專利名稱：對纖維連接蛋白額外結(jié)構(gòu)域b具有特異結(jié)合活性的修飾的泛素蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合纖維連接蛋白額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)的新的異源多聚體蛋白。此外，本發(fā)明涉及包括融合到藥學(xué)和/或診斷活性成分上的所述異源多聚體結(jié)合蛋白的融合蛋白。本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生這種異源多聚體結(jié)合蛋白或融合蛋白的方法和包含所述異源多聚體結(jié)合蛋白的藥學(xué)的和/或診斷的組合物。另外，本發(fā)明涉及包括編碼所述蛋白的DNA的文庫。進一步的實施例中，本發(fā)明涉及編碼所述異源多聚體結(jié)合蛋白或融合蛋白的多核苷酸、包括所述多核苷酸的載體和包括所述蛋白的宿主細胞、融合蛋白、載體和/或多核苷酸。優(yōu)選的實施方式中，所述異源多聚體結(jié)合蛋白或融合蛋白包括在藥物或診斷劑中。另夕卜，描述了制造所述重組蛋白或融合蛋白的方法以及所述蛋白在醫(yī)學(xué)治療方法中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對于由氨基酸組成的，但不是免疫球蛋白的結(jié)合分子的需求日益增加。迄今為止，雖然抗體代表確定的最好的結(jié)合分子，但是因為免疫球蛋白分子具有較大的缺陷，為了以高親和力和高特異性靶向配體，仍然需要新的結(jié)合分子。盡管它們能很容易地制造且它們可指向幾乎任何一個靶，它們?nèi)匀痪哂邢喈攺?fù)雜的分子結(jié)構(gòu)。仍然需要能夠易于操作的更小的分子取代抗體。這些可替換的結(jié)合劑能有利地用于，例如診斷、預(yù)防和疾病的治療的醫(yī)療領(lǐng)域。蛋白具有相對確定的通常被稱為蛋白質(zhì)骨架的三維結(jié)構(gòu)，且可作為用于設(shè)計所述可替換的結(jié)合劑的起始材料。這些骨架通常包含一個或多個區(qū)域，這些區(qū)域受特異的或隨機的序列變化作用，且經(jīng)常發(fā)生這種序列隨機化，以制造蛋白質(zhì)文庫，從蛋白質(zhì)文庫中可選出特異的結(jié)合分子。預(yù)期具有比抗體更小的尺寸，且對靶抗原具有相當、甚者更好的親和力的分子在藥物動力學(xué)性能和免疫原性方面超過抗體。先前的許多方法確實使用蛋白質(zhì)骨架作為結(jié)合蛋白的起始材料。例如，在WO99/16873中，開發(fā)對某種配體表現(xiàn)出結(jié)合活性的脂質(zhì)運載蛋白(Iipocalin)家族(所謂的Anticalin (一種抗體類似物))的修飾蛋白。利用遺傳工程的方法，通過在其天然配體結(jié)合口袋(pocket)進行氨基酸置換，對脂質(zhì)運載蛋白家族肽的結(jié)構(gòu)進行修飾。類似免疫球蛋白，Anticalin可用于確定或結(jié)合分子結(jié)構(gòu)。在某種意義上類似于抗體，柔性環(huán)形結(jié)構(gòu)被修飾；這些修飾能夠確定與天然配體不同的配體。WO 01/04144描述在蛋白本身缺少結(jié)合位置P片結(jié)構(gòu)中的蛋白表面上人工產(chǎn)生的結(jié)合域。通過這種方法重新產(chǎn)生人工的結(jié)合域，例如能夠獲得Y-晶狀體球蛋白-一種眼睛晶體結(jié)構(gòu)蛋白-的變體，其對配體具有高親和力和特異性。和已經(jīng)出現(xiàn)且由上述提及的擬抗體的柔性環(huán)形結(jié)構(gòu)形成的結(jié)合位置的修飾相比，這些結(jié)合域重新在P片的表面上產(chǎn)生。然而，WO 01/04144只描述用于產(chǎn)生新的結(jié)合性能的相對大的蛋白的變化。由于它們的尺寸，根據(jù)WO 01/04144蛋白僅能在遺傳工程水平上通過需要某些努力的方法來修飾。此外，為了維持蛋白的整體結(jié)構(gòu)，迄今為止公開的蛋白中只有總基酸相對小的百分數(shù)部分被修飾。因此，只有相對小的蛋白表面的區(qū)域是可用的，其能用于產(chǎn)生以前不存在的結(jié)合性能。而且，WO 01/04144只公開對Y-晶狀體球蛋白產(chǎn)生的結(jié)合性能。WO 04/106368描述以泛素蛋白為基礎(chǔ)的人工結(jié)合蛋白的產(chǎn)生。泛素是小的、單體的、和細胞溶質(zhì)的蛋白，其序列高度保守且出現(xiàn)在所有已知的從原生動物到脊椎動物的真核細胞中。其在生物體的細胞蛋白的可控降解的調(diào)節(jié)中充當至關(guān)緊要的角色。為了這種目的，用于降解的蛋白在它們通往酶的級聯(lián)反應(yīng)期間共價地連接到泛素或多聚泛素鏈上，且由于這種標簽選擇性地降解蛋白。根據(jù)最近的結(jié)果，泛素或泛素的蛋白標簽，也分別在其他細胞程序中充當重要的角色，例如幾種蛋白的輸入或其基因調(diào)節(jié)。除了它的生理機能的闡明之外，由于它的結(jié)構(gòu)和蛋白化學(xué)性質(zhì)，泛素是主要地研究目標。泛素的多肽鏈由76個在非常緊密的a/0結(jié)構(gòu)(Vijay-Kumar，1987)中折疊的氨基酸組成幾乎87%的多肽鏈涉及通過氫鍵的二級結(jié)構(gòu)元件的形成。主要的二級結(jié)構(gòu)是三個和半個a螺旋轉(zhuǎn)角和由四股組成的反平行P片。這些元件的特征排列通常被認為是所 謂的類泛素折疊基序(ubiquitin-like folding motif)-反平行0片暴露在后側(cè)上的蛋白表面，其中a螺旋垂直地堆積在頂上。進一步的結(jié)構(gòu)特征是蛋白內(nèi)部a螺旋和P片之間標記的疏水區(qū)域。因為它的小的尺寸，能通過化學(xué)合成和依靠生物科技的方法兩種途徑進行泛素的人工制備。由于有利的折疊性能，能通過遺傳工程利用微生物例如Escherichia coli以相對大的數(shù)量在細胞溶質(zhì)或在外周胞質(zhì)空間制造泛素。因為外周胞質(zhì)中占優(yōu)勢的氧化條件，后面的方法通常專供分泌蛋白的制造之用。由于簡易和有效的細菌制備，泛素能用作其他外源蛋白的融合伴侶，以制備難于生產(chǎn)的產(chǎn)品。依靠融合，能獲得良溶解性改的泛素和因此獲得提高的產(chǎn)量。與抗體或其他可替換的骨架相比，以泛素蛋白(也稱作載脂蛋白擬抗tt )為基礎(chǔ)的人工的結(jié)合蛋白具有的優(yōu)勢是小尺寸和高穩(wěn)定性、高親和力、高特異性、有效地微生物制造成本、和血清半衰期的調(diào)整。然而，在新的治療方法方面，仍然需要進一步開發(fā)對于特異的靶具有高親和力的那些蛋白。為了獲得人工的結(jié)合蛋白，WO 05/05730大體描述了泛素骨架的應(yīng)用，沒有提供如何修飾泛素蛋白才能獲得對纖維連接蛋白的ED-B特異的和高親和力的結(jié)合的解決方法。WO 2008/022759描述重組結(jié)合蛋白，其中FYN激酶的Src保守3結(jié)構(gòu)域(SH3)用于獲得新的結(jié)合蛋白。發(fā)現(xiàn)為了開發(fā)蛋白治療和/或診斷，能通過突變RT環(huán)和/或Src環(huán)設(shè)計特異性的靶。像脂質(zhì)運載蛋白(Iipocalins)中被用作骨架一樣，要誘變的氨基酸殘基位于可變的柔性環(huán)區(qū)域內(nèi)，模仿基礎(chǔ)的抗體/抗原結(jié)合功能的原理。這種相互作用位置的整體的適應(yīng)性是主要的焓驅(qū)動過程，其中通過相互作用位置，抗體結(jié)合到抗原決定基上；然而，通過結(jié)合柔性的互補決定區(qū)之后的靈活性的損失，這種過程導(dǎo)致不利的熵貢獻。此外相反地，利用作為骨架的泛素，首先發(fā)明人在柔性環(huán)區(qū)之內(nèi)不改變氨基酸殘基，但是在@片區(qū)域的固定的和不可改變的3鏈之內(nèi)或接近鄰近的3鏈改變氨基酸殘基改變。在不可改變的和固定的P鏈之內(nèi)或接近鄰近的作為ED-B結(jié)合區(qū)的泛素的P鏈上選擇氨基酸殘基的優(yōu)勢具體如下認為結(jié)合伴侶已經(jīng)出現(xiàn)適于緊密結(jié)合的補充幾何體。因此，這些相互作用涉及結(jié)合伴侶的更加嚴格的結(jié)構(gòu)在形狀、電荷和親水的/疏水的元件中的互補。這些嚴格的部分相互作用，以最優(yōu)化界面且調(diào)節(jié)生物學(xué)的功能。纖維連接蛋白(FN)是健康的組織和體液中豐富地表達的高分子量的細胞外的基質(zhì)糖蛋白類(matrix glycoproteins)中重要的一類。它們主要的任務(wù)在于促進細胞與許多不同的細胞外基質(zhì)(extracellular matrices)的粘附。培養(yǎng)基中非轉(zhuǎn)型細胞表面上纖維連接蛋白的存在和在轉(zhuǎn)型細胞上的不存在，形成了作為重要的粘附蛋白的纖維連接蛋白的確定。它們對許多不同的其他分子有影響，例如，膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparansulphate-proteoglycans)和纖維蛋白，因此,調(diào)節(jié)細胞的形狀和細胞骨架的形成。另外，它們是胚胎發(fā)生期間使細胞遷移和細胞分化的原因。它們也在傷口愈合中扮演重要的角色，在傷口愈合中它們促進巨噬細胞和其他免疫細胞的遷移，且能夠在血管的損傷區(qū)域通過血小板的粘附形成血凝塊。、
纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域(ED-B)是小的結(jié)構(gòu)域，其是通過初級RNA轉(zhuǎn)錄的可替換的剪接插入纖維連接蛋白分子中。分子在細胞外間質(zhì)的纖維連接蛋白分子中出現(xiàn)或遺漏，且分子代表大多數(shù)與血管形成和組織重塑相關(guān)的選擇標記(selective markers)中的一個，因為它在新的血管周圍豐富地表達，但是事實上在所有正常的成人組織(除了子宮和卵巢)中無法發(fā)現(xiàn)。已知ED-B主要地涉及癌癥。在原發(fā)病變(primary lesions)和很多人類實體癌(human solid cancer entities)的轉(zhuǎn)移位點檢測到高水平的ED-B表達,包括胸腺癌、非小細胞肺癌、直腸癌、胰腺癌、人類皮膚癌、肝癌、顱內(nèi)大型腦膜瘤、膠質(zhì)母細胞瘤(Menrad u. Menssen, 2005)。此外，ED-B能結(jié)合到診斷試劑上且順利地用作診斷工具。一個實例是在例如動脈硬化斑塊的分子成像中和例如通過癌癥病人的免疫掃描癌癥的檢測中它的應(yīng)用。許多進一步的診斷應(yīng)用是可能的。在SEQ ID N0:2示出人類纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)的91個氨基酸的氨基酸序列。對于蛋白的表達，需要加入起始甲硫氨酸。哺乳動物中ED-B是豐富的，例如嚙齒動物、牛、靈長類、食肉動物、人類中等等。其中與人類ED-B具有100%序列同一性的動物的實例是褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、小家鼠(Mus musculus)、馬(Equus caballus)、稱猴(Macaca mulatta)、家犬(Canis lupus familiaris)、和黑猩猩(Pan troglodytes)。ED-B在新血管結(jié)構(gòu)中特別地積聚且代表癌癥中用于分子干涉的靶。已知纖維連接蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域的許多抗體或抗體片段在本領(lǐng)域中作為潛在的癌癥治療學(xué)或其他指示(參見，例如，WO 97/45544,WO 07/054120,WO 99/58570,WO 01/62800)。對于纖維連接蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域，人類單鏈Fv抗體片段ScFvL19 (也被稱作L19)是特異的，對于有選擇地靶向瘤新生血管來說已經(jīng)在實驗瘤模型中和患有癌癥的病人兩者中證實了這一點。此外，描述了包括具有細胞因子例如IL-12、IL-2、IL-10、IL-15、IL-24或者GM-CSF的抗-ED-B抗體或抗-ED-B抗體片段的結(jié)合物，用于適于藥物制造的靶向藥物，以顯著地抑制癌癥、血管形成或者瘤的生長(參見，例如，W006/119897、W007/128563、W001/62298)。在動物實驗中成功地證實了實體瘤的新血管的選擇靶向，其中這些實體瘤具有與適當?shù)男?yīng)物功能例如細胞毒性劑或免疫促進劑結(jié)合的抗-ED-B抗體或抗-ED-B抗體片段例如L19。對于胰腺癌的治療，融合蛋白與小分子吉西他濱(Gemcitabine) (2’ -脫氧2’，2’ - 二氟胞喃唳核苷)結(jié)合，其中融合蛋白包括白細胞介素-2成分和抗-ED-B抗體成分(參見，例如，WO 07/115837)。上述討論的現(xiàn)有技術(shù)文獻描述的包括抗體的各種蛋白質(zhì)骨架的應(yīng)用，以產(chǎn)生新的ED-B結(jié)合蛋白。具有當前可用的化合物的靶向ED-B具有某些缺點。期望更小的分子(例如本發(fā)明基于異源多聚體的ED-B結(jié)合蛋白)相對抗體或其他結(jié)合蛋白具有重要的優(yōu)勢，這些更小的分子對ED-B抗原具有相當?shù)幕蛏踔粮叩挠H和力。因為癌癥是全世界死亡的一個主要病因,所以對治療癌癥的改良的試劑的需求不斷上漲。對于當前的化療試劑和放射治療的選擇性很小且大多數(shù)化療試劑不能在瘤的位置上聚集，因而在瘤內(nèi)未能達到適當?shù)乃健４嬖谟行У刂委煱┌Y的強烈需要。因而，本發(fā)明的目標是提供以泛素為基礎(chǔ)的異源多聚體結(jié)合蛋白，其能夠具有很高親和力的特異的結(jié)合纖維連接蛋白的細胞外區(qū)(ED-B)。本發(fā)明進一步的目標是確定和提供對于ED-B具有很高結(jié)合特異性的新的結(jié)合蛋白，例如用于癌癥的治療。此外，將提供制造所述異源多聚體結(jié)合分子的方法。通過所附獨立權(quán)利要求的技術(shù)內(nèi)容(subject-matter)解決上述描述的目標。本發(fā)明優(yōu)選的實施例包括在從屬權(quán)利要求和下面的描述、實例和圖中。

發(fā)明內(nèi)容
更具體地，本發(fā)明提供能夠結(jié)合人類纖維連接蛋白的ED-B的蛋白，包括修飾的異二聚體(hetero-dimeric)泛素蛋白，其中兩個單體泛素單元以首尾排列的方式(in a head-to-tail arrangement)連接在一起,其中所述二聚體蛋白的每一個單體是通過SEQ ID N0:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68中的至少6個氨基酸的取代不同修飾的，其中所述取代包括(I)第一單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、63、64、65和66取代；和第二單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66取代；可選地另外在位置2取代，或者(2)所述第一單體單元中，至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66取代；和所述第二單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66取代；可選地另外在位置2取代，并且可選地進一步修飾，優(yōu)選地其他氨基酸的取代，所述修飾的單體泛素單元與SEQ ID NO: I具有的氨基酸同一性為至少80%、至少85%和至少90%組中的至少一個，所述蛋白對所述纖維連接蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域具有特異的結(jié)合親和力Kd = 10_7-10_12M并且對于所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)表現(xiàn)出單價的結(jié)合活性。優(yōu)選的實施例中，所述蛋白是重組體。本發(fā)明的進一步的實施例中，每一個單體泛素單元中修飾SEQ ID NO: I的位置2、4、6、8、62、64、65、66和68中的7、8、9個或所有的氨基酸。應(yīng)該理解，本發(fā)明允許每一個單體單元中這些變體的每一個組合，例如，在第一和第二單元中。例如第一單體單元能包括6個修飾而第二單元包括7或8個修飾，第一單元可包括8個修飾和第二單元I個修飾等等。能在第一和第二單元中選出上述列出的每一個氨基酸，然后組合兩個單元。本文下面描述優(yōu)選的取代。用于本申請的重要的術(shù)語的定義術(shù)語“纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B”或簡要地叫做“ED-B”包括所有的顯示與SEQID NO:2具有至少70%，可選地75%，進一步可選地80%、85%、90%、95%、96%或97%或更多，或100%的序列同一性且具有上述定義的ED-B的功能性的蛋白。術(shù)語“有結(jié)合能力的蛋白”或“結(jié)合蛋白”涉及包括如下面進一步定義的ED-B的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的泛素蛋白。任何這種以泛素為基礎(chǔ)的結(jié)合蛋白可包括另外的不是結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu)域，例如，多聚化部分、多肽標簽、多肽連接子和/或非蛋白的聚合體分子。非蛋白的聚合體分子的某些實例是羥乙基淀粉、聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯(polyoxyalkylene)o抗體和它的片段是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明的結(jié)合蛋白不是抗體或其片段，例如Fab或scFv片段。進一步的，本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域不包括抗體中出現(xiàn)的免疫球蛋
