群774)，圖9B是包括信號序列(粗體)的CcMan 2的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。沒有信號肽的CcMan 2多肽的預測分子量是121. 6kDa。

圖10A是編碼CcMan3的核苷酸序列(SEQ ID NO: 10)(在重疊群774)，圖10B是包括信號序列(粗體)的CcMan 3的氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)。沒有信號肽的CcMan 3多肽的預測分子量是116kDa。圖IlA是編碼CcMan4的核苷酸序列(SEQ ID NO: 12)(在重疊群1237)，圖IlB是包括信號序列(粗體M^CcMan 4的氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)。沒有信號肽的CcMan 4多肽的預測分子量是184kDa。圖12A是編碼CcMan5的核苷酸序列(SEQ ID NO: 14)(在重疊群896)，圖12B是包括信號序列(粗體)的CcMan5的氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)，圖12C是不包括信號序列的CcMan5的氨基酸序列(SEQ ID N0:50)。沒有信號肽的CcMan 5多肽的預測分子量是173kDa0
圖13含有用于表達CcManl-5的表達質粒的實例，所述表達是在E. coli的細胞周質中(pET25-Man )、作為分泌蛋白在解脂耶氏酵母中(pYLPSecCcManI_5 )、作為靶向解脂耶氏酵母的分泌通路的蛋白質、被標記于N端(pYLPNtCcManl-5)或被標記于C端(pYLPCtCcManl-5)。圖14是用于在E. coli中表達的密碼子優(yōu)化過的CcManl的核苷酸序列(SEQ IDNO:16)。圖15是用于在E. coli中表達的密碼子優(yōu)化過的CcMan2的核苷酸序列(SEQ IDNO:17)。圖16是用于在E. coli中表達的密碼子優(yōu)化過的CcMan3的核苷酸序列(SEQ IDNO:18)。
圖17是用于在E. coli中表達的密碼子優(yōu)化過的CcMan4的核苷酸序列(SEQ IDNO:19)。圖18是用于在E. coli中表達的密碼子優(yōu)化過的CcMan5的核苷酸序列(SEQ IDN0:20)。圖19是pLSAH36和pLSH36載體的示意圖，和用于將C.cellulans基因導入載體的克隆策略。圖20是描述表達CcMan4和CcMan5的E. coli細胞的細胞周質級分的分析的一系列electroferogram。分析是使用DNA測序儀輔助的、突光團輔助的碳水化合物電泳(DSA-FACE)來實施的。第I和第2道分別代表右旋糖梯帶和來自RNaseB的糖。第3道是未處理過的Mnn4糖，“P”對應單甘露糖磷酸化的Man8GlcNAc2峰，“PP”對應雙甘露糖磷酸化的Man8GlcNAc2峰,兒“Man8”對應Man8GlcNAc2峰。4至9道是用Mnn4聚糖與標出的細胞周質孵育所獲得的結果，有或無后續(xù)的胎牛腸磷酸酶(CIP)消化。圖 21 是 Zhu 等人，Nat. Chem. Biol.，6 (2) : 125-32. Epub 2009 Dec 27 (2010)描述的 CcMan4 (1759AA)和 CcMan5 (1650AA)與 Bt3990 (744AA)和 Bt2199 (739AA)甘露糖苷酶的示意性比對。圖22是描述從表達的E. coli細胞中獲得的CcMan4和CcMan5酶分析的一系列electroferogram。分析是使用DSA-FACE實施的，利用過表達MNN4的菌株來源的聚糖作為底物(被稱為MNN4聚糖或MNN4糖)。第I道代表右旋糖梯帶，第2道代表未處理過的Mnn4糖。在第3至第6道中，糖分別與以下孵育不誘導的或在18°C用IPTG誘導過夜的CcMan4domain細胞周質級分,不誘導的或在18°C用IPTG誘導過夜的CcMan5domain細胞周質級分。最后一道代表來自RNaseB的糖。圖23是CcManSp774的彩帶狀示意圖。CcManS^74由N端￠-夾心結構域(8-271位殘基；淺灰色)、a-螺旋接頭(272-290位殘基；黑色)和(a a )6桶狀結構域(291-771位殘基；深灰色)組成。催化性Ca2+顯示為球狀。圖24是CcManSh774蛋白質骨架的彩帶狀示意圖，其中骨架的側鏈排列出以豎條表示的底物結合位點。碳、氧和氮原子分別著色為淺灰色、灰色和深灰色。催化中心中的Ca2+離子和水Wl、W2、W3和W4顯示為球狀。圖25是CcManSh774蛋白質骨架的彩帶狀示意圖，其中骨架的側鏈排列出以豎條表示的底物結合位點和甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖(標記為Man-P-Man)的建模位置。碳、氧和氮原子分別著色為淺灰色、灰色和深灰色。催化中心中的Ca2+離子和水Wl、W2、W3和W4顯示為球狀(為了比較，仍然顯示了將被底物02和03羥基取代的W2和W3的位置)。黃色、紅色和黑色虛線分別表示含Ca2+的配位鍵、含假設的親核水(W4)的H鍵和含-I位甘露糖和磷酸的H鍵。-I位甘露糖建模為其基態(tài)的椅式構像。在催化過程中，它的02羥基將在Ca2+離子的赤道配位平面中占據(jù)比W2更近的位置，從而導致甘露糖-I環(huán)變形為半椅式構像，促進親核水(W4)對Cl碳(箭頭)的線性攻擊。圖26A是編碼半乳糖苷酶A的解脂耶氏酵母密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，含粗體的lip2前序列和下劃線的Myc His標簽(SEQ ID N0:22)。圖26B是a -半乳糖苷酶A的氨基酸序列，含粗體的lip2前序列和下劃線的Myc His標簽(SEQ ID N0:23)。圖27A是人a葡萄糖苷酶(GAA)的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，含粗體的lip2前序列(SEQ ID NO: 24)。圖27B是人GAA的氨基酸序列，含粗體的Iip2前序列(SEQ ID NO: 25)，其中*表示終止密碼子。圖28是用于克隆huGAA的解脂耶氏酵母表達載體的示意圖。圖29是描述用源自E. coli細胞的細胞周質級分的CcMan5處理huGAA的分析的一系列electroferogram。分析是使用DSA-FACE實施的。圖30是對CcMan5的最小催化中心的描述。用圓括號給出了 SEQ ID NO:50中的等價殘基的編號。I Q(Q536) ；2 N/D-E/Q(N588-Q589) ；3 D/E(D355) ；4 R(R405) ；5 D/E-X-D/E(D660-X-D662) ；6 :G_G (G71-G72);和 7 T/S/G(T626)。圖31是使用MUSCLE (通過對數(shù)預期的多序列比較)，對CcMan5的氨基酸序列(SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 15所述氨基酸序列沒有信號肽)和它的10個同源物的比對。NP_630514 鏈霉菌屬，SEQ ID NO:26 ;ZP_02866543 梭菌屬(Clostridium)，SEQ IDN0:27 ;NP_812442 擬桿菌屬(Bacteroides)，SEQ ID NO:28 ;YP_003584502 王祖農菌屬(Zunongwangia), SEQ ID NO: 29 ;YP_003120664 噬幾丁質菌屬(Chitinophaga)，SEQ IDNO:30 ;AAK22560 柄桿菌屬(Caulobacter)，SEQ ID NO:31 ;ACL94075 柄桿菌屬，SEQ IDNO: 32 ;ACT03290 類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，SEQ ID NO:33 ;ACU59240 噬幾丁質菌屬，SEQ ID N0:34 ;ACU05553 土地桿菌屬(Pedobacter)，SEQ ID N0:35。圖32是使用MUSCLE對CcMan5的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)和它的19個同源物的比對。鏈霉菌屬 NP_630514，SEQ ID NO:26 ;鏈霉菌屬 ZP_02866543，SEQ ID NO:36,ZP_06527366 鏈霉菌屬，SEQ ID NO:37 ;YP_003013376 類芽孢桿菌屬，SEQ ID NO:38 ；NP_812442擬桿菌屬，SEQ ID N0:28 ;ZP_04848482擬桿菌屬，SEQ ID N0:39 ;ZP_03677957擬桿菌屬，SEQ ID NO:40 ;YP_003584502王祖農菌屬，SEQ ID NO: 29 ;ZP_01061975列文虎克菌屬(Leeuwenhoekiella), SEQ ID NO:41 ;ZP_07083984 鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium),SEQ ID N0:42 ;YP_003120664 噬幾丁質菌屬，SEQ ID NO:30 ;ZP_01885202 土地桿菌屬，SEQ ID N0:43 ;ZP_02866543 梭菌屬，SEQ ID NO: 27 ;XP_367221 稻瘟菌屬(Magnaporthe),SEQ ID N0:44 ;ZP_07042437 擬桿菌屬，SEQ ID N0:45 ;ZP_05759807 擬桿菌屬，SEQ IDN0:46 ;ZP_05287524 擬桿菌屬，SEQ ID NO:47 ;ZP_06076108 擬桿菌屬，SEQ ID NO:48 ；YP_001302992 Parabacteroides, SEQ ID NO:49。
圖33含有圍繞CcManSu4的活性位點的殘基的結構坐標。圖34含有PDB入口 2xsg中的兩個CcManSn74分子的不對稱單元中的蛋白Ca原子和催化性Ca2+原子，描述了蛋白質的整體折疊。詳細說明一般而言，本文件提供了水解糖蛋白上的甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接，產生具有脫帽的磷酸-6-甘露糖(M6P)殘基的靶分子(例如，靶蛋白)的方法和材料。本文描述的方法和材料特別有效的用于產生治療患有溶酶體貯積癥(LSD)的患者的試劑)，LSD是一大類遺傳性的代謝功能障礙，其特征是由于涉及降解作用的異化酶活性受損，儲藏產物在溶酶體中累積。儲藏產物的積累導致細胞功能障礙和進行性的臨床表現(xiàn)?？梢酝ㄟ^酶替換療法(ERT)校正異化酶的缺陷，只要所施用的酶可以靶向到疾病細胞的溶酶體中。溶酶體酶通常是在內質網(wǎng)(ER)中合成的糖蛋白，通過分泌通路運輸?shù)礁郀柣w中，然后被募集到溶酶體。溶酶體酶向溶酶體遞送的一種方式是通過陽離子依賴性(CD)的甘露糖6-磷酸受體(MPR)。M6P末端的聚糖在跨高爾基體網(wǎng)絡(TRN)中被2種MPR識別，介導溶酶 體酶從分泌通路分選病將酶遞送至溶酶體。使用本文描述的方法和材料，可以使用基于微生物的生產方法獲得含脫帽M6P的聚糖的治療性蛋白質，所述蛋白質可以利用同一 M6P依賴性通路遞送至溶酶體中。因而，本文描述的方法和材料可用于制備治療代謝功能障礙的糖蛋白，例如LSD。甘露糖苷酶本文件提供了編碼能夠水解寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的甘露糖苷酶多肽分離的核酸，以及能夠水解寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的分離的甘露糖苷酶。術語“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互換的使用，指RNA和DNA，包括cDNA、基因組DNA、合成的DNA和含有核酸類似物的DNA (或RNA)。多核苷酸可以具有任何的三維結構。核酸可以是雙鏈的或單鏈的(即，正義鏈或反義鏈)。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片段、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、siRNA、微RNA、核酶、cDNA、重組的多核苷酸、分支的多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物，以及核酸類似物。“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換的使用，意指任何肽鍵連接的氨基酸鏈，不論長度或翻譯后修飾。通常，當本文描述的多肽(例如，甘露糖苷酶或具有脫掉的M6P殘基的靶蛋白)按重量計構成制品中的總蛋白質的至少60%時，所述多肽是分離的，例如樣品中60%的總蛋白。在一些實施方案中，本文描述的多肽由按重量計制品中至少75%、至少90%或至少99%的總蛋白構成?！胺蛛x的核酸”指與存在于天然存在的基因組中的其他核酸分子分開的核酸，包括通常在天然存在的基因組(例如，酵母基因組)中位于核酸一側或兩側的側翼的核酸。術語“分離的”在本文中涉及核酸時，還包括任何非天然存在的核酸序列，因為此類非天然存在的序列不可見于自然界，且在天然存在的基因組中沒有直接連續(xù)的序列。分離的核酸可以是例如DNA分子，只要去除或缺少了在緊靠天然存在的基因組中的DNA分子側翼通?？梢姷囊环N核酸序列。因而，分離的核酸包括但不限于作為獨立于其他序列的分隔的分子存在的DNA分子(例如，化學合成的核酸，或由PCR或限制性內切核酸酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)，以及整合到載體、自主復制的質粒、病毒(例如，任何的副粘病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒或肝病毒)中或整合到原核細胞或真核細胞的基因組DNA中的DNA。