專利名稱：布魯氏菌噬菌體多核苷酸及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明在其一些實施方式中涉及布魯氏菌(Brucella)噬菌體核酸序列及其用途。
背景技術：
布魯氏菌(布魯氏菌屬，Brucella)是革蘭氏陰性的小球桿菌屬細菌。它們是導致天然宿主在懷孕的最后階段流產的動物病原體。布魯氏菌屬包括10個物種，這10個物種分為帶有光滑和粗糙外膜LPS的生物。分別與小反芻動物、牛和豬的布魯氏菌病相關的三個光滑型布魯氏菌物種(馬爾他布魯桿菌(羊布魯氏菌，B. melitensis)、流產布魯氏菌(流產布魯桿菌，B. abortus)和豬布魯氏菌(豬布魯桿菌，B. suis))是人畜共患病的(zoonotic to humans)。將與海洋哺乳動物布魯氏菌病相關的鯨型布魯氏菌(B. ceti)和鰭型布魯氏菌(B.pinnipedialis)記載為人布魯氏菌病的致病物(致病因素)的報告不常見。另外，與犬布魯氏菌病相關的犬布魯氏菌(B. canis)是導致人感染的粗糙型生物。該疾病在人中表現為波狀熱，也稱為馬爾他發(fā)熱，且它可能是由腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎和其他并發(fā)癥的慢性疾病或表現造成的。在極少數情況下該疾病可能變成致命的。布魯氏菌噬菌體是對布魯氏菌物種有特異性的細菌病毒。布魯氏菌噬菌體和它們的分類學關聯性的綜述出版于1981年。所有同時期已知的布魯氏菌噬菌體顯示包含屬于短尾病毒科(Podoviradae)的相似的二十面體頭和短尾形態(tài)。根據抗原和生理特性以及對化學試劑和物理試劑的抗性，顯示所研究的噬菌體密切相關。這些研究結果激發(fā)作者將所概述的變體包括到單個物種中并提出噬菌體Tb為病毒類型(Ackerman，H. -W.，Simon, F.，和 Verger, J. -Μ. 1981. Intervirology 16:1-7)。布魯氏菌噬菌體具有大小為約38千個堿基對的線性雙鏈DNA。噬菌體Tb、Fi、Wb、Iz和R/C的限制酶消化分析在DNA上表現出相似性，而且?guī)缀鯖]有發(fā)現噬菌體的溶源性存在或者宿主中存在質粒形式的證據。先前的研究已確定鳥嘌呤核苷-胞嘧啶在噬菌體Tb中的含量為45. 3-46. 7%，而預期它在其他噬菌體中具有更高的百分比，為48. 9%。數位研究者已指出噬菌體作為病原性疾病治療藥劑的用途(Brils sow，H. 2005.Microbiol. 151:2133 - 2140;Summers, ff. C. 2001. Ann. Rev. Microbiol. 55:437-451)。另外，布魯氏菌曬菌體已用于布魯氏菌分型，且曬菌體敏感性試驗已變成分類和確定布魯氏菌屬的分類樹的工具。具體地，有人建議布魯氏菌屬的分類品種(nomen-spec i es )的劃分部分地根據它們的物種特異性曬菌體敏感性判斷,該物種特異性噬菌體敏感性也與菌株的宿主從屬關系(親和，affiliation)具有良好的相關性。布魯氏菌噬菌體已根據它們對布魯氏菌屬某些種(Brucella spp)的感染性分成7組。噬菌體Izatnagar (Iz1)代表對所有光滑型布魯氏菌分類品種(nomenspecies)和部分粗糙型菌株有感染性的組 6 (Corbel 和 Tolari, 1988，Res Vet Sci ; 44:45-49)。Zhu 等人，2009[Int. J. Mol. Sci. 10:2999 - 3011]教導了 Tb (Tbilisi，第比利斯)布魯氏菌噬菌體的部分序列。
Rigby 等人，1989 [Can J Vet Res. 53:319-325]教導了 Nepean 卩遼菌體和布魯氏菌物種的其他裂解性噬菌體的部分序列。美國專利No. 20030017449教導了利用布魯氏菌噬菌體檢測布魯氏菌的方法