白折置。本說明書中，術(shù)語“配體”和“靶”和“結(jié)合伴侶”同義地使用且能互換。配體是能夠具有此處定義的親和力，結(jié)合異源多聚體修飾的泛素蛋白的任何一個分子。 術(shù)語“泛素蛋白”包含與SEQ ID NO: I —致的泛素和根據(jù)下列定義的它的修飾物。真核生物體中泛素是高度保守的。例如，在迄今為止研究的所有哺乳動物中泛素具有一致的氨基酸序列。具體地優(yōu)選的是來自人類、嚙齒動物、豬和靈長類的泛素分子。另外，能利用任何其他真核來源的泛素。例如，酵母菌的泛素與SEQ ID NO: I的序列只有三個氨基酸的不同。通常，由所述術(shù)語“泛素蛋白”包含的泛素蛋白與SEQ ID N0:1顯示氨基酸同一性超過70%、優(yōu)選地超過75%或超過80%、超過85%、超過90%、超過95%、超過96%或達到序列同一性為97%。術(shù)語“修飾的泛素蛋白”涉及氨基酸或其組合取代、插入或刪除的任何一個的泛素蛋白的修飾，而取代是最優(yōu)選的修飾，其可通過上述描述的修飾的任何一種來補充。修飾的數(shù)目嚴格地由所述修飾的單體泛素單元限制，這種修飾的單體泛素單元與SEQ ID NO: I具有的氨基酸同一性為80%、至少83%、至少85%、至少83%和至少90%組的至少一個。至多，取代的數(shù)目限制到15個氨基酸殘基，因此，對應(yīng)80%的氨基酸同一性。對應(yīng)20 %以異二聚體蛋白為基礎(chǔ)的氨基酸的修飾，異二聚體泛素分子中修飾的氨基酸的總數(shù)是30個氨基酸。與二聚體未修飾的泛素蛋白比較，二聚體修飾的泛素蛋白與SEQ ID N0:1的基本的單體序列的氨基酸同一性選自80%、至少83%、至少85%、至少83%和至少90%的組中的至少一個。為了決定泛素衍生物與SEQ ID NO: I的氨基酸序列的序列同一性的程度，例如，能使用 SIM Local 類似性程序(Xiaoquin Huang and Webb Miller, "Advances in AppliedMathematics, vol. 12:337-357，1991)或 Clustal，W. (Thompson et al. , Nucleic AcidsRes.，22(22) :4673-4680, 1994.)。優(yōu)選地，相對于SEQ ID NO: I的全部序列，修飾的蛋白與SEQ ID NO: I的序列同一性的程度是確定的。把本發(fā)明的“異二聚體融合蛋白”或“異二聚體蛋白”看作包括兩種不同修飾的單體泛素蛋白的蛋白，兩中不同修飾的單體泛素蛋白的蛋白具有兩個相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其一起對作為特異的結(jié)合伴侶的ED-B提供了單價結(jié)合性能(結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。通過融合兩個單體泛素分子形成異源二聚物，其中如此處描述的，這些分子的兩個是不同修飾的。為了產(chǎn)生具有單價結(jié)合活性的異源多聚體結(jié)合蛋白(這里異二聚體蛋白)，不同修飾的泛素單體的多聚化的優(yōu)勢在于氨基酸殘基的總數(shù)的增加，其中能修飾氨基酸殘基以對ED-B產(chǎn)生新的高親和力的結(jié)合性能。在修飾甚至更多的氨基酸時，主要的優(yōu)勢是維持蛋白化學(xué)完整性，而不減少所述對ED-B新形成的結(jié)合蛋白的骨架的總體穩(wěn)定性。為了產(chǎn)生對ED-B的新的結(jié)合位置，增加能修飾的殘基的總數(shù)，同樣地能將修飾的殘基分配到兩個單體泛素蛋白上。與修飾的單體泛素分子的數(shù)目一致，修飾的數(shù)目能是兩個。因為所述修飾的氨基酸包括在兩個單體泛素分子上，所以以泛素為基礎(chǔ)的ED-B結(jié)合蛋白的模塊結(jié)構(gòu)允許增加修飾的氨基酸的總數(shù)。本方法提供確定對ED-B具有一個單價特異性(對一個單獨的表位)的異二聚體泛素分子。因此，可能開始對結(jié)合伴侶具有共同的結(jié)合位置的異源二聚物的應(yīng)用，以引入增加的修飾的殘基的數(shù)目，其中修飾的殘基不能過度地影響最終的結(jié)合分子的蛋白化學(xué)完整性，因為那些修飾的殘基的總數(shù)是分布在形成二聚物的兩個單體單元上。所述結(jié)合ED-B的異二聚體修飾的泛素蛋白出現(xiàn)在蛋白質(zhì)文庫中。 “單價的”應(yīng)理解成以互相促進和組合的方式共同結(jié)合ED-B的修飾的二聚體泛素的第一和第二單體單元中形成兩個結(jié)合區(qū)域的能力，例如，兩個結(jié)合區(qū)域共同產(chǎn)生影響以形成單價的結(jié)合活性。第一和第二修飾的泛素的每一個結(jié)合區(qū)域分別引入所述異二聚體分子中，結(jié)合ED-B將顯然地比二聚體分子具有更低效率和更低親和力。兩個形成獨特的結(jié)合位置的結(jié)合區(qū)域比每一個單體蛋白單獨結(jié)合ED-B更有效，其中結(jié)合位置是在異二聚體修飾的泛素蛋白的表面上作為氨基酸的鄰近區(qū)域形成的，因此所述修飾的泛素是切實可行的。根據(jù)本發(fā)明，在篩選最有效的結(jié)合泛素分子之后，兩種單體蛋白沒有連接在一起這是顯著地重要的，但是在有異二聚體泛素的情況下已經(jīng)進行的篩選過程也是顯著地重要的。在最有效的結(jié)合泛素分子上接收序列信息之后，可通過任何其他方法獲得這些分子，例如，通過化學(xué)合成或通過遺傳工程方法，例如，通過將兩個已經(jīng)確定的單體泛素單元連接在一起。根據(jù)本發(fā)明，兩個不同修飾的結(jié)合到一個配體上的泛素單體通過利用例如遺傳方法彼此首尾融合連接。不同修飾的融合泛素單體以單價的方式結(jié)合且如果兩個“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”(“BDR”)共同發(fā)揮作用則不同修飾的融合泛素是有效的。這里將“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”定義為泛素單體上的區(qū)域，泛素單體在涉及結(jié)合靶的SEQ ID N0:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66,68的至少6個氨基酸中具有修飾的氨基酸。修飾的和連接的形成異二聚體蛋白的泛素單體通過單一的鄰近結(jié)合區(qū)域結(jié)合到相同的表位上。這種異聚體的鄰近區(qū)域是通過兩個模塊的兩個結(jié)合決定區(qū)域形成的，其中兩個模塊是通過兩個不同修飾的泛素單體形成的?！笆孜踩诤稀睉?yīng)理解成通過以方向N-C-N-C-依靠二聚物中包含的單元的數(shù)目連接它們的兩種共同融合的蛋白。這種首尾融合中，泛素單體可以是直接地連接而不需要任何連接子?？商鎿Q地，能通過連接子進行泛素單體的融合，例如，具有至少氨基酸序列為GIG或具有至少氨基酸序列為SGGGG的連接子，或任何其他連接子，例如GIG、SGGGG、SGGGGIG、SGGGGSGGGGIG或SGGGGSGGGG。其他用于兩個泛素單體的遺傳融合也是本領(lǐng)域中已知的，且能應(yīng)用其他連接子。本發(fā)明的修飾的泛素蛋白是對如靶或配體(這里其表達是可交替地應(yīng)用的)ED-B具有新的結(jié)合親和力的工程蛋白。術(shù)語“取代”也包括通過例如原始氨基酸的取代或添加化學(xué)基團或殘基的氨基酸的化學(xué)修飾。在至少一個蛋白的表面暴露的區(qū)域中的氨基酸的取代是至關(guān)重要的，其中氨基酸的取代包括位于0片區(qū)域的至少一個0片鏈的氨基酸或鄰近@片鏈達到3個氨基酸的排列。根據(jù)本發(fā)明，能利用任何期望的氨基酸進行用于產(chǎn)生對于ED-B特異的新的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸的取代，例如，用于修飾以產(chǎn)生ED-B新的結(jié)合性能，這不是強制性的，注意分別地具有特異的化學(xué)性能或側(cè)鏈的氨基酸，其與被取代的氨基酸的那些相似，因此任何期望的氨基酸能用于這個目的。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地通過在遺傳水平上通過隨機的突變形成的突變，例如，選擇的氨基酸的隨機取代，進行選擇的氨基酸的修飾步驟。優(yōu)選地，依靠遺傳工程的方法進行泛素的修飾，以改變屬于各自蛋白的DNA。優(yōu)選地，然后在原核或真核生物體中進行泛素蛋白的表達。顯著地在0片的四個P鏈的表面暴露的氨基酸中或鄰近泛素蛋白的P片鏈達到3個氨基酸的表面暴露的氨基酸中進行取代。每一個3鏈通常由5-7個氨基酸組成。關(guān)于SEQ ID N0:1，例如，3鏈通常包含氨基酸殘基2-7、12-16、41-45和65-71?？筛郊拥睾?優(yōu)選地修飾的區(qū)域包括鄰近P片鏈達到3個氨基酸的位置(例如，1、2、或3)?？筛郊拥睾蛢?yōu)選地修飾的優(yōu)選的區(qū)域特別包括氨基酸殘基8-11、62-64和72-75。優(yōu)選的區(qū)域包括兩個@鏈連接在一起的3轉(zhuǎn)角。一個優(yōu)選的3轉(zhuǎn)角包括氨基酸殘基62-64。最優(yōu)選的接近鄰近P片鏈的氨基酸是位置8中的氨基酸。另外，進一步優(yōu)選的氨基酸取代的實例是位置36、44、70、和/或71。例如，可附加地和優(yōu)選地修飾的那些區(qū)域包括氨基酸62、63和64 (3個氨基酸)，或72、73 (2個氨基酸)，或8 (I個氨基酸)。優(yōu)選的實施例中，通過氨基酸取代改變氨基酸殘基。然而，也可允許刪除或插入?？商砑踊騽h除的氨基酸的數(shù)目限于單體泛素分組中的1、2、3、4、5、6、7、或8個氨基酸，和相應(yīng)地關(guān)于二聚體泛素蛋白1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個氨基酸。