此外，分離的核酸可以包括改造過的核酸，例如部分是雜合體或融合核酸的DNA分子。在例如cDNA文庫或基因組文庫中，或者含有基因組DNA限制性消化的凝膠切片中，與數(shù)百至數(shù)百萬種其他核酸共存的核酸不被認為是分離的核酸。術語“外源性”在本文中涉及核酸和特定的宿主細胞時，指在自然界中可發(fā)現(xiàn)的特定細胞中不存在(且不能獲得)的任何核酸。因而，非天然存在的的核酸一旦被導入宿主細胞中，則被認為是對宿主細胞外源性的。重要的是，應注意非天然存在的核酸可以含有自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸序列的核酸子序列或片段，只要所述核酸作為整體不存在于自然界中。例如，表達載體中的含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，因而一旦導入宿主細胞中，對宿主細胞就是外源性的，因為所述核酸分子作為整體(基因組DNA加載體DNA)不存在于自然界。因而，任何作為整體不存在于自然界中的載體、自主復制的質?；虿《?例如，逆轉錄病毒、腺病毒或肝病毒)都被認為是非天然存在的核酸。由此可見，通過PCR或限制性內切核酸酶處理產生的基因組DNA片段以及cDNA被認為是非天然存在的核酸，因為它們作為分隔的分子存在，不可見于自然界。還由此可見，任何含有啟動子序列和多肽編碼序列(例如，cDNA或基因組DNA)處于自然界中不可見的排列的核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸對特定的細胞而言可以是外源性的。例如，從酵母X的細胞中分離的完整染色體對于酵母y的細胞是外源性的核酸，只要所述染色體被導入酵母細胞中。 編碼甘露糖苷酶的核酸可以與SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所述的核苷酸序列至少70%序列同一性(例如，至少80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%或100%序列同一性)。在一些實施方案中，本文描述的核酸可以編碼與SEQ ID NOs :7，9，11，13，15，50所述的氨基酸序列具有至少70% (例如，至少75，80，85，90，95，99或100%)同一性的甘露糖苷酶多肽。例如，核酸可以編碼與SEQ IDNO: 15或SEQ ID NO: 50所述的氨基酸序列，或其一部分具有至少90%(例如，至少95或98%)同一性的甘露糖苷酶。例如，核酸可以編碼與SEQ ID NO: 50的I至774位殘基具有至少90%同一性的甘露糖苷酶。如下確定特定的氨基酸序列和SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ IDNO: 11，SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15或SEQ ID N0:50所述氨基酸序列之間的百分比同一性。首先，使用含有 BLASTP 2.0. 14 版的單機版 BLASTZ 的 BLAST 2 Sequences(B12seq)程序比對氨基酸序列。該單機版BLASTZ可自Fish & Richardson的網(wǎng)站(例如,www. fr. com/blast/)或美國政府的國立生物技術信息中心的網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. rov)獲得。解釋如何使用B12seq程序的說明可見于BLASTZ所附的readme文件中。B12seq在兩條氨基酸序列之間使用BLASTP算法實施比較。為了比較兩條氨基酸序列，B12seq的選項設置如下_i設為含有待比較的第一氨基酸序列的文件(例如，C:\seql. txt) ；-j設為含有待比較的第二氨基酸序列的文件(例如，C:\seq2. txt)；-p設為blastp ；-o設為任何理想的文件名(例如，C: \output. txt);所有其他選項都保持原有的默認設置。例如，可以使用下列命令產生含有兩條氨基酸下列之間的比較的輸出文件C: \B12seq - i c:\seql. txt-j c:\seq2.txt-pblastp -o c:\output. txt。如果兩條比較序列具有同源性,則設計的輸出文件將展現(xiàn)比對序列的同源性區(qū)域。如果兩條比較序列沒有同源性，則設計的輸出文件將不展現(xiàn)比對的序列。對于除使用blastn以外，對核酸序列遵循相似的程序。一經(jīng)比對，通過計數(shù)兩條序列中都存在的相同氨基酸殘基的位置數(shù)，來確定匹配數(shù)。通過將匹配數(shù)除以全長甘露糖苷酶多肽氨基酸序列的長度，再將獲得的值乘以100，確定百分比同一性。例如，當與SEQ ID NO:7所述序列比對時具有700個匹配的氨基酸序列與 SEQ ID N0:7 所述序列 77. 8% 相同(S卩，700 + 900*100=77. 8)。應注意，百分比同一性值四舍五入至最接近的十分之幾。例如，78. 11,78. 12、78. 13 和 78. 14 四舍五入至 78. 1，而 78. 15,78. 16,78. 17,78. 18 和 78. 19 四舍五入至 78. 2。
還應注意，長度值總是整數(shù)。應理解，多個核酸可以編碼具有特定氨基酸序列的多肽。遺傳密碼的簡并性是本領域普遍已知的；即，對于許多氨基酸，有一個以上的核苷酸三聯(lián)體作為所述氨基酸的密碼子。例如，可以修飾給定的甘露糖苷酶多肽的編碼序列中的密碼子，使得獲得在特定物種(例如，細菌或真菌)中的最佳表達。例如，可以將SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:8,SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14所述的核酸密碼子優(yōu)化用于E. coli表達，如圖14-18所述(參見 SEQ ID NOs: 16-20)。還可以使用雜交來評估兩條核酸序列之間的同源性。本文中描述的核酸序列或其片段可用作根據(jù)標準雜交技術的雜交探針。目標探針(例如，含有一部分CcMan5核苷酸序 列的探針)與來自測試來源的DNA或RNA的雜交是測試來源中存在與探針對應的DNA或RNA(例如，CcMan5核苷酸序列)的指針。雜交條件是本領域技術人員已知的,可見于CurrentProtocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. , 6. 3. 1-6. 3. 6, 1991 中。中等的雜交條件定義為與以下條件等價的條件，即，30°C下在2X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，再在50°C下在IX SSC,0. 1% SDS中洗滌。高嚴謹度的條件定義為與以下條件等價的條件，即，45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，再在65°C下在0. 2X SSC, 0. 1% SDS中洗漆。還可以基于本文描述的一部分C.cellulans甘露糖苷酶的三維結構(SEQ IDNO: 50的1-774位殘基，也稱為CcManSh774),來鑒別能夠雜交寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的甘露糖苷酶多肽?？梢酝ㄟ^例如X射線衍射CcManSh774的晶體，確定三維結構。CcManSp774的結構坐標(例如,儲藏在Protein Data Bank (世界范圍的網(wǎng)站F1DB.org中的PDB ID No. 2xs下)中的CcManSn74的坐標)，圖33中所述關于CcMan5的催化中心的坐標，或者圖34中所述關于PDB入口 2xsg中的兩個CcManSn74分子的不對稱單元中的蛋白Ca原子和催化性Ca2+原子的坐標，可用于多種用途，包括但不限于表征能夠水解寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的甘露糖苷酶的三維結構，以及可視化、鑒別和表征這樣的甘露糖苷酶區(qū)域，所述區(qū)域參與接受甘露糖-6-磷酸a，I-甘露糖(后文中稱為Man-P-Man)作為底物并賦予所述酶水解Man-P-Man產生末端磷酸_6_甘露糖的能力。“結構坐標”是與分子或分子復合物中原子相對于其他原子的空間關系對應的笛卡爾坐標。結構坐標可使用X射線衍射技術或NMR技術獲得，或者可以使用分子取代分析或同源性建模推斷。各種軟件程序允許圖示結構坐標組，獲得分子或分子復合物的三維展示?？梢酝ㄟ^數(shù)學操作修飾由圖33或圖34提供的原始組得到本文描述的結構的結構坐標，例如通過倒置或整體加入或減去。由此，應認識到本發(fā)明的結構坐標是相對的，不以任何方式受圖33或圖34的實際x、y、z坐標的具體限制。如實施例8所述,CcManSp774的結構由兩個結構域組成,N端的P -夾心結構域(SEQID NO: 50的8-271位殘基)和C端的(a a )6桶狀結構域(SEQ ID NO: 50的291-771位殘基)，通過a-螺旋接頭(SEQ ID NO: 50的272-290位殘基)連接。兩個結構域之間的界面產生了攜帶保守的催化性Ca2+離子的空洞形狀，并產生-I底物結合位點(命名如Davies等人，Biochem. J. 321:557-9(1997)所述)和催化中心的形狀。SEQ ID NO:50 的 22、25、71、72、195、196、354、405、535、536、588、589、626、658、660 和 662 位殘基形成底物結合位點?？梢允褂肐3DB ID No. 2xs的結構坐標或圖33所示的摘要(包括CcManS1I74的活性位點周圍的殘基)或圖34所示的摘要(包括PDB入口 2xsg中的兩個CcMan51-774分子的不對稱單元中的蛋白Ca原子和催化性Ca2+原子)，部分或全部的表征CcManSn74的三維結構，并描述蛋白質的整體折疊。例如，可以通過根據(jù)I3DB ID No. 2xs的7-771位氨基酸殘基的結構坐標，土不超過2人的所述氨基酸的保守性骨架原子的均方根誤差，來表征CcManSu4的三維結構。在一些實施方案中，CcManSp774的三維結構包括根據(jù)TOB ID No. 2xs的氨基酸的全部結構坐標，土不超過2A的所述氨基酸的保守性骨架原子的均方根誤差(例如，不超過1.5 A、1.0A或0.5人)。在本文中，“均方根誤差”是偏離均值的方差平方的算數(shù)平均值的均方根，是表示本文所述結構坐標的偏差或方差的方式。本公開內容包括所有包含所示氨基酸殘基的保守性取代的實施方案，所述保守性取代導致落入所述均方根誤差范圍內的相同結構坐標。、本文提供的結構坐標可用于表征甘露糖苷酶多肽的三維結構。根據(jù)此類結構，可以將底物結合位點例如通過計算機可視化、鑒別和表征，基于分子的表面結構、表面電荷、位阻排列、反應氨基酸的存在、疏水性或親水性的區(qū)域等。為了使用本文所述結構產生的結構坐標,如圖33、圖34或I3DB ID No. 2xs所述，可以將相關的坐標展示為或轉化為三維形狀或圖像呈現(xiàn)。能夠從結構坐標組產生分子或其部分的三維圖像呈現(xiàn)的軟件程序是可商購的。可商購的軟件程序實例包括但不限于以下的GRID (Oxford University,Oxford,UK) ；MCSS(Molecular Simulations,San Diego,CA) ；AUT0D0CK(Scripps ResearchInstitute, La Jolla, CA) ；D0CK(University of California, San Francisco, CA)；Flo99 (Thistlesoft, Morris Township, NJ) ；Ludi(Molecular Simulations, San Diego,CA) ；QUANTA(Molecular Simulations,San Diego,CA) ；Insight(Molecular Simulations,San Diego, CA) ；SYBYL(TRIPOS, Inc.，St. Louis. MO)；和 LEAPFROG(TRIP0S，Inc.，St. Louis, MO) o本文描述的結構坐標可以用于標準的同源性建模技術，從而確定分子或分子復合物的未知三維結構。同源性建模涉及使用一個或多個相關蛋白質分子、分子復合物或其部分的結構坐標，構建未知的結構模型。同源性建模可以通過擬合蛋白質中被解析的三維結構與已知分子的同源性結構元件的三維結構中共同的或同源的蛋白質部分來進行，尤其是使用由本文的圖33和34提供的相關(S卩，同源的)結構坐標?？梢允褂冒被嵝蛄型恍浴⑼吹拇渭壗Y構元件和/或同源的三級折疊，來確定同源性。同源性建?？梢园ㄓ靡呀馕龅南嚓P結構替代氨基酸(或其他元件)，重建部分或全部的三維結構。相應的，可以使用本文描述的CcManSp774的三維結構生成未知分子的三維結構，并使用多種本領域普遍已知的技術細化?；诒疚拿枋龅娜S結構，可以在CcManSn74或其他甘露糖苷酶的一些原子或側基中產生取代，從而改善或修飾它的選擇性。例如，CcMan5在536和588位含有非酸性殘基，允許甘露糖苷酶的磷酸連接耐受在Man-P-Man底物中的異頭氧。由此，可以將其他甘露糖苷酶中的相應殘基變?yōu)榉撬嵝詺埢黾痈事短擒彰附邮躆an-P-Man底物的能力?？梢酝ㄟ^分析核苷酸和多肽序列比對，鑒別適用于本文中的其他甘露糖苷酶多肽候選物。例如，在核苷酸或多肽序列的數(shù)據(jù)庫中實施搜索，可以鑒別甘露糖苷酶多肽的同源物和/或類似物。序列分析可以涉及使用已知的甘露糖苷酶氨基酸序列對非冗余數(shù)據(jù)庫進行BLAST、相互Reciprocal或PSI-BLAST分析。數(shù)據(jù)庫中那些具有大于40%序列同一性的多肽可以鑒別為進一步評估作為甘露糖苷酶多肽適用的候選物。氨基酸序列相似性允許保守型氨基酸取代，例如用另一個疏水性殘基取代一個疏水性殘基，或者用另一個極性殘基取代一個極性殘基。