專利名稱：改良的油包囊蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)和改良不同宿主細(xì)胞類型中的油體(oil bodies)的組合物和方法。
背景技術(shù)：
在自然界中，開花植物通過(guò)在其種子中積聚油(即三酰基甘油(TAG))有效地儲(chǔ)存能量，并通過(guò)將磷脂蛋白單層嵌入油體周圍而在離散油體中儲(chǔ)存能量。這些種子作物已作為飼料用于多種農(nóng)業(yè)應(yīng)用中，且近年來(lái)也已用作生物燃料的原料源。以單位重量計(jì)，脂質(zhì)的能量含量大致為蛋白或碳水化合物的兩倍，且因此格外關(guān)注提高各種物種(最值得注意地，植物)的油含量。除能量方面以外，油體自身也具有獨(dú)特特性，且形成許多生物技術(shù)應(yīng)用的 基礎(chǔ)，所述應(yīng)用包括、但不限于重組蛋白的純化、多聚蛋白復(fù)合物的形成、乳化作用及生物活性物的遞送。遺憾的是，植物種子占總植物生物量的極小百分比，且隨著對(duì)改良農(nóng)業(yè)生產(chǎn)率及替代性能量的需要，認(rèn)識(shí)到當(dāng)前由多種所投入的種子作物獲得的油產(chǎn)量是不足的。研究工作已經(jīng)不僅集中于提高植物種子內(nèi)油生產(chǎn)的生產(chǎn)率，而且集中于提高其它細(xì)胞類型及物種中的油生產(chǎn)的生產(chǎn)率。傳統(tǒng)的育種及誘變已在此領(lǐng)域中獲得愈來(lái)愈多的成功；但是，基因工程已在改良有機(jī)體以產(chǎn)生提高的油水平方面取得長(zhǎng)足進(jìn)步。盡管某些研究組已對(duì)油合成途徑的不同部分進(jìn)行研究以增量調(diào)節(jié)種子中的油產(chǎn)量，另其它研究組已經(jīng)致力于增加占生物量的更大部分的細(xì)胞類型中的油。雖然基因工程已在增加某些靶標(biāo)中的油含量方面取得一些進(jìn)展，但仍留有重要挑戰(zhàn)。仍要實(shí)現(xiàn)種子中的油體生產(chǎn)的生產(chǎn)率的進(jìn)一步提高，且尚未實(shí)現(xiàn)在其它細(xì)胞類型及物種中生產(chǎn)油體(類似于植物種子中的油體生產(chǎn))的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有不同穩(wěn)定程度的油體的組合物及方法。本發(fā)明涉及生廣具有人工引入的半胱；氣酸殘基的改良油質(zhì)蛋白。優(yōu)選地，在改良油質(zhì)蛋白的N端及C端親水臂中弓I入人工引入的半胱氨酸殘基。改良油質(zhì)蛋白的表達(dá)允許在除維管植物的生殖組織以外的新細(xì)胞類型及甚至其它物種中生成穩(wěn)定的油體。當(dāng)與TAG合成酶組合時(shí)，本發(fā)明導(dǎo)致TAG作為穩(wěn)定的油體在真核細(xì)胞中積聚及儲(chǔ)存。與未改良的細(xì)胞或甚至僅表達(dá)TAG合成酶的細(xì)胞相比，本發(fā)明允許以其它方式實(shí)現(xiàn)TAG的過(guò)量積聚。例如，本發(fā)明已證實(shí)，可在除種子以外的維管植物的營(yíng)養(yǎng)部分中積聚更高水平的穩(wěn)定的油體。在它們的營(yíng)養(yǎng)組織中具有提高的TAG水平的植物，會(huì)提供用于動(dòng)物原料和生物燃料原料應(yīng)用的有用能源。另外，從宿主細(xì)胞(諸如大腸桿菌、巴氏畢赤酵母、釀酒酵母、杜氏藻屬、萊氏衣藻)純化出的重組改良油質(zhì)蛋白可用于生產(chǎn)人造油體。人造油體中的改良油質(zhì)蛋白或由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞純化獲得的改良油質(zhì)蛋白，可任選地經(jīng)由在改良油質(zhì)蛋白中的半胱氨酸殘基進(jìn)行交聯(lián)?？梢酝ㄟ^(guò)操縱氧化還原環(huán)境來(lái)控制交聯(lián)度。也可通過(guò)改變改良油質(zhì)蛋白中的半胱氨酸數(shù)量來(lái)調(diào)適交聯(lián)度。使用這些技術(shù)的組合，由改良油質(zhì)蛋白形成的油體可針對(duì)其乳化特性進(jìn)行調(diào)適，以調(diào)節(jié)熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性及肽酶抗性。改良油質(zhì)蛋白也可與目標(biāo)蛋白融合，以形成融合蛋白。融合蛋白(改良油質(zhì)蛋白+目的蛋白)可在細(xì)胞或有機(jī)體中重組表達(dá)。以此方式，含有表達(dá)的融合蛋白的油體可用于純化及遞送目的蛋白，用于多種用途。另外，油體可保護(hù)動(dòng)物的胃和/或瘤胃內(nèi)的TAG，或至少延遲TAG在其中的降解和/或生物氫化，使得來(lái)自TAG的完整離散脂質(zhì)由動(dòng)物的腸吸收。因此，本發(fā)明也可用于動(dòng)物 的膳食攝入方面，尤其通過(guò)改良油質(zhì)蛋白在植物中的表達(dá)。編碼具有人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白的多核苷酸在第一方面，本發(fā)明提供了編碼包括至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)油質(zhì)蛋白也包括油體固醇蛋白(steroleosin)及油體I丐蛋白(caloleosin)。改良油質(zhì)蛋白因此可選自改良油質(zhì)蛋白、改良的油體I丐蛋白或改良的油體固醇蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白是改良油質(zhì)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白是改良的油體鈣蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白是改良的油體固醇蛋白。每類油質(zhì)蛋白(油質(zhì)蛋白、油體鈣蛋白和油體固醇蛋白)的實(shí)例均在本文中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白包括至少兩個(gè)半胱氨酸，其中至少一個(gè)經(jīng)人工引入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白包括至少兩個(gè)至至少十三個(gè)(即，2、3、
4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14個(gè)或更多個(gè))人工引入的半胱氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述半胱氨酸經(jīng)人工引入在油質(zhì)蛋白的N端親水區(qū)中或油質(zhì)蛋白的C端親水區(qū)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白包括至少一個(gè)在N端親水區(qū)中的半胱氨酸及至少一個(gè)在C端親水區(qū)中的半胱氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述半胱氨酸基本上均勻地分布于油質(zhì)蛋白的N端及C端親水區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸編碼融合蛋白，所述融合蛋白包括與目的蛋白融合的改良油質(zhì)蛋白。構(gòu)建體在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種遺傳構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的多核苷酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建體中的多核苷酸可操作地連接至啟動(dòng)子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物營(yíng)養(yǎng)組織中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物種子中驅(qū)動(dòng)所述多核昔Ife的表達(dá)。在另Iv實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物花粉中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在大腸桿菌細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在酵母細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在藻類細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體，其含有編碼改良的中性脂質(zhì)蛋白的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體也含有編碼三?；视?TAG)合成酶的第二種多核苷酸。在不同的實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體可連接至能夠在不同宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的啟動(dòng)子序列。因此，本發(fā)明也提供了所述構(gòu)建體用于誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)改良油質(zhì)蛋白和/或TAG合成酶的用途。在不同的實(shí)施方案中，所述表達(dá)改良油質(zhì)蛋白的構(gòu)建體及所述表達(dá)TAG合成酶的構(gòu)建體可由相同或不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體以適當(dāng)位置及取向定位于適當(dāng)功能性內(nèi)源啟動(dòng)子中，以便進(jìn)行構(gòu)建體的表達(dá)。在不同的實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體可在細(xì)菌、植物、真菌或藻類細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在植物細(xì)胞中表達(dá)所述構(gòu)建體的情況下，該細(xì)胞可為營(yíng)養(yǎng)組織、種子、花粉或果實(shí)組織。宿主細(xì)胞在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的構(gòu)建體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其被遺傳修飾成包含本發(fā)明的多核苷酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其被遺傳修飾成表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。
也表達(dá)TAG合成酶的宿主細(xì)胞在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞也被遺傳修飾成表達(dá)三?；视?TAG)合成酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞被遺傳修飾成包含編碼三?；视?TAG)合成酶的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞包含表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包括編碼三?；视?TAG)合成酶的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸可操作地連接至啟動(dòng)子序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物營(yíng)養(yǎng)組織中驅(qū)動(dòng)所述核酸序列的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物種子中驅(qū)動(dòng)所述核酸序列的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物花粉中驅(qū)動(dòng)所述核酸序列的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在大腸桿菌細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在酵母細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在藻類細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。宿主細(xì)胞類型宿主細(xì)胞可為任何類型的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、藻類細(xì)胞及植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為真菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為藻類細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。植物在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種植物，其包含本發(fā)明的植物細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種植物，其包含本發(fā)明的構(gòu)建體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種植物，其被遺傳修飾成包含本發(fā)明的多核苷酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種植物，其被遺傳修飾成表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物表達(dá)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的改良油質(zhì)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白在植物營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白在植物種子中表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白在植物花粉中表達(dá)。也表達(dá)TAG酶的植物在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物也被遺傳修飾成表達(dá)三?；视?TAG)合成酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述三?；视?TAG)合成酶在與改良油質(zhì)蛋白相同的組織中表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物被遺傳修飾成包含編碼三?；视?TAG)合成酶的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物包含表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包括編碼三酰基甘油(TAG)合成酶的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸可操作地連接至啟動(dòng)子序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物營(yíng)養(yǎng)組織中驅(qū)動(dòng)所述核酸序列 的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物種子中驅(qū)動(dòng)所述核酸序列的表達(dá)。在Iv實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物花粉中驅(qū)動(dòng)所述核Ife序列的表達(dá)。含有人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白多肽在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種改良油質(zhì)蛋白，其包括至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種改良油質(zhì)蛋白，其由本發(fā)明的多核苷酸編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白包括至少兩個(gè)半胱氨酸，其中至少一個(gè)經(jīng)人工引入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白包括至少兩個(gè)至至少十三個(gè)(即，2、3、4、5、6、7、8、9、
10、1、12、13、14個(gè)或更多個(gè))人工引入的半胱氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白包括至少一個(gè)在N端親水區(qū)中的半胱氨酸及至少一個(gè)在C端親水區(qū)中的半胱氨酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述半胱氨酸經(jīng)人工引入油質(zhì)蛋白的N端親水區(qū)中或油質(zhì)蛋白的C端親水區(qū)中。優(yōu)選地，半胱氨酸基本上均勻地分布于油質(zhì)蛋白的N端與C端親水區(qū)之間。含有包括人工弓IA的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白的融合蛋白在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，其包含本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白及目的蛋白。所述融合蛋白因而包含改良油質(zhì)蛋白部分及目的蛋白部分。包含改良油質(zhì)蛋白的油體在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種油體，其包含本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種油體，其包含本發(fā)明的至少兩種改良油質(zhì)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩種改良油質(zhì)蛋白經(jīng)由在改良油質(zhì)蛋白的半胱氨酸殘基之間的二硫橋彼此交聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白經(jīng)由改良油質(zhì)蛋白中的人工引入的半胱氨酸殘基而交聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述油體另外包含融合蛋白，其中所述融合蛋白包括與目的蛋白融合的油質(zhì)蛋白。在該實(shí)施方案中，融合蛋白中的油質(zhì)蛋白無(wú)需包括人工引入的半胱氨酸。優(yōu)選地，融合蛋白中的油質(zhì)蛋白不包括人工弓IA的半胱氨酸。此實(shí)施方案的油體可用于純化及遞送目的蛋白，如在Roberts等人，(2008)中所論述。然而，在該實(shí)施方案中，可能通過(guò)改良油質(zhì)蛋白在油體中的存在而任選地改變油體的穩(wěn)定性/完整性，由此實(shí)現(xiàn)更嚴(yán)格的純化及遞送程序。包含具有改良油質(zhì)蛋白的融合蛋白的油體
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的融合蛋白的油體，所述融合蛋白包含本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白及目的蛋白。所述融合蛋白因此包含改良油質(zhì)蛋白部分及目的蛋白部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述油體包含至少兩種本發(fā)明的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少兩種融合蛋白經(jīng)由在融合蛋白的改良油質(zhì)蛋白部分中的半胱氨酸殘基之間的二硫橋彼此交聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白經(jīng)由在融合蛋白的改良油質(zhì)蛋白部分中的半胱 氨酸殘基之間的二硫橋而交聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述油體包含至少一種本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種融合蛋白交聯(lián)至至少一種改良油質(zhì)蛋白，所述交聯(lián)是經(jīng)由在融合蛋白的改良油質(zhì)蛋白部分中的半胱氨酸及在改良油質(zhì)蛋白中的半胱氨酸。同樣,此實(shí)施方案的油體可用于純化及遞送目的蛋白，如在Roberts等人，(2008)中所論述。然而，在該實(shí)施方案中，可能通過(guò)改良油質(zhì)蛋白在油體中的存在而任選地改變油體的穩(wěn)定性/完整性，由此實(shí)現(xiàn)更嚴(yán)格的純化及遞送程序。乳劑在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種乳劑，其包含本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述乳劑包含所述改良油質(zhì)蛋白和合適的載體。所述載體可經(jīng)緩沖以具有適當(dāng)?shù)难趸€原環(huán)境，以保持希望的油質(zhì)蛋白交聯(lián)度。為了將改良油質(zhì)蛋白重新懸浮于載體中，可能需要聲處理或高壓勻漿化，接著暴露于適當(dāng)氧化條件下。組合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含所述改良油質(zhì)蛋白和合適的載體。所述載體可經(jīng)緩沖以具有適當(dāng)?shù)难趸€原環(huán)境，以達(dá)到希望的改良油質(zhì)蛋白交聯(lián)度。為了將改良油質(zhì)蛋白重新懸浮于載體中，可能需要聲處理或高壓勻漿化，接著暴露于適當(dāng)氧化條件下。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的油體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含所述油體和合適的載體。所述載體可經(jīng)緩沖以具有適當(dāng)?shù)难趸€原環(huán)境，以保持希望的改良油質(zhì)蛋白交聯(lián)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的油體的組合物，其經(jīng)調(diào)配以供施用于皮膚。包含本發(fā)明的油體的植物及其部分在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的植物或其部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的植物營(yíng)養(yǎng)組織。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的植物種子。包含本發(fā)明的油體的動(dòng)物飼料在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的動(dòng)物飼料。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的植物或其部分的動(dòng)物飼料。生產(chǎn)油體的方法在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)油體的方法，所述方法包括組合下述物質(zhì)的步驟a)至少兩種改良油質(zhì)蛋白，其各自包括至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸，b)三?；视?