一個實施例中，沒有做出氨基酸的插入。仍然進一步的實施例中，沒有進行刪除。假如本發(fā)明的修飾的泛素蛋白包括所述權(quán)利要求中指定的取代和也包括此處說明的一種或多種氨基酸的刪除和/或添加，則野生型人類泛素(SEQ ID NO: I)特異的氨基酸位置必需與修飾的泛素結(jié)盟，以彼此分配相應(yīng)的蛋白。在融合蛋白的情形中(參見下面)，以相同的方式完成每一個單體泛素分組的編號(和比對)，例如每一個各自的分組在氨基酸位置I上起始的二聚物的，例如比對。單體泛素中，優(yōu)選的來自哺乳動物，例如人類，能修飾在P鏈中或鄰近P片鏈達到3個氨基酸位置中出現(xiàn)至少10 %的氨基酸，優(yōu)選地至少20 %、進一步優(yōu)選地至少25 %，優(yōu)選地取代，根據(jù)本發(fā)明以產(chǎn)生先前不存在的結(jié)合性能。最大限度上，修飾3鏈中或鄰近3片鏈達到3個氨基酸位置中出現(xiàn)的優(yōu)選地大約50%的氨基酸，進一步優(yōu)選地在最大限度大約40%或大約35%或相當于大約30%或相當于大約25%的氨基酸，優(yōu)選地取代。一個3鏈中，通常修飾一到四個氨基酸。一個實施例中，在優(yōu)選地第一和第四P鏈中，例如氨基酸殘基2-7或65-71的區(qū)域，修飾六個氨基酸的三個。根據(jù)本發(fā)明，修飾的單體泛素被用作占總數(shù)20%的氨基酸的異源二聚物的構(gòu)造單元(building unit)?？紤]到這個方面,修飾的泛素蛋白與SEQID N0:1的序列同一丨丨生至少為80%。本發(fā)明進一步的實施例中，氨基酸水平上與SEQ ID NO: I的氨基酸序列的序列同一性是至少83%、至少85%、至少87%和此外至少90%至少92%或至少95%的序列同一性。與SEQ ID NO: I的氨基酸序列相比，本發(fā)明也包含氨基酸序列同一性超過97%的修飾的泛素蛋白。本發(fā)明的進一步的實施例中，在SEQ ID N0:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和/或68中的3或4或5或6或7個氨基酸中修飾泛素。另一個實施例中，已經(jīng)預(yù)修飾這些位置中要修飾的泛素。例如，進一步的修飾能包括在氨基酸74和75或氨基酸45上的修飾，以產(chǎn)生更好的穩(wěn)定性或蛋白化學(xué)性能。可獲得修飾的泛素單體，其中修飾SEQ ID NO: I的泛素總數(shù)達到9、10、11、12、13、14和最多15個的氨基酸，優(yōu)選地取代。根據(jù)實例，能獲得具有14個取代和刪除的修飾的單體泛素。以泛素的氨基酸的總數(shù)為基礎(chǔ)，這種相應(yīng)的百分數(shù)大約是20%。這是格外地不可思議的且不能期望的，因為通常更低的百分數(shù)已經(jīng)足夠打亂蛋白的折置。本發(fā)明的一個實施例中，修飾那些氨基酸，以產(chǎn)生具有新的ED-B結(jié)合性能的區(qū)域，其中這種結(jié)合性能在蛋白的表面上形成鄰近區(qū)域。如此，能產(chǎn)生鄰近區(qū)域，其對于ED-B具有結(jié)合性能。根據(jù)本發(fā)明“鄰近區(qū)域”涉及下列由于它們側(cè)鏈的電荷、立體結(jié)構(gòu)和疏水性/親水性，氨基酸以相應(yīng)的方式與它們的環(huán)境相合。環(huán)境能是溶劑，通常是水，或其他分 子，例如，空間地接近氨基酸。依靠關(guān)于蛋白的結(jié)構(gòu)信息和各自的軟件，能特征化蛋白的表面。例如，能以這種方式顯示蛋白的原子和溶劑之間的界面區(qū)，其中這種方式包括關(guān)于如何構(gòu)建這種界面區(qū)的信息，其表面區(qū)域接近溶劑，或者電荷在表面上如何分布的信息。例如利用適當?shù)能浖ㄟ^這種類型的可視化能顯示鄰近區(qū)域。這種方法是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的。根據(jù)本發(fā)明，整個的表面暴露區(qū)域也基本上用作要修飾的表面上的鄰近區(qū)域，以產(chǎn)生新的結(jié)合性能。一個實施例中，為了這種目的，修飾也能包括a-螺旋區(qū)域。異二聚體修飾的泛素蛋白中，結(jié)合決定區(qū)域包括兩個表面暴露的區(qū)域共同形成的一個鄰近區(qū)域，其包括一個結(jié)合決定區(qū)域長度的兩倍。在至少一個蛋白的表面暴露的區(qū)域中的氨基酸的修飾是至關(guān)重要的，其中表面暴露的區(qū)域包括P片區(qū)域的至少一個P鏈或鄰近P片鏈達到3個氨基酸的位置。通過本質(zhì)上的片狀和幾乎完全地伸展定義“ P片結(jié)構(gòu)”。與由多肽鏈的連續(xù)片段形成的a螺旋形成對比，能通過多肽鏈的不同的區(qū)域形成P片。用這種方法，在初級結(jié)構(gòu)中進一步分開的隔開的區(qū)域能彼此親近。3鏈代表性地具有5-10個氨基酸的長度(泛素中通常5-6個殘基)且具有幾乎完全伸展的構(gòu)造。P鏈彼此如此接近，所以在一條鏈的C-O基團和另一條鏈的NH基團之間形成氫鍵，反之亦然。P片能是由幾條鏈形成的且具有片狀結(jié)構(gòu)，其中在片狀平面的上面或下面之間Ca原子的位置是可替換的。氨基酸側(cè)鏈跟隨這種模式，因此對于頂部或?qū)τ诘撞康狞c是可替換的。依靠P鏈的方向，片可分成平行片和反平行片。根據(jù)本發(fā)明，兩種都能突變且用于制備要求的蛋白。對于0鏈和0片結(jié)構(gòu)的突變形成，在泛素接近表面中選擇P鏈或鄰近P鏈(其是3片的鏈)達到3個氨基酸的位置。利用相關(guān)的可用的X-射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)能確定表面暴露的氨基酸。如果晶體結(jié)構(gòu)是不可用的，依靠計算機分析能做出嘗試，以預(yù)測表面暴露的3片區(qū)域和關(guān)于可用的一級結(jié)構(gòu)的單獨的氨基酸位置的可接近性或者模擬3d蛋白結(jié)構(gòu)和以這種方式獲得關(guān)于潛在的表面暴露的氨基酸的信息。它的進一步的公開能參考例如J. Mol.Biol.，1987 Apr 5; 194(3) :531-44. Vijay-Kumar S，Bugg C. E.，Cookff. J.。然而，也可能在0片中或鄰近P鏈達到3個氨基酸的位置中進行修飾，因為其能省略要突變形成的氨基酸位置的耗時的預(yù)選擇。從它們的DNA環(huán)境分離那些編碼P片結(jié)構(gòu)或鄰近P片鏈達到3個氨基酸的位置的DNA，遭受隨機的突變形成和隨后整合入編碼蛋白的DNA中，它們是先前從蛋白中清除的。這之后是選擇工藝，以得到具有期望的結(jié)合性能的突變體。本發(fā)明的另一個實施例中，如上述說明的選擇P鏈或鄰近P鏈接近表面達到3個氨基酸，且確定這些選擇的區(qū)域內(nèi)的要突變的氨基酸位置。以這種方式選擇的氨基酸位置然后能在DNA水平上突變，通過位置定向突變形成，例如，通過編碼另一個先前選擇的特異的氨基酸的密碼子取代編碼特異的氨基酸的密碼子，或在隨機突變形成的背景下進行這種取代，其中定義要取代的氨基酸位置，但是沒有編碼新的、尚未確定的氨基酸的密碼子?！氨砻姹┞兜陌被帷笔且捉咏車軇┑陌被?。如果與模式三肽Gly-X-Gly中的氨基酸的可接近性相比，蛋白中的氨基酸的可接近性超過8 %，則氨基酸被稱作“表面暴露的”。這些蛋白區(qū)域或單獨的氨基酸位置，也分別優(yōu)選潛在的結(jié)合伴侶的結(jié)合位置，因為它的選擇將根據(jù)本發(fā)明進行。另外，參考Caster et al, 1983 Science, 221，709-713，和 Shrake & Rupley, 1973 J. Mol. Biol. 79 (2) : 351-371，其全部內(nèi)容包括在本申請中以供參考。通過在重新產(chǎn)生的人工結(jié)合位置的區(qū)域中氨基酸的取代，泛素蛋白質(zhì)骨架的變體不同于雙親蛋白且不同于彼此，可通過各自序列片段的靶向突變形成產(chǎn)生泛素蛋白質(zhì)骨架的變體。在這種情形中，能分別地通過具有各自其他性能的氨基酸置換或取代具有某些性能例如極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的氨基酸。除了取代之外，術(shù)語“突變形成”和“修飾的”和“置換的”也包括插入和刪除。在蛋白水平上，也能根據(jù)本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的方法通過氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)改變進行修飾。泛素突變的方法作為各自序列片段的突變形成的起始點，例如，能利用泛素的cDNA，其中cDNA能通過本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員已知的方法制備、改變和擴增。為了初級序列的相對小的區(qū)域(大約1-3個氨基酸)中的泛素的位置特異的改變，商業(yè)上可利用試劑和目前的方法("QuickChange'Stratagene; 〃Mutagene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit〃，Biorad)。為了更大區(qū)域的位置定向的突變形成，例如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)特異的實施例是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可利用的。為了這種目的，合成的寡脫氧核苷酸的混合物能用于例如突變的引入，其中合成的寡脫氧核苷酸在期望的位置具有簡并堿基對組成。這也能通過利用堿基對類似物獲得，堿基對類似物不能自然地出現(xiàn)在染色體組的DNA中，例如，次黃嘌呤核苷。用于0片區(qū)域的一種或多種P鏈或鄰近P片鏈達到3個氨基酸的位置的突變形成的起始點能是例如泛素的cDNA或也能是染色體組的DNA。此外，也能合成地制備編碼泛素蛋白的基因。本身已知的可用于突變形成的不同的程序是位置特異的突變形成的方法、隨機突變形成的方法、利用PCR的突變形成或相似的方法。本發(fā)明的優(yōu)選的實施例中，要誘變的氨基酸位置是預(yù)先確定的。進行要修飾的氨基酸的選擇，以滿足本權(quán)利要求I中關(guān)于那些要修飾的氨基酸的限制。每一種情形中，通常建立不同的突變體的庫，其是利用本身已知的方法篩選的。通常，要修飾的氨基酸的預(yù)選擇能顯著地容易地進行，因為足夠的結(jié)構(gòu)信息是要修飾的泛素蛋白可用的。