需要時，可以人工檢查此類候選物，從而縮小進一步評估的候選物數(shù)量?？梢酝ㄟ^選擇表現(xiàn)出具有這樣的結構域的候選物，來實施人工檢查，其中所述結構域被懷疑存在于能夠水解末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的甘露糖苷酶中，例如一個或多個(例如，1、2、3、4或更多個)保守的結構域或功能區(qū)(例如，底物結合空穴)。此類結構域可包括富含甘氨酸的基序GVGXXGXGG，其中X是Gly、Ser、Thr、Val、Ala、Cys或Gln (或其他具有小側鏈的氨基酸)。該基序可見于SEQ ID NO:50的69-77位殘基。該區(qū)域形成環(huán)，為_1甘露糖和酶的活性位點中的磷酸-結合子位點提供了關鍵性的氫鍵。保守基序的另一個實例包括VEXE基序，其中Arg(R)與-I環(huán)，并可能與+1環(huán)形成氫鍵，Glu (E)處于與該R殘基的鹽鍵橋中，可能使該基序成形；而X是Trp或除Pro以外的任何氨基酸。該基序可見于SEQ ID NO:50的404-407位殘基。合適的基序還可以是X1YQGX2基序,其中X1是Leu、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr或Met,X2是Thr、Ser或Asn。該基序可見于SEQ ID NO: 50的534-538位殘基。該基序中的Gln (Q)作為E是重要的，存在不具有水解寡糖上的末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的能力的甘露糖苷酶中。該基序中的Tyr(Y)被認為對+1位點形成而言是重要的。此外，由SEQ ID N0:50 的22、25、71、72、195、196、354、405、535、536、588、589、626、658,660和662位殘基定義的區(qū)域形成了 CcMan5的底物結合空穴。作為最低需求，G71、G72、D355、R405、Q536、N588、Q589、T626、D660、D662 形成了催化中心，其中 N588、Q589 和D660參與協(xié)調催化性Ca2+離子，D662和D660參與活化親核的水，Q536穩(wěn)定躍遷狀態(tài)過程中的異頭氧，而G71、G71、D355、R405和T626參與-I位點的底物結合。參見圖30關于最小催化中心的展示。由此，當位于最小的催化中心(例如，圖30所述)的氨基酸側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5 A偏差以內時，可以選擇甘露糖苷酶作為能夠水解末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的候選甘露糖苷酶。保守基序還可以是在蛋白質的N端結構域中的⑶XGN基序，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。該基序可見于SEQ ID NO: 50的21-25位殘基，形成酶的部分底物結合口袋，如圖24所示。特別的是，D和N的側鏈框出了底物結合空穴，并可能形成結合+1甘露糖的備選子口袋。如實施例14所述，在多肽序列的數(shù)據(jù)庫中實施搜索在下了生物中鑒別出CcMan5的同源物天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor) (GenBank 登錄號NP_630514)、變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans) (GenBank 登錄號ZP_05522540)、變鉛青鏈霉菌(GenBank 登錄號:ZP_06527366)、螺狀梭菌(Clostridium spiroforme) (GenBank登錄號ZP_02866543)、多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron) (GenBank 登錄號NP_812442)、Zunongwangia profunda (GenBank 登錄號YP_003584502)；Chitinophaga pinensis (GenBank 登錄號YP_003120664);類芽抱桿菌屬(GenBank 登錄號YP_003013376);擬桿菌屬(GenBank 登錄號ZP_04848482) ；Bacteroidescellulosilyticus (GenBank 登錄號ZP_03677957) ；Leeuwenhoekiella blandensis(GenBank 登錄號ZP_01061975) ；Sphingobacterium spiritivorum (GenBank 登錄號ZP_07083984)和土地桿菌屬(GenBank登錄號ZP_01885202)。天藍色鏈霉菌和變鉛青鏈霉菌中的甘露糖苷酶是相似的(與CcMan5 GH92結構域66%序列同一性，在765個BLASTP比對的殘基中有501個相同)，不僅在上述基序而且在三維結構的許多環(huán)中?？梢酝ㄟ^標準技術生產編碼甘露糖苷酶多肽的分離的核酸分子。例如，可以使用聚合酶連鎖反應(PCR)技術獲得含有本文所述核苷酸序列的分離的核酸。PCR可用于從DNA以及RNA中擴增特定的序列，包括來自總基因組DNA或總細胞RNA的序列。一般而言，來自目標區(qū)域末端或遠端的序列信息被用于設計與待擴增的模板的反向鏈序列相同或相似的寡核苷酸引物。還可以利用多種PCR對策，其中可以位點特異性的核苷酸序列修飾導入模板核酸中。還可以化學合成分離的核酸，不論是作為單個核酸分子(例如，使用phosphoramidite技術按3’至5’方向用自動化DNA合成)或作為一系列的寡核苷酸。例如，可以合成含有所需序列的一個或多個成對的長寡核苷酸(例如，>100個核苷酸)，其中每一對含有互補的短片段(例如，約15個核苷酸)，使得將寡核苷酸對退火時形成二聚體。使 用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每個寡核苷酸對獲得單個雙鏈核酸分子，之后可連接成載體。本發(fā)明的分離的核酸還可以通過誘變例如天然存在的DNA而獲得。本文件還提供了本文描述的甘露糖苷酶的(i)生物學活性的變體和(ii)生物學活性的片段或其生物學活性的變體。相對于SEQ ID NOs :7、9、11、13、15或50所述的序列，甘露糖苷酶的生物學活性的變體可以含有添加、刪除或取代。含取代的蛋白一般具有不超過50個(例如，不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50個)保守氨基酸取代。保守取代是用具有相似特征的另一個氨基酸取代一個氨基酸。保守取代包括以下組中的取代纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非極性的疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述極性、堿性或酸性組中的一個成員被另一個同組成員的任意取代都可視為保守取代。相反，非保守取代是用具有不相似特征的另一個氨基酸取代一個氨基酸。圖31和32所述的序列比對提供了進行多個氨基酸取代的實例。缺失變體可以缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20個氨基酸片段(2個或多個氨基酸)或非連續(xù)的單個氨基酸。添加(添加變體)包括這樣的融合蛋白，所述融合蛋白含有(a) SEQID NOs :7、9、11、13或15所述甘露糖苷酶，或其片段；和(b)內部或末端(C或N)的不相關或異源的氨基酸序列。在此類融合蛋白的語境中，術語“異源的氨基酸序列”指除(a)以外的氨基酸序列。異源序列可以是例如用于純化重組蛋白的序列(例如，F(xiàn)LAG、多聚組氨酸(例如，六組氨酸)、gluttanin (HA)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP))。異源序列還可以是用作診斷的蛋白或可檢測的標志物，例如，熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)或氯霉素乙酰轉移酶(CAT)。在一些實施方案中，融合蛋白含有來自另一種蛋白質的信號序列。在某些宿主細胞(例如，酵母宿主細胞)中，可以通過使用異源信號序列增加靶蛋白的表達和/或分泌。在一些實施方案中，融合蛋白可以含有載體(例如，KLH，可用于例如引發(fā)免疫應答產生抗體)，或者內質網(wǎng)或高爾基體細胞器的滯留信號。異源序列的長度可以改變，在一些情況下可以是比異源序列連接的全長靶蛋白更長的序列。甘露糖苷酶的生物學活性片段或生物學活性變體具有野生型、全長、成熟蛋白質的至少 40% (例如，至少 50% ；60% ；70% ；75% ；80% ；85% ；90% ；95% ；97% ；98% ；99% ；99. 5% 或100%或甚至更高的)甘露糖苷酶活性(例如，脫帽M6P殘基)。例如，甘露糖苷酶的生物學活性片段可含有SEQ ID NO:50的1-774位殘基。本文描述的甘露糖苷酶可用于生產具有脫帽末端磷酸-6-甘露糖(M6P)殘基的分子(例如，靶蛋白)。方法可以在體外或體內實施。脫帽(uncapping)M6P殘基的體外方法 本文描述的甘露糖苷酶可以是重組生產的，用于在體外脫帽/打開(uncapping)寡糖上的M6P殘基。為了重組生產甘露糖苷酶，使用含有與編碼甘露糖苷酶多肽的核酸有效連接的啟動子的載體。在本文中，“啟動子”指能夠使基因轉錄的DNA序列。啟動子被RNA聚合酶識別，之后起始轉錄。因而，啟動子含有被RNA聚合酶直接結合或涉及募集RNA聚合酶的DNA序列。啟動子序列還可以包括“增強子區(qū)”，這是一個或多個可以結合蛋白質(即，反式作用因子，大部分類似轉錄因子)來增強基因簇中的基因轉錄水平(由此得名)的DNA區(qū)域。增強子通常位于編碼區(qū)的5’區(qū)，也可以與啟動子序列分隔，例如可以位于基因的內含子區(qū)域或基因編碼區(qū)的3’。在本文中，“有效連接”意指整合到遺傳構建體(例如，載體)中，使得表達控制序列有效的控制目標編碼序列的表達?？梢詫⒈磉_載體導入宿主細胞(例如，通過轉化或轉染)中，用于表達編碼的多肽，之后可以純化所述多肽?？捎糜谛∫?guī)?；虼笠?guī)模生產甘露糖苷酶多肽的表達系統(tǒng)包括但不限于微生物，例如用含有核酸分子的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌(例如，E. coli)，和用含有核酸分子的重組真菌表達載體轉化的真菌(例如，釀酒酵母、解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、畢赤酵母、多形漢遜酵母或曲霉)。有效的表達系統(tǒng)還包括用含有核酸分子的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)，和用含有核酸分子的重組病毒表達載體(例如，煙草花葉病毒)感染的或用重組質粒表達載體(例如，Ti質粒)轉化的植物細胞細胞。還可以使用哺乳動物表達系統(tǒng)生產甘露糖苷酶多肽，所述表達系統(tǒng)包括錨定了重組表達構建體的細胞(例如，永生化細胞系，如COS細胞、中華田鼠卵巢細胞、Hela細胞、人胎腎293細胞和3T3 LI細胞)，所述構建體沿著本文描述的核酸含有源自哺乳動物細胞基因組(例如，金屬硫蛋白啟動子)或來自別哺乳動物病毒(例如，腺病毒晚期啟動子和巨細胞病毒啟動子)的啟動子。通常，用幫助純化蛋白質的異源氨基酸序列標記重組的甘露糖苷酶多肽，例如FLAG、多聚組氨酸(例如，六組氨酸)、gluttanin (HA)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP)。純化蛋白質的其他方法包括層析技術，例如離子交換層析、疏水和逆向層析、尺寸排阻層析、親和層析、疏水電荷誘導層析等(參見例如，Scopes, ProteinPurification !Principles and Practice,第 3 版，Springer-Verlag, New York(1993)；Burton 和 Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81(1998))。為了在體內生產具有脫帽末端M6P的分子，在合適的條件下將含有甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的靶分子與純化的甘露糖苷酶或含有重組生產的甘露糖苷酶的細胞裂解物接觸。細胞裂解物可來自遺傳改造過的細胞，包括真菌細胞、植物細胞或動物細胞。動物細胞的非限制性實例包括線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物和哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、田鼠、沙鼠、狗、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人。在將靶分子(例如寡糖或糖蛋白)與純化的甘露糖苷酶或含有重組生產的甘露糖苷酶的細胞裂解物接觸的基礎上，甘露糖苷酶水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接，并產生具有一個或多個脫帽末端M6P殘基的靶分子。實施例2中描述的方法可用于確定是否已經(jīng)脫帽了末端M6P殘基。在通過甘露糖苷酶加工后，可以分離已脫帽末端M6P殘基的靶分子。用于獲得細胞裂解物并保持裂解物中的甘露糖苷酶的活性或完整性的合適方法可以包括使用恰當?shù)木彌_液和/或抑制劑，包括保持或使細胞裂解物中的N糖基化活性變化最小化的核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制劑。此類抑制劑包括例如螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇二(P-氨乙基乙酯)N，N，NI, NI-四乙酸(EGTA)，蛋白酶抑制劑例如苯甲基磺酸氟化物(PMSF)、aprotinin、leupeptin、antipain等,磷酸酶抑制劑如磷酸鹽、氟化鈉、釩酸鹽等。獲得含有酶活性的裂解物的恰當緩沖液和條件描述在例如Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47), John Wiley & Sons, NewYork (1999) ；Harlow 和 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press(1988) ;Harlow和Lane, Using Antibodies A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press (1999) ；Tietz Textbook of Clinical Chemistry,第 3 版，Burtis和 Ashwood 編著，W. B. Saunders, Philadelphia, (1999)中。需要時，可以進一步加工細胞裂解物，消除或最小化存在的干擾物質。需要時，可以通過多種本領域技術人員普遍已知的方法將細胞裂解物分級，包括亞細胞分級，和層析技術，例如離子交換層析、疏水和逆向層析、尺寸排阻層析、親和層析、疏水電荷誘導層析