發(fā)明內容
根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了包含布魯氏菌曬菌體核酸序列的分離多核苷酸，該核酸序列對布魯氏菌噬菌體有特異性并包含選自由SEQ ID NO: 396和387-393組成的組中的序列。根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了與本發(fā)明分離多核苷酸雜交的長度為至少15個核苷酸的分離多核苷酸。根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了下調目的基因在細菌中的表達的方法，該方法包括用包含布魯氏菌噬菌體調節(jié)序列的核酸構建體轉化細菌，從而下調目的基因的表達。根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了包含SEQ ID N0:396中列出的核酸序列的至少100個核苷酸的核酸構建體。根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了核酸構建體，其包含i.編碼可操作地融合到布魯氏菌啟動子上的目的基因的多核苷酸；ii.融合到該啟動子5’端上的第一布魯氏菌卩遼菌體序列，該第一序列包含SEQ IDNO:394中列出的核酸序列的至少100個核苷酸；和iii.融合到目的基因3’端上的第二布魯氏菌噬菌體序列，該第二序列包含SEQ IDNO:395中列出的核酸序列的至少100個核苷酸。根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了重組布魯氏菌曬菌體,其通過輸出可檢測信號鑒定布魯氏菌屬細菌。根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了分離布魯氏菌屬細菌細胞，其包含本發(fā)明的重組布魯氏菌曬菌體。根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了診斷受驗者布魯氏菌感染的方法，該方法包含使受驗者的樣品與本發(fā)明重組布魯氏菌噬菌體接觸，從而診斷布魯氏菌感染。根據本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供了診斷受驗者布魯氏菌感染的方法，該方法包含使受驗者的樣品與本發(fā)明的分離布魯氏菌屬細菌細胞接觸，從而診斷布魯氏菌感染。根據本發(fā)明一些實施方式，該分離多核苷酸包含SEQ ID NO: 396中列出的核酸序列的至少100個連續(xù)核苷酸。根據本發(fā)明一些實施方式，該分離多核苷酸包含SEQ ID N0:396中列出的序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該分離多核苷酸包含SEQ ID NO: 387-393中列出的核酸序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該分離多核苷酸具有SEQ ID NO: I中列出的核酸序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該分離多核苷酸在正向或反向包含選自由SEQ IDNO: 394和395組成的組中的至少一個核酸序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該分離多核苷酸進一步包含異源核酸序列和引導(指導)異源核酸序列的表達的異源啟動子序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該核酸序列包含轉錄調節(jié)區(qū)。根據本發(fā)明一些實施方式，該轉錄調節(jié)區(qū)包含布魯氏菌噬菌體啟動子。根據本發(fā)明一些實施方式，該分離多核苷酸包含SEQ ID NO:2-386中列出的序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該異源核酸序列編碼可檢測部分。根據本發(fā)明一些實施方式，該異源核酸序列編碼對布魯氏菌有致死性的多肽。根據本發(fā)明一些實施方式,該細菌包含布魯氏菌屬細菌。