靶向突變形成和更長的序列片段的突變形成的方法，例如，依靠PCR、通過化學(xué)的突變形成或利用細菌的增變株，也屬于本技術(shù)且能根據(jù)本發(fā)明使用。本發(fā)明的一個實施例中，通過攜帶氨基酸密碼子NNK的DNA寡核苷酸的裝配進行突變形成。然而，應(yīng)理解，也能利用其他密碼子(三個一組)。以優(yōu)選地維持3片結(jié)構(gòu)的方式進行突變。通常，突變形成發(fā)生在暴露在蛋白表面上的穩(wěn)定的3片區(qū)域的外側(cè)上。它包括位置特異的和隨機的突變形成兩種。能利用商業(yè)上可用的StnUagenc.IX QiiickChangeIc >或Bio-Rad (Mutagene 噬菌粒體外突變裝備)(cf. us 5，789，166；US4,873，192)的裝備產(chǎn)生包括一級結(jié)構(gòu)中相對小的區(qū)域的位置特異的突變形成。如果更多延伸的區(qū)域遭受位置特異的突變形成，則必需制備DNA盒，其中通過包含變異的和未改變的位置的寡核苷酸的裝配獲得要誘變的區(qū)域(Nord et al, 1997 Nat.Biotechnol. 8，772-777;McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250，460-470.)。能通過、增變株中DNA的增值或通過PCR (易錯PCR)擴增引入隨機的突變形成(例如，Pannekoek etal., 1993 Gene 128,135140)。為了這個目的，使用具有增加錯誤率的聚合酶。分別地為了增強引入的突變形成的程度或為了聯(lián)合不同的突變，能依靠DNA改組(DNA shuffling)聯(lián)合 PCR 片段中的突變(Stemmer, 1994 Nature 370,389-391)。在 Kuchner 和 ArnolcK 1997)TIBTECH 15，523-530的檢查中提供關(guān)于酶的這些突變形成策略的檢查。為了在選擇的DNA區(qū)域中進行這種隨機的突變形成，也必需構(gòu)建用于突變形成的DNA盒。通過本領(lǐng)域中已建立的和知名的方法進行隨機的修飾?！半S機地修飾的核苷酸或氨基酸序列”是在許多位置已經(jīng)遭受核苷酸或氨基酸的插入、刪除或取代的核苷酸或氨基酸序列，它的本性是不能預(yù)知的。很多情形中，隨機的核苷酸(氨基酸)或核苷酸(氨基酸)序列的插入將是“完全地隨機的”(例如，作為隨機化合成或PCR-介導(dǎo)的突變形成的結(jié)果)。然而，隨機的序列也能包括具有共同的功能特征的序列(例如，具有表達產(chǎn)物的配體的反應(yīng))或隨機的序列在最終的表達產(chǎn)物具有完全的隨機序列的意義上可能是隨機的，其中完全的隨機序列具有例如平均分配的不同氨基酸的。為了向載體中恰當?shù)匾腚S機化的片段，根據(jù)本發(fā)明，通過位置定向的PCR-介導(dǎo)的突變形成的原理引入表達載體的隨機的核苷酸，這是優(yōu)選的。然而，技術(shù)人員已知的其他選項，和可能向載體擦黑如合成的隨機的序列庫。為了通過融合PCR產(chǎn)生突變體或庫，例如，可進行三個PCR反應(yīng)。進行兩個PCR反應(yīng)以產(chǎn)生部分地重疊的中間片段。進行第三個PCR反應(yīng)以融合中間片段。構(gòu)建庫或突變體變種的方法可包括在期望的限制位點周圍構(gòu)建第一組引物(限制位點引物)，正向和反向限制引物，和在例如感興趣的密碼子的上游和下游周圍構(gòu)建第二組弓I物(誘導(dǎo)有機體突變的引物)，正向和反向誘導(dǎo)有機體突變的引物。一個實施例中，直接地在感興趣的密碼子各自的上游和下游構(gòu)建引物。限制和誘導(dǎo)有機體突變的引物用于構(gòu)建第一中間片段和第二中間片段。兩個PCR反應(yīng)產(chǎn)生這些線性中間片段。每一個這些線性中間片段包含至少一個感興趣的密碼子的突變、側(cè)翼核苷酸序列和酶切位點。第三PCR反應(yīng)使用兩個中間片段和正向和反向限制引物，以產(chǎn)生融合的線性產(chǎn)物。相反，這里利用限制酶酶切線性產(chǎn)物的平末端，以在線性產(chǎn)物上形成粘性末端。通過DNA連接酶的使用融合線性產(chǎn)物的粘性末端，以產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物，例如，環(huán)狀多核苷酸序列。為了構(gòu)建中間片段，進行了兩組正向和反向引物的設(shè)計和合成，第一組與它的側(cè)翼核苷酸序列一起包含限制性酶酶切位點，和第二組包含至少一個感興趣的密碼子的變種(誘導(dǎo)有機體突變的引物)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將認可，許多變種將依賴許多期望修飾的變種氨基酸。通過發(fā)明者，如果在這個工藝中利用其他限制性酶，則可相應(yīng)地改變這種酶切位點的精確位置和相應(yīng)的正向和反向引物的序列，這是預(yù)期的。本領(lǐng)域可利用其他方法且其可代替使用。根據(jù)本發(fā)明，除了表達產(chǎn)物的隨機化片段引入骨架之外，通過將融合到編碼至少一種融合伴侶的核苷酸序列上的核苷酸序列隨機化，將隨機序列結(jié)合到融合伴侶上，這是經(jīng)常必需的。這種融合伴侶能例如，促進表達和/或純化/分離和/或表達產(chǎn)物的進一步的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明的一個實例，依靠PCR在單體泛素的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和
/或68上的至少6個氨基酸上能顯著容易地進行氨基酸的隨機取代，因為提及的位置位于接近蛋白的氨基或羧基端。因此，要操作的密碼子是在相應(yīng)的cDNA鏈的5’和3’端上。因而，除了位置2、4、6和/或8上的密碼子要突變之外，用于突變PCR反應(yīng)的第一寡脫氧核苷酸與泛素的氨基端的編碼鏈的序列一致。因此，除了位置62、63、64、65、66和/或68上的密碼子要突變之外，第二寡脫氧核苷酸至少部分地與羧基末端的非編碼鏈的多肽序列一致。依靠兩種寡脫氧核苷酸，利用編碼單體泛素的DNA序列作為模板進行聚合酶鏈式反應(yīng)。此外，利用側(cè)面寡核苷酸能將獲得的擴增產(chǎn)物添加到另一個聚合酶鏈式反應(yīng)中，其中寡核苷酸為限制性核酸內(nèi)切酶引入確定序列。根據(jù)本發(fā)明，首選的是將獲得的基因盒引入到載體系統(tǒng)，載體系統(tǒng)適用于后來的選擇程序，以對預(yù)定的半抗原或抗原具有結(jié)合性能的泛素變體的分離。泛素中要修飾的區(qū)域根據(jù)它們是否是作為結(jié)合伴侶的ED-B有用的和蛋白的總體結(jié)構(gòu)是否可能忍受修飾，從根本上選擇修飾的區(qū)域。除了表面暴露P鏈中的修飾之外，也能在蛋白的其他表面暴露的區(qū)域中進行修飾，優(yōu)選地在鄰近3鏈達到3個氨基酸的位置中。這些修飾區(qū)域都涉及對ED-B重新產(chǎn)生的具有聞未和力的結(jié)合。本發(fā)明的另一個可選擇的實施例中，修飾蛋白中四個P鏈的一個或兩個中，優(yōu)選地兩個中的或鄰近優(yōu)選的四個P鏈的兩個達到3個氨基酸的位置的氨基酸，以產(chǎn)生新的結(jié)合性能。選項也是四個P鏈的三個或四個或鄰近四個P鏈的三個或四個達到3個氨基酸的位置的修飾，以ED-B結(jié)合的產(chǎn)生。顯著地優(yōu)選的是修飾氨基末端和羧基末端鏈中或鄰近氨基末端和羧基末端鏈達到3個氨基酸的位置中的氨基酸，優(yōu)選地取代，以對ED-B產(chǎn)生新的結(jié)合位置。這個方面中，顯著地優(yōu)選的是修飾鄰近羧基末端3片鏈達到4個氨基酸位置上的氨基酸，優(yōu)選地取代，和修飾鄰近氨基末端3片鏈達到I個氨基酸位置上的氨基酸，優(yōu)選地取代。在哺乳動物泛素的下列位置的至少三個表面暴露的氨基酸中，優(yōu)選地人類泛素