坐寸o在一些實施方案中，可以制備細胞的細胞器仍然完整和/或有功能的細胞裂解物。例如，含有一個或多個完整的粗面內質網(wǎng)、完整的光面內質網(wǎng)或完整的高爾基體配置的裂解物。制備含有完整的細胞器和用于測試細胞器功能性的裂解物的合適方法描述在例如Moreau 等人，(1991) J. Biol. Chem. 266 (7) : 4329-4333 ;Moreau 等人，(1991) J. Biol.Chem. 266(7) :4322-4328 ;Rexach等人，(1991) J. Cell Biol. 114(2) :219-229 JPPaulik等人，(1999) Arch. Biochem. Biophys. 367 (2) : 265-273 中。靶分子在本文中指任何含有末端甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的分子，或者當在真菌來源的細胞中表達時，含有甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的任何分子。合適的革巴分子包括病原體蛋白，例如破傷風類毒素或白喉類毒素；病毒表面蛋白，例如巨細胞病毒(CMV)糖蛋白B、H和gCIII，人免疫缺陷病毒(HIV-I)衣殼糖蛋白，勞氏肉瘤病毒(RSV)衣殼糖蛋白，單純皰疹病毒(HSV)衣殼糖蛋白，Epstein Barr病毒(EBV)衣殼糖蛋白，varicella-zoster病毒(VZV)衣殼糖蛋白，人乳頭瘤病毒(HPV)衣殼糖蛋白，流感病毒糖蛋白和肝炎家族表面抗原；溶酶體蛋白(例如，酸性a葡萄糖苷酶、a半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、腦苷脂酶或半乳糖腦苷脂酶)；胰島素；胰高血糖素；生長因子；細胞因子；趨化因子；和抗體或其片段。生長因子包括例如血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)素、血小板來源的生長因子(PDGF)、紅細胞生成素(EPO)、Thrombopoietin (TPO),Myostatin (⑶F-8)、生長分化因子-9 (⑶F9)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF或FGF2)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)。細胞因子包括例如白介素，如 IL-I 至 IL-33 (例如，IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13 或 IL-15)。趨化因子包括例如 1-309、TCA-3、MCP-UMIP-I a、MIP-I^ 、RANTES、C10、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-1y、Eotaxin、MCP_5、MCP-4、NCC-I、Ck ^ 10、HCC-I、Leukotactin-I、LEC, NCC-4、TARC, PARC 或 Eotaxin-2。還包括腫瘤糖蛋白(例如，腫瘤相關抗原)，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘液素、HER-2/neu和前列腺特異性抗原(PSA) (Henderson 和 Finn, Advances in Immunology, 62, pp. 217-56 (1996) ) 在一些實施方案中，靶蛋白可以是與溶酶體貯積癥相關的，所述靶蛋白包括例如酸性a葡萄糖苷酶、a半乳糖苷酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、0 -D-半乳糖苷酶、P -葡萄糖苷酶、3 -氨基己糖苷酶、3 -D-甘露糖苷酶、a -L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N乙酰氨基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖酸(iduronate)-2-硫酸酯酶、a -葡萄糖胺-N-乙酰轉移酶、^ -D-葡萄糖酸酶、透明質酸酶、a -L-甘露糖苷酶、a -神經(jīng)氨酸苷酶、磷酸轉移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、神經(jīng)磷脂酶、硫酯酶、組織蛋 白酶K和脂蛋白脂肪酶。在一些實施方案中，靶蛋白是融合蛋白，其中靶蛋白與另一種多肽序列、或與聚合物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測的部分(例如，熒光素、冷光素或放射性)融合。例如，靶蛋白可以與聚合物(例如，聚乙二醇)連接，增加小蛋白的分子量和/或增加循環(huán)駐留時間。脫帽M6P殘基的體內方法本文描述的遺傳改造過的細胞可用于生產含有脫帽M6P殘基的靶分子。例如，基于細胞的方法可以包括導入遺傳改造過的真菌細胞中，使得包括編碼甘露糖苷酶的核酸、編碼靶分子的核酸，其中細胞生產含有脫帽末端M6P殘基的靶分子。在一些實施方案中，編碼甘露糖苷酶和靶分子的核酸含有分泌序列，使得甘露糖苷酶和靶分子共同分泌。本文描述的遺傳改造過的細胞含有編碼甘露糖苷酶的核酸，可用于產生一種或多種具有脫帽末端M6P殘基的靶分子。適合體內生產脫帽末端M6P殘基的細胞可以是真菌來源的，包括解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、甲基營養(yǎng)型酵母(例如，假絲酵母屬、漢遜酵母屬、Oogataea、畢赤酵母屬或隱球酵母屬的甲基營養(yǎng)型酵母)或者曲霉屬、木霉屬、鏈胞霉屬、鐮刀霉屬或金孢子菌屬的絲狀真菌。示例性的真菌物種包括但不限于 Pichia anomala、Pichia bovis、Pichia canadensis、Pichia carsonii、Pichiafarinose、Pichia fermentans、Pichia fluxuum、Pichia membranaefaciens、Pichiamembranaefaciens、Candida valida、Candida albicans、Candida ascalaphidarum、Candida amphixiae、Candida Antarctica、Candida atlantica、Candida atmosphaerica、Candida blattae、Candida carpophila、Candida cerambycidarum、Candida chauliodes、Candida corydalis、Candida dosseyi、Candida dubliniensis、Candida ergatensis、Candida fructus、Candida glabrata、Candida fermentati、Candida guilliermondii、Candida haemulonii、Candida insectamens、Candida insectorum、Candida intermedia、Candida jeffresii、Candida kefyr、Candida krusei、Candida lusitaniae、CandidaIyxosophila^ Candida maltosa、Candida membranifaciens、Candida milleri、Candidaoleophila、 Candida oregonensis、 Candida parapsilosis、 Candida quercitrusa、Candida shehatea、Candida temnochilae、Candida tenuis、Candida tropical is、Candida tsuchiyae、Candida sino Iaborantium^ Candida so jae ^ Candida viswanathii、Candida utilis、Oogataea minuta、Pichia membranaefaciens、Pichiasilvestris^Pichia membranaefaciens、Pichia chodati、Pichia membranaefaciens、Pichiamenbranaefaciens、Pichia minuscule、Pichia pastoris、Pichia pseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pichia saitoi、Pichia silvestrisi、Pichiastrasburgensis、 Pichia terricola、 Pichia vanriji、 Pseudozyma Antarctica、Rhodosporidium toruloides、 Rhodotorula glutinis、 Saccharomyces bayanus、Saccharomyces bayanus、 Saccharomyces momdshuricus、 Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus、 Saccharomyces cerevisiae、 Saccharomyces bisporus、Saccharomyces chevalieri、 Saccharomyces delbrueckii、 Saccharomyces exiguous、Saccharomyces fermentati、 Saccharomyces fragilis、 Saccharomyces marxianus、Saccharomyces mellis、Saccharomyces rosei、Saccharomyces rouxii、Saccharomycesuvarum、 Saccharomyces willianus、 Saccharomycodes ludwigii、 Saccharomycopsis capsularis、Saccharomycopsis fibuligera、Saccharomycopsis fibuligera、Endomyceshordei、Endomycopsis fobuligera. Saturnispora saitoi、Schizosaccharomycesoctosporus、Schizosaccharomyces pombe、Schwanniomyces occidentalism Torulasporadelbrueckii、 Torulaspora delbrueckii、 Saccharormyces dairensis、 Torulasporadelbrueckii、 Torulaspora fermentati、 Saccharomyces fermentati、 Torulasporadelbrueckii、 Torulaspora rosei、 Saccharomyces rosei, Torulaspora delbrueckii、Saccharomyces rosei、 Torulaspora delbrueckii、 Saccharomyces delbrueckii、Torulaspora delbrueckii、 Saccharomyces delbrueckii、 Zygosaccharomycesmongolicus、Dorulaspora globosa、Debaryomyces globosus、Torulopsis globosa、Trichosporon cutaneum、 Trigonopsis variabilis、 Williopsis californica、Williopsis saturnus、Zygosaccharomyces bisporus、Zygosaccharomyces bisporus、Debaryomyces disporua.Saccharomyces bisporas、 Zygosaccharomyces bisporus、Saccharomyces bisporus、Zygosaccharomyces mellis、Zygosaccharomyces priorianus、Zygosaccharomyces rouxiim、 Zygosaccharomyces rouxii、 Zygosaccharomycesbarkeri、 Saccharomyces rouxii、 Zygosaccharomyces rouxii、 Zygosaccharomycesmajor、Saccharomyces rousii、Pichia anomala、Pichia bovis、Pichia Canadensis、Pichia carsonii、Pichia farinose、Pichia fermentans、Pichia fluxuum、Pichiamembranaefaciens、Pichia pseudopolymorpha、Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pseudozyma Antarctica、Rhodosporidium toruloides、Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula glutinis^Saccharomyces bayanus、Saccharomyces bayanus、Saccharomycesbisporus、 Saccharomyces cerevisiae、 Saccharomyces chevalieri、 Saccharomycesdelbrueckii、 Saccharomyces fermentati、 Saccharomyces fragilis、 Saccharomycodesludwigii、 Schizosaccharomyces pombe、 Schwanniomyces occidentalism Torulasporadelbrueckii、Torulaspora globosa、Trigonopsisvariabi I is、Williopsis californica、Williopsis saturnus、Zygosaccharomyces bisporus、Zygosaccharomyces mellis 或Zygosaccharomyces rouxii。