根據本發(fā)明一些實施方式，該布魯氏菌屬細菌菌株包含豬布魯氏菌或馬爾他布魯桿菌(羊布魯氏菌)。根據本發(fā)明一些實施方式，該基因是對細菌內源的基因。根據本發(fā)明一些實施方式，該基因是對該細菌噬菌體內源的基因。根據本發(fā)明一些實施方式，該調節(jié)序列包含SEQ ID NO:396中列出的核酸序列的至少100個核苷酸。根據本發(fā)明一些實施方式，該調節(jié)序列包含SEQ ID N0:396中列出的序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該調節(jié)序列進一步包含SEQ ID N0:397中列出的序列。
根據本發(fā)明一些實施方式，該調節(jié)序列的側面有轉座子序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該核酸構建體包含SEQ ID NO:396中列出的核酸序列。根據本發(fā)明一些實施方式，該核酸序列的側面有轉座子序列。根據本發(fā)明一些實施方式，目的基因編碼治療性多肽。根據本發(fā)明一些實施方式，目的基因編碼可檢測部分。根據本發(fā)明一些實施方式，目的基因包含在Lux操縱子中。根據本發(fā)明一些實施方式,該可檢測信號是發(fā)光信號。根據本發(fā)明一些實施方式,該重組布魯氏菌曬菌體包含裂解活性。根據本發(fā)明一些實施方式，該噬菌體基因組包含編碼可檢測信號的多核苷酸序列。除非另有限定，否則本文使用的所有技術和/或科學術語的含義都與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的相同。雖然下面描述了示例方法和/或材料，但本發(fā)明實施方式的實踐或試驗中可使用與本文所描述的那些相似或者等效的方法和材料。如有沖突，以專利說明書為準，包括定義。另外，材料、方法和實例僅為了說明，并非為了限制。


本文僅參考附圖舉例說明本發(fā)明的一些實施方式。關于下面詳細討論的示圖，要強調的是，所示細節(jié)僅為了舉例，用于示意性地討論本發(fā)明的實施方式。在這方面，參考示圖所作的描述將使本領域普通技術人員明了本發(fā)明的實施方式如何實施。在圖中圖I示出在具有通過測序儀鑒定的38255個核苷酸的特異共有序列(consensus)最大重疊群(contigue)上證實的閱讀序列。可以看出，C和A各自等同地分配在核苷酸5549和5550處的8個重疊群中，在一個或其他位置中留出單個核苷酸空隙。這表明SNP (或雜合子)分別位于C和A之間的位置5549處。在每個構建體中，N均被準確地鑒定為C。
圖2描述了已成功亞克隆到質粒pBS中的9個噬菌體Iz1DNA片段。這些片段與全噬菌體Iz1基因組DNA雜交，并且核苷酸測序證實它們的準確序列，該序列與完整噬菌體基因組中的重疊序列相同。圖3A-B是示出基于布魯氏菌質粒pBBRlmcs-4. l-II1053LuxCDABE的兩個質粒構建體的示意圖。這些構建體包括延伸在核苷酸1550(Tl6509和18579 19630之間的噬菌體Iz1DNA片段，以及以正確取向添加到它們的3’端和5’端的Τη5鑲嵌端(mosaic end)之一。這些工程化改造片段在兩個取向上分別克隆到Lux的上游和下游。圖4是示出用于構建圖3B所示的質粒構建體的引物位置的示意圖。圖5是示出用以產生布魯氏菌噬菌體載體克隆所采取的步驟的流程圖。
具體實施方式