，和c)磷脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白各自包括至少兩個(gè)半胱氨酸，其中至少一個(gè)經(jīng)人工引入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白各自包括至少一個(gè)在油質(zhì)蛋白的N端親水區(qū)中的半胱氨酸及至少一個(gè)在油質(zhì)蛋白的C端親水區(qū)中的半胱氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白包括至少兩個(gè)至至少十三個(gè)(即，2、3、4、 5、6、7、8、9、10、1、12、13、14個(gè)或更多個(gè))人工引入的半胱氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述半胱氨酸經(jīng)人工引入油質(zhì)蛋白的N端親水區(qū)中或油質(zhì)蛋白的C端親水區(qū)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述半胱氨酸基本上均勻地分布于油質(zhì)蛋白的N端與C端親水區(qū)之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白經(jīng)由在油質(zhì)蛋白的半胱氨酸殘基之間的二硫橋而交聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白在油質(zhì)蛋白的人工引入的半胱氨酸殘基之間交聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白為融合蛋白的一部分，其中所述融合蛋白包含改良油質(zhì)蛋白及目的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述額外步驟通過(guò)控制所生產(chǎn)的油體的氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)油體中改良油質(zhì)蛋白的交聯(lián)度。在活體內(nèi)組合的所有組分(活體內(nèi)油體)在一個(gè)實(shí)施方案中，在宿主細(xì)胞內(nèi)組合a)、b)及c)的組分。在該實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白優(yōu)選地在宿主細(xì)胞中表達(dá)。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地優(yōu)選地被遺傳修飾成表達(dá)改良油質(zhì)蛋白。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地包含本發(fā)明的構(gòu)建體。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地被遺傳修飾成包含本發(fā)明的多核苷酸。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地被遺傳修飾成表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。也表達(dá)TAG合成酶的宿主細(xì)胞在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞也被遺傳修飾成表達(dá)三?；视?TAG)合成酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞包含表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包括編碼三?；视?TAG)合成酶的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸序列可操作地連接至啟動(dòng)子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物營(yíng)養(yǎng)組織中驅(qū)動(dòng)所述核酸序列的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物種子中驅(qū)動(dòng)所述核酸序列的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子序列能夠在植物花粉中驅(qū)動(dòng)所述核酸序列的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞也被遺傳修飾成包含編碼三?；视?TAG)合成酶的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞也被遺傳修飾成表達(dá)編碼三酰基甘油(TAG)合成酶的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，編碼改良油質(zhì)蛋白的多核苷酸及編碼三?；视?TAG)合成酶的核酸序列可置于待轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中的同一構(gòu)建體或不同構(gòu)建體中。各自的表達(dá)可由相同或不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，所述啟動(dòng)子可包括于待轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)理解，或者，可以將所述多核苷酸及核酸轉(zhuǎn)化進(jìn)不含啟動(dòng)子的細(xì)胞中，但所述多核苷酸及核酸中的任一個(gè)的表達(dá)可由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞構(gòu)成有機(jī)體的一部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述有機(jī)體為植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在植物的營(yíng)養(yǎng)組織中生產(chǎn)所述油。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，植物積聚比合適的對(duì)照植物多約50%至約400%的脂質(zhì)。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，植物積聚比合適的對(duì)照植物多約100%至約300%的脂質(zhì)。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，植物積聚比合適的對(duì)照植物多約150%至約250%的脂質(zhì)。合適的對(duì)照植物包括其品種和/或物種與本發(fā)明方法中所用的轉(zhuǎn)化植物相同的植物的未轉(zhuǎn)化型或野生型型式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物被加工成動(dòng)物飼料。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物被加工成生物燃料原料。純化活體內(nèi)生產(chǎn)的油體的額外方法步驟在一個(gè)實(shí)施方案中,所述方法包括從細(xì)胞或有機(jī)體純化所述油體的額外步驟。改變活體內(nèi)生產(chǎn)的純化油體的交聯(lián)度的額外方法步驟在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)控制活體內(nèi)生產(chǎn)的純化油體的氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)純化油體中的改良油質(zhì)蛋白的交聯(lián)度的額外步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用氧化環(huán)境來(lái)提高交聯(lián)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用還原環(huán)境來(lái)降低交聯(lián)度。在活體外組合的組分(活體外/人造油體)在某些實(shí)施方案中，可在活體外組合a)、b)及c)的組分。在一個(gè)實(shí)施方案中，a)的改良油質(zhì)蛋白已在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)，且從所述宿主細(xì)胞純化，隨后與b)及c)的組分組合。改變活體外/人造油體的交聯(lián)度的額外方法步驟在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)控制在其中組合a)、b)及c)的組分的氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)交聯(lián)度的額外步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在氧化環(huán)境中組合a)、
b)及c)的組分來(lái)提高交聯(lián)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在還原環(huán)境中組合a)、b)及c)的組分來(lái)降低交聯(lián)度。也可在油體形成之后通過(guò)控制容納油體的氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)交聯(lián)度。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)比合適的對(duì)照植物積聚更多油的植物的方法，所述方法包括提供用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物，所述多核苷酸表達(dá)由所述多核苷酸編碼的改良油質(zhì)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，也用編碼TAG合成酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物，以表達(dá)TAG合成酶且由此合成TAG。在一個(gè)實(shí)施方案中,通過(guò)用本發(fā)明的任一種多核苷酸及編碼TAG合成酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化單一植物或植物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)所述植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如下生產(chǎn)所述植物使被本發(fā)明的任一種多核苷酸轉(zhuǎn)化的第一植物與被編碼TAG合成酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化的第二植物雜交，生產(chǎn)被本發(fā)明的多核苷酸及編碼TAG合成酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述油為TAG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在植物的營(yíng)養(yǎng)組織中生產(chǎn)所述油。
在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物積聚比合適的對(duì)照植物多約50%至約400%的脂質(zhì)。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物積聚比合適的對(duì)照植物多約100%至約300%的脂質(zhì)。在該方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物積聚比合適的對(duì)照植物多約150%至約250%的脂質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物被加工成動(dòng)物飼料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物被加工成生物燃料原料。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)油體的方法，所述方法包括a)將至少一個(gè)編碼本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白的核酸分子引入宿主細(xì)胞中；及b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以便表達(dá)改良油質(zhì)蛋白。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)油體的方法，所述方法包括a)將至少一個(gè)編碼本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白的核酸分子及編碼TAG合成酶的核酸分子引入宿主細(xì)胞中 '及b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以便表達(dá)改良油質(zhì)蛋白及TAG合成酶。所述宿主細(xì)胞可以是本文所述的宿主細(xì)胞。油體在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的油體。組合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的油體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含所述油體和合適的載體。所述載體可經(jīng)緩沖以提供適當(dāng)?shù)难趸€原環(huán)境，以保持希望的改良油質(zhì)蛋白交聯(lián)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的油體的組合物，其經(jīng)調(diào)配以供施用于皮膚。包含本發(fā)明的油體的植物及其部分在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的植物或其部分。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的植物營(yíng)養(yǎng)組織。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的植物種子。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的植物花粉。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的植物果實(shí)或子實(shí)體。包含本發(fā)明的油體的動(dòng)物飼料在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的油體的動(dòng)物飼料。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的植物或其部分的動(dòng)物飼料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述飼料適合于包括人類的哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述飼料適合于非人類哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的動(dòng)物包括農(nóng)畜，諸如但不限于牛、綿羊、馬、山羊、豬、雞等。植物所述改良油質(zhì)蛋白可為改良的天然存在的油質(zhì)蛋白。可衍生出未改良的油質(zhì)蛋白序列的植物可來(lái)自含有油質(zhì)蛋白及編碼油質(zhì)蛋白的多核苷酸序列的任何植物物種。在其中表達(dá)改良油質(zhì)蛋白的植物細(xì)胞可來(lái)自任何植物物種。在其中表達(dá)改良油質(zhì)蛋白的植物可來(lái)自任何植物物種。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞或植物源自裸子植物物種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞或植物源自被子植物物種。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述植物細(xì)胞或植物源自雙子葉植物物種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞或植物源自單子葉植物物種。其它優(yōu)選的植物為來(lái)自包括、但不限于以下各屬的草料植物物種玉蜀黍?qū)?Zea)、黑麥草屬(Lolium)、大麥屬(Hordium)、芒屬(Miscanthus)、甘鹿屬(Saccharum)、羊茅屬(Festuca)、雞腳茅屬(Dactylis)、雀麥屬(Bromus)、偃麥草屬(Thinopyrum)、三葉草屬(Trifolium)、苜猜屬(Medicago)、梯牧草屬(Pheleum)、金絲雀草屬(Phalaris)、絨毛草屬(Holcus)、大豆屬(Glycine)、蓮屬(Lotus)、車前草屬(Plantago)及菊苣屬(Cichorium)0其它優(yōu)選的植物為豆科植物。豆科植物或其部分可涵蓋在豆科(Leguminosae或Fabaceae)植物科中的任何植物。例如，所述植物可選自草料豆科(legumes),包括苜猜草、三葉草；銀合歡；谷物豆科，包括豆、小扁豆、羽扇豆、豌豆、花生、大豆；開花豆科，包括羽扇豆；藥用或工業(yè)用豆科；及休耕或綠肥豆科物種。特別優(yōu)選的屬為三葉草屬。優(yōu)選的三葉草物種包括白三葉草(Trifoliumrepens);兔足三葉草(Trifolium arvense);親和三葉草(Trifolium affine);及類白三葉草(Trifolium occidentale)。尤其優(yōu)選的三葉草物種為白三葉草。另一個(gè)優(yōu)選的屬為苜蓿屬。優(yōu)選的苜蓿物種包括紫苜蓿(Medicago sativa)及蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)。尤其優(yōu)選的苜蓿物種為紫苜蓿，常稱為苜蓿草。另一個(gè)優(yōu)選的屬為大豆屬。優(yōu)選的大豆物種包括大豆(Glycine max)及爪哇大豆(Glycine wightii)(也稱為爪睡大豆(Neonotonia wightii))。尤其優(yōu)選的大豆物種為大豆(Glycine max),常稱為大豆(soy bean)。尤其優(yōu)選的大豆物種為爪哇大豆,常稱為野生大ii(perennial soybean) 另一個(gè)優(yōu)選的屬為豇豆屬(Vigna)。尤其優(yōu)選的豇豆物種為豇豆(Vignaunguiculata),常稱為5[豆(cowpea)。另一個(gè)優(yōu)選的屬為黧豆屬(Mucana)。優(yōu)選的黧豆物種包括剌毛黧豆(mucanapruniens)。尤其優(yōu)選的黧豆物種為剌毛黧豆,常稱為黧豆(velvetbean)。另一個(gè)優(yōu)選的屬為花生屬(Arachis)。尤其優(yōu)選的花生物種為多年生花生(Arachis glabrata),常稱為多年生花生(perennial peanut)。另一個(gè)優(yōu)選的屬為豌豆屬(Pisum)。優(yōu)選的豌豆物種為豌豆(Pisum sativum),常稱為豌豆(pea)。另一個(gè)優(yōu)選的屬為蓮屬。優(yōu)選的蓮物種包括百脈根(Lotus corniculatus)、長(zhǎng)柄百脈根(Lotus pedunculatus)、窄葉百脈根(Lotus glabar)、細(xì)葉百脈根(Lotus tenuis)及大百脈根(Lotus uliginosus)。優(yōu)選的蓮物種為百脈根,常稱為角果百脈根(BirdsfootTrefoil)。另一優(yōu)選的蓮物種為窄葉百脈根，常稱為窄葉角果百脈根。另一優(yōu)選的蓮物種為長(zhǎng)柄百脈根，常稱為濕地百脈根(Big trefoil)。另一優(yōu)選的蓮物種為細(xì)葉百脈根，常稱為細(xì)長(zhǎng)百脈根(Slender trefoil)。另一個(gè)優(yōu)選的屬為蕓苔屬(Brassica)。優(yōu)選的蕓苔物種為羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleracea),常稱為草料甘藍(lán)菜(foragekale)及甘藍(lán)(cabbage)。
其它優(yōu)選的物種為含油種子作物，包括、但不限于以下各屬蕓苔屬、紅花屬(Carthumus)、向日葵屬、玉蜀黍?qū)偌爸ヂ閷?Sesamum)。優(yōu)選的含油種子屬為蕓苔屬。優(yōu)選的含油種子物種為甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)。優(yōu)選的含油種子屬為蕓苔屬。優(yōu)選的含油種子物種為羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceae)。優(yōu)選的含油種子屬為玉蜀黍?qū)?。?yōu)選的含油種子物種為玉米(Zea mays)。優(yōu)選的含油種子屬為紅花屬。優(yōu)選的含油種子物種為紅花籽草(Carthamustinctorius)。優(yōu)選的含油種子屬為向日葵屬。優(yōu)選的含油種子物種為向日葵(Helianthusannuus)0 優(yōu)選的含油種子屬為玉蜀黍?qū)?。?yōu)選的含油種子物種為玉米。優(yōu)選的含油種子屬為芝麻屬。優(yōu)選的含油種子物種為芝麻(Sesamum indicum)。優(yōu)選地青貯料屬為玉蜀黍?qū)?。?yōu)選地青貯料物種為玉米。優(yōu)選地谷物生產(chǎn)屬為大麥屬(Hordeum)。優(yōu)選地谷物生產(chǎn)物種為大麥(Hordeumvulgare)。優(yōu)選地牧草屬為黑麥草屬。優(yōu)選地牧草物種為黑麥草(Lolium perenne)。優(yōu)選地牧草屬為黑麥草屬。優(yōu)選地牧草物種為黑麥草(Lolium arundinaceum)。優(yōu)選地牧草屬為三葉草屬。優(yōu)選地牧草物種為白三葉草。優(yōu)選地牧草屬為大麥屬。優(yōu)選地牧草物種為大麥。優(yōu)選地植物也包括草料，或動(dòng)物原料植物。所述植物包括、但不限于以下各屬芒屬、甘鹿屬、黍?qū)?Panicum)。優(yōu)選地生物燃料屬為芒屬。優(yōu)選地生物燃料物種為巨芒(Miscanthusgiganteus)。優(yōu)選地生物燃料屬為甘鹿屬。優(yōu)選地生物燃料物種為甘鹿(Saccharumofficinarum)。優(yōu)選地生物燃料屬為黍?qū)?。?yōu)選地生物燃料物種為柳枝稷(Panicum virgatum)。