示例性的絲狀真菌包括曲霉的多個物種，包括但不限于Aspergillus caesiellus、白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergilluscarneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、彎頭曲霉(Aspergillus deflectus)、黃曲霉、煙曲霉、灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)、構巢曲霉、黑曲霉、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus )、Aspergilluspenicilloides、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、醬油曲霉、Aspergillus sydowi>Aspergillus tamari、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)或米色曲霉(Aspergillus versicolor)。在如本文所述的遺傳改造前的此類細胞可以從多個商業(yè)來源和研究資源機構中獲得，例如美國典型培養(yǎng)物收藏中心(Rockville，MD)。靶分子包括蛋白質，例如本文所述的任何靶蛋白(見上文)。除編碼甘露糖苷酶的外源性核酸外，遺傳改造過的細胞可以包括一個或多個遺傳修飾，例如(i)刪除了編碼外部鏈延伸(OCHl)蛋白的內源性基因；(ii)導入編碼能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽的重組核酸(例如，來自解脂耶氏酵母、釀酒酵母、Ogataea minuta、畢赤酵母或白色念珠菌的MNN4多肽)，增加甘露糖殘基的磷酸化；(iii)導入或撥打干擾OCHl蛋白功能性表達的RNA分子；(iv)導入編碼具有N-糖基化活性的野生型(例如，內源性或外源性)蛋白質的重組核酸(即，表達具有N-糖基化活性的蛋白質)；(v)導入編碼上述靶分子的重組核酸；或(V)改變一個或多個編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的內源性基因的啟動子或增強子元件，從而改變其編碼的蛋白質的表達。RNA分子包括例如小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA (shRNA)、反義RNA或微RNA (miRNA)。遺傳改造還包括改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的內源性基因，產生具有添加(例如，異源序列)、刪除或取代(例如，突變如點突變；保守或非保守突變)的蛋白質。突變可以是特異性導入的(例如，通過定點誘變或同源重組)或者可以是隨機導入的(例如，可以化學誘變細胞，如中所述Newman和Ferro-Novick(1987)J. Cell Biol.105(4):1587)。本文所述的遺傳修飾可以導致一種或多種的(i)在遺傳改造過的細胞中，一種或多種活性的增加，(ii)在遺傳修飾過的細胞中，一種或多種活性的減少，或(iii)在遺傳修飾過的細胞中，一種或多種活性的定位或胞內分布改變?？梢岳斫猓囟ɑ钚缘牧康脑隽?(例如，促進甘露糖基磷酸化)可能是由于過表達一種或多種能夠促進甘露糖基磷酸化的蛋白質，內源性基因拷貝數(shù)的增加(例如，基因復制)，或內源性基因的啟動子或增強子的改變，刺激由基因編碼的蛋白質的表達增加。一種或多種特定活性的減少可能是由于過表達突變形式(例如，顯性負突變形式)、導入或表達一種或多種干擾RNA分子，降低具有特定活性的蛋白質的表達，或者刪除一種或多種編碼具有特定活性的蛋白質的內源基因。為了通過同源重組破壞基因，可以以包括可選擇的標志物的方式構建“基因替代” 載體。可選擇的標志物基因可以與長度足以介導同源重組的基因部分的5’和3’端有效連接?？蛇x擇的標志物可以是任何一種補償宿主細胞營養(yǎng)缺陷型的基因或者提供抗體耐受性的基因，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其他合適的可選擇的標志物包括使酵母細胞產生氯霉素抗性的CAT基因，或由于表達-半乳糖苷酶而導致藍色克隆的IacZ基因。然后，使用本領域普遍已知的方法(見下文)，將基因替代載體的線性化DNA片段導入細胞中?？梢曰谶x擇標志物確定線性片段與基因組的整合和基因的破壞，并可以通過例如Southern印跡分析驗證。可以通過例如Cre-IoxP系統(tǒng)(見下文)從宿主細胞的基因組中去除選擇標志物?？蛇x的，可以以包括待破壞的基因部分的方式構建基因替代載體，所述部分缺少任何內源基因啟動子序列，并不編碼基因編碼序列或只編碼基因編碼序列的失活片段。“失活片段”是編碼蛋白質的基因的片段，具有從全長基因編碼序列產生的蛋白質的少于約10%(例如，少于約9%、少于約8%、少于約7%、少于約6%、少于約5%、少于約4%、少于約3%、少于約2%、少于約1%或0%)的活性。此類基因部分插入到載體中，插入的方式使得沒有任何已知的啟動子序列與基因序列有效連接，但終止密碼子和轉錄終止序列與基因序列部分有效連接。之后，可以將該載體線性化為基因序列部分，并轉化到細胞中。通過單同源重組，該線性化載體之后整合到基因的內源配對物中。表達載體可以是自主型或整合型?？梢詫⒅亟M核酸(例如，編碼甘露糖苷酶的核酸)以表達載體的形式導入到細胞中，例如質粒、噬菌體、轉座子、粘?；虿《绢w粒。重組核酸可以在染色體外維持，或者可以整合到酵母細胞染色體DNA中。表達載體可以忽悠選擇標志物基因，所述基因編碼在選擇條件下細胞存活必需的蛋白質(例如，編碼尿嘧啶生物合 成必需的酶的URA3，或編碼色氨酸生物合成必需的酶的TRPl )，允許檢測和/或選擇那些被所需核酸轉化的細胞(參見例如，美國專利號4，704, 362)。表達載體還可以包括自主復制序列(ARS)。例如，美國專利號4，837，148描述了為在畢赤酵母中維持質粒提供核酸手段的自主復制序列。整合型載體公開在例如美國專利號4，882，279中。整合型載體一般至少包括如下連續(xù)排列的序列第一可插入的DNA片段、可選擇的標志物基因和第二可插入的DNA片段。第一和第二可插入的DNA片段都是長度約200個(例如，約250、約300、約350、約400、約450、約500個，或約1000個或更多個)核苷酸，并具有與待轉化的物種的基因組DNA部分同源的核苷酸序列。將含有用于表達的目標基因的核苷酸序列(例如，編碼具有N糖基化活性的蛋白質的基因)插入到該載體的第一和第二可插入的DNA片段之間，不論是在標志物基因之前或之后?？梢栽谵D化前將整合型載體線性化，以促進目標核苷酸序列整合到宿主細胞基因組中。表達載體的特征可以是處于酵母(例如，解脂耶氏酵母、Ogataea minuta、畢赤酵母或其他合適的真菌物種)啟動子控制下的重組核酸，使得其能夠在真菌細胞中表達。合適的酵母啟動子包括例如ADC1、TPI1、ADH2、hp4d、POX和GallO (參見例如，Guarente等人，
(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA79 (23) :7410)啟動子。其他合適的啟動子描述在例如Zhu和 Zhang(1999)Bioinformatics 15(7-8) :608-611 和美國專利號 6，265，185 中。啟動子可以是組成型或誘導型(條件性)的。組成型啟動子理解為其表達在標準培養(yǎng)條件下恒定的啟動子。誘導型啟動子是響應一種或多種誘導條件的啟動子。例如，誘導型啟動子可以是化學調控的(例如，轉錄活性受化學誘導劑的存在或缺失調控的啟動子，例如乙醇、四環(huán)素、類固醇、金屬或其他小分子)或物理調控的(例如，轉錄活性受物理誘導因子的存在或缺失調控的啟動子，例如光或高溫、低溫)。誘導型啟動子還可以受一種或多種轉錄因子的間接調控，所述轉錄因子自身受化學或物理條件的直接調控。可以理解，其他的遺傳改造修飾也可以是條件性的。例如，可以使用如定點DNA重組條件性的刪除基因，例如Cre-IoxP系統(tǒng)(參見例如，Gossen等人，(2002) Ann. Rev.Genetics 36:153-173 和美國申請公開號 20060014264)?？梢允褂枚喾N方法將重組核酸導入本文描述的細胞中，例如原生質體技術或完整的細胞氯化鋰酵母轉化方法。其他可用于轉化質?；蚓€性核酸載體的方法描述在例如美國專利號 4，929，555 ；Hinnen 等人，(1978)Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929 ；Ito 等人，
(1983)J. Bacteriol. 153:163 ;美國專利號 4, 879, 231 ;和 Sreekrishna 等人，(1987)Gene59:115，其公開內容通過引用全文整合到本文中。也可以使用電穿孔和PEG1000完整細胞轉化方法，如 Cregg 和 Russel, Methods in Molecular Biology Pichia Protocols,第 3章，Humana Press, Totowa, N. J ,第 27-39 頁(1998)所述?？梢允褂们‘?shù)募夹g選擇轉化的真菌細胞，包括但不限于在缺少所需的生物化學產物(由于細胞的營養(yǎng)缺陷型)的條件下，培養(yǎng)轉化后的營養(yǎng)缺陷型細胞，選擇和檢測新的表型，或者培養(yǎng)在存在對缺少包含在轉化子中的抗性基因的酵母有毒的抗生素的條件下。 還可以通過基因組中整合的表達盒選擇和/或驗證轉化子，可以通過例如Southern印跡或PCR分析來評估。在將載體導入目標靶細胞之前，載體可以在如上所述的細菌細胞中生長，例如大腸桿菌(E. coli)?？梢酝ㄟ^任何本領域已知的從細菌環(huán)境中獲得純化載體DNA的方法，從細菌細胞中分離載體DNA。可以用苯酚、氯仿和乙醇專門提取純化的載體DNA，確保質粒DNA制品中不存在任何E. coli蛋白，因為這些蛋白質對于哺乳動物細胞而言是有毒的。在一些實施方案中，遺傳改造過的真菌細胞缺少OCHl基因或其基因產物(例如，mRNA或蛋白質)，是OCHl活性缺陷的。在一些實施方案中，遺傳改造過的細胞表達能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽(例如，來自解脂耶氏酵母、釀酒酵母、Ogataea minuta、畢赤酵母或白色念珠菌的MNN4多肽，或來自畢赤酵母的PNOl多肽)。例如，真菌細胞可以表達解脂耶氏酵母的 MNN4 多肽(Genbank 登錄號=XM 503217 ；Genolevures Ref :YALI0D24101g)。在一些實施方案中，遺傳改造過的細胞是OCHl活性缺陷的，并表達能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽。在脫帽M6P殘基后，可以分離靶分子。在一些實施方案中，靶分子留在酵母細胞內，并在細胞裂解時釋放。在一些實施方案中，靶分子通過編碼序列提供的機制(外源性核酸天然的，或者改造到表達載體中)被分泌到培養(yǎng)基中，所述機制指導分子從細胞的分泌?？梢酝ㄟ^多種用于檢測分子存在的標準規(guī)程驗，證存在于細胞裂解物或培養(yǎng)基中的脫帽后的靶分子。例如，當改變的靶分子是蛋白質時，此類規(guī)程可以包括但不限于用特異性針對改變的靶蛋白(或靶蛋白本身)的抗體進行免疫印跡或放射性免疫沉淀，結合特異性針對改變的靶蛋白(或靶蛋白本身)的配體，或者測試改變的靶蛋白(或靶蛋白本身)的特定酶活性。在使用本文描述的方法生產的靶分子中，糖蛋白上至少47% (例如，至少50，55，60, 65，70, 75，80, 85或90%)的N-聚糖具有末端磷酸-6-甘露糖殘基?？梢詮腄SA-FACE電色譜圖s的峰面積中估計具有末端磷酸-6-甘露糖殘基的N-聚糖的百分比。在一些實施方案中，分離后，可以將脫帽的靶分子連接到異源部分上，例如使用酶手段或化學手段?！爱愒床糠帧敝溉魏闻c改變的靶分子連接(例如，共價或非共價的)的組件，所述組件不同于最初存在于改變的靶分子中的組件。異源部分包括例如聚合物、載體、佐齊U、免疫毒素或可檢測的部分(例如，熒光素、冷光素或放射性)部分。在一些實施方案中，可以向改變的靶分子上添加額外的N-聚糖。