本發(fā)明在其一些實施方式中涉及布魯氏菌噬菌體核酸序列及其用途。在詳細解釋本發(fā)明的至少一個實施方式之前，應理解本發(fā)明的應用不必局限于下面說明書中陳述的或通過實例舉例說明的細節(jié)。本發(fā)明能夠有其他實施方式，或能夠以多種方式實踐或實施。布魯氏菌物種是影響多種哺乳動物的重要的人畜共患病病原體。在農業(yè)方面重要的家畜中，這些細菌導致流產和不孕，它們是嚴重的全世界性經濟問題。感染人的布魯氏菌物種引起波狀熱，波狀熱如果未經治療，會表現為睪丸炎、骨關節(jié)炎、脊椎炎、心內膜炎、和神經障礙。在極少數情況下它可能是致命的。本發(fā)明人已對作為所有其他布魯氏菌曬菌體基因型代表的布魯氏菌曬菌體Iz1的整個基因組(38，254個堿基對)進行測序。鑒定出兩個基因組布魯氏菌噬菌體Iz1群體，它們之間的差異在于核苷酸5549處的C或A。對這個序列進行BLAST分析，發(fā)現與人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)ATCC 49188染色體I具有同源性的6個區(qū)一參見本文下面實施例部分中的表2。從全長基因組序列中扣除這些序列，使得本發(fā)明人發(fā)現對布魯氏菌噬菌體有特異性的新的多核苷酸序列(例如，SEQ ID NO: 387-393)0從該序列搜集的信息已使本發(fā)明人能夠鑒定最少數量的ORF的明顯順序，其可用于將目的基因(例如，編碼可檢測部分的那些)插入到該噬菌體中，而不影響它的裂解活性。因而，依據噬菌體基因組中這個位點被可檢測信號(例如，Lux操縱子)重組替代，探索重組布魯氏菌噬菌體的發(fā)育。由于輸出這個信號，因此此種噬菌體可以用來鑒定布魯氏菌屬細菌。產生噬菌體載體布魯氏菌克隆，其中噬菌體Iz1在質粒pBBRlmcs4. 1-111053/luxCDABE/15B-18B (圖3B)的存在下共同存在(共同居住，co-residence)于該細胞中，為發(fā)生在質粒DNA上的Lux操縱子與布魯氏菌噬菌體DNA之間的重組事件提供無限的機會。另外，本發(fā)明人已在噬菌體中鑒定出調節(jié)區(qū)，該調節(jié)區(qū)具有調節(jié)功能并且顯示能夠下調由質粒賦予的光表達，指示在布魯氏菌屬細菌內實施此種基因調節(jié)機制的可能性。因而，例如，本發(fā)明人鑒定出可在轉化到布魯氏菌屬細菌中之后下調可操作地連接到其上的基因的噬菌體DNA片段(SEQ ID NO: 396; 19630-18579)。當這個序列與另外的噬菌體DNA片段(SEQ ID NO: 397; 16509-15500)—起轉化到布魯氏菌屬細菌中時，它為布魯氏菌物種賦予不同的致死活性，對流產布魯氏菌菌株544具有最強的致死性，對羊布魯氏菌具有較小的致死性，而對布魯氏菌的豬布魯氏菌菌株無致死性。相應地，這個片段的下調活性也顯示出是物種特異性的。噬菌體調節(jié)區(qū)的知識有利于計算機鑒定布魯氏菌基因組內另外未識別的調節(jié)序列。這種途徑已在屬于α-變形桿菌類別的豆科植物內共生菌苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) (del Val C 等人，Mol Microbiol 2007;66:1080-1091),以及植物冠癭病(Crown-Gall)的致病物根癌農桿菌(Agrobactrum tumefaciens)和布魯氏菌中得到證明，表明這些生物之間存在密切的關系，因而可能具有共同的功能(Inon deIannino N 等人， JBacteriol 1998;180:4392-4400)。因而，根據本發(fā)明的一個方面，提供了包含布魯氏菌噬菌體核酸序列的分離多核苷酸，該核酸序列對布魯氏菌噬菌體有特異性并包括選自由SEQ ID NO:387-393組成的組中的序列。如本文所使用的，術語“噬菌體”(與術語“細菌噬菌體”同義)是指選擇性地感染原核生物——如細菌的病毒。