2、4、6、8、62、63、64、65、66、68，顯著地優(yōu)選的修飾，優(yōu)選地取代。所述氨基酸組的至少四個氨基酸在泛素的表面形成鄰近表面暴露區(qū)域，發(fā)現(xiàn)其顯著地適于產(chǎn)生修飾的蛋白，這種蛋白具有關(guān)于作為結(jié)合伴侶的ED-B先前不存在的結(jié)合親和力。要修飾這些氨基酸殘基的至少3個?？蛇x地修飾所述氨基酸殘基的3、4、5、6、7、8、9或10，可選地聯(lián)合附加的氨基酸殘基。在做出上述修飾之后，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)氨基酸修飾的泛素序列在實例中描述，其結(jié)合ED-B具有非常高的親和力(Kd值達到10_9)。融合蛋白另一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及包括融合到藥學(xué)和/或診斷學(xué)上的有效成分上的本發(fā)明的結(jié)合蛋白的融合蛋白。仍然進一步的方面中，本發(fā)明涉及包括融合到藥學(xué)和/或診斷學(xué)上的有效成分上的本發(fā)明的異二聚體結(jié)合蛋白的融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白可包括非多肽成分，例如，非肽連接子、非肽配體，例如，用于治療上或診斷上相關(guān)的放射性核。它也可包括小的有機的或非氨基酸基礎(chǔ)的化合物，例如，糖、寡聚一或多聚糖、脂肪酸等等。本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，異源多聚體以泛素為基礎(chǔ)的ED-B結(jié)合分子單價地或非單價地結(jié)合到具有治療上或診斷上相關(guān)性能的蛋白或肽上。 下面給出如何獲得以泛素為基礎(chǔ)的具有ED-B結(jié)合能力的融合蛋白的某些實例。a)通過泛素中出現(xiàn)的賴氨酸殘基蛋白的綴合；b)通過半光氨酸殘基，異二聚體以泛素為基礎(chǔ)的結(jié)合蛋白的綴合-半胱氨酸殘基能位于C-末端，或任何其他位置上(例如，氨基酸殘基24或57);與丁烯二酰亞胺(maleimide)可選擇的成分的綴合；c)肽的或蛋白原的綴合-遺傳的融合(優(yōu)選的C-或N-末端)；d) “標簽建立融合-蛋白或肽位于靶蛋白ED-B的C-或N末端上。融合“標簽”，例如，多聚-組氨酸(顯著地相關(guān)的放射性標記)。這些和其他用于共價地和非共價地將感興趣的蛋白粘附到載體上的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且因而在這里沒有更詳細地描述?？蛇x地，所述有效成分是細胞因子，優(yōu)先選自那些組的細胞因子，那些組是由腫瘤壞死因子(例如，TNF a、TNF P )、白細胞介素(例如，IL-2、IL-12、IL-10、IL-15、IL-24、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-IU IL-13、IL-8、IL-I a、IL-I ^ )、干擾素(例如，IFNa、IF卵、IFNy )、巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤生長相關(guān)因子(GRO) (GROa、GRO
3、GRO Y )、巨噬細胞炎性蛋白(MIP) (MIP-la ,MIP-I ^、MIP_3a、MIP_3P )、TGF-P LIFlCD80、CD-40 配體、B70、LT- ^、Fas-配體、ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1a / @、BUNZ0/STRC33、1-TAC、BLC/BCA-1、MDC、TECK, TARC, RANTES, HCC-1、HCC-4、DC-CKUMCP-1-5、人嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)、Eotaxin-2、1-309、MPIF_l、6Ckine、CTACK、MEC、淋巴細胞趨化因子(Lymphotactin )、人神經(jīng)趨化蛋白(Fractalkine )、和其他。用于本發(fā)明的一個最優(yōu)選的細胞因子是TNFa。由于人類中有效劑量的不可接受的毒性，炎性的細胞因子TNF具有多重的活性，哺乳動物體中包括當前臨床上不相關(guān)的抗癌作用。當前，TNF治療上用于與抑制細胞生長的物質(zhì)如苯丙氨酸氮芥結(jié)合。進一步可選地，能與異源多聚體以泛素為基礎(chǔ)的結(jié)合蛋白綴合的所述有效成分是有毒的化合物，優(yōu)選地小的有機化合物或多肽，可選地有毒的化合物，例如，選游離肥皂草素(saporin)、截短的假單胞菌外毒素A、重組植物毒素(recombinant gelonin)、蓖麻毒素-A鏈、烯二炔類高效抗腫瘤抗生素(calicheamicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、達內(nèi)霉素(dynemicin)、可達毒素(kedarcidin)、九兀環(huán)類烯二炔(maduropeptin)、阿毒素(doxorubicin)、柔毛毒素(daunorubicin)、有絲分裂抑制齊[J(auristatin)、霍亂毒素、蒴蓮根毒素(modeccin)、白喉毒素組成的組。本發(fā)明的進一步的實施例中，根據(jù)本發(fā)明異源多聚體以泛素為基礎(chǔ)的結(jié)合蛋白可包含人工的氨基酸。本發(fā)明的融合蛋白的進一步的實施例中，所述有效成分是熒光染色，優(yōu)選的成分選自放射性核素的組或選自Y —放射同位素的組，優(yōu)選地99^123^111^，或選自正電子輻射源的組，優(yōu)選地18^608^86^ 124工，或選自3輻射源的組，優(yōu)選地131,0^177^、67Cu,或選自a福射源的組，優(yōu)選地213Bi、211At ;Alexa氟染料或Cy染料(Berlier et al.，JHistochem Cytochem. 51 (12) : 1699-1712，2003);光敏材料；促凝血因子，優(yōu)選地組織因子(例如，tTF截短的組織因子)；促藥物活化的酶，優(yōu)先選游離羧肽酶、葡萄糖苷酸酶和葡萄糖苷酶組成的組的酶；和/或功能的Fe結(jié)構(gòu)域,優(yōu)選地人類功能的Fe結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明涉及融合蛋白的進一步的實施例，進一步包括調(diào)節(jié)血清半衰期的成分，優(yōu)先選游離聚乙二醇、清蛋白一結(jié)合肽，和免疫球蛋白組成的組的成分。 結(jié)合特異性(解離常數(shù))根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白的結(jié)合特異性是被上述非融合蛋白特異的Kd定義。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“Kd”定義與本發(fā)明在范圍10_7-10_12M中一致的特異的結(jié)合親和。10_5M和以下的值能夠被認為是可計量的結(jié)合親和力。依靠本申請，IO-7到10_nM的值優(yōu)選的用于例如色析法應(yīng)用，或者10_9到KT12M用于例如診斷或治療的應(yīng)用。進一步優(yōu)選的結(jié)合親和力范圍為1(T7到I(T10M,優(yōu)選地到l(TnM。決定結(jié)合親和力的方法是本身已知的且能例如從下列方法中選出ELISA、以表面等離子共振(SPR)為基礎(chǔ)的技術(shù)(例如由Biaeore 提供的)、熒光光譜學(xué)、等溫滴定溫量熱儀(ITC)、分析超速離心法、FACS。在做出上述修飾之后，本發(fā)明在實例中描述的氨基酸修飾的泛素的序列，其具有高親和力的結(jié)合它們的靶(Kd值達到KTkiMX泛素的二聚化這個發(fā)明中“二聚物”被認為是包括兩個單體泛素蛋白的蛋白。如果二聚物包括兩個不同修飾的單體，其被稱為“異源多聚體一二聚物”或“異源二聚物”。因而，本發(fā)明的“異源二聚物”被認為是兩個不同修飾的對特異的結(jié)合伴侶ED-B表現(xiàn)組合的單價結(jié)合性能單體蛋白的融合。應(yīng)強調(diào)，本發(fā)明的修飾的異二聚體ED-B結(jié)合泛素蛋白不能通過分別地篩選每一個單體泛素蛋白和然后組合它們的兩個獲得，而是通過由對所述ED-B配體共同表現(xiàn)單價結(jié)合活性的第一和第二單體單元組成的異二聚體蛋白的篩選獲得。應(yīng)期望，每一個所述分組對ED-B表現(xiàn)相當有限的結(jié)合親和力，而只有組合的二聚體修飾的泛素蛋白具有此處描述的極好的結(jié)合性能(參見，例如，圖4)。根據(jù)本發(fā)明，兩個不同修飾的泛素單體通過首尾融合連接到ED-B的相同的表位上遺傳上連接，且如果兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域共同發(fā)揮作用，則是有效的。單體的BDRs形成單一的鄰近結(jié)合區(qū)域。因而，根據(jù)本發(fā)明，二聚有效地結(jié)合纖維連接蛋白的ED-B的修飾的泛素蛋白。如上述討論的，能直接地或通過連接子連接單體。能利用許多可能的連接子。每一個單體泛素在2、4、6、8、62、63、64、65、66、68的至少六個氨基酸中顯示修飾。單體蛋白彼此遺傳上融合。