用于檢測靶分子糖基化的方法包括DNA測序儀輔助的(DSA)、熒光團輔助的碳水化合物電泳(FACE)，或表面增強的激光吸附/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF MS)。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中例如糖蛋白被變形，然后固定在例如膜上的。然后，可以用合適的還原劑還原糖蛋白，例如_■硫蘇糖醇(DTT)或0疏基乙醇?？梢允褂盟釋⒌鞍踪|的疏基羧化，例如碘乙酸。之后，可以使用酶從蛋白質中釋放N-聚糖，例如N-葡萄糖苷酶F。任選的，可以通過還原性的胺化作用重建和衍生N-聚糖。然后，可以濃縮衍生的N-聚糖。適合N-聚糖分析的儀器包括例如ABI PRISM 377DNA測序儀(Applied Biosystems)?？梢允褂美鏕ENESCAN 3. I軟件(Applied Biosystems)實施數(shù)據(jù)分析。任選的，可以用一種或多種酶進一步處理分離的甘露糖蛋白，驗證其N-聚糖狀態(tài)。N-聚糖分析的其他方法包括例如質譜(例如，MALDI-TOF-MS)、正常相的高壓液相色譜(HPLC)、逆相層析和離子交換層析(例如，當未標記聚糖時，用脈沖安培電流檢測，如果恰當?shù)臉擞浟司厶牵瑒t用UV吸光值或突光檢測)。還參見 Callewaert 等人，(2001) Glycobiology 11 (4) : 275-281 和 Freire等人，(2006) Bioconjug. Chem. 17(2) : 559-564。培養(yǎng)改造過的細胞、本文件還提供了本文描述的任何改造細胞的基本純的培養(yǎng)物。在本文中，遺傳改造過的細胞的“基本純的培養(yǎng)物”是這樣的細胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物中少于約40% (S卩，少于約 35% ；30% ；25% ；20% ；15% ；10% ；5% ；2% ；1% ；0. 5% ；0. 25% ；0. 1% ；0. 01% ；0. 001% ；0. 0001% ；
或者甚至更少)的總活細胞數(shù)是遺傳改造過的細胞以外的活細胞，例如，細菌、真菌(包括酵母)、真菌原生質或原生動物細胞。術語“約”在上下文中意指相關的百分比可以是比所述百分比高或低15%。因而，例如，約20%可以是17%至23%。此類遺傳改造過的細胞的培養(yǎng)物包括細胞和生長培養(yǎng)基、儲藏培養(yǎng)基或運輸培養(yǎng)基?；|可以是液體、半固體(例如，凝膠狀基質)或冷凍的。培養(yǎng)物包括生長在液體中的細胞，或生長在半固體基質中/上的細胞，或者在儲藏或運輸基質中儲藏或運輸?shù)募毎ɡ鋬鰞Σ鼗蜻\輸基質。培養(yǎng)物是在培養(yǎng)容器或儲藏容器或底物(例如，培養(yǎng)皿、瓶或管，或者儲藏瓶或管)中的。本文描述的遺傳改造過的細胞可以作為例如冷凍的細胞懸浮液儲藏，例如在含有冷凍保護劑(如甘油或蔗糖)的緩沖液中，或作為凍干的細胞儲藏?？蛇x的，可以作為干燥的細胞制品儲藏，所述細胞制品是通過例如流體床干燥或噴霧干燥或任何合適的干燥方法獲得的。代謝功能障礙具有脫帽末端M6P殘基的分子可用于治療多種代謝功能障礙。代謝功能障礙是影響單個人(或動物)細胞中的能量產生的功能障礙。大部分的代謝功能障礙是遺傳的，雖然一些可以是“作為飲食、毒素、感染等的結果而“獲得的”。遺傳性代謝功能障礙也稱為先天性代謝錯誤。一般而言，遺傳性代謝功能障礙是由遺傳缺陷引起的，所述缺陷導致細胞代謝過程中一些步驟必需的酶缺失或錯誤的構建。最大類的代謝功能障礙是碳水化合物代謝功能障礙、氨基酸代謝功能障礙、有機酸代謝功能障礙(有機酸尿)、脂肪酸氧化和線粒體代謝功能障礙、葉啉代謝功能障礙、嘌呤或嘧啶代謝功能障礙、類固醇代謝功能障礙、線粒體功能障礙、過氧化物酶體功能障礙和溶酶體貯積癥(LSD)?？梢酝ㄟ^施用一種或多種具有脫帽末端M6P殘基的分子(或同一分子的藥物組合物)治療的代謝功能障礙的實例可以包括遺傳性血色素沉積癥、眼皮膚白化病、蛋白C缺陷、I型遺傳性血管性水腫、先天性蔗糖酶-異麥芽糖缺陷、II型Crigler-Najjar綜合征、Laron綜合征、遺傳性髓過氧化物酶、原發(fā)性甲狀腺機能減退、先天性長QT綜合征、酪氨酸結合球蛋白缺陷、家族性高膽固醇血癥、家族性高乳糜微粒血癥、Abeta-脂蛋白血癥、低血漿脂蛋白A水平、伴隨肝損傷的遺傳性肺氣腫、先天性甲狀腺機能減退、成骨不全癥、遺傳性低纖維蛋白原血癥、a-抗糜蛋白酶缺陷、腎源性尿崩癥、腺苷脫氨酶缺陷、Pelizaeus Merzbacher病、IIA型血管性血友病、因子V和VIII組合缺陷、遲發(fā)型脊稚骨N發(fā)育不良、無脈絡膜癥、I細胞病、Batten病、毛細管共濟失調、ADPKD-常染色體顯性遺傳多囊腎病、微絨毛包含病、結節(jié)性硬化癥、眼腦腎Lowe綜合征、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、骨髓發(fā)育不良癥候群、Tangier病、家族性肝內膽汁淤積癥、X-連鎖腎上腺腦白質營養(yǎng)不良、Scott綜合征、I型和2型Hermansky-Pudlak綜合征、Zellweger綜合征、肢近端型點狀軟骨發(fā)育不良、常染色體隱性原發(fā)性高草酸鹽尿、Mohr Tranebjaerg綜合征、脊髓和bullar肌肉萎縮、原發(fā)性ciliary diskenesia (Kartagener綜合征 )、巨人癥和肢端肥大癥、乳漏、Addison病、腎上腺性男性化、Cushing綜合征、酮酸中毒、原發(fā)性或繼發(fā)性醛甾酮癥、Miller Dieker綜合征、無腦回、運動神經(jīng)元病、Usher綜合征、Wiskott-Aldrich綜
合征、Optiz綜合征、亨廷頓氏病、遺傳性胰腺炎、抗磷脂綜合征、重疊結締組織病、Sjogren綜合征、僵人綜合征、Brugada綜合征、Finnish型先天性腎臟綜合征、Dubin-Johnson綜合征、X連鎖的低磷酸鹽血癥、Pendred綜合征、持續(xù)性胰島素低血糖嬰兒、遺傳性球形紅細胞增多癥、無血漿銅藍蛋白、嬰兒神經(jīng)元蠟樣質脂褐質沉積癥、假性軟骨發(fā)育不全和多發(fā)性骨骺、Stargardt樣黃斑營養(yǎng)不良、X連鎖的進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮癥、常染色體顯性色素性視網(wǎng)膜炎、Wolcott-Rallison綜合征、Cushing病、肢節(jié)型肌營養(yǎng)不良癥、IV型粘多糖癥、遺傳性家族性Finish淀粉樣病變、肝糖儲積病、肉瘤、慢性骨髓單核細胞性白血病、心肌病、面生殖發(fā)育異常、Torsion病、亨廷頓氏病和脊髓小腦性共濟失調、遺傳性高同型半胱氨酸血癥、多神經(jīng)病、低運動神經(jīng)元病、色素性視網(wǎng)膜炎、血清陰性關節(jié)炎、間質性肺纖維化、Raynaud 癥狀、Wegner 氏肉芽腫、preoteinuria、CDG-Ia> CDG-Ib> CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG-If、CDG-IIa、CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IId、Ehlers-Danlos 綜合征、多發(fā)性外生骨疣、Griscelli綜合征(I型或2型)或X連鎖的非特異性智力遲鈍。此外，代謝功能障礙還可以包括溶酶體貯積癥，例如但不限于費波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GMl-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、泰-薩二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、異染性腦白質營養(yǎng)不良、尼曼-匹克病(A、B和C型)、V型粘多糖病(Scheie disease), II型粘多糖病(Hunter disease)、IV型粘多糖病(Sanfilippo disease)、莫奎歐氏癥、VI型粘多糖病(Maroteaux-Lamy disease)、透明質酸酶缺乏癥、天冬氨酰葡萄糖胺尿癥、巖藻糖代謝病、甘露糖苷貯積癥、辛德勒病、I型唾液腺病、龐貝氏癥、骨密質發(fā)育不全、蠟樣脂褐質沉積癥、膽固醇酯沉積病、沃爾曼病、多種硫酸酯酶缺乏癥、半乳糖涎酸貯積癥、粘脂沉積癥(II、III和IV型)、胱氨酸病、唾液酸貯積功能障礙、具有Marinesco- Sjdgren綜合征的乳糜微滴滯留病、Hermansky-Pudlak 綜合征、Chediak-Higashi 綜合征、Danon 氏病或Geleophysic發(fā)育不良。代謝功能障礙的癥狀是多種多樣的，可以包括一種或多種的例如貧血、疲勞、易怒、低血小板、肝腫大、脾腫大、骨骼衰弱、肺損傷、感染(例如，胸腔感染或肺炎)、腎損傷、進行性腦損害、癲癇發(fā)作、超厚胎糞、咳嗽、哮鳴、過多的唾液或粘液產生、呼吸短促、腹痛、腸閉塞、繁殖力問題、鼻息肉、指甲/趾甲和皮膚的增生性病變、手足痛、血管角質瘤、少汗、角膜和晶狀體渾濁、白內障、二尖瓣脫垂和/或回流、心臟擴大癥、不耐低溫、行走困難、吞咽困難、進行性視力喪失、進行性聽力喪失、張力減退、巨舌、反射消失、下腰痛、睡眠呼吸暫停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前彎癥或脊柱側凸?？梢岳斫?，由于缺陷或缺少的蛋白質和導致的疾病表型(例如，代謝功能障礙的癥狀表現(xiàn))的不同性質，給定的功能障礙一般將只表現(xiàn)出特定功能障礙的特征性癥狀。例如，患法布里病(Fabry disease)的患者可以表現(xiàn)出上述癥狀特定子集，例如但不限于不耐低溫、角膜旋轉、疼痛、皮膚發(fā)紅、惡心或腹瀉?；加懈咝喜〉幕颊呖梢员憩F(xiàn)出脾腫大、肝硬化、抽搐、張力亢進、窒息、骨質疏松或皮膚褪色。除了施用一種或多種本文描述的脫帽的分子外，還可以通過正確的營養(yǎng)和維生素(例如，輔助因子療法)、物理療法和疼痛藥物治療代謝功能障礙。根據(jù)給定的代謝功能障礙的特定性質，患者可以在任何年齡表現(xiàn)出這些癥狀。在許多情況下，癥狀可以出現(xiàn)于兒童期或早成年期。例如，法布里病(Fabry disease)的癥狀可以出現(xiàn)于較早的年齡段，例如10歲或11歲。 在本文中，“處于出現(xiàn)代謝功能障礙的風險”的對象是這樣的對象，所述對象具有出現(xiàn)功能障礙的傾向，即，由于酶突變的結果導致出現(xiàn)代謝功能障礙的遺傳傾向，例如酸性a葡萄糖苷酶、a半乳糖苷酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、^ -D-半乳糖苷酶、^ -葡萄糖苷酶、
氨基己糖苷酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a -N乙酰氨基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖酸-2-硫酸酯酶、a -葡萄糖胺-N-乙酰轉移酶、^ -D-葡萄糖酸酶、透明質酸酶、a -L-甘露糖苷酶、a -神經(jīng)氨酸苷酶、磷酸轉移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、神經(jīng)磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。顯而易見的，“處于出現(xiàn)代謝功能障礙的風險”的對象不是目標物種中的所有對象?！皯岩删哂泄δ苷系K”的對象是這樣的對象，所述對象具有一種或多種代謝功能障礙的癥狀，例如本文描述的任何功能障礙的癥狀藥物組合物和治療方法具有脫帽的M6P殘基的靶分子可以整合到含有治療有效量的分子和一種或多種佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑的藥物組合物中?？山邮艿南♂寗⑤d體和賦形劑通常不會負面的影響受體的內穩(wěn)態(tài)(例如，電解質平衡)。可接受的載體包括生物可兼容的、惰性的或生物可吸收的鹽、緩沖試劑、寡糖或多糖、聚合物、改善粘性的試劑、防腐劑等。一個示例性的載體是生理鹽溶液(0. 15M NaCl，pH 7. 0至7. 4)。另一個示例性的載體是50mM磷酸鈉，IOOmM氯化鈉。制備和施用藥物組合物的其他細節(jié)可見于例如Remington’ sPharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co. , Easton, Pa.)中。組合物中還可以整合補充的活性化合物。含具有脫帽的M6P殘基的分子組合物的施用可以使系統(tǒng)性的或局部的。藥物組合物可以如下制備使得它們適合不經(jīng)腸道的和/或經(jīng)腸道的施用。特定的施用方式包括皮下、靜脈內、肌肉內、腹腔內、透皮的、鞘內的、口腔的、直腸的、臉頰的、局部的、鼻腔的、眼的、關節(jié)內的、動脈內的、蛛網(wǎng)膜下的、支氣管的、陰道的和子