許多細菌噬菌體對細胞的特定屬或種或菌株有特異性。該噬菌體通常為裂解性細菌噬菌體。裂解性細菌噬菌體是一種通過完成裂解循環(huán)，沿裂解途徑前進，而不進入溶原途徑的噬菌體。裂解性細菌噬菌體經歷病毒復制，導致細胞膜的裂解、摧毀細胞并釋放能夠感染其他細胞的子代細菌噬菌體顆粒。溶原性細菌噬菌體是一種能夠進入溶原途徑的噬菌體，其中該細菌噬菌體在完成它的裂解循環(huán)之前變成細胞基因組的蟄伏、不活潑(passive)部分。根據一個實施方式，該噬菌體是Tb型噬菌體，例如，噬菌體Iz115對布魯氏菌噬菌體有特異性的序列一種存在于該噬菌體中，但不存在于其他生物體中的序列——即對布魯氏菌特有的序列。由于布魯氏菌噬菌體基因組的序列現在是已知的，因此布魯氏菌噬菌體特異性序列可以利用BLAST或其他類似程序鑒定。根據一個實施方式，布魯氏菌曬菌體特異性序列與另一個核酸序列的同一'丨生不大于70%，如利用序列比對軟件如BLAST分析證實的。根據一個實施方式，布魯氏菌曬菌體特異性序列與另一個核酸序列的同一'丨生不大于60%，如利用序列比對軟件如BLAST分析證實的。如本文所使用的，短語“分離多核苷酸”是指分離并以RNA序列、互補多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復合多核苷酸序列(例如，上面的組合)形式提供的單鏈或雙鏈核酸序列。如本文所使用的，短語“互補多核苷酸序列”是指利用逆轉錄酶或任何其他RNA依賴性DNA聚合酶逆轉錄信使RNA產生的序列。此種序列隨后可以利用DNA依賴性DNA聚合酶在體內或體外擴增。如本文所使用的，短語“基因組多核苷酸序列”是指源(分離)自染色體的序列，因而它代表染色體的鄰接部分。如本文所使用的，短語“復合多核苷酸序列”是指這樣的序列，其至少部分是互補的且至少部分是基因組的。復合序列可以包括編碼本發(fā)明的多肽所需的一些外顯子(exonal)序列，以及介入其間的一些內含子序列。這些內含子序列可以是任何來源的，包括其他基因，并通常包括保守剪接信號序列。此種內含子序列可以進一步包括順式作用的表達調節(jié)元件。
根據一個實施方式，該分離多核苷酸包含SEQ ID NO: 387-393中列出的序列的至少15個、至少20個、至少40個、至少50個、至少100個、至少200個、至少500個或至少1000個連續(xù)核苷酸。因而，本發(fā)明多核苷酸長度可以為15-38，254個核苷酸。應理解，本發(fā)明也涵蓋了上文描述的序列的同源物。因此，本發(fā)明這個方面的多核苷酸可以具有與源自SEQ ID NO:387-393的序列有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少93%、至少95%或多至100%同一性的核酸序列，如利用國家生物技術信息中心(National Centerfor Biotechnology Information, NCBI)的 BlastN 軟件利 用缺省參數測定的。因而，本發(fā)明包括上文所述的核酸序列、其片段、可與其雜交的序列、與其取向相反的序列、與其同源的序列、編碼具有不同的密碼子使用的類似多肽的序列、以突變?yōu)樘卣鞯母淖冃蛄校鐾蛔優(yōu)?，例如一個或多個核苷酸的缺失、插入或置換，這種突變是天然發(fā)生的或人工誘導的，隨機或以靶向方式進行的。本發(fā)明考慮的示例性多核苷酸是包含SEQ ID NO: I和387-393中列出的核酸序列的那些。本發(fā)明考慮的其他示例性多核苷酸是這樣的多核苷酸，其包含SEQID NO:387-393中列出的序列內的調節(jié)區(qū)，例如如本發(fā)明人給出的SEQ IDNO:395中列出的調節(jié)區(qū)的至少100個連續(xù)核苷酸，從而在以相反取向(B卩，SEQ ID NO:396)插入時具有下調可操作地連接到其上的基因的活性。