具體實(shí)施例方式在本說(shuō)明書中，在提及專利說(shuō)明書、其它外部文獻(xiàn)或其它信息來(lái)源的情況下，這通常是為了提供論述本發(fā)明特征的背景的目的。除非另外特別說(shuō)明，否則對(duì)所述外部文獻(xiàn)的提及不應(yīng)解釋為以任何權(quán)限承認(rèn)所述文獻(xiàn)或所述信息來(lái)源為現(xiàn)有技術(shù)或構(gòu)成本領(lǐng)域的一般常識(shí)的一部分。在本說(shuō)明書中所用的術(shù)語(yǔ)“包含”是指“至少部分地由...組成”。當(dāng)解釋本說(shuō)明書中包括術(shù)語(yǔ)“包含”的各句時(shí)，不同于以該術(shù)語(yǔ)為前言的一項(xiàng)或多項(xiàng)特征的特征也可能存在。諸如“包含”等相關(guān)術(shù)語(yǔ)欲以相同方式解釋。以重量比計(jì)，脂質(zhì)的能量含量大致為蛋白或碳水化合物的兩倍。大部分自然界的脂質(zhì)是由植物生產(chǎn)，且脂質(zhì)的最稠密形式為三酰基甘油(TAG)。雙子葉植物可積聚多達(dá)其種子重量的約60%的TAG，所述TAG隨后用作發(fā)芽的能源。因而，許多研究工作靶向使用富含油的種子，以持續(xù)生產(chǎn)用于動(dòng)物及生物燃料原料的足夠脂質(zhì)。倘若種子僅能生產(chǎn)有限量的TAG，則采用替代方案來(lái)在營(yíng)養(yǎng)組織中生產(chǎn)額外脂質(zhì)(優(yōu)選地為TAG)。大部分這些方案已在植物的葉子中增量調(diào)節(jié)或過(guò)度表達(dá)Kennedy途徑中的一種或幾種酶，以合成TAG。然而，大部分通過(guò)此方案生產(chǎn)的額外脂質(zhì)通常通過(guò)脂肪酶及^ -氧化作用的組合在植物內(nèi)再移動(dòng)，使得脂質(zhì)含量有限地增加(通常為2-4%的DM)。在發(fā)育種子中生產(chǎn)的TAG通常容納于稱為油體(OB)的離散結(jié)構(gòu)中，所述OB是高度穩(wěn)定的，且保持為離散密封細(xì)胞器，甚至當(dāng)細(xì)胞脫水或經(jīng)歷冷凍條件時(shí)也不聚結(jié)(Siloto等人，2006; Shimada等人，2008)。OB由嵌有蛋白乳化劑的磷脂單層圍繞TAG核心組成。蛋白乳化劑占OB的0. 5-3. 5% ;其中，80-90%為油質(zhì)蛋白，其余主要由鈣結(jié)合蛋白(油體鈣蛋白)及固醇結(jié)合蛋白(油體固醇蛋白)組成(Lin和Tzen, 2004)。油質(zhì)蛋白的乳化特性來(lái)源于其三個(gè)功能域，所述功能域由兩親的N端臂、高度保守的中心疏水核心(約72個(gè)殘基)及C端兩親臂組成。類似地，油體鈣蛋白及油體固醇蛋白皆具有親水的N端及C端臂及其自身 保守的疏水核心。先前已推測(cè)，具有TAG合成酶的油質(zhì)蛋白或聚油質(zhì)蛋白(油質(zhì)蛋白的串聯(lián)頭尾相接融合體)在葉中的組成型表達(dá)，將導(dǎo)致穩(wěn)定油體的形成，從而使得TAG積聚。然而，我們后來(lái)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在植物葉子中與DGATl共表達(dá)時(shí)，油質(zhì)蛋白及聚油質(zhì)蛋白是無(wú)效的，且促使TAG發(fā)生積聚(Roberts等人,數(shù)據(jù)未公開)。本發(fā)明提供了改良油質(zhì)蛋白，其含有一個(gè)或多個(gè)人工引入的半胱氨酸殘基。用含有經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白包囊中性脂質(zhì)，會(huì)提供在葉中積聚可評(píng)估數(shù)量的TAG同時(shí)無(wú)需等待至衰老且不生產(chǎn)極端表型的替代性機(jī)制。另外，改良油質(zhì)蛋白具有許多其它應(yīng)用，包含改進(jìn)OB穩(wěn)定性、乳劑特性以及重組蛋白的生產(chǎn)及純化。油體OB的直徑一般在0. 5-2. 5iim的范圍內(nèi)，且由嵌有蛋白乳化劑(主要為油質(zhì)蛋白)的磷脂單層圍繞TAG核心組成(Tzen等人，1993; Tzen,等人1997)。OB僅包括0. 5-3. 5%的OB ;其中80-90%為油質(zhì)蛋白，其余主要由鈣結(jié)合蛋白(油體鈣蛋白)及固醇結(jié)合蛋白(油體固醇蛋白)組成(Lin和Tzen，2004)。植物細(xì)胞內(nèi)油質(zhì)蛋白與TAG的比率會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)油體的尺寸及數(shù)量(Sarmiento等人，1997; Siloto等人，2006)。雖然OB主要在許多植物的種子及花粉中天然生產(chǎn)，但其也見于一些其它器官(例如，特定塊莖)中。油質(zhì)蛋白為比較小(15_24kDa)的蛋白，其嵌入OB的表面。油體穩(wěn)定性油體及人造油體在上面所討論的用途中的適用性至少部分受限于其穩(wěn)定性以及其它。一種實(shí)現(xiàn)油體穩(wěn)定性的方案是，生產(chǎn)包含所謂聚油質(zhì)蛋白的油體。聚油質(zhì)蛋白為兩個(gè)或兩個(gè)以上油質(zhì)蛋白單元的頭尾相接融合體(Roberts等人，2008)。改變油質(zhì)蛋白單元的數(shù)量，能夠調(diào)適油體的特性(熱穩(wěn)定性及降解速率)。聚油質(zhì)蛋白在植物(Planta)中的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致聚油質(zhì)蛋白單元按單一油質(zhì)蛋白單元摻入油體中(Scott等人，2007)。使用呈串聯(lián)頭尾相接排列的多個(gè)油質(zhì)蛋白單元來(lái)制造聚油質(zhì)蛋白。單獨(dú)的構(gòu)建體(含有I至6個(gè)油質(zhì)蛋白重復(fù)單元)經(jīng)特別設(shè)計(jì)，用于在植物及大腸桿菌中表達(dá)。大部分重組聚油質(zhì)蛋白積聚于轉(zhuǎn)殖基因植物的油體中及大腸桿菌的包涵體中。使用經(jīng)純化的原核生物生產(chǎn)的聚油質(zhì)蛋白生產(chǎn)人造油體。聚油質(zhì)蛋白會(huì)提高蛋白酶-K中的油體及人造油體熱穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)完整性。然而，存在若干限制因素，其決定聚油質(zhì)蛋白可提供的保護(hù)/穩(wěn)定性程度；這些因素與可在翻譯過(guò)程之前接合在一起的串聯(lián)重復(fù)單元的數(shù)量有關(guān)，且油體靶向變得受限(Scott等人，2007);而另一限制則來(lái)自通過(guò)產(chǎn)生具有頭尾相接融合排列的轉(zhuǎn)錄物而實(shí)現(xiàn)的油質(zhì)蛋白融合體的性質(zhì)。這基本上為多聚的油質(zhì)蛋白重復(fù)單元的線性蛋白，其在每一單個(gè)油質(zhì)蛋白重復(fù)單元上具有許多共價(jià)連接及共價(jià)連接的位置(即在每個(gè)末端的最大值)。另夕卜，此排列僅提供針對(duì)N端降解蛋白的保護(hù)，但其不提供針對(duì)識(shí)別特定內(nèi)部肽序列的其它蛋白水解酶的任何額外保護(hù)。此外，在聚油質(zhì)蛋白分子中的油質(zhì)蛋白單元之間通過(guò)頭尾相接串聯(lián)重復(fù)單元形成的連接不易在原位改變。雖然特定蛋白酶特異性位點(diǎn)可經(jīng)工程改造 至接合區(qū)中以使嵌入油體或人造油體中的融合的聚油質(zhì)蛋白分子分裂開，但它們不易再融
口 o嵌入油體中的油質(zhì)蛋白先前已通過(guò)添加諸如戊二醛或genepin等交聯(lián)劑而共價(jià)交聯(lián)(Peng等人，2004&2006)，然而，此隨機(jī)交聯(lián)需要將交聯(lián)劑添加至油體制品中，且不易逆轉(zhuǎn)。人造油體原核表達(dá)的重組油質(zhì)蛋白可用于生產(chǎn)人造油體(A0B)，其特性與植物來(lái)源的OB極其相似(Peng 等人 2004;Roux 等人 2004;Chiang 等人 2005;Chiang 等人 2007)。油體及人造油體的應(yīng)用油體及其組成性油質(zhì)蛋白的獨(dú)特特性，構(gòu)成許多生物技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)，包括純化重組蛋白；形成多聚蛋白復(fù)合物；乳化作用；遞送生物活性物；生產(chǎn)多價(jià)生物活性物，和甚至用作潛在香味增強(qiáng)劑(關(guān)于綜述，參見Capuano等人，2007和Roberts等人，2008)。乳劑當(dāng)一種或多種液體(其與另一液體不混溶)通常因不同極性及由此導(dǎo)致的不同疏水性而均勻懸浮于另一液體中時(shí)，產(chǎn)生乳劑。實(shí)例包括均勻分散于水中的油滴或均勻分散于油中的水滴。相對(duì)穩(wěn)定的乳劑的產(chǎn)生需要使用乳化劑，所述乳化劑會(huì)降低液體之間的界面張力。一般根據(jù)在指定條件下保持均勻分散的持續(xù)時(shí)間來(lái)測(cè)量乳劑的穩(wěn)定性。乳化劑常用于食品及化妝品產(chǎn)業(yè)中；所以需要具有高乳劑穩(wěn)定性，且對(duì)于消費(fèi)及局部施用而言是安全的。含有油質(zhì)蛋白的完整油體天然地形成不含表面活性劑的水包油乳劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，完整油體或其中大部分TAG已經(jīng)去除的油體在食品、局部個(gè)人護(hù)理(護(hù)膚霜)及藥物制劑中具有廣泛的乳化應(yīng)用(Harada等人，2002; Deckers等人，2003; Hou等人，2003)。生物氫化作用已經(jīng)證實(shí)，反芻動(dòng)物飼料的脂質(zhì)特性又會(huì)影響肉及乳制品的脂質(zhì)特性(Demeyer及Doreau，1999)。不同植物具有不同脂質(zhì)特性；通過(guò)僅用具有所要脂質(zhì)特性的植物選擇性地喂養(yǎng)動(dòng)物，可能積極地影響下游肉及乳制品的脂質(zhì)特性。在反芻動(dòng)物中，肉及乳汁的最終脂質(zhì)構(gòu)成不僅受膳食脂質(zhì)影響，而且受生物氫化作用顯著影響(Jenkins和McGuire2006; Firkins等人，2006; Lock和Bauman, 2004)。生物氫化作用是在瘤胃中存在的生物群實(shí)現(xiàn)對(duì)非還原化合物(諸如不飽和脂肪)的氫化。通過(guò)將脂質(zhì)包囊在提供微生物降解抗性的一種或多種蛋白中，可以防止/延遲生物氫化作用(Jenkins及Bridges 2007)。通過(guò)將三?；视桶矣诰塾唾|(zhì)蛋白或油質(zhì)蛋白中來(lái)在植物中防止生物氫化作用，參見Scott等人，(2007)，Cookson 等人，(2009)和 Roberts 等人，(2008)。油質(zhì)蛋白油質(zhì)蛋白 為比較小(15至24kDa)的蛋白，其使得OB成為密封的單個(gè)細(xì)胞器，當(dāng)細(xì)胞脫水或經(jīng)歷冷凍條件時(shí)OB不聚結(jié)(Leprince等人，1998; Siloto等人，2006; Slack等人，1980; Shimada 等人 2008)。油質(zhì)蛋白具有三個(gè)功能域，所述功能域由兩親的N端臂、高度保守的中心疏水核心(約72個(gè)殘基)及C端兩親臂組成?？山邮艿耐?fù)鋵W(xué)模型為下述模型其中N端及C端兩親臂位于OB外部，且中心疏水核心位于OB內(nèi)部(Huang, 1992; Loer和Herman, 1993;Murphy1993)。N端及C端兩親臂的帶負(fù)電荷殘基暴露于水相外部，而帶正電荷殘基暴露于OB內(nèi)部且面向帶負(fù)電荷脂質(zhì)。因此，具有向外的負(fù)電荷的兩親臂負(fù)責(zé)維持OB為單個(gè)實(shí)體，這是通過(guò)活體內(nèi)及離體標(biāo)本中的空間位阻及靜電排斥(Tzen等人，1992)。N端兩親臂是高度可變的，且因此沒有特定二級(jí)結(jié)構(gòu)可描述所有實(shí)例。相比而言，C端臂含有30-40個(gè)殘基的a -螺旋域(Tzen等人，2003)。中心核心是高度保守的，且被認(rèn)為是已知存在于自然界中的最長(zhǎng)疏水區(qū)；在中心處有保守的12個(gè)殘基的脯氨酸結(jié)基序，所述基序包括三個(gè)間隔的脯氨酸殘基(關(guān)于綜述，參見Frandsen等人，2001;Tzen等人，2003)。尚不清楚中心域的二級(jí)、三級(jí)及四級(jí)結(jié)構(gòu)。存在許多不同排列的模型化、傅立葉變換-紅外(FT-IR)及圓二色性(⑶)證據(jù)(關(guān)于綜述，參見Roberts等人，2008)。主要油質(zhì)蛋白的特性在植物之間是相對(duì)保守的，且表征如下 對(duì)應(yīng)于約140-230個(gè)氨基酸殘基的15_25kDa蛋白。 所述蛋白序列可沿其長(zhǎng)度分為幾乎相等的4個(gè)部分，所述部分對(duì)應(yīng)于N端親水區(qū)、兩個(gè)中心疏水區(qū)(由脯氨酸結(jié)或節(jié)接合)及C端親水區(qū)。 油質(zhì)蛋白的拓?fù)鋵W(xué)可歸因于其物理特性，包括由親水域側(cè)接的折疊的疏水核心。此排列給油質(zhì)蛋白賦予兩親性質(zhì)，使得疏水域嵌入磷脂單層中(Tzen等人，1992)，而側(cè)接的親水域暴露于細(xì)胞質(zhì)的水性環(huán)境中。 油質(zhì)蛋白通常不含半胱氨酸。用于本發(fā)明的優(yōu)選油質(zhì)蛋白為如下油質(zhì)蛋白其含有約70個(gè)非極性氨基酸殘基(包括脯氨酸結(jié))的中心域，該中心域未被任何帶電殘基中斷，并側(cè)接兩個(gè)親水臂。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“油質(zhì)蛋白”也包括油體固醇蛋白及油體鈣蛋白。油體固醇蛋白油體固醇蛋白包含N端錨定區(qū)段，該區(qū)段包含兩個(gè)兩親的a-螺旋(每個(gè)螺旋有912個(gè)殘基)，它們由14個(gè)殘基的疏水錨定區(qū)連接。可溶性的脫氫酶域含有NADP+結(jié)合子域及固醇結(jié)合子域。油體固醇蛋白-A與-B之間的明顯區(qū)別在于它們的不同的固醇結(jié)合子域(Lin及Tzen，2004)。油體固醇蛋白在其疏水域中具有脯氨酸節(jié)，且在其一個(gè)親水臂中含有固醇結(jié)合脫氫酶。油體鈣蛋白油體鈣蛋白(Frandsen等人，2001)具有與基礎(chǔ)油質(zhì)蛋白稍微不同的脯氨酸結(jié)，且在親水臂中含有鈣結(jié)合基序及若干潛在磷酸化位點(diǎn)。類似于油質(zhì)蛋白，認(rèn)為油體鈣蛋白具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中N端及C端臂為親水性的，而中心域?yàn)槭杷缘那矣米饔腕w錨定部。N端親水域由28個(gè)殘基的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋鈣結(jié)合EF-手基序組成，該基序包括不變甘氨酸殘基作為結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向點(diǎn)，并包括5個(gè)保守含氧殘基作為鈣-結(jié)合配體(Chen等人，1999 ；Frandsen 等人,2001)。C端親水域含有若干磷酸化位點(diǎn)，且靠近C端處為不參與任何二硫鍵內(nèi)部或之間連接的不變半胱氨酸(Peng，2004)。油體鈣蛋白的親水N端及C端為油質(zhì)蛋白的親水N端及C端的約3倍(Lin及Tzen，2004)。認(rèn)為疏水域由兩親a -螺旋及錨定區(qū)(其包括脯氨酸結(jié))組成。適于通過(guò)添加至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸而改良的用于本發(fā)明的油質(zhì)蛋白(油質(zhì)蛋白、油體固醇蛋白和油體鈣蛋白)序列的實(shí)例如下表I所示。(多核苷酸及多肽)序列提供于序列表中。表I
15 .....##FsIq""""""""......Fseq'
IDID
NO:
油質(zhì)蛋白 ■S樣 302907 34— AAC2384035
油質(zhì)蛋白飛來(lái) U977QQ 36AABS 84 0237
油質(zhì)蛋白南務(wù) 162353CAA4422S39
油質(zhì)蛋白南務(wù) BT023738 ~40AAZ2393QAl
油質(zhì)蛋白 h a葵 162352. I ~42CM44224. I43
油盾蛋白甘藍(lán)型油菜 182020. I _ 44~CAA57545. I45 _
油質(zhì)蛋白虞 顚-001 153560. I ~46NP-001 147032. I47
油質(zhì)蛋白 it# Jhimfh I 48AAL40177. Iii
油質(zhì)蛋白羽衣甘藍(lán) ~F117126. I SOAAP24S47. ISI
油質(zhì)蛋白 AY928084. I ~S2AAYl4574. IS3
油體固醇蛋 AALI 3315 54AALI 331555 白
油體固Sf■蛋 /I. IiulHiN 1-11678274 ThAlW,522 — 57
白_______
油體固醉蛋 i"i NMJlOl 159142. I InNPJ0I1526I4. I59 '
白
IbiiiIW* 甘藍(lán)-S油策EFI4391 5. I 6()ABM301 78. I61
白______
油體鈣蛋白飛麻 Ifi 09921 62— AAFl 3743~ 3
油體鈣蛋白 "1F004M9 64~ AA87122765
來(lái)ImIooiTs84347)66 局 NprooiTsT^oeT
「01991—……"Av9664477l......................................."bS.........................AAY40837.....................................................b9....................
.......泰.白.....—.....c..........rev(j/uia..........FJ4S51'5471......................................."70.........................ACJ70083.....................................................7.1.....................
—■油_琢我務(wù)白■……..I:………Siujn/S'………....................................................72....................................aby56"iq37i............................................................................—n——油質(zhì)蛋白、油體固醇蛋白和油體鈣蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。來(lái)自許多不同物種的其它序列可易于通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法來(lái)鑒別。例如，使用術(shù)語(yǔ)油質(zhì)蛋白、油體固醇蛋白和油體I丐蛋白中的任一個(gè)，通過(guò)NCBIEntrez Cross-Database Search(獲自 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/gquery),可以容易地鑒別其它序列。植物脂質(zhì)生物合成
所有植物細(xì)胞均通過(guò)局限于質(zhì)體中的共同路徑從乙酰輔酶A生產(chǎn)脂肪酸。雖然新近合成的?；湹囊徊糠蛛S后用于質(zhì)體內(nèi)的脂質(zhì)生物合成(原核細(xì)胞路徑)，但大部分輸入細(xì)胞溶質(zhì)中以供在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或其它位點(diǎn)處進(jìn)行甘油脂質(zhì)裝配(真核細(xì)胞路徑)。此外，一些質(zhì)體外甘油脂質(zhì)返回到質(zhì)體中，引起質(zhì)體與ER脂質(zhì)池之間值得注意的混合(Ohlrogge和Jaworski 1997)。對(duì)脂肪酸生物合成的質(zhì)體路徑的最簡(jiǎn)單描述由兩個(gè)酶系統(tǒng)組成乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)及脂肪酸合酶(FAS)。ACCase催化從乙酰輔酶A形成丙二酰_CoA，F(xiàn)AS將丙二?；糠洲D(zhuǎn)移至酰基載體蛋白(ACP)并催化用丙二?；?ACP延伸增長(zhǎng)的?；湣３跏贾舅岷铣煞磻?yīng)由3-酮?；?ACP III (KAS III)催化，這導(dǎo)致乙酰輔酶A與丙二酰基-ACP的縮合。由KASI及KAS II催化后續(xù)縮合。在脂肪酸合成的下一循環(huán)開始之前，3-酮酰基-ACP中間體在剩余FAS反應(yīng)中被還原為飽和的?；?ACP，所述反應(yīng)依次由3-酮酰基-ACP還原酶、3羥基?；?ACP脫水酶及烯?；?ACP還原酶催化。FAS的最終產(chǎn)物通常為16:0及18:0-ACP,且植物細(xì)胞的最終脂肪酸組成在很大程 度上由在脂肪酸合成的最終階段使用這些酰基-ACP的若干酶的活性決定。硬脂?；?ACP去飽和酶通過(guò)在C18:0-ACP的9位處插入順式雙鍵而修飾FAS的最終產(chǎn)物。通過(guò)水解或從ACP轉(zhuǎn)移?；?，終止脂肪酸合成反應(yīng)。水解由?；?ACP硫酯酶催化，所述硫酯酶存在兩個(gè)主要類型一種硫酯酶對(duì)18:1-ACP具有相對(duì)特異性，第二種硫酯酶對(duì)飽和的酰基-ACP具有更高特異性。已被硫酯酶從ACP釋放的脂肪酸離開質(zhì)體且進(jìn)入真核細(xì)胞脂質(zhì)路徑中，在該路徑中，脂肪酸主要在ER上酯化為甘油脂質(zhì)。與硫酯酶相反，在質(zhì)體中的?；D(zhuǎn)移酶通過(guò)將來(lái)自ACP的?；糠洲D(zhuǎn)酯至甘油來(lái)終止脂肪酸合成，且它們是引起質(zhì)體甘油脂質(zhì)裝配的原核細(xì)胞脂質(zhì)路徑的基本部分。三?；视蜕锖铣蒚AG生物合成中的唯一關(guān)鍵步驟為最后一步，即第三脂肪酸添加至現(xiàn)存的二?；视停纱水a(chǎn)生TAG。在植物中，此步驟主要(但非排它地)由5種(主要局限于ER)TAG合成酶之一執(zhí)行，所述TAG合成酶包括酰基輔酶A: 二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGATl);不相關(guān)?；o酶A :二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT2);與DGATl或DGAT2具有小于10%同一性的可溶性DGAT (DGAT3) (Saha等人，2006);磷脂酰膽堿-固醇0-?；D(zhuǎn)移酶(PDAT);及蠟合酶(WSD1, Li等人，2008)。DGATl及DGAT2蛋白由兩個(gè)不同的基因家族編碼，其中DGATl含有大約500個(gè)氨基酸及10個(gè)預(yù)測(cè)的跨膜域，DGAT2僅具有320個(gè)氨基酸及兩個(gè)跨膜域(Shockey等人，2006)。本文中所用術(shù)語(yǔ)“三?；视秃铣擅浮被颉癟AG合成酶”是指，能夠催化第三脂肪酸添加至現(xiàn)存二?；视蜕弦杂纱水a(chǎn)生TAG的酶。優(yōu)選的TAG合成酶包括、但不限于?；o酶A: 二?；视王；D(zhuǎn)移酶I (DGATl) ;二?；视王；D(zhuǎn)移酶2 (DGAT2);磷脂酰膽堿-固醇0-?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)和細(xì)胞溶質(zhì)可溶形式的DGAT (可溶性的DGAT或DGAT3)。倘若內(nèi)源性的DGATl及DGAT2在成熟及衰老的葉中發(fā)揮作用(Kaup等人，2002 ；Shockey等人，2006)，則植物可能具有許多反饋機(jī)制來(lái)控制其活性。實(shí)際上，Zou等人(2008)最近在旱金蓮(Tropaeolum majus)(園藝旱金蓮)DGAT1 (TmDGATl)序列內(nèi)鑒別出共同序列(X-Leu-X-Lys-X-X-Ser-X-X-X-Val)JtS SNFl 相關(guān)蛋白激酶-I (SnRKl)的成員特有的革巴向基序，其中Ser為用于磷酸化的殘基。SnRKl蛋白為一類Ser/Thr蛋白激酶,其已經(jīng)日益涉入植物的碳代謝的全面調(diào)節(jié)中，例如通過(guò)磷酸化作用使磷酸蔗糖合酶滅活(Halford及Hardie，1998)。Zou等人(2008)接著證明，通過(guò)單點(diǎn)突變(TmDGATl的Serl97Ala)消除DGATl中的潛在SnRKl磷酸化位點(diǎn)，會(huì)造成在種子中積聚明顯更高水平的TAG。此突變使活性提高38-80%，由這使得擬南芥屬中的油含量以每一種子計(jì)增加20-50%。
磷脂DGA?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)從一個(gè)磷脂分子及一個(gè)二酰基甘油分子形成TAG。PDAT當(dāng)在酵母中表達(dá)時(shí)極具活性，但當(dāng)在植物種子中表達(dá)時(shí)不能明顯提高TAG產(chǎn)量。PDAT及所提出的DAG = DAG?；D(zhuǎn)移酶為產(chǎn)生TAG的中性脂質(zhì)合成酶，但不認(rèn)為其是Kennedy途徑的一部分。蠟酯合酶與DGAT酶的組合(WS/DGAT)已見于迄今所研究的所有產(chǎn)中性脂質(zhì)的原核生物中。WS/DAGAT對(duì)多種不常見脂肪酸、醇及甚至硫醇具有格外寬廣的活性。此酶具有推定的跨膜區(qū)域，但不展示與來(lái)自真核生物的DGATl及DGAT2家族或來(lái)自荷荷芭(荷荷芭為已發(fā)現(xiàn)的唯一積聚蠟酯的真核生物)的WE合酶的序列同源性。應(yīng)當(dāng)指出，卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)和?；?輔酶膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)為生產(chǎn)非TAG的固醇酯(中性脂質(zhì)的一種形式)的酶。在需要增加中性脂質(zhì)的應(yīng)用中，有證據(jù)表明，與DGAT2相比具有更高活性及更寬特異性的DGATl為優(yōu)選的。當(dāng)特定脂肪酸(諸如長(zhǎng)鏈PUFA)為優(yōu)選的時(shí)，DGATl仍適用，只要其接受所選的脂肪酸。植物一般在sn-2位中摻入長(zhǎng)鏈PUFA。不知道這是否是因于LPAT對(duì)此基質(zhì)的高活性或DGATl對(duì)此基質(zhì)的低活性。對(duì)于PUFA的提高的特異性而言，偏好這些脂肪酸的DGAT2可為優(yōu)選的，或可使用定向進(jìn)化或等效程序來(lái)改變DGATl的特性。來(lái)自若干植物物種的成員的適用于本發(fā)明的方法及組合物中的這些TAG合成酶的實(shí)例提供在下表2中。(多核苷酸及多肽)序列提供于序列表中。表2
.........TAC"￥ S,S ...................................................................................................—'cmk............................................................................SEQ ......m.記.吾.....SEO...................
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PGATl ................... —4a南齊 —NM_ 127503 TiNP, 1 79535 — 75
DGATl 旱金蓮 —AY 084 05 2 ~76AAM03340 77
DGATl 玉來(lái) "EUQ3983Q —— 78ABV91586 79
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IKiAT3 I 可溶姓Hi AY875644 84= AAX62755 i
的 DGAT3______
.....PDAT............................................................................................KOlBb ........................................86—.....^71968()8................................................87....................