通過協(xié)作中的所述BDRs介導(dǎo)對靶的結(jié)合，例如，BDRs協(xié)作且形成單一的和共同的有以單價方式結(jié)合到纖維連接蛋白的所述ED-B結(jié)構(gòu)域上的能力的結(jié)合區(qū)域。結(jié)合ED-B的修飾的泛素異源二聚物根據(jù)本發(fā)明，泛素的異源二聚物結(jié)合ED-B具有的Kd = KT7-IO-12M且關(guān)于所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)表現(xiàn)單價的結(jié)合活性，這些泛素的異源二聚物是選自下列兩個選項(I)第一單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、63、64、65和66取代；和第二單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66取代；可選地另外在位置2取代，或者(2)所述第一單體單元中，至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66取代；和 所述第二單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66取代；可選地另外在位置2取代。一個實施例中，融合蛋白是所述泛素單體遺傳上的融合二聚物，其中泛素單體在第一泛素單體的位置6、8、63 — 66中具有氨基酸取代和氨基酸殘基中位置6、8、62 — 66中的取代，和可選地第二泛素單體的位置2中，優(yōu)選地第一泛素單體中的取代位置6中的賴氨酸(K)到色氨酸(W)或笨丙氨酸(F)，位置8中的亮氨酸(L)到色氨酸或笨丙氨酸(W，F(xiàn))，位置63中的賴氨酸(K)到精氨酸(R)或組氨酸(H)，位置64中的谷氨酸(E)到賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)，位置65中的絲氨酸(S)到苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)和位置66中的蘇氨酸(T)到脯氨酸(P);第二泛素單體中，取代是位置6中的賴氨酸(K)到蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)、絲氨酸(S)或谷酰胺(Q)，位置8中的亮氨酸(L)到谷酰胺(Q)或蘇氨酸(T)或天冬酰胺(N)或絲氨酸(S)，位置62中的谷酰胺(Q)到色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)，位置63中的賴氨酸(K)到絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)或谷酰胺(Q)，位置64中的谷氨酸(E)到天冬酰胺(N)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、或谷酰胺(Q)，位置65中的絲氨酸(S)到苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)，和位置66中的蘇氨酸(T)到谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，和位置2中可選地谷酰胺(Q)到精氨酸(R)、組氨酸(H)或賴氨酸(K)是優(yōu)選的。這些每個單體中可替換的取代能彼此沒有任何限制的結(jié)合，假設(shè)合成的修飾的泛素異二聚體對所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)顯示特異的結(jié)合親和力Kd =IO^7-IO-12M,且關(guān)于所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)表現(xiàn)單價的結(jié)合活性，和假設(shè)沒有破壞或妨礙泛素蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。最優(yōu)選的是下列取代(I)第一單體單元中至少 K6W、L8W、K63R、E64K、S65F、和 T66P ；和第二單體單元中至少K6T、L8Q、Q62W、K63S、E64N、S65W、和T66E ;可選地另外Q2R，或者(2)第一單體單元中至少 Q2T、F4W、K6H、Q62N、K63F、E64K、S65L、和 T66S ；第二單體單元中至少K6X、L8X、Q62X、K63X、E64X、S65X、和 T66X ;可選地另外 Q2X，
其中X能是任何氨基酸(參見圖2)。顯著地優(yōu)選的是下列第一泛素單體中的取代，以產(chǎn)生ED-B結(jié)合蛋白2 :Q — T、4 F — W、6 K — H、62 Q — N、63 K — F、64:E — K、65 S — L、66 T — S。
沒有連接子或任何連接子能用于連接兩個單體的首尾。優(yōu)選地連接子是SEQ IDNO: 32的那些或者序列GIG或者SGGGGIG或者SGGGGSGGGGIG。一個優(yōu)選的實施例中，具有兩個結(jié)合決定區(qū)域(BDR) —起發(fā)揮作用已結(jié)合ED-B泛素異源二聚物，包括SEQ ID N0:33or 34的氨基酸序列。通過下列序列提供進一步優(yōu)選的蛋白，其中XXXX可以是任何氨基酸(SEQ ID N0:47)。作為連接子，SGGGGSGGGGIG用在這里應(yīng)該理解，其他類型的連接子或沒有連接子也是切實可行的替代。MTIWVHTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNINFKLSLHLVLRLRGGSGGGGSGGGGIGMQIFVXTXTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIWAGKQLEDGRTLSDYNIXXXXXLHLVLRLRGG圖2中示出具有這些序列的蛋白的實例的保守序列。本發(fā)明的優(yōu)選的融合蛋白包括作為藥學(xué)有效成分的具有SEQ ID N0:35or 36的序列的TNF-a。本發(fā)明進一步的方面中，本發(fā)明也包括編碼之前描述的蛋白或融合蛋白多核苷酸。此外，本發(fā)明包含包括所述多核苷酸的載體。本發(fā)明的另外的方面中，宿主細胞包括此處描述的蛋白或融合蛋白和/或編碼所述重組蛋白多核苷酸或本發(fā)明的融合蛋白或包含所述多核苷酸的載體。本發(fā)明的蛋白的用途，例如，特異性地針對ED-B的基于異二聚體泛素的結(jié)合蛋白融合到效應(yīng)物例如TNF a上本發(fā)明的修飾的泛素ED-B結(jié)合蛋白用作例如制備體內(nèi)或體外使用的診斷方法和治療方法。根據(jù)本發(fā)明，蛋白能用作例如，直接效應(yīng)物分子(調(diào)節(jié)劑、拮抗劑、激動劑)或抗原確定結(jié)構(gòu)域。圖I的表格中示出具有ED-B抗原的豐富的表現(xiàn)的腫瘤的實例。依靠選擇的融合伴侶，本發(fā)明的藥物的成分適和用于癌癥的治療，例如，胸腺癌和直腸癌，或任何其他ED-B豐富的腫瘤疾病(比較，圖I中列出的它的例子)。組合物適于包含治療學(xué)上的有效劑量。要進行的劑量的質(zhì)量依賴要治療的有機體、疾病的類型、病人的年齡和體重和本身已知的其他因素。組合物包含藥學(xué)上或診斷上可接受的載體且能可選地包含進一步的輔助劑和本身已知的賦形劑。這些包括但不限于，例如，穩(wěn)定劑、表面活性劑、鹽、緩沖液、著色劑等等。藥學(xué)的組合物能以液體制備、乳劑、用于局部應(yīng)用的洗劑、氣霧劑形式，以粉末、顆粒、藥片、栓劑或者膠囊的形式，以乳劑或脂質(zhì)體(liposomal)制備的形式。組合物是優(yōu)選的無菌的、非高溫和等張的，且包含藥學(xué)上傳統(tǒng)的和可接受的本身已知的添加劑。此外，已做出參考美國藥典或Remington’s藥物科學(xué)(Mac Publishing Company (1990))的規(guī)則。在人類和獸醫(yī)領(lǐng)域中，能通過本身已知的方法制備醫(yī)學(xué)治療和預(yù)防藥學(xué)上有效的藥物，其包含至少一種與本發(fā)明一致的修飾的異源多聚體ED-B結(jié)合泛素蛋白。依靠草本制劑的制備，這些組合物能通過注射或灌輸、全身給藥、直腸給藥、腹膜給藥、肌肉給藥、皮下給藥、皮膚給藥或通過其他按照慣例上使用的應(yīng)用方法。藥物的制備的類型依賴要治療的疾病的類型、疾病的嚴重程度、要治療的病人和其他藥學(xué)領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的因素。實施例中，藥物的組合物包含本發(fā)明的蛋白或融合蛋白或其組合，且進一步包括一種或多種化學(xué)治療試劑，優(yōu)先選自下列表格
權(quán)利要求