宮內的施用。施用可以是周期性的注射藥物組合物的大藥丸(boIus )，或者可以通過外部(例如，IV袋)或內部(例如，生物可侵蝕的植入物、生物人工器官或植入后改變的N糖基化分子生產細胞的克隆)的儲槽進行靜脈內或腹腔內不間斷或持續(xù)的施用。參見例如美國專利號4, 407,957,5, 798, 113和5，800，828。藥物組合物的施用可以使用合適的遞送手段實現(xiàn)，例如泵(參見例如，Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993) ；Cancer, 41:1270 (1993)；Cancer Research, 44:1698 (1984));微膠囊(參見例如，美國專利號 4，352，883 ;4，353，888和5，084, 350);連續(xù)釋放的聚合物植入物(參見例如，Sabel，美國專利號4，883，666);大膠囊(參見例如，美國專利號5，284，761,5, 158，881,4, 976，859和4，968，733，和公開的PCT專利申請W092/19195、WO 95/05452);皮下、靜脈內、動脈內、肌肉內或其他合適位點的注射；或口服施用，以膠囊、液體、片劑、丸劑或緩釋配方的形式。不經(jīng)腸道的遞送系統(tǒng)的實例包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的灌注系統(tǒng)、泵遞送、封閉的細胞遞送、脂質體遞送、針頭遞送的注射、無針頭注射、噴霧器、煙霧器和透皮貼。適合不經(jīng)腸道的施用的配方通常含有改變的N糖基化分子的無菌含水制品，優(yōu)選是與受體的血液等滲的(例如，生理鹽水)。配方可以存在單元劑量或多劑量形式。
適合口服施用的配方可以作為分散單元存在，例如膠囊劑、扁囊劑(cachet)、片劑或潤喉糖，都含有預定量的改變的N糖基化分子；或作為含水液體或不含水液體中的懸浮液存在，例如糖漿、酏劑、乳化液或飲劑(draught)。適合局部施用的具有脫帽的M6P殘基的分子可以作為例如乳膏、噴霧、泡沫劑、凝膠、油膏、軟膏或干擦劑(dry rub)施用給哺乳動物(例如，人類患者)。干擦劑可以在施用位點再水合。此類分子還可以直接融合到(例如，浸泡到或干燥為)可以之后應用于局部的繃帶、紗布或貼劑上。此類分子還可以在局部施用的繃帶、紗布或貼劑上維持成半固體、凝膠狀或完全的液體狀態(tài)(參見例如，美國專利號4，307，717)。藥物組合物的治療有效量可以按本領域技術人員可認知的劑量方案向需要的對象施用。例如，可以向對象系統(tǒng)性的施用組合物，按例如每次劑量0. 01 u g/kg至10，000 u g/kg對象體重。在另一個實例中，劑量是從每次劑量I U g/kg至100 u g/kg對象體重。在另一個實例中，劑量是從每次劑量Iu g/kg至30 ii g/kg對象體重，例如從每次劑量3 ii g/kg至10 ii g/kg對象體重。為了使治療效果最佳，可以首先以不同的劑量方案施用具有脫帽的M6P殘基的分子。單元劑量和方案取決于這樣的因素，包括例如哺乳動物的物種、其免疫狀態(tài)、哺乳動物的體重。通常，可以使用恰當?shù)暮Y選測定監(jiān)控此類分子在組織中的水平，所述測定作為臨床測試程序的一部分，例如確定給定治療方案的功效。具有脫帽的M6P殘基的分子的給藥頻率落入醫(yī)學實踐人員(例如，醫(yī)生或護士)的技能和臨床判斷范圍內。通常，施用方案是通過建立最佳施用參數(shù)的臨床試驗建立的。然而，實踐人員可以根據(jù)對象的年齡、健康、體重、性別和醫(yī)學狀態(tài)，改變此類施用方案。給藥頻率可以根據(jù)治療是否是預防性或治療性的而改變?？梢酝ㄟ^例如細胞培養(yǎng)或實驗動物中已知的制藥方法，確定此類分子或其藥物組合物的毒性和治療功效。這些方法可用于例如確定LD50 (50%的群體致死的劑量)和ED50(在50%的群體中治療有效的劑量)。在毒性效應和治療效應之間的劑量比例是治療指數(shù)，可表示為LD50/ED50比。表現(xiàn)出高治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的?？梢允褂帽憩F(xiàn)出毒副作用的藥物組合物，但是應該仔細的設計遞送系統(tǒng)，將此類混合物靶向到受影響組織的位點，從而使對正常細胞(例如，非靶細胞)的潛在損傷最小化，從而降低副作用。從細胞培養(yǎng)測定和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于配置在恰當對象(例如，人類患者)中使用的劑量范圍。此類藥物組合物的劑量一般落入循環(huán)濃度范圍內，包括沒有或只有極小毒性的ED50。劑量可以 在該范圍內改變，取決于使用的制劑類型和利用的施用途徑。對于所使用的本文描述的藥物組合物(例如，用于治療對象中的代謝功能障礙)，可以從細胞培養(yǎng)測定中初步估計治療有效劑量?？梢栽趧游锬Ｐ椭信渲瞥蛇@樣的劑量，所述劑量實現(xiàn)了包括細胞培養(yǎng)中確定的IC50 (即，實現(xiàn)了癥狀的半最大抑制的藥物組合物濃度)在內的循環(huán)血漿濃度范圍。此類信息可用于更精確的確定人中的有效劑量?？梢酝ㄟ^例如高性能的液相色譜測量血漿中的水平。如本文中定義的，具有脫帽的M6P殘基的分子的“治療有效量”是能夠在治療對象中產生醫(yī)學上理想的結果(例如，減輕一種或多種代謝功能障礙的癥狀)的分子的量。治療有效量(即，有效劑量)可以包括毫克或微克量的化合物/千克對象或樣品重量(例如，約I微克/千克至約500毫克/千克，約100微克/千克至約5毫克/千克，或約I微克/千克至約50微克/千克)。對象可以是任何哺乳動物，例如人(例如，人類患者)或非人靈長類(例如，黑猩猩、狒狒或猴子)、小鼠、大鼠、兔、荷蘭豬、沙鼠、田鼠、馬、家畜類(例如，牛、綿羊或山羊)、狗、貓、或鯨。本文描述的分子或其藥物組合物可以作為與另一只治療的組合療法向對象施用，例如，代謝功能障礙(例如，溶酶體貯積癥)的治療。例如，組合療法可以不看向對象(例如，人類患者)施用一種或多種其他試劑，所述試劑為患有或有風險出現(xiàn)(或懷疑患有)代謝功能障礙(例如，溶酶體貯積癥)的對象提供了治療益處。因而，化合物或藥物組合物和一種或多種其他試劑可以同時施用?？蛇x的，可以首先施用分子，其次施用一種或多種其他試劑，反之亦然。應理解，處于在先治療特別毒性(例如，具有顯著副作用的代謝功能障礙治療)的情況下時，本文描述的分子的施用可用于抵消和/或減少在先治療的量至足以產生相同或改善的治療益處但沒有毒性的水平。本文描述的任何藥物組合物可以與施用說明一起包括在容器、包裝或分配器中。下文是實踐本發(fā)明的實施例。實施例不以任何方式視為對本發(fā)明范圍的限制。
實施例實施例I產生具有高度磷酸化的N-聚糖的解脂耶氏酵母菌株為了上調解脂耶氏酵母的聚糖磷酸化，用2種額外的MNN4基因拷貝轉化MTLY60菌株，每種基因拷貝位于分離的表達載體中。MNN4基因參與增加酵母中的聚糖磷酸化。圖I含有克隆了 MNN4基因的pYLTmAX質粒的示意圖，所述質粒用于生產pYLTmAXMnn4，含有處于TEF啟動子控制下的MNN4開放閱讀框。制備含有2種額外的MNN4基因拷貝的菌株，I種處于hp4d啟動子的控制下，I種處于TEFl啟動子的控制下。從MTLY60 A ochl菌株(I份MNN4野生型拷貝)、MTLY60 A ochl+Hp4dMNN4 菌株(1WT+1 份額外的 MNN4 拷貝)和 MTLY60 A ochl+Hp4dMNN4+TEFMNN4菌株(1WT+2份額外的MNN4拷貝)制備N聚糖，和通過DNA測序儀輔助的(DSA)、突光團輔助的碳水化合物電泳(FACE)。參見Callewaert等人，Glycobiology11(4) :275-281(2001)?；趫D2中的結果，可以推斷含I份額外拷貝的菌株中磷酸化峰是上調的，并出現(xiàn)雙磷酸化的峰。在含2份額外拷貝的菌株中，雙磷酸化的峰高得多，而中性的Man8GlcNAc2糖的峰低得多。實施例2鑒別可以脫帽真菌來源的磷酸化聚糖中存在的加蓋(capping)的甘露糖殘基的甘露糖苷酶活性酵母和絲狀真菌對糖的磷酸化導致甘露糖-磷酸-甘露糖二酯連接(圖3)。為了獲得磷酸處于單酯連接中的結構，需要能夠水解甘露糖-磷酸 連接的甘露糖苷酶，使磷酸保持連接在高甘露糖聚糖結構的6位上。Chiba等人，Glycobiology，12(12) :821-8(2002)指出，纖維單胞菌物種中的甘露糖苷酶能夠脫帽甘露糖。然而，Chiba等人僅部分的純化了甘露糖苷酶蛋白，不能鑒別編碼蛋白質的基因。 從LMG細菌收藏中心獲得纖維化纖維單胞菌(Cellulosimicrobium cellulans,也稱為溶黃嘌呤厄菌(Oerskovia xanthineo Iytica)和藤黃節(jié)桿菌(ArthrobacterIuteus))的分離物，并測試所生產的甘露糖苷酶活性。細菌在30°C和含甘露糖的基質中生長，向培養(yǎng)基中分泌甘露糖苷酶。從培養(yǎng)物獲得細菌上清液(SN)，通過將SN與分離的源自實施例I所述過表達MNN4的菌株中的N-聚糖孵育，測試所需的甘露糖苷酶活性。在孵育后，通過DSA-FACE測定聚糖(圖4 )。在用SN處理后，聚糖獲得了額外的電荷，在電場中遷移更快，并移動到electroferogram的左手側。如果這些跑動快的結構確實是磷酸單酯取代的高甘露糖聚糖，則它們的尺寸將比運動到相同位置的中性產物更大。用磷酸酶處理此類聚糖可獲得跑得更慢的中性寡糖。如圖5所示，用胎牛腸磷酸酶(CIP)處理，獲得了表現(xiàn)出較低電泳遷移率的峰，證明磷酸是末端的且甘露糖是脫帽的。實施例3部分純化和講一步鑒別甘露糖苷酶為了純化甘露糖苷酶，將纖維化纖維單胞菌生長在IL的培養(yǎng)基B (Bagiyan等人，Eur. J. Biochem. 249(1) :286-92(1997))或培養(yǎng)基 A (Chiba 等人，2002，見上文)上。參見表I。之后，用40%和80%硫酸銨沉淀培養(yǎng)基，通過SDS-PAGE分析樣品。用含ImM CaClJA20mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5透析硫酸銨級分，然后在源自MNN4過表達菌株(實施例I)的寡糖上測試活性。表I培養(yǎng)基組分
培養(yǎng)基A (I升)培養(yǎng)基B (I升)
2g甘露聚糖如甘露聚糖
0. 5g (NH4)2SO42g (NH4)2SO權利要求
1.脫帽(uncapping)寡糖上的甘露糖_6_磷酸殘基的方法，所述方法包括 A)提供所述具有甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接的寡糖；和 B)將所述寡糖與能夠水解所述甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶接觸。
2.權利要求I的方法，其中所述甘露糖苷酶包括與SEQID NO: 50的I至774位殘基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3.權利要求I的方法，其中所述甘露糖苷酶包括與SEQID NO: 50的I至774位殘基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
4.權利要求I的方法，其中所述甘露糖苷酶包括與SEQID NO: 50的I至774位殘基所述的氨基酸序列或SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列具有至少98%同一性的氨基酸序列。
5.權利要求I的方法，其中對于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5 A偏差以內。
6.權利要求I的方法，其中所述甘露糖苷酶包括以下氨基酸序列，所述序列具有(i)GVGXXGXGG 基序，其中 X 是 Gly, Ala, Ser, Thr 或 Cys ; (ii) VRXE 基序，其中 X 是除 Pro 以外的任何氨基酸;(Ui)X1YQGX2基序，其中X1是Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr或Met，其中X2是Thr, Ser或Asn ;或(iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。
7.權利要求1-6的任一項的方法，其中所述接觸步驟是使用純化的甘露糖苷酶、重組的甘露糖苷酶、含有所述重組的甘露糖苷酶的細胞裂解物，或者含有所述重組的甘露糖苷酶的真菌細胞來實施的。
8.權利要求1-7的任一項的方法，其中所述寡糖與蛋白質連接。
9.權利要求7的方法，其中所述蛋白質是在真菌生物中表達的人蛋白。
10.權利要求9的方法,其中所述真菌生物是解脂耶氏酵母(YarrowiaIipolytica)或Arxula adeninivorans。
11.權利要求9的方法，其中所述真菌生物是甲基營養(yǎng)型酵母。
12.權利要求11的方法，其中所述甲基營養(yǎng)型酵母是畢赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、Oogataea minuta 或多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)。
13.權利要求9的方法，其中所述真菌生物是絲狀真菌。
14.權利要求13的方法，其中所述絲狀真菌選自淺藍灰曲霉(Aspergilluscaesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、彎頭曲霉(Aspergillus deflectus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、赫曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、Aspergillus penicilloides、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、醬油曲霉(Aspergillus sojae)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、Aspergillus tamari、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)和花斑曲霉(Aspergillusversicolor)。
15.權利要求8的方法，其中所述蛋白質是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結合片段，或融合蛋白。
16.權利要求15的方法，其中所述溶酶體蛋白是溶酶體酶。