.....PDAT....................................................H...................................................)(0()25713()4.........................88—.....Xp7qi)252T350................................89....................本發(fā)明也涵蓋改良的TAG合成酶的用途，所述TAG合成酶被修飾(例如在其序列中的置換、插入或添加等)以改變其特異性和/或活性。TAG在葉中的積聚近來(lái)在美國(guó)中北部地區(qū)對(duì)302個(gè)被子植物物種進(jìn)行的野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，24%在葉中具有明顯的細(xì)胞溶質(zhì)油滴，通常每個(gè)葉肉細(xì)胞具有一個(gè)大油滴(Lersten等人，2006[來(lái)自Slocombe等人，2009])。認(rèn)為細(xì)胞溶質(zhì)葉TAG的作用涉入碳儲(chǔ)存和/或膜脂質(zhì)再造中(關(guān)于綜述，參見Slocombe等人，2009)。實(shí)際上,在衰老的葉中，質(zhì)體脂肪酸在進(jìn)一步移動(dòng)之前分配至TAG中，且認(rèn)為DGATl有助于此過(guò)程(Kaup等人，2002)。
已數(shù)次嘗試工程改造植物以在其葉中積聚升高水平的TAG。這些嘗試的成功已經(jīng)或多或少地受限于所積聚的相對(duì)低水平的TAG，且在一些情況下，受限于僅在衰老葉中積聚的大部分TAG，由此限制收獲的靈活性及在任一時(shí)刻積聚TAG的作物的比例(Bouvier-Nave等人,2001 ；Xu 等人,2005 ；ffinichayakul 等人,2008 ；Andrianov 等人,2010 ；Slocombe 等人，2009及其中的參考文獻(xiàn))。至今，在葉中積聚TAG的嘗試主要集中于三個(gè)特定基因候選物，包括DGAT的過(guò)度表達(dá)(TAG生物合成)、TCD1或CTS的突變(從而防止脂質(zhì)再移動(dòng))、及LEC1、LEC2及WRIl (涉入發(fā)育種子中的油儲(chǔ)存及蛋白積聚的轉(zhuǎn)錄因子)的過(guò)度表達(dá)。TAG及其它中性脂質(zhì)合成酶的過(guò)度表達(dá)依賴于足量基質(zhì)在展葉和/或成熟葉中的存在，認(rèn)為所述基質(zhì)是由合成膜的脂質(zhì)的質(zhì)體(在葉的情況下，為葉綠體)提供。在擬南芥屬的光合成葉中，據(jù)估計(jì)膜脂質(zhì)的每日回轉(zhuǎn)率為總脂肪酸的4% (Bao等人，2000)。在衰老的葉中，現(xiàn)存質(zhì)體膜會(huì)提供在進(jìn)一步移動(dòng)之前分配至TAG中的大批脂肪酸。擬南芥屬DGATl基因在煙葉中的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致TAG積聚增加(Bouvier-Nave等人，2001)，這在以后由Andrianov等人(2010)重復(fù)及定量。他們計(jì)算出TAG水平增加20 倍，且造成在成熟葉中來(lái)自約3%至約6%的干物質(zhì)的雙倍脂質(zhì)含量。通過(guò)使用誘導(dǎo)型Alc啟動(dòng)子在成熟葉中過(guò)度表達(dá)LEC2 (種子成熟及種子油儲(chǔ)存的一種主要調(diào)節(jié)物)，進(jìn)一步增加至6. 8% (Andrianov等人，2010)。未對(duì)可提取的TAG作出估算,也未對(duì)TAG在展葉中的積聚進(jìn)行任何計(jì)算。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的通透酶樣蛋白TRI半乳糖基二?；视?TGDl)中的突變會(huì)引起TAG、寡半乳糖脂及磷脂酸酯的積聚，這伴隨胚不孕性的高發(fā)生率及相對(duì)較差的總體植物生長(zhǎng)(Xu等人，2005)。Winichayakul等人，(2008)在黑麥草(多年生黑麥草)的葉中過(guò)度表達(dá)擬南芥DGAT1，且發(fā)現(xiàn)這導(dǎo)致總可提取的葉脂質(zhì)增加50% (干物質(zhì)的約4%至6%)。此外，在通過(guò)間隔2-3周反復(fù)收獲所產(chǎn)生的新葉中存在升高的脂質(zhì)水平，表明新長(zhǎng)出的葉也能夠積聚額外脂質(zhì)。然而，當(dāng)葉齡超過(guò)2周時(shí)，在這些葉中升高的脂質(zhì)水平通常開始降低至野生型水平，表明脂質(zhì)正經(jīng)由分解代謝而再移動(dòng)(通過(guò)脂肪酶從甘油主鏈釋放，隨后3 -氧化)。Slocombe等人，(2009)證明，在CTS過(guò)氧化物酶體ABC運(yùn)載體(cts_2)中的突變會(huì)導(dǎo)致至多I. 4%TAG在葉中(尤其在衰老開始期間)積聚。它們也在衰老期間在cts-2背景下異位地表達(dá)LEC2 ;雖然這并不會(huì)由于cts-2突變而增加TAG的總積聚，但確實(shí)會(huì)增加TAG的種子油型物種在衰老組織中的積聚。雖然cts-2阻斷脂肪酸分解，但它也造成嚴(yán)重表型。Slocombe等人，(2009)的結(jié)論是,再循環(huán)的膜脂肪酸可能能夠通過(guò)在衰老組織中表達(dá)種子程序或通過(guò)阻斷脂肪酸分解而重新導(dǎo)向TAG。Scott等人，(2007)聲稱，三?；视王ズ铣擅负途塾唾|(zhì)蛋白(兩個(gè)或更多個(gè)油質(zhì)蛋白單元以串聯(lián)頭尾相接排列形式融合)的共表達(dá)，能實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)在植物細(xì)胞中的儲(chǔ)存。類似地，Cookson等人，(2009)聲稱，在植物的營(yíng)養(yǎng)部分內(nèi)生產(chǎn)單一油質(zhì)蛋白及TAG合成酶，會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)組織中的油體及TAG的數(shù)量增加。使用這些技術(shù)中的任一種，會(huì)使脂質(zhì)含量(未必呈TAG形式)最多增加至多約50%。此外，該水平隨著葉的成熟開始下降；通常在葉齡大于2周的葉中(資料未公開)。因此，TAG在營(yíng)養(yǎng)組織中可以積聚的程度似乎在某種程度上受限于下述事實(shí)，即內(nèi)源地固定的碳回收機(jī)構(gòu)分解代謝TAG。葉衰老-脂質(zhì)經(jīng)由TAG中間體再循環(huán)葉衰老為一系列高度受控的事件，最終導(dǎo)致細(xì)胞、組織及最終整個(gè)器官的死亡。這使得必須調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)素的募集以及其自衰老組織向其它仍生長(zhǎng)和發(fā)育的組織的移位。葉綠體為葉肉細(xì)胞中展示衰老征狀的第一細(xì)胞器，且雖然在葉衰老級(jí)聯(lián)的早期即引發(fā)類囊體膜的分解，但葉綠體包膜保持相對(duì)完整直至衰老的很晚階段。DGATl在擬南芥屬葉的衰老期間被增量調(diào)節(jié)，且這臨時(shí)與常見于葉綠體半乳糖脂中的含TAG的脂肪酸水平增加相關(guān)聯(lián)。從衰老的葉(尤其衰老的葉綠體)募集膜碳至植物的生長(zhǎng)部分，是葉衰老的關(guān)鍵特征，且它涉及類囊體脂質(zhì)的脫酯作用及所得游離脂肪酸向韌皮部移動(dòng)蔗糖的轉(zhuǎn)化。類囊體脂質(zhì)的脫酯作用似乎由一種或多種衰老誘導(dǎo)的半乳糖脂肪酶所介導(dǎo)。TAG的形成似乎是衰老期間膜脂質(zhì)碳向韌皮部移動(dòng)蔗糖移動(dòng)的中間步驟(Kaup等人，2002)。 經(jīng)工程改造以包括人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白 本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白或用于本發(fā)明方法中的改良油質(zhì)蛋白被改良成含有至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸殘基。優(yōu)選地，經(jīng)工程改造的油質(zhì)蛋白含有至少兩個(gè)半胱氨酸。含有經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白對(duì)中性脂質(zhì)的包囊，會(huì)提供在葉中積聚可評(píng)估數(shù)量的TAG同時(shí)無(wú)需等待至衰老且不生產(chǎn)極端表型的替代性機(jī)制。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法可用于生產(chǎn)具有人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白。這樣的方法包括定點(diǎn)誘變(US 6，448，048)，其中編碼油質(zhì)蛋白的多核苷酸被改良以將半胱氨酸弓I入編碼的油質(zhì)蛋白中。或者，可全部合成編碼改良油質(zhì)蛋白的多核苷酸。在實(shí)施例部分中提供了用于生產(chǎn)本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白及用于本發(fā)明方法中的改良油質(zhì)蛋白的其它方法。引入的半胱氨酸可以是額外的氨基酸(即插入)，或可以替代現(xiàn)存的氨基酸(即替換)。優(yōu)選地，引入的半胱氨酸替代現(xiàn)存的氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述被替代的氨基酸為帶電殘基。優(yōu)選地，預(yù)測(cè)所述帶電殘基是在親水域中，且因此可能位于油體的表面上。使用標(biāo)準(zhǔn)的方法(例如Kyte及Doolitle, (1982))，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地鑒別油質(zhì)蛋白的親水及疏水區(qū)/臂。本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白的分子量?jī)?yōu)選地在5至50kDa、更優(yōu)選10至40kDa、更優(yōu)選15至25kDa的范圍內(nèi)。本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白優(yōu)選地在100至300個(gè)氨基酸、更優(yōu)選110至260個(gè)氨基酸、更優(yōu)選120至250個(gè)氨基酸、更優(yōu)選130至240個(gè)氨基酸、更優(yōu)選140至230個(gè)氨基酸的尺寸范圍內(nèi)。所述改良油質(zhì)蛋白優(yōu)選地包含N端親水區(qū)、兩個(gè)中心疏水區(qū)(由脯氨酸結(jié)或節(jié)接合)及C端親水區(qū)。所述改良油質(zhì)蛋白優(yōu)選地可沿其長(zhǎng)度分為幾乎相同的四個(gè)部分，所述部分對(duì)應(yīng)于N端親水區(qū)(或臂)、兩個(gè)中心疏水區(qū)(由脯氨酸結(jié)或節(jié)接合)及C端親水區(qū)(或臂)。所述改良油質(zhì)蛋白的拓?fù)鋵W(xué)優(yōu)選地歸因于其物理特性，包括由親水域側(cè)接的折疊的疏水核心。優(yōu)選地，當(dāng)與三酰基甘油(TAG)及磷脂組合時(shí)，所述改良油質(zhì)蛋白可形成在油體中。優(yōu)選地，拓?fù)鋵W(xué)給改良油質(zhì)蛋白賦予兩親性質(zhì)，從而使得疏水域嵌入油體的磷脂單層中，而側(cè)接親水域暴露于油體外部的水性環(huán)境，諸如在細(xì)胞質(zhì)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白或用于本發(fā)明方法中的改良油質(zhì)蛋白包含與以上表I中所提及的任一種油質(zhì)蛋白蛋白序列的疏水域具有至少70%同一性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白或用于本發(fā)明方法中的改良油質(zhì)蛋白包含與以上表I中所提及的任一種蛋白序列具有至少70%同一性的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除額外人工引入的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸以外，所述改良油 質(zhì)蛋白與以上表I中所提及的任一種油質(zhì)蛋白基本上相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白或用于本發(fā)明方法中的改良油質(zhì)蛋白包含與SEQ ID NO: 16的油質(zhì)蛋白序列具有至少70%同一性的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除額外人工引入的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸以外，所述改良油質(zhì)蛋白具有與SEQ I D NO: 16相同的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述改良油質(zhì)蛋白具有SEQ ID NO: 16至20中的任一個(gè)的
氨基酸序列。具有改良油質(zhì)蛋白的融合蛋白本發(fā)明也提供了一種融合蛋白，其包括與目的蛋白融合的本發(fā)明的改良油質(zhì)蛋白。優(yōu)選地，所述目的蛋白是在融合蛋白的N端或C端末端。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于重組表達(dá)融合蛋白的方法(Papapostolou及Howorka, 2009)。本發(fā)明的融合蛋白的生產(chǎn)通常可能包括，將目的蛋白的編碼序列與改良油質(zhì)蛋白的編碼序列融合。這樣的融合蛋白可包括于或表達(dá)于本發(fā)明的油體中，且用于純化及遞送目的蛋白以供多種應(yīng)用，如在Roberts等人，(2008)中所論述。然而，本發(fā)明可能通過(guò)改良油質(zhì)蛋白在油體中的存在而任選地改變油體的穩(wěn)定性/完整性，由此實(shí)現(xiàn)更嚴(yán)格的純化及遞送程序。具有未改良油質(zhì)蛋白的融合蛋白本發(fā)明也涉及融合蛋白的應(yīng)用，所述融合蛋白包括與目的蛋白融合的未改良油質(zhì)蛋白。本發(fā)明的融合蛋白的生產(chǎn)通?？赡馨?，將目的蛋白的編碼序列與未改良油質(zhì)蛋白的編碼序列融合。優(yōu)選地，所述目的蛋白是在融合蛋白的N端或C端末端。這樣的融合蛋白可包括于或表達(dá)于本發(fā)明的油體中，且用于純化及遞送目的蛋白以供多種應(yīng)用，如在Roberts等人，(2008)中所論述。然而，本發(fā)明可能通過(guò)改良油質(zhì)蛋白在本發(fā)明的油體中的存在而任選地改變油體的穩(wěn)定性/完整性，由此實(shí)現(xiàn)更嚴(yán)格的純化及遞送程序。營(yíng)養(yǎng)組織
營(yíng)養(yǎng)組織包括芽、葉、根、莖。優(yōu)選的營(yíng)養(yǎng)組織為葉。營(yíng)養(yǎng)組織特異性的啟動(dòng)子營(yíng)養(yǎng)特異性的啟動(dòng)子的實(shí)例參見US 6，229，067 ；和US 7，629，454 ；和US7, 153，953 ;和 US 6，228，643?；ǚ厶禺愋缘膯?dòng)子花粉特異性的啟動(dòng)子的實(shí)例參見US 7，141，424 ；和US 5，545，546 ；和US5, 412，085 ;和 US 5，086，169 ;和 US 7，667，097。種子特異性的啟動(dòng)子
種子特異性的啟動(dòng)子的實(shí)例參見US 6，342，657 ；和US 7，081, 565 ；和US7, 405，345 ;和 US7, 642，346 ;和 US7, 371，928。果實(shí)特異性的啟動(dòng)子果實(shí)特異性的啟動(dòng)子的實(shí)例參見US 5，536，653 ；和US 6，127，179 ；和US5, 608，150 ;和 US 4，943，674。多核苷酸和片段本文中所用術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指，任何長(zhǎng)度但優(yōu)選至少15個(gè)核苷酸的單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括以下非限制性實(shí)例編碼及非編碼的基因序列、有義及反義互補(bǔ)序列、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、pre_mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重組多肽、分離和純化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。本文中提供的多核苷酸序列的“片段”是能夠與目標(biāo)靶物特異性地雜交的鄰接核苷酸子序列，例如長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸的序列。本發(fā)明的片段包含所公開的多核苷酸的鄰接核苷酸中的15個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少16個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少17個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少18個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少19個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少21個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少22個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少23個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少24個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少25個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少26個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少27個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少28個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少29個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少31個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少32個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少33個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少34個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少35個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少36個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少37個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少38個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少39個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少40個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少41個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少42個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少43個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少44個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少45個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少46個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少47個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少48個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少49個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少51個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少52個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少53個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少54個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少55個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少56個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少57個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少58個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少59個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少61個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少62個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少63個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少64個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少65個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少66個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少67個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少68個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少69個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少71個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少72個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少73個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少74個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少75個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少76個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少77個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少78個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少79個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少80個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少81個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少82個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少83個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少84個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少85個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少86個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少87個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少88個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少89個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少90個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少91個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少92個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少93個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少94個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少95個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少96個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少97個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少98個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少99個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少150個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少250個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少350個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少450個(gè)核苷酸和最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。多核苷酸序列的片段可用于反義、RNA干擾(RNAi)、基因沉默、三螺旋或核酶技術(shù)中，或用作引物、探針，包括在微陣列中，或用于本發(fā)明的基于多核苷酸的選擇法中。、