另一個調節(jié)序列在正向或反向取向上都包括SEQ ID N0:394。這也存在于可能影響噬菌體Iz1基因的調節(jié)功能的完整噬菌體基因組中。利用生物信息學工具，本發(fā)明人在噬菌體中鑒定出可用作啟動子序列的噬菌體基因組全長序列內的另外的調節(jié)區(qū)(即，轉錄調節(jié)區(qū))(SEQ IDNO:2-386).此種啟動子序列可以設置在異源性核酸序列的上游以便促進它的轉錄。而且，該下調活性可以用來鑒定改變轉錄調節(jié)區(qū)活性的重要化學物，從而有利于新藥的開發(fā)。還提供了編碼推定的多肽的其他序列，它們也被認為在本發(fā)明范圍內。此種序列提供在本文下表I中。編碼此種多肽的多核苷酸序列可以用于各種用途。因而，例如編碼推定的溶解素(Iysin)和穿孔素(holin)的多核苷酸序列可以用來選擇性地滅殺布魯氏菌細胞?；谌芙馑氐闹委煹膬?yōu)點很多它們可以高純度制備并具有高特異活性；它們表現出迅速的致死作用；它們是無毒的；以及明顯地，所形成的對抗這些蛋白質的抗體不會中和它們的裂解活性。最后，沒有細菌對這些蛋白質產生抗性，可能是因為它們具有用于細胞壁結合和水解的多個結構域。另外的重要多肽的實例是I.包括鞭毛蛋白的分泌蛋白(分泌型III，這種裝置與許多革蘭氏陰性病原體使用的注射體(injectisome)和用于將效應蛋白質轉移到宿主細胞中的共生體(symbiont)有關)和VirB (分泌型IV，DNA跨生物膜的易位是許多活生物體的必需過程。在細菌中，IV型分泌系統(tǒng)(T4SS)用于將DNA以及蛋白質底物從供體遞送到靶細胞。T4SS是由一打或更多膜蛋白質響應于環(huán)境信號組裝而成的結構復雜的布局(機器，machine)。DNA跨生物膜的易位是許多活生物體的必需過程。在細菌中，IV型分泌系統(tǒng)(T4SS)用于將DNA以及蛋白質底物從供體遞送到靶細胞。T4SS是由一打或更多膜蛋白質響應于環(huán)境信號組裝而成的結構復雜的布局(機器))。2.噬菌體整合酶一在溶原性循環(huán)中催化細菌噬菌體的位點特異性整合和切除。3.毒素，磷脂酶一降解磷脂，蛋白酶一降解蛋白質。表I·
權利要求
1.一種包含布魯氏菌(Brucella)噬菌體核酸序列的分離多核苷酸，所述核酸序列對布魯氏菌噬菌體有特異性并包含選自由SEQ ID NO:396和387-393組成的組中的序列。
2.根據權利要求I所述的分離多核苷酸,包含SEQID N0:396中列出的核酸序列的至少100個連續(xù)核苷酸。
3.根據權利要求2所述的分離多核苷酸，包含SEQID N0:396中列出的序列。
4.根據權利要求I所述的分離多核苷酸，包含SEQID N0:387-393中列出的核酸序列。
5.—種與根據權利要求I所述的分離多核苷酸雜交的長度為至少15個核苷酸的分離多核苷酸。
6.根據權利要求I所述的分離多核苷酸，具有SEQID NO: I中列出的核酸序列。
7.根據權利要求I所述的分離多核苷酸，在正向或反向包含選自由SEQID N0:394和 395組成的組中的至少一個核酸序列。
8.根據權利要求7所述的分離多核苷酸，進一步包含異源核酸序列和引導所述異源核酸序列的表達的異源啟動子序列。
9.根據權利要求I所述的分離多核苷酸，其中所述核酸序列包含轉錄調節(jié)區(qū)。
10.根據權利要求9所述的分離多核苷酸，其中所述轉錄調節(jié)區(qū)包含布魯氏菌噬菌體啟動子。
11.根據權利要求10所述的分離多核苷酸，包含SEQID N0:2-386中列出的序列。
12.根據權利要求8所述的分離多核苷酸，其中所述異源核酸序列編碼可檢測部分。
13.根據權利要求8所述的分離多核苷酸，其中所述異源核酸序列編碼對布魯氏菌有致死性的多肽。