17.權利要求16的方法，其中所述溶酶體蛋白與溶酶體貯積癥(LSD)相關。
18.權利要求17的方法，其中所述LSD是費波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GMl-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、泰-薩二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、異染性腦白質營養(yǎng)不良、尼曼-匹克病、V型粘多糖病(Scheie disease)、II型粘多糖病(Hunter disease)、IV型粘多糖病(Sanfilippo disease)、莫奎歐氏癥、VI型粘多糖病(Maroteaux-Lamy disease)、透明質酸酶缺乏癥、天冬氨酰葡萄糖胺尿癥、巖藻糖代謝病、甘露糖苷貯積癥、辛德勒病、I型唾液腺病、龐貝氏癥、骨密質發(fā)育不全、蠟樣脂褐質沉積癥、膽固醇酯沉積病、沃爾曼病、多種硫酸酯酶缺乏癥、半乳糖涎酸貯積癥、粘脂沉積癥、胱氨酸病、唾液酸貯積功能障礙、具有Marinesco- Sjogren綜合征的乳糜微滴滯留病、Hermansky-Pudlak綜合征、Chediak-Higashi 綜合征、Danon 氏病或Geleophysic 發(fā)育不良。
19.權利要求18的方法，其中所述LSD是龐貝氏癥或費波瑞病。
20.權利要求1-6的任一項的方法,其中所述甘露糖苷酶包括祀向序列。
21.生產具有末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白的方法，所述方法包括 提供經(jīng)過遺傳改造的真菌細胞，所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能夠水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖；和 向所述細胞導入編碼靶蛋白的核酸，其中所述細胞生產包括所述末端的磷酸-6-甘露糖殘基的所述革巴蛋白。
22.權利要求21的方法，其中對于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5 A偏差以內。
23.權利要求21的方法，其中所述甘露糖苷酶包括a)與SEQID NO: 50的I至774位氨基酸或SEQ ID N0:50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或b)具有以下序列的氣基酸序列i )GVGXXGXGG基序，其中X是Gly, Ala, Ser, Thr或Cys ;ii )VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；(UDX1YQGX2基序，其中X1是Leu，He, Val, Ala, Phe, Tyr或Met，其中\(zhòng)是1111'，Ser或Asn ;或(iv)⑶XGN，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸。
24.權利要求21-23的任一項的方法，其中所述真菌細胞進一步包括編碼能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。
25.權利要求21-24的任一項的方法，其中所述真菌細胞是經(jīng)過改造而缺少OCHl活性的。
26.權利要求21-25的任一項的方法，其中所述甘露糖苷酶是C.cellulans、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)或變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)的甘露糖苷酶。
27.在真菌生物中生產具有末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白的方法，所述方法包括 A)提供經(jīng)過遺傳改造的真菌細胞，所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶能夠水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖，且所述真菌細胞進一步包括編碼靶蛋白的核酸；和 B)分離所述具有所述末端磷酸-6-甘露糖殘基的靶蛋白。
28.權利要求27的方法，其中對于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5 A偏差以內。
29.權利要求27的方法，其中所述甘露糖苷酶包括(i)與SEQID N0:50的I至774位氨基酸或SEQ ID N0:50所述氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或(ii)具有以下序列的氨基酸序列(i) GVGXXGXGG基序，其中X是Gly，Ala，Ser, Thr或Cys ；(ii) VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；(iii) X1YQGX2基序，其中X1是Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr 或 Met,其中 X2 是 Thr, Ser 或 Asn ;或(iv)GDXGN,其中 X 可以是除Pro以外的任何氨基酸。
30.權利要求27-29的任一項的方法，其中所述靶蛋白和所述甘露糖苷酶是共同分泌的。
31.經(jīng)過遺傳改造生產包含末端磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白的分離的真菌細胞，所述真菌細胞包括編碼甘露糖苷酶的核酸，其中所述甘露糖苷酶在所述真菌細胞中的表達產生了包含所述末端的磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白。
32.權利要求31的真菌細胞，其中對于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5 A偏差以內。
33.權利要求31的真菌細胞，其中所述甘露糖苷酶包括(a)與SEQID N0:50的I至774位氨基酸或SEQ ID NO: 50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或(b )具有以下序列的氨基酸序列(i ) GVGXXGXGG基序，其中X是Gly，Ala，Ser，Thr或Cys ;(ii) VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；(iii) X1YQGX2基序，其中X1是Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr 或 Met,其中 X2 是 Thr, Ser 或 Asn ;或(iv)GDXGN,其中 X 可以是除Pro以外的任何氨基酸。
34.權利要求31-33的任一項的真菌細胞，其中所述真菌細胞還包括編碼能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。
35.權利要求31-33的任一項的真菌細胞，其中所述真菌細胞經(jīng)過遺傳改造缺少OCHl活性。
36.權利要求31-33的任一項的真菌細胞，其中所述真菌細胞進一步包括編碼能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽的核酸，且其中所述真菌細胞經(jīng)過遺傳改造缺少OCHl活性。
37.權利要求31-36的任一項的真菌細胞，其中所述真菌細胞還包括編碼靶蛋白的核酸，其中所述靶蛋白是糖蛋白。
38.權利要求31-36的任一項的真菌細胞，其中所述靶蛋白是人蛋白。
39.權利要求38的真菌細胞，其中所述靶蛋白是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結合片段，或融合蛋白。
40.權利要求39的真菌細胞，其中所述溶酶體蛋白是溶酶體酶。
41.權利要求40的真菌細胞，其中所述溶酶體酶是酸性a葡萄糖苷酶或a半乳糖苷酶。
42.權利要求38的真菌細胞，其中所述靶蛋白是與LSD相關的蛋白質。
43.權利要求42的真菌細胞，其中所述LSD是費波瑞病、I型粘多糖病、法伯氏病、高歇氏病、GMl-神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病、泰-薩二氏病、山德霍夫氏病、GM2活化因子病、克拉伯病、異染性腦白質營養(yǎng)不良、尼曼-匹克病、V型粘多糖病(Scheie disease), II型粘多糖病(Hunter disease)、IV型粘多糖病(Sanfilippo disease)、莫奎歐氏癥、VI型粘多糖病(Maroteaux-Lamy disease)、透明質酸酶缺乏癥、天冬氨酰葡萄糖胺尿癥、巖藻糖代謝病、甘露糖苷貯積癥、辛德勒病、I型唾液腺病、龐貝氏癥、骨密質發(fā)育不全、蠟樣脂褐質沉積癥、膽固醇酯沉積病、沃爾曼病、多種硫酸酯酶缺乏癥、半乳糖涎酸貯積癥、粘脂沉積癥、胱氨酸病、唾液酸貯積功能障礙、具有Marinesco-SjGgren綜合征的乳糜微滴滯留病、Hermansky-Pudlak綜合征、Chediak-Higashi 綜合征、Danon 氏病或Geleophysic 發(fā)育不良。
44.權利要求31-43的任一項的真菌細胞，其中所述真菌細胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans 的細胞。
45.權利要求32的真菌細胞，其中所述能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽是MNN4多肽。
46.權利要求45的真菌細胞，其中所述MNN4多肽是解脂耶氏酵母、釀酒酵母(S. cerevisiae)、Ogataea minuta、畢赤酵母或白色念珠菌(C. albicans)的多妝。
47.權利要求46的真菌細胞，其中所述能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽是畢赤酵母PNOl多肽。
48.權利要求31-47的任一項的真菌細胞，其中所述甘露糖苷酶是C.cellulans、天藍色鏈霉菌或變鉛青鏈霉菌的甘露糖苷酶。
49.權利要求31-47的任一項的真菌細胞，其中所述甘露糖苷酶包括分泌信號。
50.權利要求33-47的任一項的真菌細胞，其中所述甘露糖苷酶包括將所述甘露糖苷酶靶向胞內區(qū)室區(qū)域的靶向信號。
51.權利要求31-47的任一項的真菌細胞，其中所述甘露糖苷酶包括將所述甘露糖苷酶靶向胞內區(qū)室區(qū)域的分泌信號和靶向信號。
52.解脂耶氏酵母、畢赤酵母、多形漢遜酵母、Arxulaadeninivorans、甲醇畢赤酵母、Oogataea minuta或黑曲霉細胞的基本純的培養(yǎng)物，其大部分被遺傳改造為生產包括末端磷酸-6-甘露糖殘基的糖蛋白，所述細胞包括編碼能夠水解甘露糖-I-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶的核酸。
53.權利要求52的培養(yǎng)物，其中對于所述甘露糖苷酶，位于最小的催化中心的氨基酸側鏈中的原子的三維蛋白坐標落入距圖33中等價原子的坐標1.5 A偏差以內。
54.權利要求52的培養(yǎng)物，其中所述甘露糖苷酶包括a)與SEQID N0:50的I至.774位氨基酸或SEQ ID N0:50的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或b)具有以下序列的氨基酸序列(i) GVGXXGXGG基序，其中X是Gly，Ala，Ser, Thr或Cys ;(ii) VRXE基序，其中X是除Pro以外的任何氨基酸；(iii) X1YQGX2基序，其中X1是Leu, He, Val, Ala, Phe, Tyr 或 Met,其中 X2 是 Thr, Ser 或 Asn ;或(iv)GDXGN,其中 X 可以是除Pro以外的任何氨基酸。
55.權利要求52-54的培養(yǎng)物，其中所述細胞進一步包括編碼能夠促進甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。
56.權利要求55的培養(yǎng)物，其中所述細胞經(jīng)過遺傳改造而缺少OCHl活性。
57.包含末端磷酸-6-甘露糖殘基的分離的糖蛋白，其中所述蛋白是由權利要求1-30的任一項的方法生產的。
58.包含糖蛋白的組合物，其中所述糖蛋白上至少47%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖殘基。
59.權利要求58的組合物，其中所述糖蛋白上至少50%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖殘基。
60.權利要求58的組合物，其中所述糖蛋白上至少75%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖殘基。
61.權利要求58的組合物，其中所述糖蛋白上至少90%的N-聚糖包括末端磷酸-6-甘露糖殘基。
全文摘要
本文通過能夠水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接為磷酸-6-甘露糖的甘露糖苷酶描述了用于脫帽寡糖上的甘露糖-6-磷酸殘基的方法和遺傳改造過的細胞。
文檔編號C07H11/04GK102712914SQ201080054049
公開日2012年10月3日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權日2009年9月29日
發(fā)明者H.K.雷毛特, K.C.T.A.M.皮恩斯, N.L.M.卡勒沃特, P.S.蒂爾斯, W.弗維肯 申請人:Vib研究所, Vrije布魯塞爾大學, 奧克西雷恩英國有限公司, 根特大學