術(shù)語(yǔ)“引物”是指，通常具有游離3’ OH基團(tuán)的短多核苷酸，其與模板雜交，且用于引發(fā)與靶物互補(bǔ)的多核苷酸的聚合。術(shù)語(yǔ)“探針”是指，在基于雜交的試驗(yàn)中，用于檢測(cè)與探針互補(bǔ)的多核苷酸序列的短多核苷酸。所述探針可由如本文所定義的多核苷酸的“片段”組成。多肽和片段本文中所用術(shù)語(yǔ)“多肽”包括任何長(zhǎng)度但優(yōu)選至少5個(gè)氨基酸的氨基酸鏈，包括全長(zhǎng)蛋白，其中氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)肽鍵相連。本發(fā)明的多肽或用于本發(fā)明方法中的多肽可為純化的天然產(chǎn)物，或可使用重組或合成技術(shù)部分地或整體地生產(chǎn)。該術(shù)語(yǔ)可指多肽、多肽的聚集體(諸如二聚體或其它多聚體)、融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。多肽的“片段”為多肽的子序列，其執(zhí)行生物活性所需的功能和/或提供多肽的三維結(jié)構(gòu)。該術(shù)語(yǔ)可指能夠執(zhí)行上述酶活性的多肽、多肽的聚集體(諸如二聚體或其它多聚體)、融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。當(dāng)用于本文中所公開的多核苷酸或多肽序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”用于指從它們的天然細(xì)胞環(huán)境中取出的序列。分離的分子可通過(guò)任何方法或方法的組合獲得，包括生物化學(xué)的、重組的及合成的技術(shù)。術(shù)語(yǔ)“重組的”是指，從多核苷酸序列的天然背景所包圍的序列中取出的多核苷酸序列，和/或與在其天然背景下不存在的序列重組。通過(guò)從“重組的”多核苷酸序列翻譯，生產(chǎn)“重組的”多肽序列。就源自特定屬或種的本發(fā)明的多核苷酸或多肽而言，術(shù)語(yǔ)“源自”是指，所述多核苷酸或多肽具有與在該屬或種中天然發(fā)現(xiàn)的多核苷酸或多肽相同的序列。源自特定屬或種的多核苷酸或多肽因此可以合成地或重組地生產(chǎn)。變體本文中所用術(shù)語(yǔ)“變體”是指，不同于特別鑒別出的序列的多核苷酸或多肽序列，其中缺失、置換或添加了一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。變體可為天然存在的等位基因變體或非天然存在的變體。變體可來(lái)自同一物種或來(lái)自其它物種，且可包括同系物、旁系同源物及直系同源物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的變體具有與本發(fā)明多肽相同或類似的生物活性。就多肽而言，術(shù)語(yǔ)“變體”包括所有形式的多肽和如本文所定義的多肽。多核苷酸變體
變體多核苷酸序列優(yōu)選地與本發(fā)明的序列表現(xiàn)出至少50%、更優(yōu)選至少51%、更優(yōu)選至少52%、更優(yōu)選至少53%、更優(yōu)選至少54%、更優(yōu)選至少55%、更優(yōu)選至少56%、更優(yōu)選至少57%、更優(yōu)選至少58 %、更優(yōu)選至少59%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少61%、更優(yōu)選至少62%、更優(yōu)選至少63%、更優(yōu)選至少64%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少66%、更優(yōu)選至少67%、更優(yōu)選至少68%、更優(yōu)選至少69%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少71%、更優(yōu)選至少72%、更優(yōu)選至少73%、更優(yōu)選至少74%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少76%、更優(yōu)選至少77%、更優(yōu)選至少78%、更優(yōu)選至少79%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少81%、更優(yōu)選至少82%、更優(yōu)選至少83%、更優(yōu)選至少84%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少86%、更優(yōu)選至少87%、更優(yōu)選至少88%、更優(yōu)選至少89%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%和最優(yōu)選至少99%同一性。在本發(fā)明的多核苷酸的至少20個(gè)核苷酸位置、優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸位置、更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸位置且最優(yōu)選整個(gè)長(zhǎng)度的比較窗上，發(fā)現(xiàn)同一性?？梢匀缦路绞綔y(cè)定多核苷酸序列同一性。在bl2seq(Tatiana A. Tatusova, ThomasL. Madden (1999)，“Blast 2sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)中，使用 BLASTN(來(lái)自 BLAST程序套件，2. 2. 5版[2002年11月])，將主題多核苷酸序列與候選多核苷酸序列進(jìn)行比較，所述bl2seq可從NCBI (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)公開獲得。除應(yīng)關(guān)閉對(duì)低復(fù)雜性部分的過(guò)濾以外，利用bl2seq的預(yù)設(shè)參數(shù)?？墒褂靡韵聈nix命令行參數(shù)檢驗(yàn)多核苷酸序列的同一性bl2seq - i nucleotideseql - j nucleotideseq2 - F F - p blastn參數(shù)-F F關(guān)閉對(duì)低復(fù)雜性區(qū)段的過(guò)濾。參數(shù)-P為序列對(duì)選出適當(dāng)算法。bl2seq程序在“Identities=”行中將序列同一性報(bào)告為相同核苷酸的數(shù)量及百分比。使用總體序列比對(duì)程序(例如Needleman, S. B.和 Wunsch, C. D. (1970) J. Mol.Biol. 48，443-453)，也可以在候選序列與主題多核苷酸序列之間的重疊部分的整個(gè)長(zhǎng)度上計(jì)算多核苷酸序列同一,I"生。Needleman-Wunsch總體比對(duì)算法的一個(gè)完整實(shí)現(xiàn),參見EMBOSS套件(Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite, Trends in Genetics June 2000,第 16 卷，第 6 期，第 276-277 頁(yè))中的needle 程序。該 EMBOSS 套件可從 http://www. hgmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/ 得到。EuropeanBioinformatics Institute 月艮務(wù)器也在 http:/www. ebi. ac. uk/emboss/align/上在線提供執(zhí)行兩個(gè)序列之間的EMBOSS-needle總體比對(duì)的工具?；蛘?，可使用GAP程序，其計(jì)算兩個(gè)序列在無(wú)處罰末端空隙的情況下的最佳總體比對(duì)。GAP 描述在以下論文中Huang, X. (1994)0n Global Sequence Alignment. ComputerApplications in the Biosciences 10,227-235。計(jì)算多核苷酸％序列同一丨I"生的優(yōu)選方法是基于使用Clustal X (Jeanmougin等人，1998，Trends Biochem. Sci. 23，403-5.)對(duì)比待比較的序列。本發(fā)明的多核苷酸變體也涵蓋這樣的變體所述變體展現(xiàn)與可能保留那些序列的功能等效性的一個(gè)或多個(gè)特別鑒別的序列的相似性，且不能恰當(dāng)?shù)仡A(yù)期隨機(jī)發(fā)生。使用從來(lái)從 NCBI (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)的 BLAST 程序套件(2. 2. 5 版[2002 年 11月])可公開獲得的bl2seq程序，可以測(cè)定有關(guān)多肽的這種序列相似性。
可使用以下unix命令行參數(shù)檢驗(yàn)多核苷酸序列的相似性bl2seq - i nucleotideseql - j nucleotideseq2 - F F - p tblastx參數(shù)-FF關(guān)閉對(duì)低復(fù)雜性區(qū)段的過(guò)濾。參數(shù)-P為序列對(duì)選出適當(dāng)算法。該程序發(fā)現(xiàn)序列之間的相似性區(qū)域，且為每個(gè)這樣的區(qū)域報(bào)導(dǎo)一個(gè)“E值”，所述E值為預(yù)期在含有隨機(jī)序列的固定參考尺寸的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到該偶然匹配的預(yù)期次數(shù)。此數(shù)據(jù)庫(kù)的尺寸是由bl2seq程序中的默認(rèn)值設(shè)定。對(duì)于遠(yuǎn)小于I的小E值而言，E值大致為這樣的隨機(jī)匹配的機(jī)率。當(dāng)與任一個(gè)特別鑒別的序列相比較時(shí)，變體多核苷酸序列優(yōu)選地表現(xiàn)出小于1x10'更優(yōu)選地小于lxl0_9、更優(yōu)選地小于lxl0_12、更優(yōu)選地小于lxl0_15、更優(yōu)選地小于lxl0_18、更優(yōu)選地小于lxl0_21、更優(yōu)選地小于lxl0_3°、更優(yōu)選地小于lxl0_4°、更優(yōu)選地小于lxl0_5°、更優(yōu)選地小于lxl0_6°、更優(yōu)選地小于lxl0_7°、更優(yōu)選地小于1x10,、更優(yōu)選地小于 IxlO-90和最優(yōu)選地小于lxl0_1(l°的E值?；蛘?，本發(fā)明的變體多核苷酸或用于本發(fā)明方法中的變體多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與指定的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交。術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”及其語(yǔ)法等效描述是指，多核苷酸分子在限定的溫度及鹽濃度條件下與靶多核苷酸分子(諸如固定于DNA或RNA印跡(諸如DNA印跡或RNA印跡)上的靶多核苷酸分子)雜交的能力。通過(guò)最初在更低嚴(yán)謹(jǐn)性條件下雜交，隨后將嚴(yán)謹(jǐn)性增加至希望的嚴(yán)謹(jǐn)性，可以測(cè)定在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交的能力。關(guān)于長(zhǎng)度大于約100個(gè)堿基的多核苷酸分子，典型的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為，比天然雙鏈體的解鏈溫度(Tm)低不超過(guò)25至30 °C (例如10°C)(—般參見，Sambrook等人編，1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版.Cold Spring Harbor Press ；Ausubel 等人，1987，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing)。大于約100個(gè)堿基的多核苷酸分子的Tm可通過(guò)下式來(lái)計(jì)算Tm=81. 5+0. 41%(G+C_log(Na+).(Sambrook等人,Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2 版 ColdSpringHarbor Press;Bolton and McCarthy, 1962, PNAS 84:1390)。長(zhǎng)度大于 100個(gè)喊基的多核苷酸的典型嚴(yán)謹(jǐn)條件是這樣的雜交條件，諸如在6 X SSC、0. 2%SDS的溶液中預(yù)洗滌；在65°C，在6XSSC、0. 2%SDS中雜交過(guò)夜；隨后在1XSSC、0. 1%SDS中在65°C進(jìn)行兩次各30分鐘的洗漆，并在0. 2XSSC、0. 1%SDS中在65°C進(jìn)行兩次各30分鐘的洗滌。關(guān)于長(zhǎng)度小于100個(gè)堿基的多核苷酸分子，示例性的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是，比Tm低5至10°C。平均而言，長(zhǎng)度小于100堿基對(duì)的多核苷酸分子的Tm降低大約(500/寡核苷酸長(zhǎng)度)。。。關(guān)于稱為肽核酸(PNA)的DNA模擬物(Nielsen等人，Science. 1991年12月6日；254 (5037) : 1497-500)，Tm 值高于 DNA-DNA 或 DNA-RNA 雜交物的 Tm 值，且可使用 Giesen等人，Nucleic Acids Res. 1998年11月I日；26 (21) :5004-6中所述的公式來(lái)計(jì)算。長(zhǎng)度小于100個(gè)堿基的DNA-PNA雜交物的示例性的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為，比Tm低5至10°C。本發(fā)明的變體多核苷酸或用于本發(fā)明方法中的變體多核苷酸也涵蓋這樣的多核苷酸其不同于本發(fā)明的序列，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而編碼具有與由本發(fā)明的多核苷酸所編碼的多肽相似的活性的多肽。不改變多肽的氨基酸序列的序列變化是“沉默變異”。除ATG (甲硫氨酸)和TGG (色氨酸)以外，同一氨基酸的其它密碼子可通過(guò)本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)發(fā)生改變，例如，以優(yōu)化在特定宿主有機(jī)體中的密碼子表達(dá)。引起編碼的多肽序列中的一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的保守置換但不顯著改變其生物活性的多核苷酸序列變化，也包括于本發(fā)明中。技術(shù)人員知曉制造表型沉默的氨基酸置換的方法(參見，例如，Bowie 等人，1990，Science 247，1306)。使用從NCBI (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)公開獲得的來(lái)自 BLAST 程序套件(2. 2. 5版[2002年11月])的bl2seq程序,通過(guò)先前所述的tblastx算法,可以測(cè)定由于編碼的多肽序列中的沉默變異及保守置換而產(chǎn)生的變體多核苷酸。多肽變體就多肽而言，術(shù)語(yǔ)“變體”涵蓋天然存在的、重組地和合成地生產(chǎn)的多肽。變體多肽序列優(yōu)選地與本發(fā)明的序列表現(xiàn)出至少50%、更優(yōu)選至少51%、更優(yōu)選至少52%、更優(yōu)選至少53%、更優(yōu)選至少54%、更優(yōu)選至少55%、更優(yōu)選至少56%、更優(yōu)選至少57%、更優(yōu)選至少58%、更優(yōu)選至少59%、更優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少61%、更優(yōu)選至少62%、更優(yōu)選至少63%、更優(yōu)選 至少64%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少66%、更優(yōu)選至少67%、更優(yōu)選至少68%、更優(yōu)選至少69%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少71%、更優(yōu)選至少72%、更優(yōu)選至少73%、更優(yōu)選至少74%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少76%、更優(yōu)選至少77%、更優(yōu)選至少78%、更優(yōu)選至少79%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少81%、更優(yōu)選至少82%、更優(yōu)選至少83%、更優(yōu)選至少84%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少86%、更優(yōu)選至少87%、更優(yōu)選至少88%、更優(yōu)選至少89%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%和最優(yōu)選至少99%同一性。在本發(fā)明的多肽的至少20個(gè)氨基酸位置、優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸位置、更優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸位置且最優(yōu)選整個(gè)長(zhǎng)度的比較窗上，發(fā)現(xiàn)同一性。多肽序列同一性可以如下方式測(cè)定。在bl2seq中使用BLASTP (來(lái)自BLAST程序套件，2. 2. 5版[2002年11月])將主題多肽序列與候選多肽序列進(jìn)行比較，bl2seq可從NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公開獲得。除應(yīng)關(guān)閉對(duì)低復(fù)雜性區(qū)域的過(guò)濾以夕卜，利用bl2seq的默認(rèn)參數(shù)。使用總體序列比對(duì)程序，也可在候選序列與主題多核苷酸序列之間的重疊部分的整個(gè)長(zhǎng)度上計(jì)算多肽序列同一,I"生。如上文所論述的EMB0SS_needle(可獲自http:/www. ebi.ac. uk/emboss/align/)及 GAP (Huang. X. (1994)0n GlobalSequence Alignment. ComputerApplications in the BioscienceslO, 227-235.),也是適用于計(jì)算多肽序列同一性的總體序列比對(duì)程序。用于計(jì)算多肽％序列同一丨丨生的優(yōu)選方法，是基于使用ClustalX (Jeanmougin等人，1998，Trends Biochem. Sci. 23，403-5)比對(duì)待比較的序列。本發(fā)明的多肽變體或用于本發(fā)明方法中的多肽變體也涵蓋這樣的多肽變體其展現(xiàn)與可能保留序列的功能等效性的一個(gè)或多個(gè)特別鑒別的序列的相似性，且不能恰當(dāng)預(yù)期隨機(jī)發(fā)生。使用從NCBI (ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)公開獲得的來(lái)自BLAST程序套件(2. 2.5版[2002年11月])的bl2seq程序，可以測(cè)定有關(guān)多肽的這種序列相似性?？墒褂靡韵聈nix命令行參數(shù)檢驗(yàn)多肽序列的相似性bl2seq - i peptideseql - j peptideseq2_F F - pblastp當(dāng)與任一個(gè)特別鑒別的序列相比較時(shí)，變體多肽序列優(yōu)選地表現(xiàn)出小于lxl0_6、更優(yōu)選地小于lxl0_9、更優(yōu)選地小于lxl0_12、更優(yōu)選地小于lxl0_15、更優(yōu)選地小于lxl0_18、更優(yōu)選地小于lxl0_21、更優(yōu)選地小于lxl0_3°、更優(yōu)選地小于lxl0_4°、更優(yōu)選地小于lxl0_5°、更優(yōu)選地小于lxl0_6°、更優(yōu)選地小于lxl0_7°、更優(yōu)選地小于lxl0_8°、更優(yōu)選地小于lxl0_9°和最優(yōu)選地小于1x10,°的E值。參數(shù)-F F關(guān)閉對(duì)低復(fù)雜性區(qū)段的過(guò)濾。參數(shù)-P為序列對(duì)選出適當(dāng)算法。該程序發(fā)現(xiàn)序列之間的相似性區(qū)域，且為每一個(gè)這樣的區(qū)域報(bào)導(dǎo)一個(gè)“E值”，所述E值為預(yù)期在含有隨機(jī)序列的固定參考尺寸的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到該偶然匹配的預(yù)期次數(shù)。對(duì)于遠(yuǎn)小于I的小E值而言，E值大致為該隨機(jī)匹配的機(jī)率。所述多肽序列的一個(gè)或若干個(gè)氨基酸的保守置換(不顯著改變其生物活性)也包括于本發(fā)明中。技術(shù)人員知曉制造表型沉默的氨基酸置換的方法(參見，例如，Bowie等人，1990，Science 247，1306)。構(gòu)建體、載體及其組分
術(shù)語(yǔ)“遺傳構(gòu)建體”是指多核苷酸分子，通常為雙鏈DNA，其中可能已插入另一個(gè)多核苷酸分子(插入多核苷酸分子)，例如，但不限于，cDNA分子。遺傳構(gòu)建體可含有允許轉(zhuǎn)錄插入多核苷酸分子且任選地將轉(zhuǎn)錄物翻譯為多肽的必需元件。所述插入多核苷酸分子可源自宿主細(xì)胞，或可源自不同細(xì)胞或有機(jī)體，和/或可為重組多核苷酸。一旦在宿主細(xì)胞內(nèi)，遺傳構(gòu)建體則可整合進(jìn)宿主染色體DNA中。所述遺傳構(gòu)建體可連接至載體上。術(shù)語(yǔ)“載體”是指多核苷酸分子，通常為雙鏈DNA，其用于將遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞中。所述載體可能能夠在至少一個(gè)額外宿主系統(tǒng)(諸如大腸桿菌)中復(fù)制。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)構(gòu)建體”是指這樣的遺傳構(gòu)建體其包括允許轉(zhuǎn)錄插入多核苷酸分子且任選地將轉(zhuǎn)錄物翻譯為多肽的必需元件。表達(dá)構(gòu)建體通常在5’至3’方向包含a)在宿主細(xì)胞(構(gòu)建體將轉(zhuǎn)化進(jìn)其中)中具有功能的啟動(dòng)子，b)待表達(dá)的多核苷酸，和c)在宿主細(xì)胞(構(gòu)建體將轉(zhuǎn)化進(jìn)其中)中具有功能的終止子。術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”或“開放讀碼框”(ORF)是指，能夠在適當(dāng)調(diào)節(jié)序列控制下生產(chǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或多肽的基因組DNA序列或cDNA序列的有義鏈。在某些情況下，編碼序列可通過(guò)5’翻譯起始密碼子和3’翻譯終止密碼子的存在來(lái)鑒別。當(dāng)插入遺傳構(gòu)建體中時(shí)，“編碼序列”在可操作地連接至啟動(dòng)子及終止子序列的情況下能夠被表達(dá)?！翱刹僮鞯剡B接”是指，將待表達(dá)的序列放置在調(diào)控元件的控制下，所述調(diào)控元件包括啟動(dòng)子、組織特異性調(diào)控元件、臨時(shí)調(diào)控元件、增強(qiáng)子、抑制子及終止子。術(shù)語(yǔ)“非編碼區(qū)”是指，在翻譯起始位點(diǎn)的上游并在翻譯終止位點(diǎn)的下游的非翻譯序列。這些序列也分別稱為5’ UTR和3’ UTR0這些區(qū)域包括轉(zhuǎn)錄起始及終止、mRNA穩(wěn)定性及調(diào)節(jié)翻譯效率所需的元件。終止子為終止轉(zhuǎn)錄的序列，且見于翻譯序列的下游基因的3’不翻譯端。終止子為mRNA穩(wěn)定性的重要決定因素，且在有些情況下，已發(fā)現(xiàn)具有空間調(diào)節(jié)功能。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指，在編碼區(qū)上游的調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的非轉(zhuǎn)錄順式調(diào)控元件。啟動(dòng)子包含指定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的順式引發(fā)元件及保守盒(諸如TATA盒)，及被轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基序。編碼序列內(nèi)的內(nèi)含子也可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，且影響轉(zhuǎn)錄后加工(包括剪接、加帽及聚腺苷酸化)。