14.一種下調細菌中目的基因的表達的方法，所述方法包括用包含布魯氏菌噬菌體調節(jié)序列的核酸構建體轉化細菌，從而下調所述目的基因的表達。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述細菌包含布魯氏菌屬細菌。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述布魯氏菌屬細菌菌株包含豬布魯氏菌 (B. Suis)或馬爾他布魯氏菌(B. melitensis)。
17.根據權利要求14所述的方法，其中所述基因是對所述細菌內源的基因。
18.根據權利要求14所述的方法，其中所述基因是對所述細菌的噬菌體內源的基因。
19.根據權利要求14所述的方法，其中所述調節(jié)序列包含SEQID N0:396中列出的核酸序列的至少100個核苷酸。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述調節(jié)序列包含SEQID N0:396中列出的序列。
21.根據權利要求19所述的方法，其中所述調節(jié)序列進一步包含SEQIDN0:397中列出的序列。
22.根據權利要求14所述的方法，其中所述調節(jié)序列的側面有轉座子序列。
23.—種包含根據權利要求2所述的分離多核苷酸的核酸構建體。
24.根據權利要求23所述的核酸構建體，包含SEQID N0:396中列出的核酸序列。
25.根據權利要求23所述的核酸構建體，其中所述核酸序列的側面有轉座子序列。
26.一種核酸構建體，包含i.編碼可操作地融合到布魯氏菌啟動子上的目的基因的多核苷酸； .融合到所述啟動子5’端上的第一布魯氏菌噬菌體序列，所述第一序列包含SEQ ID NO:394中列出的核酸序列的至少100個核苷酸；和iii.融合到所述目的基因3’端上的第二布魯氏菌噬菌體序列，所述第二序列包含SEQ ID NO:395中列出的核酸序列的至少100個核苷酸。
27.根據權利要求26所述的核酸構建體，其中所述目的基因編碼治療性多肽。
28.根據權利要求26所述的核酸構建體，其中所述目的基因編碼可檢測部分。
29.根據權利要求28所述的核酸構建體，其中所述目的基因包含在Lux操縱子中。
30.一種重組布魯氏菌曬菌體,所述重組布魯氏菌曬菌體通過輸出可檢測信號鑒定布魯氏菌屬細菌。
31.根據權利要求30所述的重組布魯氏菌噬菌體，其中所述可檢測信號是發(fā)光信號。
32.根據權利要求30所述的重組布魯氏菌噬菌體，具有裂解活性。
33.根據權利要求30所述的重組布魯氏菌噬菌體，其中所述噬菌體的基因組包含編碼所述可檢測信號的多核苷酸序列。
34.一種分離布魯氏菌屬細菌細胞，包含根據權利要求30至33中任一項所述的重組布魯氏菌噬菌體。
35.一種診斷受驗者的布魯氏菌感染的方法，所述方法包含使所述受驗者的樣品與根據權利要求30所述的重組布魯氏菌噬菌體接觸，從而診斷所述布魯氏菌感染。
36.一種診斷受驗者的布魯氏菌感染的方法，所述方法包含使所述受驗者的樣品與根據權利要求34所述的分離布魯氏菌屬細菌細胞接觸，從而診斷所述布魯氏菌感染。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含布魯氏菌噬菌體核酸序列的分離多核苷酸，該核酸序列對布魯氏菌噬菌體有特異性并包含選自由SEQ ID NO387-393組成的組中的序列。示例性多核苷酸序列是包含SEQ ID NO396中列出的核酸序列的至少100個連續(xù)核苷酸的多核苷酸序列。進一步公開了此種序列的用途。
文檔編號C07H21/00GK102933594SQ201080055381
公開日2013年2月13日 申請日期2010年10月7日 優(yōu)先權日2009年10月7日
發(fā)明者梅納赫姆·鮑瑙伊, 瓦萊里婭·斯特拉達, 斯韋特蘭娜·巴登斯坦, 伊扎克·本-阿索利, 費爾哈特·奧斯曼 申請人:以色列農業(yè)與農村發(fā)展部，吉姆若恩獸醫(yī)協(xié)會