1.一種能夠結(jié)合纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)的蛋白，包括修飾的異二聚體泛素蛋白，其中兩個單體泛素單元以首尾排列的方式連接在一起，其中所述二聚體蛋白的每一個單體通過SEQ ID N0:1的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68中的至少6個氨基酸的取代而被不同地修飾， 其中所述取代包括 (1)在第一單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、63、64、65和66取代；和 在第二單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66取代；可選地另外在位置2取代，或者 (2)在第一單體單元中，至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66取代；和 在第二單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66取代；可選地另外在位 置2取代， 并且可選地進一步修飾，優(yōu)選地其他氨基酸的取代，所述修飾的單體泛素單元與SEQID NO: I具有的氨基酸同一性為至少80%、至少85%和至少90%的組中的至少一個，所述蛋白對所述纖維連接蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域具有特異的結(jié)合親和力Kd = 10_7-10_12M并且對所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)表現(xiàn)出單價的結(jié)合活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蛋白，其中所述取代包括 (1)在第一單體單元中，至少K6W、L8W、K63R、E64K、S65F和T66P;和在第二單體單元中，至少1(61\180、0621、1(635、￡64隊5651 和 T66E ;可選地另外 Q2R，或者 (2)在第一單體單元中，至少Q(mào)2T、F4W、K6H、Q62N、K63F、E64K、S65L 和 T66S ； 并且在第二單體單元中，至少在位置6、8、62、63、64、65、和66取代；可選地另外在位置2取代。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的蛋白，其中進一步修飾I到7個另外的氨基酸，其可選地選自位置36、44、70和71的氨基酸中的一個或多個，并且可選地另外62、63和64或72和73或8。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的蛋白，其中兩個泛素單體直接連接或通過連接子連接，優(yōu)選地連接子具有至少序列GIG或至少SGGGG，優(yōu)選地或SGGGGIG或SGGGGSGGGGIG(SEQ ID NO:32)。
5.一種融合蛋白，包括融合到藥學(xué)活性成分或診斷成分上的前述權(quán)利要求中任一項所述的蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其包括SEQID NO: 33或34或47的泛素異源二聚物或與SEQ ID NO:33或34或47的序列具有至少90%或95%的氨基酸同一性。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的融合蛋白，其中所述藥學(xué)活性成分是細胞因子、趨化因子、細胞毒性化合物、或酶，并且其中所述診斷活性成分是熒光化合物、光敏劑、或放射性核素。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的融合蛋白，其中所述藥學(xué)活性成分是TNF-a或其衍生物，優(yōu)選地，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 35或36的序列或其中SEQ ID NO: 47與TNF-a或其衍生物融合，或與SEQ ID NO: 35或36的序列或融合于TNF-a或其衍生物的SEQID NO:47具有至少90%或95%的氨基酸同一性。
9.一種藥物組合物，包含藥物有效量的能夠結(jié)合權(quán)利要求1-4中任一項所述的纖維連接蛋白的ED-B結(jié)構(gòu)域的蛋白或藥物有效量的權(quán)利要求5-8中任一項所述的融合蛋白，和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，進一步包括一種或多種化療劑，優(yōu)先選自苯丙氨酸氮芥、多柔比星、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、氟脫氧尿嘧啶、順鉬、紫杉醇、和吉西他濱；或選自激酶抑制劑組，或放射性藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其是組合制劑的形式或多部分試劑盒的形式。
12.編碼權(quán)利要求1-4中任一項所述的重組蛋白或權(quán)利要求5-8中任一項所述的融合蛋白的多核苷酸。
13.包括權(quán)利要求12所述的多核苷酸的載體。
14.一種宿主細胞，包括權(quán)利要求1-4中任一項所述的蛋白、權(quán)利要求5-8中所述的融合蛋白、權(quán)利要求14所述的載體和/或權(quán)利要求12所述的多核苷酸。
15.一種診斷化合物，包括權(quán)利要求1-4中任一項所述的蛋白或權(quán)利要求5-8所述的融合蛋白以及診斷可接受的載體。
16.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任一項所述的蛋白的方法，包括下列步驟 a)提供來源于單體泛素蛋白的經(jīng)不同修飾的二聚體泛素蛋白群，所述群包括二聚體泛素蛋白，所述二聚體泛素蛋白包括兩個以首尾排列方式連接在一起的修飾的泛素單體，其中所述二聚體蛋白的每一個單體是通過SEQ ID NO:l的位置2、4、6、8、62、63、64、65、66和68中的至少6個氨基酸的取代被不同修飾的， 其中所述取代包括 (1)在第一單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、63、64、65和66取代；和 在第二單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66取代；可選地另外在位置2取代，或者 (2)在第一單體單元中，至少在氨基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66取代；和 在第二單體單元中，至少在氨基酸位置6、8、62、63、64、65和66取代；可選地另外在位置2取代， b)提供作為潛在配體的纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)； c)使所述經(jīng)不同修飾的蛋白群與所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)接觸； d)通過篩選方法確定修飾的二聚體泛素蛋白，其中所述修飾的二聚體泛素蛋白以范圍為10_7-10_12M的特異的結(jié)合親和力Kd結(jié)合所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)并且對所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)表現(xiàn)出單價的結(jié)合活性，并且可選地 e)利用所述結(jié)合親和力分離所述修飾的二聚體泛素蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述經(jīng)不同修飾的蛋白群是通過遺傳上融合兩個各自編碼經(jīng)不同修飾的單體泛素蛋白的DNA文庫獲得的。
18.—種產(chǎn)生權(quán)利要求5-8中任一項所述的融合蛋白的方法，其中將權(quán)利要求1-4中任一項所述的蛋白融合到藥學(xué)活性成分或診斷成分上。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的重組蛋白或權(quán)利要求5-8中任一項所述的融合蛋白，用于醫(yī)學(xué)治療或診斷的方法中。
20.一種包含編碼如權(quán)利要求1-4中任一項限定的經(jīng)修飾的單體泛素蛋白的DNA的文庫。
21.一種包含DNA的融合文庫，通過融合權(quán)利要求20的兩個文庫獲得，每個文庫編碼經(jīng)不同修飾的單體泛素蛋白單元，以獲得異二聚體泛素融合蛋白，其單體單元以首尾排列的方式連接在一起，所述文庫編碼對所述纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B (ED-B)表現(xiàn)單價的結(jié)合活性的泛素異二聚體融合蛋白。
22.—種通過表達權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的DNA文庫獲得的蛋白質(zhì)文庫。
全文摘要
本發(fā)明涉及獲自修飾的泛素的新的異源多聚體蛋白，其能夠以高親和力結(jié)合纖維連接蛋白的額外結(jié)構(gòu)域B(ED-B)。此外，本發(fā)明涉及包括融合到藥學(xué)和/或診斷活性成分上的所述重組蛋白的融合蛋白。本發(fā)明進一步涉及所述蛋白在醫(yī)學(xué)治療方法中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/00GK102753569SQ201080056991
公開日2012年10月24日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者伊爾卡·亨澤根, 埃里克·菲德萊爾, 安雅·庫納特, 托馬斯·戈特勒, 曼亞·格洛塞爾, 約爾格·納坎普, 阿諾德·施托伊爾納格爾, 馬庫斯·菲德萊爾 申請人:塞爾蛋白質(zhì)股份有限公司