啟動(dòng)子可與待表達(dá)的多核苷酸同源。這意味著，在自然界中發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子與多核苷酸可操作地連接?；蛘?，啟動(dòng)子可與待表達(dá)的多核苷酸異源。這意味著，在自然界中未發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子與多核苷酸可操作地連接。“轉(zhuǎn)基因”是這樣的多核苷酸其取自一種有機(jī)體，且通過(guò)轉(zhuǎn)化引入不同的有機(jī)體中。轉(zhuǎn)基因可源自與引入該轉(zhuǎn)基因的有機(jī)體物種相同的物種或不同的物種?！胺聪蛑貜?fù)序列”是存在重復(fù)的序列，其中重復(fù)序列的另一半是在互補(bǔ)鏈中，例如(5，)GATCTA....... TAGATC (3，)(3，)CTAGAT....... ATCTAG (5，) 通讀轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)錄物其經(jīng)歷互補(bǔ)堿基配對(duì)，以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，條件是，在重復(fù)區(qū)之間存在3-5堿基對(duì)間隔物。宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞可源自例如細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物、藻類或植物有機(jī)體。宿主細(xì)胞也可為合成細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞，尤其是在植物營(yíng)養(yǎng)組織中的植物細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)基因植物”是指，含有經(jīng)遺傳操縱或轉(zhuǎn)化而生產(chǎn)的新遺傳物質(zhì)的植物。所述新遺傳物質(zhì)可源自與所得轉(zhuǎn)基因植物相同物種或不同物種的植物。分離或生產(chǎn)多核苷酸的方法使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種技術(shù)，可以分離本發(fā)明的多核苷酸分子。作為實(shí)例，通過(guò)使用在Mullis等人編，1994The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser(通過(guò)引用并入本文)中所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，可以分離這樣的多肽。使用源自本發(fā)明的多核苷酸序列的如本文所定義的引物，可以擴(kuò)增本發(fā)明的多肽。用于分離本發(fā)明的多核苷酸的其它方法包括使用具有本文所述的序列的所有或部分多肽作為雜交探針。使標(biāo)記的多核苷酸探針與固定在固體支持物(諸如硝化纖維素濾膜或尼龍膜)上的多核苷酸雜交的技術(shù)，可以用于篩選基因組或cDNA文庫(kù)。示例性的雜交及洗滌條件為在65°C，在5. 0XSSC、0. 5%十二烷基硫酸鈉、IX登哈特溶液中雜交20小時(shí)；在I. OXSSCU% (w/v)十二烷基硫酸鈉中洗滌(在55°C進(jìn)行三次各20分鐘的洗滌)，和任選地在60°C、在0. 5XSSC、1% (w/v)十二烷基硫酸鈉中洗滌一次(20分鐘)?？蛇x的進(jìn)一步洗滌(20分鐘)可在60°C、在0. 1XSSC、1% (w/v)十二烷基硫酸鈉的條件下進(jìn)行。通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)，諸如限制性核酸內(nèi)切酶消化、寡核苷酸合成及PCR擴(kuò)增，可以生產(chǎn)本發(fā)明的多核苷酸片段?？稍诒绢I(lǐng)域熟知的方法中使用部分多核苷酸序列來(lái)鑒別相應(yīng)的全長(zhǎng)多核苷酸序列。這樣的方法包括基于PCR的方法、5’ RACE (Frohman MA, 1993, Methods EnzymoI. 218:340-56)及基于雜交的方法、基于計(jì)算機(jī)/數(shù)據(jù)庫(kù)的方法。此外，作為實(shí)例，反向PCR允許獲取未知序列，所述序列側(cè)接本文中所公開的多核苷酸序列，從基于已知區(qū)域的引物起始(Triglia等人，1998, NucleicAcids Resl6, 8186,通過(guò)引用并入本文)。該方法使用若干限制酶，以在基因的已知區(qū)域中產(chǎn)生合適的片段。隨后通過(guò)分子內(nèi)連接環(huán)化該片段，且將其用作PCR模板。從已知區(qū)域設(shè)計(jì)不同引物。為了以物理方式裝配全長(zhǎng)克隆，可利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，ColdSpring Harbor Press, 1987)。當(dāng)從特定物種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，有益地用源自該物種的一個(gè)或多個(gè)序列轉(zhuǎn)化這樣的植物。所述益處可以是，減少公眾對(duì)于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因有機(jī)體中的跨物種轉(zhuǎn)化的關(guān)注。另夕卜，當(dāng)基因減量調(diào)節(jié)是希望的結(jié)果時(shí)，可能必須利用與需要減少其表達(dá)的植物中的序列相同(或至少高度相似)的序列。尤其出于這些原因，希望能夠在若干不同植物物種中鑒別及分離特定基因的直系同源物。變體(包括直系同源物)可通過(guò)所述方法來(lái)鑒別。鑒別變體的方法物理方法

變體多肽可使用基于PCR的方法來(lái)鑒別(Mullis等人編，1994The PolymeraseChain Reaction, Birkhauser)。通常,可用于通過(guò)PCR擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸分子的變體的引物的多核苷酸序列，可以是基于編碼相應(yīng)氨基酸序列的保守區(qū)的序列?；蛘?，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的文庫(kù)篩選法(Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Pres s，1987)。當(dāng)鑒別探針序列的變體時(shí)，通常相對(duì)地降低雜交和/或洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性，直至找到確切序列匹配。也可通過(guò)物理方法鑒別多肽變體，例如使用針對(duì)本發(fā)明多肽產(chǎn)生的抗體篩選表達(dá)文庫(kù)(Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold SpringHarbor Press, 1987),或借助于這樣的抗體鑒別來(lái)自天然來(lái)源的多肽?；谟?jì)算機(jī)的方法通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基于計(jì)算機(jī)的方法，使用公共域序列比對(duì)算法及用于搜尋序列數(shù)據(jù)庫(kù)的序列相似性搜尋工具(公共域數(shù)據(jù)庫(kù)包括Genbank、EMBL> Swiss-Prot、PIR和其它)，也可以鑒別本發(fā)明的變體序列(包括多核苷酸及多肽變體)。關(guān)于在線資源的實(shí)例，參見，例如，Nucleic Acids Res. 29:1-10和11-16，2001。相似性搜尋會(huì)檢索及比對(duì)目標(biāo)序列，以供與待分析的序列(即，查詢序列)進(jìn)行比較。序列比較算法使用計(jì)分矩陣來(lái)為每一比對(duì)指派總分?？捎糜阼b別序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的變體的程序的一個(gè)示例性家族為BLAST程序套件(2. 2. 5 版[2002 年 11 月])，包括 BLASTN, BLASTP、BLASTX、tBLASTN 和 tBLASTX,它們可從(ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/)或國(guó)家生物技術(shù)信息中心(Nationa I Centerfor Biotechno logy Information, NCBI)、國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館(National Library ofMedicine, Building 38A, Room8N805, Bethesda, MD 20894 USA)公開獲得。NCBI 服務(wù)器也提供了使用程序來(lái)篩選許多可公開獲得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)的設(shè)施。BLASTN對(duì)照核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較核苷酸查詢序列。BLASTP對(duì)照蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較氨基酸查詢序列。BLASTX對(duì)照蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較在所有閱讀框架中翻譯的核苷酸查詢序列。tBLASTN對(duì)照核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較在所有閱讀框架中動(dòng)態(tài)翻譯的蛋白查詢序列。tBLASTX對(duì)照核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的六-框架翻譯物比較核苷酸查詢序列的六-框架翻譯物。BLAST程序可以預(yù)設(shè)參數(shù)來(lái)使用，或可視需要改變參數(shù)以改進(jìn)篩選。算法的BLAST家族(包括BLASTN、BLASTP及BLASTX)的應(yīng)用，描述于Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，1997 的出版物中。通過(guò)BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法產(chǎn)生的查詢序列對(duì)一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)序列的“命中”，會(huì)比對(duì)及鑒別序列的相似部分。以相似性程度及序列重疊部分的長(zhǎng)度的順序，排列命中。命中一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)序列，一般表示僅在查詢序列的一小部分序列長(zhǎng)度上具有重疊。BLASTN,BLASTP,BLASTX, tBLASTN 及 tBLASTX 算法也產(chǎn)生比對(duì)的“預(yù)期”值。預(yù)期值(E)指示，當(dāng)搜尋含有隨機(jī)鄰接序列的相同尺寸的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，可“預(yù)期”偶然見到的命中數(shù)目。預(yù)期值系用作判定命中數(shù)據(jù)庫(kù)是否表明真正相似性的有效閾值。例如，指派給多核苷酸命中的0. I的E值解釋為是指，在所篩選數(shù)據(jù)庫(kù)的尺寸的數(shù)據(jù)庫(kù)中，可能預(yù)期在具有相似分?jǐn)?shù)的序列的比對(duì)部分上僅偶然見到0. I匹配。對(duì)于在比對(duì)及匹配部分上具有0. 01或小于0. 01的E值的序列而言，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中偶然匹配的機(jī)率為1%或1%以下。
可以用CLUSTALW(Thompson, J. D.，Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994)CLUSTALff: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrixchoice.Nucleic Acids Research, 22:4673-4680, http://www-igbmc. u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/Top. html)或 T-COFFEE (Cedric Notredame, Desmond G. Higgins, JaapHeringa,T-Coffee:A novel method for fast and accurate multiple sequencealignment, J. Mol. Biol. (2000)302:205-217))，或使用漸進(jìn)成對(duì)比對(duì)的 PILEUP (Feng 和Doolittle, 1987, J. Mol. EvoI. 25, 351)，進(jìn)彳丁一組相關(guān)序列的多重序列比對(duì)?？衫脠D樣識(shí)別軟件應(yīng)用來(lái)找到基序或標(biāo)簽序列。例如，MEME (用于基序引出的多個(gè)Em)在一組序列中找到基序及標(biāo)簽序列，且MAST (基序比對(duì)及搜尋工具)使用這些基序在查詢序列中鑒別相似或相同基序。提供MAST結(jié)果作為與適當(dāng)統(tǒng)計(jì)資料及所找到基序的目視全覽的一系列比對(duì)。在圣地亞哥的加利福尼亞大學(xué)(University of California, SanDiego)開發(fā)出 MEME 和 MAST。PR0SITE (Bairoch 和 Bucher, 1994，Nucleic Acids Res. 22，3583; Hofmann 等人,1999, Nucleic Acids Res. 27，215)是鑒別從基因組或cDNA序列翻譯的未表征蛋白的功能的方法。PR0SITE數(shù)據(jù)庫(kù)(WWW. expasy. org/prosite)含有生物學(xué)顯著圖樣及特性,且被設(shè)計(jì)成使得其可與適當(dāng)計(jì)算工具一起使用，以向已知蛋白家族指派新序列或判定哪個(gè)已知域存在于該序列中(Falquet 等人，2002，Nucleic Acids Res. 30，235)。Prosearch 是可以既定序列圖樣或標(biāo)簽搜尋SWISS-PR0T及EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)的工具。分離多肽的方法本發(fā)明的多肽或用于本發(fā)明方法中的多肽(包括變體多肽)可使用本領(lǐng)域中熟知的肽合成方法來(lái)制備，諸如使用固相技術(shù)進(jìn)行直接肽合成(例如Stewart等人，1969，Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California),或例如使用 Applied Biosystems 431A 妝合成儀(Foster City, California)進(jìn)行自動(dòng)合成。多肽的突變形式也可在所述合成期間產(chǎn)生。本發(fā)明的多肽及變體多肽或用于本發(fā)明方法中的多肽及變體多肽也可使用本領(lǐng)域中熟知的多種技術(shù)(例如 Deutscher 編，1990，Methods in Enzymology,第 182 卷，Guideto Protein Purification)從天然來(lái)源純化。或者，本發(fā)明的多肽及變體多肽或用于本發(fā)明方法中的多肽及變體多肽可在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)，并與細(xì)胞分離，如下文所論述。生產(chǎn)構(gòu)建體及載體的方法本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸序列和/或編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸，且可用于轉(zhuǎn)化例如細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物或植物有機(jī)體。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體意欲包括如本文中所定義的表達(dá)構(gòu)建體。生產(chǎn)及使用遺傳構(gòu)建體及載體的方法是本領(lǐng)域中熟知的，且一般描述于Sambrook 等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版,Cold SpringHarbor Press, 1987 ;Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing, 1987 中。生產(chǎn)包含多核苷酸、構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞的方法本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或載體。 包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體(諸如表達(dá)構(gòu)建體)的宿主細(xì)胞可用于本領(lǐng)域熟知的方法中(例如 Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2版Cold SpringHarbor Press, 1987; Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing, 1987)，用于重組生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。這樣的方法可能包括，在適用于或有助于表達(dá)本發(fā)明的多肽的條件下，在適當(dāng)介質(zhì)中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。隨后，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法(例如 Deutscher 編，1990，Methods in Enzymology,第 182 卷，Guide to ProteinPurification)，可以將表達(dá)的重組多肽(其可以任選地分泌至培養(yǎng)物中)與介質(zhì)、宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基分離。生產(chǎn)包含構(gòu)建體及載體的植物細(xì)胞及植物的方法本發(fā)明另外提供了包含本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的植物細(xì)胞，及修飾成改變本發(fā)明的多核苷酸或多肽或用于本發(fā)明方法中的多核苷酸或多肽的表達(dá)的植物細(xì)胞。包含這樣的細(xì)胞的植物也形成本發(fā)明的一個(gè)方面。用多肽轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物及其部分的方法，參見Draper等人，1988，PlantGenetic 轉(zhuǎn)化 and Gene Expression. A Laboratory Manual二BlackwelI Sci.Pub.Oxford,第 365 頁(yè);Potrykus and Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants.Springer-Verlag, Berlin.；和 Gelvin 等人，1993，Plant Molecular Biol. Manual.Kluwer Acad. Pub. Dordrecht。對(duì)轉(zhuǎn)基因植物(包括轉(zhuǎn)化技術(shù))的綜述，參見Galun和Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, London。植物的遺傳操縱方法可利用許多植物轉(zhuǎn)化策略(例如，Birch,1997，Ann RevPl ant Phys Plant MolBiol, 48，297，Hellens RP,等人(2000)Plant Mol Biol 42:819-32，Hellens R等人PlantMeth 1:13)。例如，策略可設(shè)計(jì)成增加多核苷酸/多肽在通常表達(dá)所述多核苷酸/多肽的植物細(xì)胞、器官中和/或在特定發(fā)育階段的表達(dá)，或在通常不表達(dá)所述多核苷酸/多肽的細(xì)胞、組織、器官中和/或在特定發(fā)育階段異位表達(dá)所述多核苷酸/多肽。表達(dá)的多核苷酸/多肽可源自待轉(zhuǎn)化的植物物種，或可源自不同植物物種。轉(zhuǎn)化策略可設(shè)計(jì)成減少多核苷酸/多肽在通常表達(dá)所述多核苷酸/多肽的植物細(xì)胞、組織、器官中或在特定發(fā)育階段的表達(dá)。這樣的策略稱為基因沉默策略。用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)基因的遺傳構(gòu)建體通常包括用于驅(qū)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)克隆的多核苷酸的表達(dá)的啟動(dòng)子，終止子，及用于檢測(cè)遺傳構(gòu)建體在轉(zhuǎn)化植物中的存在的選擇標(biāo)記序列。適用于本發(fā)明的構(gòu)建體中的啟動(dòng)子在單子葉植物或雙子葉植物的細(xì)胞、組織或器官中具有功能，且包括細(xì)胞特異性的、組織特異性的及器官特異性的啟動(dòng)子、細(xì)胞周期特異性的啟動(dòng)子、時(shí)間啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、在大多數(shù)植物組織中具有活性的組成型啟動(dòng)子、及重組啟動(dòng)子。在必要時(shí)，啟動(dòng)子的選擇將取決于克隆的多核苷酸的時(shí)間及空間表達(dá)。啟動(dòng)子可為通常與目標(biāo)轉(zhuǎn)基因有關(guān)的啟動(dòng)子，或源自其它植物、病毒及植物病原性細(xì)菌及真菌的基因的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)就能夠選出適用于使用包含本發(fā)明的多核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體改良及調(diào)節(jié)植物特性的啟動(dòng)子。組成型植物啟動(dòng)子的實(shí)例包括CaMV 35S啟動(dòng)子、膽脂堿合酶啟動(dòng)子及章魚堿合酶啟動(dòng)子、及來(lái)自玉蜀黍的Ubil啟動(dòng)子。在特定組織中具有活性的植物啟動(dòng)子，會(huì)對(duì)內(nèi)部發(fā)育信號(hào)或外部非生物的或生物的應(yīng)激做出響應(yīng)，這描述于科學(xué)文獻(xiàn)中。示例性的啟動(dòng)子描述于例如WO 02/00894中，該文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文中。常用于植物轉(zhuǎn)化遺傳構(gòu)建體中的示例性的終止子包括，例如，花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35S終止子、根瘤土壤桿菌膽脂堿合酶或章魚堿合酶終止子、玉蜀黍zein基因終止子、水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子及馬鈴薯(Solanum tuberosum) PI-II終止子。常用于植物轉(zhuǎn)化中的選擇標(biāo)記包括賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(NPT II)、賦予壯觀霉素及鏈霉素抗性的aadA基因、賦予Ignite (AgrEvo)及Basta(Hoechst)抗性的草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(bar基因)及賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)o也預(yù)見到遺傳構(gòu)建體的應(yīng)用，所述遺傳構(gòu)建體包含可用于植物及植物組織中的啟動(dòng)子表達(dá)分析的報(bào)告基因(表達(dá)對(duì)于宿主而言外來(lái)的活性、通常為酶活性和/或可見信號(hào)(例如熒光素酶、⑶S、GFP)的編碼序列)。報(bào)告基因文獻(xiàn)論述于Herrera-Estrella等人，1993，Nature 303,209,和 Schrott,1995，見Gene Transfer to Plants(Potrykus, T. , Spangenberg 編)Springer Verlag. Berline,第 325-336 頁(yè)。下面是公開了可用于遺傳轉(zhuǎn)化以下植物物種的遺傳轉(zhuǎn)化方案的代表性出版物稻米(Alam 等人，1999，Plant Cell Rep. 18,572)、蘋果(Yao 等人，1995，PlantCell Reports 14，407-412)、玉米(美國(guó)專利第 5，177，010 號(hào)及第 5，981，840 號(hào))、小麥(Ortiz 等人，1996，Plant Cell Rep. 15，1996，877)、西紅柿(美國(guó)專利第 5，159，135 號(hào))、馬鈴薯(Kumar 等人,1996Plant J. 9, :821 )、木薯(Li 等人,1996Nat. Biotechnology14,736)、萵苣(Michelmore 等人，1987，Plant Cell Rep. 6，439)、煙草(Horsch 等人，1985，Science 227，1229)、棉花(美國(guó)專利第 5，846，797 號(hào)及第 5，004，863 號(hào))、草類(美國(guó)專利第5，187，073號(hào)及第6. 020，539號(hào))、胡椒薄荷(Niu等人，1998，PlantCell Rep. 17, 165)、橘類植物(Pena 等人,1995, Plant Sci. 104, 183)、香菜(Krens 等A, 1997, Plant Cell Rep, 17，39)、香蕉(美國(guó)專利第5，792，935號(hào))、大豆(美國(guó)專利第5,416,011 號(hào)、第 5，569,834 號(hào)、第 5, 824, 877 號(hào)、第 5，563, 04455 號(hào)及第 5，968，830)、菠蘿(美國(guó)專利第5，952，543號(hào))、楊樹(美國(guó)專利第4，795，855號(hào))、單子葉統(tǒng)稱(美國(guó)專利第5，591,616號(hào)及第6,037, 522號(hào))、蕓苔屬(美國(guó)專利第5，188,958號(hào)、第5，463，174號(hào)及第 5, 750, 871 號(hào))、谷類(美國(guó)專利第 6, 074, 877 號(hào))、梨(Matsuda 等人，2005，Plant CellRep. 24 (I) :45-51)、李屬(Ramesh 等人，2006Plant Cell Rep. 25 (8) :821-8 ;Song 及Sink 2005Plant Cell Rep. 2006; 25 (2) :117-23 ；Gonzalez Padilla 等人，2003PlantCell Rep. 22 (I) :38-45)、草莓(Oosumi 等人，2006Planta. 223 (6) :1219-30 ；Folta等人,2006Planta Apr 14;PMID: 16614818)、玫瑰(Li 等人,2003)、樹莓(Graham 等人，1995Methods Mol Biol. 1995;44:129-33)、西紅柿(Dan 等人，2006，Plant CellReports V25:432-441 )、蘋果(Yao 等人，1995，Plant Cell R印 14，407-412)、芥花(大油菜(Brassica napus L. ) (Cardoza 及 Stewart, 2006Methods Mol Biol. 343:257-66)、紅花(Orlikowska 等人，1995，Plant Cell Tissue and Organ Cul ture 40:85-91)、黑麥草(Altpeter 等人，2004Developments in Plant Breeding 11 (7) :255-250)、稻米(Christou等人，1991Nature Biotech. 9:957-962)、玉米(Wang等人，2009In:Handbook ofMaize 第 609-639 頁(yè))及毛花稱猴桃(Actinidia eriantha) (Wang 等人，2006，Plant CellRep. 25，5:425-31)。本發(fā)明也涵蓋其它物種的轉(zhuǎn)化。合適的方法及方案可獲自科學(xué)文獻(xiàn)中。植物術(shù)語(yǔ)“植物”意欲包括整個(gè)植物，植物的任何部分，植物的種子、果實(shí)、繁殖體及子 代。術(shù)語(yǔ)“繁殖體”是指植物中可用于繁殖或增殖的任何部分，其為有性或無(wú)性的，包括種子及插枝。可培養(yǎng)本發(fā)明的植物，并自交或與不同植物品系雜交，且可鑒別具有希望的表型特征的所得雜種?？膳囵B(yǎng)兩代及兩代以上，以確保主題表型特征穩(wěn)定地維持及繼承。由這樣的標(biāo)準(zhǔn)育種方法得到的植物，也形成本發(fā)明的一個(gè)方面?？s寫油質(zhì)蛋白(或Ole) _0-0是指不含經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白。油質(zhì)蛋白(或01e)_l_l是指在每個(gè)親水臂中均具有一個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白。油質(zhì)蛋白(或01e)_l_3是指在N端親水臂中具有一個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸且在C端親水臂中具有三個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白。油質(zhì)蛋白(或01e)_3_l是指在N端親水臂中具有三個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸且在C端親水臂中具有一個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白。油質(zhì)蛋白(或01e)_3_3是指在N端親水臂中具有三個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸且在C端親水臂中具有三個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白。油質(zhì)蛋白(或01e)_5_6是指在N端親水臂中具有五個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸且在C端親水臂中具有六個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白。油質(zhì)蛋白(或01e)_6_7是指在N端親水臂中具有六個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸且在C端親水臂中具有七個(gè)經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白。


圖I顯示了油質(zhì)蛋白_0-0及DGATl (S205A)構(gòu)建體的序列。CaMV35為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。attBI為GATEWAY 重組位點(diǎn)。UBQ10為來(lái)自擬南芥UBQ10基因的內(nèi)含子。OCS終止子為章魚堿合酶終止子。
圖2顯示了轉(zhuǎn)化進(jìn)擬南芥中的油質(zhì)蛋白_1_1及DGATl (S205A)構(gòu)建體排列。圖3顯示了油質(zhì)蛋白_1_3及DGATl (S205A)構(gòu)建體的序列。CaMV35為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。attB I為GATEWAY 重組位點(diǎn)。UBQlO為來(lái)自擬南芥UBQlO基因的內(nèi)含子。OCS終止子為章魚堿合酶終止子。圖4顯示了油質(zhì)蛋白_3_1及DGATl (S205A)構(gòu)建體。CaMV35為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。attB I為GATEWAY 重組位點(diǎn)。UBQlO為來(lái)自擬南芥UBQlO基因的內(nèi)含子。OCS終止子為章魚堿合酶終止子。圖5顯示了油質(zhì)蛋白_3-3及DGATl (S205A)構(gòu)建體。CaMV35為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。attB I為GATEWAY 重組位點(diǎn)。UBQlO為來(lái)自擬南芥UBQlO基因的內(nèi)含子。OCS、終止子為章魚堿合酶終止子。圖6顯示了用于轉(zhuǎn)化植物的構(gòu)建體pRShl的圖譜。該圖譜顯示了油質(zhì)蛋白的排列，其中人工引入的半胱氨酸(在此情況下01eo_3-3)在CaMV35s啟動(dòng)子的控制下，以及擬南芥DGATl (S205A)也在CaMV35s啟動(dòng)子的控制下。其它油質(zhì)蛋白序列及TAG合成酶序列當(dāng)然可分別取代01eo_3-3及DGATI。圖7顯示了抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體的斑點(diǎn)印跡比較，所述抗體結(jié)合至含有及不含經(jīng)工程改造的半胱氨酸殘基的經(jīng)純化重組芝麻種子油質(zhì)蛋白上。圖8顯示了在AOB中檢測(cè)大腸桿菌表達(dá)的油質(zhì)蛋白半胱氨酸蛋白的免疫印跡分析。將等體積的A0B(7. 5iiL，包括2XSDS裝載染料，不含還原劑)加載于每個(gè)泳道上。GSSG的mM濃度在各泳道上方指示。圖9 顯示了大腸桿菌表達(dá)的 01e-0-0、01e-l_l 及 Ole-3-3 的 SDS 及 SDS-UREAPAGE/免疫印跡分析。在還原劑(DTT及3-ME)或氧化劑(GSSG)存在及不存在下，從包涵體(IB)及人造油體(AOB)制備樣品，其中將等量的蛋白加載于相鄰泳道上。圖10顯示了在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下表達(dá)DGATl (S205A)及芝麻油質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中的油質(zhì)蛋白(01eo_0-0、01eo_l-3、01eo_3_l和01eo_3_3、SEQ ID NO11-20)積聚的免疫印跡分析。圖11顯示了在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下表達(dá)DGAT1(S205A)及芝麻油質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥的油體中的油質(zhì)蛋白(01eo_0-0、01eo_l-3、01eo_3-l及01eo_3-3，SEQ ID NO11-20)積聚的免疫印跡分析。在氧化劑存在下(+ )寡聚油質(zhì)蛋白條帶(二聚的及三聚的)的出現(xiàn)，指示二硫鍵能夠在天然油體的外部形成。圖12顯示了在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下表達(dá)DGATl (S205A)及芝麻油質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉中的油質(zhì)蛋白(01eo_0-0、01eo_l-3、01eo_3_l及01eo_3_3，SEQ ID NO11-20)積聚的免疫印跡分析。圖13顯示了在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬葉中的重組油質(zhì)蛋白積聚(黑色箭頭)的免疫印跡。圖14顯示了 FAMES GC/MS結(jié)果，所述結(jié)果證實(shí)了額外脂質(zhì)(黑色箭頭)在過(guò)度表達(dá)DGATl (S205A)及01e_3，3的擬南芥屬葉中積聚。圖15顯示了含有DGATl (S205A)及01e_3，3的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬的野生型及獨(dú)立系(independent line)的總?cè)~脂質(zhì)特性的GC/MS結(jié)果?；疑^指示內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品。黑色箭頭指示額外中性脂質(zhì)(蠟酯、固醇酯及TAG)?？招募^展現(xiàn)三個(gè)系(41S、18A及47C)，它們與野生型(及系50A)相比在其葉中積聚大量中性脂質(zhì)。
圖16顯示了 GC/MS結(jié)果，所述結(jié)果表明野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥屬(含有DGATl(5205八)及016_3，3)在發(fā)芽后2、3、4和5周的總TAG特性。黑色箭頭指示在轉(zhuǎn)基因葉中發(fā)現(xiàn)、而在非野生型葉中未發(fā)現(xiàn)的額外TAG。圖17顯示了 FAMES GC/MS結(jié)果，所述結(jié)果表明野生型及轉(zhuǎn)基因白三葉草(含有DGATl (S205A)及01e_3, 3)的總?cè)~脂質(zhì)特性。圖18顯示了 FAMES GC/MS結(jié)果，所述結(jié)果表明野生型及轉(zhuǎn)基因白三葉草(含有DGATl (S205A)及 01e_3，3)的 C18:l 及 C18:2 葉脂質(zhì)特性。實(shí)施例現(xiàn)在將參考以下非限制性實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例I :制造兔抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體
生產(chǎn)兔抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體在大腸桿菌中表達(dá)含有C端His標(biāo)簽的全長(zhǎng)芝麻種子油質(zhì)蛋白(核苷酸序列顯示于SEQ ID NO: I中)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備包涵體。將包涵體溶解于結(jié)合緩沖液(IOOmM磷酸鹽緩沖液pH8.0、500mM NaCl、8M尿素和IOmM咪唑)中，并加載到含有平衡的離子金屬親和色譜法(IMAC) Ni瓊脂糖(Invitrogen)的柱上。通過(guò)用6體積的洗漆緩沖液(IOOmM磷酸鹽緩沖液pH8.0、500mM NaCl、6M尿素和50mM咪唑)洗滌，從所述柱去除未結(jié)合的蛋白。在I體積的洗脫緩沖液(IOOmM磷酸鹽緩沖液pH8. 0、500mM NaCl、6M尿素和250mM咪唑)等分試樣中，洗脫蛋白。通過(guò)SDS-PAGE/考馬斯染色，分析洗脫的級(jí)分，并使用布拉德福德氏試驗(yàn)測(cè)量蛋白濃度。將265iig IMAC-純化的重組油質(zhì)蛋白蛋白與等量弗氏完全佐劑混合，直至0. 5mL的終體積。在收集預(yù)采血之后，將第一注射液施用進(jìn)兔的頸后及肩部區(qū)域的多個(gè)部位中。在首次注射之后3周及7周，遞送含有77 y g經(jīng)純化油質(zhì)蛋白的加強(qiáng)注射，且在第9周取出約3mL測(cè)試血，以供初步分析。通過(guò)添加0. 25%v/v苯酚及0. 01%v/v硫柳汞來(lái)保存血清，將所述血清分成200 u L等分試樣在-20°C儲(chǔ)存。通過(guò)免疫印跡，評(píng)估兔抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體的敏感性，表明可以在1/2,000的抗體稀釋度定期檢測(cè)0. 25ng芝麻種子油質(zhì)蛋白(圖7)。實(shí)施例2 :含有一個(gè)或多個(gè)人工引入的半胱氨酸殘基的改良油質(zhì)蛋白的設(shè)計(jì)和大腸桿菌表達(dá)用于在大腸桿菌中表達(dá)的構(gòu)建體設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)了許多改良油質(zhì)蛋白構(gòu)建體，以供在大腸桿菌中表達(dá)。這些構(gòu)建體在N端及C端親水臂上含有I或3個(gè)半胱氨酸殘基。所述構(gòu)建體是基于來(lái)自不含半胱氨酸殘基的芝麻種子油質(zhì)蛋白(GenBank克隆AF091840)的核苷酸序列及翻譯的多肽序列(SEQ ID NO: 16)。使用經(jīng)工程改造的Ndel/Xhol位點(diǎn)，將所有克隆亞克隆進(jìn)pET29b中。此外，將ProTrp編碼序列添加至C端親水臂的3’末端的編碼區(qū)上，以模仿由先前經(jīng)Peng等人(2006) Stability enhancement of native and artificial oil bodies by genipincrosslink (臺(tái)灣專利I 250466)工程改造的NcoI位點(diǎn)所編碼的氨基酸殘基。將本文中描述的經(jīng)突變以在N端及C端親水區(qū)中包括半胱氨酸殘基的油質(zhì)蛋白-半胱氨酸蛋白稱為 01e-l-l、01e-l-3、01e-3-l 和 01e_3_3(分別為 SEQ IDNO 2、3、4 及5)，其中第一個(gè)及第二個(gè)數(shù)字分別對(duì)應(yīng)N端及C端中的二硫鍵數(shù)目。使用不含半胱氨酸殘基的標(biāo)準(zhǔn)油質(zhì)蛋白作為對(duì)照，且稱為Ole-O-O (SEQ IDNO I)。
用半胱氨酸置換預(yù)測(cè)存在于油體表面上的帶電殘基，并列舉如下。N 端單個(gè)半胱氨酸(Ole-1-x) Glu3CysN 端三個(gè)半胱;氛酸(Ole-3-x) Glu3Cys Argl2Cys Gln23CysC 端單個(gè)半胱氨酸(Ole-x-1) Glnl37CysC 端三個(gè)半胱氨酸(01e-x_3)Glnll2Cys Lysl23Cys Glnl37Cys將構(gòu)建體設(shè)計(jì)成，經(jīng)由Ncol/Xhol消化及連接，可以相對(duì)簡(jiǎn)單地從GENEART提供的主鏈(pCR4Blunt-T0P0)亞克隆進(jìn)pET29b(Novogen)中。這將油質(zhì)蛋白編碼序列置于pET29N端S 標(biāo)簽融合體的下游及C端His標(biāo)簽的上游(圖1-5及SEQ ID No 1_10)。所用油質(zhì)蛋白及改良油質(zhì)蛋白序列總結(jié)在序列表的概述中。
含有至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化通過(guò)SDS-PAGE/考馬斯亮藍(lán)染色及SDS-PAGE/免疫印跡分析，使用針對(duì)芝麻種子油質(zhì)蛋白產(chǎn)生的抗體，評(píng)估重組芝麻種子油質(zhì)蛋白(含有及不含經(jīng)工程改造的半胱氨酸)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)(描述于實(shí)施例I中)。于新鮮接種的IOmL大腸桿菌培養(yǎng)物(BL2IRosetta-Gami )中誘導(dǎo)重組改良油質(zhì)蛋白的表達(dá)，所述大腸桿菌培養(yǎng)物含有在PET29表達(dá)載體中的油質(zhì)蛋白(含有或不含經(jīng)工程改造的半胱氨酸殘基)編碼序列。使培養(yǎng)物在37°C及220rpm下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD600O. 5-0. 7);通過(guò)添加IPTG至ImM最終濃度，誘導(dǎo)表達(dá)。在37°C及220rpm下溫育誘導(dǎo)的培養(yǎng)物另外2-3小時(shí)。鑒于改良油質(zhì)蛋白的特性，申請(qǐng)人并不試圖以可溶性形式表達(dá)它，而寧愿選擇從包涵體中提取它。將培養(yǎng)物的等分試樣(ImL)轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管中，并通過(guò)離心(在4°C，2655 X g，5分鐘)使細(xì)胞沉淀。以5mL/g濕細(xì)胞沉淀物,將沉淀的細(xì)胞重新懸浮于BllgBllS ter 試劑(Merck)中，添加DNA酶至40 u g/mL,并在旋轉(zhuǎn)器上溫和地混合30分鐘，然后在4°C、在8000g離心10分鐘。用上述BugBus ter 及DNA酶再處理所得細(xì)胞沉淀物。通過(guò)在4°C、在8000g離心10分鐘，將剩余的可溶性蛋白及懸浮的細(xì)胞碎片與不溶性的包涵體分離。使用由D’ Andrea等人(2007)改編的規(guī)程,從所述包涵體進(jìn)一步純化重組油質(zhì)蛋白。簡(jiǎn)而言之通過(guò)再懸浮于200mM碳酸鈉緩沖液pHll (5mL/g原始細(xì)胞沉淀物)中，洗滌包涵體制品，并通過(guò)在4°C、在8000Xg離心10分鐘,使其再沉淀。使洗漆過(guò)的包涵體沉淀物重新懸浮5mL 200mM碳酸鈉緩沖液(每克沉淀物)中，并加入9體積的新鮮制備的氯仿甲醇混合物(5:4v/v)中，產(chǎn)生5:4:1(氯仿甲醇緩沖液)的最終比率。將該懸浮液溫和地混合5分鐘，形成乳狀單相混合物；將其在4°C、在10，OOOxg離心10分鐘，將含有改良油質(zhì)蛋白的上清液小心地與沉淀物分離，并轉(zhuǎn)移至新試管中。在氮?dú)饬飨赂稍锷锨逡旱牡确衷嚇?，并將蛋白再溶解?M尿素中，通過(guò)y Qubit (Invitrogen)進(jìn)行定量。實(shí)施例3 :抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體用于結(jié)合含有人工引入的半胱氨酸的芝麻種子油質(zhì)蛋白的用途使用斑點(diǎn)印跡法來(lái)比較實(shí)施例I中所述的抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體(Ab)的結(jié)合不含半胱氨酸的油質(zhì)蛋白相對(duì)于結(jié)合含有半胱氨酸的油質(zhì)蛋白(實(shí)施例2中所述)的能力。將純化的01e-0-0、01e-l-3及Ole-3-l以12至0. 25ng的一系列稀釋液印跡在預(yù)平衡的Hybond-P PVDF轉(zhuǎn)移膜上。以1:2000，與作為第一抗體的抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體一起溫育它。然后，與適當(dāng)?shù)牡诙贵w一起溫育所述印跡，并通過(guò)化學(xué)發(fā)光顯影(圖7)。結(jié)果表明，在免疫印跡上，抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體對(duì)不含半胱氨酸殘基的油質(zhì)蛋白的敏感性比含半胱氨酸殘基的油質(zhì)蛋白的敏感性高至多一個(gè)數(shù)量級(jí)。由于具有不同敏感性，必須在供免疫印跡分析的凝膠上加載不同量的重組蛋白。盡管存在不均勻泳道加載，仍可能以單體形式與寡聚形式之間的相對(duì)分布的方式，比較泳道之間的不同油質(zhì)蛋白。實(shí)施例4 :用大腸桿菌表達(dá)的含有至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸且改變交聯(lián)度的改良油質(zhì)蛋白制造人造油體人造油體的制備隨后通過(guò)干燥實(shí)施例3中所述的上清液的等分試樣(經(jīng)計(jì)算含有150 ii g或Img的重組油質(zhì)蛋白)，制備人造油體(A0B)。生成AOB的過(guò)程包括，組合PL、TAG及重組油質(zhì)蛋白/改良油質(zhì)蛋白。在強(qiáng)離液劑不存在下，從純化的級(jí)分分離單個(gè)重組油質(zhì)蛋白所需的斷裂力，包括聲處理與冷卻的數(shù)個(gè)交替循環(huán)。這如下實(shí)現(xiàn)將150 ii g及Img油質(zhì)蛋白/改良油質(zhì)蛋白樣品溶解于20 ii L含有 150 u g PL (Sigma,目錄號(hào)P3644)的氯仿中，并與60 u L純化的芝麻種子油(Tzen及Huang1992)及940 u L AOB緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液pH8. OUOOmM NaCl)混合。隨后聲處理全部混合物 3 次，各 30 秒(Sonics & Materials Vibra-Cell VC600, 600W, 20kHz ; 1/8"楔形微尖端探針，功率設(shè)定#3)。申請(qǐng)人:還發(fā)現(xiàn)，純化程序可成功地放大，且當(dāng)50g細(xì)胞沉淀物用作原料時(shí)，必須用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器替代氮?dú)饬?，以去除氯仿及大部分甲醇。此時(shí)，大部分油質(zhì)蛋白/改良油質(zhì)蛋白從共沸溶劑中沈淀出，并通過(guò)在12，OOOg離心10分鐘來(lái)分離。將包涵體懸浮于ImL AOB緩沖液II (50mM磷酸鈉pH8. OUOOmM NaCl、20mMP -巰基乙醇、IOmM DTT和5%[v/v]芝麻油)中，隨后聲處理4次。通過(guò)在12，OOOrpm離心10分鐘，濃縮A0B，這導(dǎo)致覆蓋水性級(jí)分的AOB懸浮液的形成。通過(guò)移液器去除下層水性級(jí)分，并通過(guò)在ImL AOB緩沖液III (50mM磷酸鈉pH8. OUOOmM NaCl)中溫和地?cái)噭?dòng)，洗滌剩余的AOB (以去除可溶性蛋白及還原劑)。洗滌之后，通過(guò)離心再濃縮A0B，且去除下層水性級(jí)分，隨后通過(guò)在AOB緩沖液IV (50mM磷酸鈉緩沖液pH8. O、IOOmM NaClUmM GSSG)中渦旋，使其再懸浮，且在4°C保存AOB以供進(jìn)一步分析。成功地在大腸桿菌包涵體中表達(dá)及定位重組01e-0-0、及油質(zhì)蛋白-半胱氨酸的所有變體(圖9)。Ole-O-O主要以單體形式存在(在包涵體以及AOB中);其比20kDa分子量標(biāo)志物更快地分層遷移(在還原及非還原SDS及SDS-UREA PAGE中)。也存在兩個(gè)約35及36kDa的更慢遷移的免疫反應(yīng)帶，它們可能對(duì)應(yīng)二聚油質(zhì)蛋白的兩個(gè)形式。雖然未預(yù)測(cè)到Ole-O-O含有任何半胱氨酸殘基，但兩個(gè)可見二聚體的總強(qiáng)度及比率受還原劑(3 -MEi5%的樣品加載緩沖液及IOmMDTT)存在的影響。在包涵體中，Ole-I-I的主要形式為單體。似乎僅存在一個(gè)二聚形式，且此形式不受還原劑或尿素的影響。來(lái)自AOB的Ole-I-I (在還原劑存在下且隨后在氧化劑存在下產(chǎn)生)表現(xiàn)出二聚體與單體的比率大幅提高以及三聚、四聚及可能的五聚寡聚體(這些寡聚體的電泳聚焦在SDS-UREA凝膠中顯著改善)的形成。GSSG的去除及還原劑再引入AOB中，會(huì)導(dǎo)致僅單體與二聚體以與在包涵體中所見相似的比例存在。用Ole-I-I產(chǎn)生的AOB (在還原劑及GSSG均不存在下)表明存在幾乎相等部分的單體及二聚體及小量三聚體，這指示，形成AOB的條件具有一定還原電位。GSSG的后續(xù)添加會(huì)導(dǎo)致寡聚部分增加以及四聚形式的出現(xiàn)。雖然單體為包涵體中01e-3-3的主要形式，但也存在相當(dāng)高百分率的多種寡聚形式。寡聚體的比例在添加還原劑之后下降至小范圍，且在添加還原劑及離液劑之后稍微增力口。當(dāng)從AOB中提取重組蛋白時(shí)，比三聚體更大的Ole-3-3寡聚形式較差地溶解。GSSG的添加且在還原劑及離液劑不存在下，會(huì)促進(jìn)大寡聚形式的生成，這些寡聚形式中的一部分未能進(jìn)入濃縮膠中?？傊?，這些結(jié)果表明，在AOB上， Ole-3-3高度交聯(lián)，且交聯(lián)位置與從包涵體中回收的01e-3-3相比更多變。這提示，盡管預(yù)存在相當(dāng)多的交聯(lián)(在包涵體內(nèi))，但在AOB上，01e-3-3可利用大量用于交聯(lián)的潛在配偶體。類似地，對(duì)于01e-l-3及01e_3_l，當(dāng)在I個(gè)或2個(gè)親水區(qū)上存在一個(gè)以上半胱氨酸時(shí)，交聯(lián)物質(zhì)的數(shù)量增加(圖8及9)?？深A(yù)期，在非還原SDS-PAGE中，含有相同數(shù)目的油質(zhì)蛋白但具有在不同位置的二硫鍵的寡聚體將彼此不同地遷移。實(shí)際上，這可從圖8中看出，該圖中數(shù)據(jù)表明，油質(zhì)蛋白臂的位置相對(duì)于彼此在油體上的不同位置處。例如，Ole-I-I每臂僅可形成一個(gè)二硫鍵，且該二硫鍵必須在相同位置處形成，因?yàn)槿齻€(gè)半胱氨酸的存在能夠使得一個(gè)以上二硫鍵形成，但其也使得二硫鍵以不同程度的親水臂重疊以及多個(gè)油質(zhì)蛋白結(jié)合至同一臂上來(lái)形成(圖8及9)。SDS及還原劑(DTT及P _ME)的添加會(huì)減少寡聚復(fù)合物的數(shù)量(圖9)。SDS及尿素的添加會(huì)導(dǎo)致與單獨(dú)的SDS類似的圖樣，例外是，先前溶解的多種二聚形式一致地遷移，且三聚及四聚形式似乎呈現(xiàn)更高豐度，大概因?yàn)樗鼈円惨詥螏问竭w移，由此相應(yīng)地提高強(qiáng)度(圖9)。相比而言，SDS、還原劑及尿素的存在導(dǎo)致形成更少的Ole-I-I及01e-l-3寡聚形式，而Ole-3-l或01e-3-3則不然(圖9)。在01e_3_l及01e_3_3的情況下，尿素似乎不會(huì)使二硫化油質(zhì)蛋白完全變性，且可能實(shí)際上防止二硫鍵完全還原。實(shí)情可為，在包涵體生成期間形成這些鍵(需視還原及非還原包涵體制品而定)。此外，在經(jīng)工程改造的半胱氨酸殘基不存在下形成的二聚油質(zhì)蛋白的存在(圖8及9)表明，一些低聚反應(yīng)歸因于其它類型的吸引，例如強(qiáng)疏水鍵合，其不會(huì)被SDS完全破壞，但可被SDS及尿素的組合幾乎完全破壞(圖8及9)?？扇缦略u(píng)估在油質(zhì)蛋白肽中增加潛在交聯(lián)位點(diǎn)的數(shù)量對(duì)AOB完整性及乳劑穩(wěn)定性的影響。AOB完整性的定量測(cè)定使用吸光度(0D_)、使用血球計(jì)數(shù)器的AOB直接計(jì)數(shù)、或通過(guò)顯微術(shù)目測(cè)評(píng)價(jià)聚結(jié)來(lái)評(píng)估AOB穩(wěn)定性及完整性，被證實(shí)具有高度可變性，且尤其受以下影響預(yù)抽樣攪動(dòng)的程度；取出的樣品的數(shù)量；在顯微鏡下保持的時(shí)間。為了避免此可變性，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)出一種定量在多種處理期間從AOB釋放至周圍介質(zhì)中的TAG的量的簡(jiǎn)單方法，作為比較完整性的手段。在250iiL GC玻璃插入管中，使用AOB緩沖液(含有蛋白酶K[PNK]，適當(dāng)時(shí)，在OB或AOB樣品中以I: I的PNK :總蛋白比率)，將基本上等量(基于TAG的FAMES-GC/MS估計(jì)及蛋白的布拉德福德測(cè)定)的AOB制品補(bǔ)足至200 UL的總體積，并用塑料蓋覆蓋。在處理(高溫或暴露于PNK)之后,將15 ii L魚油(Vi tamax , Australia)添加至樣品中，并通過(guò)渦旋進(jìn)行混合，然后在5，200g離心I分鐘。添加魚油之后進(jìn)行渦旋,能夠使已經(jīng)從AOB漏出的任何TAG與添加的魚油混合，且通過(guò)短暫離心而漂浮。取出4 UL油相樣品，并進(jìn)行脂肪酸甲基酯化(FAME)，隨后通過(guò)GC-MS (Shimadzu型號(hào)，裝備有50mQC2/BPX70-0. 25GC毛細(xì)柱(SGE),如由Browse等人(1986)所描述)來(lái)分析。在不添加魚油的情況下，已經(jīng)從AOB漏出的TAG的量極少，以致甚至在離心之后也不能形成可取樣的可見層，在此情況下，最大體積將為L(zhǎng)。魚油與芝麻油的極其不同的脂質(zhì)特性，使我們能夠容易地區(qū)分漏出的TAG與添加的TAG。使用內(nèi)部C15:0及C17:0標(biāo)準(zhǔn)物，申請(qǐng)人可計(jì)算在處理后回收的C18:2(在芝麻種子油中的主要脂質(zhì))的絕對(duì)量。在高溫下測(cè)定AOB完整性及乳劑穩(wěn)定性水包油乳劑在高溫下的穩(wěn)定性較低；因此，研究具有變化數(shù)量的引入半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白在高溫下是否影響AOB完整性是有意義的。為了實(shí)現(xiàn)此目的，申請(qǐng)人測(cè)定了OB及AOB (含有不同的油質(zhì)蛋白)在95°C在磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液pH8、IOOmMNaCl)中的完整性(使用上述方法)。加熱AOB 2小時(shí)。如上所述測(cè)定完整性。
可如下評(píng)估更高比率的交聯(lián)油質(zhì)蛋白TAG對(duì)瘤胃液中AOB的穩(wěn)定性的影響。測(cè)定在瘤胃液中的AOB完整性二硫化物的目的之一是，提供一定程度的保護(hù)以免被瘤胃微生物群生物氫化?？扇缦略u(píng)估在瘤胃液中的AOB穩(wěn)定性。將AOB添加至等體積(25 ii L)的瘤胃液中。在39 °C溫育樣品0、15、30、60、120及240分鐘，在溫育結(jié)束時(shí)，添加等體積的加載緩沖液(Invitrogen)，混合，并在70°C加熱10分鐘。通過(guò)SDS-PAGE/免疫印跡，比較15 y L各樣品/加載緩沖液混合物。如上所述測(cè)定完整性。分析在蛋白酶K中的AOB完整性為了研究改良油質(zhì)蛋白在可控的及可重復(fù)的高度降解環(huán)境中的影響，在37°C在含有1:1 (g/g蛋白)蛋白酶K (Invitrogen)的磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液pH8、IOOmMNaCl)中溫育4小時(shí)之后，測(cè)定AOB (含有不同改良油質(zhì)蛋白)的完整性(使用上述方法)。雖然蛋白酶K的最大活性在低于65°C時(shí)實(shí)現(xiàn)，但使用更低的溫度來(lái)減少溫度對(duì)AOB不穩(wěn)定性的影響。如上所述測(cè)定完整性。實(shí)施例5 :含有一個(gè)或多個(gè)人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白的設(shè)計(jì)及在植物中的表達(dá)用于在植物中表達(dá)的構(gòu)建體設(shè)計(jì)申請(qǐng)人:合成了在N端及C端臂中具有不同數(shù)量的半胱氨酸的芝麻種子油質(zhì)蛋白(基于GenBank克隆AF091840)的單個(gè)編碼序列。所述編碼序列側(cè)接5’ NotI位點(diǎn)和3’ NdeI位點(diǎn)。合成了含有以下位點(diǎn)的單獨(dú)受體盒attLl位點(diǎn)、NotI位點(diǎn)和NdeI位點(diǎn)，繼之以nos終止序列、前向CaMV35s啟動(dòng)子、擬南芥DGATl (S205A) (SEQ ID NO 11-20及圖1-5)以及它自身的UBQlO內(nèi)含子、attL2位點(diǎn)。經(jīng)由NotI及NdeI位點(diǎn)，將具有不同數(shù)量的半胱氨酸的芝麻種子油質(zhì)蛋白單個(gè)地轉(zhuǎn)移至受體盒中。隨后，通過(guò)LR重組反應(yīng)，將這些完成的盒中的每一個(gè)轉(zhuǎn)移至植物二元載體pRShl中(圖6 (Winichayakul等人，2008))。這會(huì)將油質(zhì)蛋白置于CaMV35s啟動(dòng)子(已包含于pRShl內(nèi))的下游,且將nos終止子(已包含于pRShl內(nèi))置于擬南芥屬DGATl (S205A)的下游(圖1-5)。優(yōu)化編碼芝麻種子油質(zhì)蛋白(含有半胱氨酸)的核苷酸序列及DGATl以供在擬南芥中表達(dá)，這包括以下方面的優(yōu)化密碼子頻率、GC含量、去除隱蔽剪接位點(diǎn)、去除mRNA不穩(wěn)定性序列、去除潛在聚腺苷酸化識(shí)別位點(diǎn)及添加四核苷酸終止密碼子(Brown 等人，1990 ；Beelman 及 Parker, 1995 ；Rose, 2004 ；Rose 及Beliakoff, 2000 ；Norris 等人，1993)。應(yīng)當(dāng)指出，所用油質(zhì)蛋白序列僅為示例性的的。任何油質(zhì)蛋白或油體固醇蛋白或油體鈣蛋白序列均可經(jīng)工程改造以含有交聯(lián)區(qū)。對(duì)照原始油質(zhì)蛋白翻譯序列的重復(fù)序列，檢查完整ORF的編碼序列(剪接之后)，且發(fā)現(xiàn)在油質(zhì)蛋白編碼區(qū)上是相同的。用含有半胱氨酸的芝麻種子油質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)化擬南芥如先前所述(Scott等人，2007),(使用上述構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化擬南芥變體Columbia,分析T2種子的改良油質(zhì)蛋白，對(duì)含有具有不同數(shù)量半胱氨酸的芝麻種子油質(zhì)蛋白的擬南芥油體進(jìn)行免疫印跡分析?；ㄐ蚪⒎?floral-dip)(Clough, 1998)及花序滴落法(floral-drop)(Martinez-Trujillo, 2004)均用于轉(zhuǎn)化擬南芥屬,其中使用含有二元構(gòu)建體的根瘤土壤桿 菌GV3101。從處理過(guò)的植物收集Tl種子，使其發(fā)芽，并通過(guò)在發(fā)芽后第14天及第21天用Bastaii噴霧來(lái)選擇。移植Basta 抗性Tl植物(分別是含有單一芝麻種子油質(zhì)蛋白及改良油質(zhì)蛋白構(gòu)建體的71、62及23轉(zhuǎn)化體)，使其自體受精(self-fertilise)，結(jié)種子，并收集T2種子。通過(guò)SDS-PAGE/免疫印跡，用抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體分析從Bas ta **抗性擬南芥屬植物提取的等量種子；在大部分樣品中，觀察到適當(dāng)尺寸的重組芝麻種子油質(zhì)蛋白及改良油質(zhì)蛋白(圖10)。對(duì)選定的T2系執(zhí)行DNA印跡分析，以測(cè)定插入位點(diǎn)的數(shù)量。實(shí)施例6 :從擬南芥種子提取及純化具有含有至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白的油體來(lái)自擬南芥種子的粗油體制品從如實(shí)施例5中所述生產(chǎn)的植物種子，如下制備粗OB制品用含有刮勺尖量的沙及750 ii L提取緩沖液(IOmM磷酸鹽緩沖液pH 7. 5，含有600mM蔗糖)的研缽及研杵研磨200mg種子,或使用Wiggenhauser D-130勻衆(zhòng)器在300 u L提取緩沖液中勻衆(zhòng)化25mg種子。添加另外750 u L提取緩沖液，且將研缽中的漿料轉(zhuǎn)移至2mL微量離心管，而在ImL提取緩沖液中沖洗勻漿器尖端，并將此體積添加至勻漿化的種子中。隨后在20，000 Xg離心樣品5分鐘；由此產(chǎn)生沉淀物及水性上清液,所述水性上清液上面被含有完整及破碎油體以及游離TAG的不混溶油層覆蓋。將上覆油層輕輕推向試管的側(cè)邊，丟棄水層及沉淀物。隨后通過(guò)在提取緩沖液中渦旋，使油層從試管的側(cè)邊再懸浮，并置于新的2mL微量離心管中。用提取緩沖液將終體積補(bǔ)足至0. 5mL。來(lái)自擬南芥種子的純化的油體制品，及經(jīng)工程改造油質(zhì)蛋白之間的交聯(lián)半胱氨酸
殘基使用Wiggenhauser D-130勻衆(zhòng)器,在300 ii I提取緩沖液(IOmM磷酸鹽緩沖液pH7. 5,含有600mM鹿糖)中研磨25mg (如實(shí)施例5中所述的轉(zhuǎn)化植物的)擬南芥屬種子。研磨種子直至碾碎，樣品呈現(xiàn)“乳油狀”且起泡，因?yàn)榈矸圩苑N子中釋放出來(lái)。在Iml緩沖液中沖洗勻漿器尖端，并將此體積加入碾碎的種子。制備四批樣品直至此時(shí)，隨后在14，OOOrpm離心5分鐘。使用薄凝膠加載尖，將油層輕輕推向試管的側(cè)邊，且將水層移至新試管中。使用提取緩沖液，從試管的側(cè)邊再懸浮油層，且置于新的2ml試管中。用提取緩沖液將終體積補(bǔ)足至0. 5ml (由試管的側(cè)面讀取)，將樣品分成兩份，并將氧化劑(3mMGSSG)加入一個(gè)試管中，并在室溫下溫育10分鐘。隨后將油體制品添加至等體積的2X凝膠加載緩沖液中，并煮沸5分鐘，然后加載于凝膠上。
在標(biāo)準(zhǔn)凝膠裝備系統(tǒng)(Bio-Rad)上的預(yù)制的NuPAGE Novex 4_12%Bis_Tris Midi凝膠(Invitrogen)上,或在NuPAGE Novex 12%Bis_Tris 梯度凝膠 I. Omm (15 孔，目錄號(hào)NP0343B0X)(含有NuPAGE .MESSDS電泳緩沖液(僅對(duì)于Bis-Tris凝膠)(20X),目錄號(hào)NP0002-02)上,或在手灌Tris-HCl凝膠上,使樣品泳動(dòng)。通過(guò)SafeStain (Invitrogen)染色凝膠，以展現(xiàn)使用iBlot系統(tǒng)(Invitrogen)加載或印跡于硝化纖維素膜上的總蛋白。在各情況下，陰性對(duì)照為從野生型Columbia種子提取的樣品，陽(yáng)性對(duì)照為對(duì)野生型芝麻種子執(zhí)行相同提取方法(但通過(guò)研缽及研杵研磨)。將10 U I每個(gè)樣品及陰性對(duì)照加載于凝膠上，將5 Ul用于陽(yáng)性對(duì)照。在印跡之后，在12. 5%脫脂奶粉于TBST(50mM Tris pH7. 4、IOOmM NaCl,0. 2%吐溫)中的溶液中封閉膜至少I. 5小時(shí)。隨后在TBST中洗滌膜3X5分鐘，然后以1/1000與第一抗體(抗芝麻)一起于TBST中在室溫溫育I小時(shí)。在用TBST洗滌另外3次之后，以1/5000與第二抗體(抗兔)一起在室溫溫育I小時(shí)。洗滌膜另外3次，然后使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)發(fā)光方案，使信號(hào)顯影。
圖11顯示了在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下芝麻種子油質(zhì)蛋白單元在油體上的積聚?？梢钥闯?，發(fā)現(xiàn)重組油質(zhì)蛋白及聚油質(zhì)蛋白在擬南芥的種子中積聚，且正確地靶向油體(圖11)。此外，可以看出，在氧化劑存在下歷時(shí)10分鐘，含有半胱氨酸的重組油質(zhì)蛋白形成交聯(lián)，如在這些樣品中寡聚體出現(xiàn)及單體形式相應(yīng)消失所證實(shí)，而在野生型或非氧化轉(zhuǎn)基因油體中則不然?？扇缦略u(píng)估增加油質(zhì)蛋白肽中的潛在交聯(lián)位點(diǎn)的數(shù)量對(duì)植物中OB完整性及乳劑穩(wěn)定性的影響。OB完整性的定量測(cè)定使用吸光度(0D_)、使用血球計(jì)數(shù)器的AOB直接計(jì)數(shù)、或通過(guò)顯微術(shù)目測(cè)評(píng)價(jià)聚結(jié)來(lái)評(píng)估OB穩(wěn)定性及完整性，被證實(shí)具有高度可變性，且尤其受以下影響預(yù)抽樣攪動(dòng)的程度；取出的樣品的數(shù)量；在顯微鏡下保持的時(shí)間。為了避免此可變性，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)出一種定量在多種處理期間從OB釋放至周圍介質(zhì)中的TAG的量的簡(jiǎn)單方法，作為比較完整性的手段。在250iiL GC玻璃插入管中，使用AOB緩沖液(含有蛋白酶K[PNK]，適當(dāng)時(shí)，在OB樣品中以1:1的PNK :總蛋白比率)，將基本上等量(基于TAG的FAMES-GC/MS估計(jì)及蛋白的布拉德福德測(cè)定)的OB制品補(bǔ)足至200 u L的總體積，并用塑料蓋覆蓋。在處理(高溫或暴露于PNK)之后，將15 il L魚油(V i tamax , Australia)添加至樣品中，并通過(guò)渦旋進(jìn)行混合,然后在5，200g離心I分鐘。添加魚油之后進(jìn)行渦旋,能夠使已經(jīng)從OB漏出的任何TAG與添加的魚油混合，且通過(guò)短暫離心而漂浮。取出L油相樣品，并進(jìn)行脂肪酸甲基酯化(FAME)，隨后通過(guò) GC-MS (Shimadzu 型號(hào)，裝備有 50mQC2/BPX70_0. 25GC 毛細(xì)柱(SGE)，如由 fcowse等人(1986)所描述)來(lái)分析。在不添加魚油的情況下，已經(jīng)從OB漏出的TAG的量極少，以致甚至在離心之后也不能形成可取樣的可見層，在此情況下，最大體積將為6 u L0魚油與芝麻油的極其不同的脂質(zhì)特性，使我們能夠容易地區(qū)分漏出的TAG與添加的TAG。使用內(nèi)部C15:0及C17:0標(biāo)準(zhǔn)物，申請(qǐng)人可計(jì)算在處理后回收的C18:2(在芝麻種子油中的主要脂質(zhì))的絕對(duì)量。在高溫下測(cè)定OB完整性及乳劑穩(wěn)定性水包油乳劑在高溫下的穩(wěn)定性較低；因此，研究具有變化數(shù)量的引入半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白在高溫下是否影響OB和AOB完整性是有意義的。為了實(shí)現(xiàn)此目的，申請(qǐng)人測(cè)定了 OB (含有不同的油質(zhì)蛋白)在95°C在磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液pH8、100mMNaCl)中的完整性(使用上述方法)。加熱AOB 2小時(shí)。如上所述測(cè)定完整性。可如下評(píng)估更高比率的交聯(lián)油質(zhì)蛋白TAG對(duì)瘤胃液中OB的穩(wěn)定性的影響。測(cè)定在瘤胃液中的OB完整性二硫化物的目的之一是，提供一定程度的保護(hù)以免被瘤胃微生物群生物氫化。可如下評(píng)估在瘤胃液中的OB穩(wěn)定性。將OB添加至等體積(25 u L)的瘤胃液中。在39°C溫育樣品0、15、30、60、120及240分鐘，在溫育結(jié)束時(shí)，添加等體積的加載緩沖液(Invitrogen)，混合，并在70°C加熱10分鐘。通過(guò)SDS-PAGE/免疫印跡，比較15 y L各樣品/加載緩沖液混合物。如上所述測(cè)定完整性。分析在蛋白酶K中的OB完整性
為了研究改良油質(zhì)蛋白在可控的及可重復(fù)的高度降解環(huán)境中的影響，在37°C在含有1:1 (g/g蛋白)蛋白酶K (Invitrogen)的磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液pH8、IOOmMNaCl)中溫育4小時(shí)之后，測(cè)定AOB (含有不同改良油質(zhì)蛋白)的完整性(使用上述方法)。雖然蛋白酶K的最大活性在低于65°C時(shí)實(shí)現(xiàn)，但使用更低的溫度來(lái)減少溫度對(duì)OB不穩(wěn)定性的影響。如上所述測(cè)定完整性。實(shí)施例7 :在擬南芥的葉中生產(chǎn)油體為了在營(yíng)養(yǎng)組織中生產(chǎn)油體，必須在這樣的組織(例如葉)中生產(chǎn)三酰基甘油。在植物的營(yíng)養(yǎng)部分中生產(chǎn)三酰基甘油在大多數(shù)植物(包括多年生黑麥草)中，大部分葉脂質(zhì)附著于甘油主鏈上，且作為二?；视痛嬖?。將所述葉脂質(zhì)摻入脂質(zhì)雙層中，葉脂質(zhì)在這里充當(dāng)多個(gè)亞細(xì)胞細(xì)胞器的膜或充當(dāng)細(xì)胞本身的膜。葉中的大部分脂質(zhì)雙層為葉綠體類囊體膜。更小量的葉脂質(zhì)作為葉表皮蠟質(zhì)存在，且甚至更小百分比的葉脂質(zhì)以三酰基甘油(TAG)形式存在。大多數(shù)植物在發(fā)育胚及花粉細(xì)胞中合成及儲(chǔ)存TAG，隨后在所述發(fā)育胚及花粉細(xì)胞中利用TAG來(lái)提供在發(fā)芽及花粉管生長(zhǎng)期間可分解代謝的能量。雙子葉植物可積聚高達(dá)種子重量的約60%的TAG。通常，在主要能量?jī)?chǔ)存形式為碳水化合物(例如淀粉)的單子葉植物種子中，該水平顯著更低。在TAG生物合成中灼唯一關(guān)鍵步驟為最后一步，即第三脂肪酸添加至現(xiàn)存二?；视蜕?，由此產(chǎn)生TAG。在植物中，通過(guò)下述三種酶之一來(lái)執(zhí)行該步驟，所述酶包括酰基輔酶A :二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT1)、不相關(guān)?；o酶A :二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT2)及磷脂二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(Zou等人，1999 ；Bouvier-Nave等人，2000 ；Dahlqvist等人，2000 ；Lardizabal等人，2001)。這些基因中的任一個(gè)的轉(zhuǎn)錄區(qū)在植物的營(yíng)養(yǎng)部分中的過(guò)度表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致在葉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中形成TAG液滴，如以下的過(guò)度表達(dá)所證實(shí)在煙草中的擬南芥屬DGATl (Bouvier-NaW等人，(2000));在酵母及煙草中的油桐樹DGAT2 (Shockey等人，(2006));在擬南芥屬中的擬南芥屬PDAT (Stahl等人，(2004))。在有些情況下，擬南芥屬DGATl的過(guò)度表達(dá)經(jīng)證實(shí)在例如百脈根(Lotusjaponicus)毛根(Bryan等人，2004)及多年生黑麥草葉(Cookson等人，2009)中增加總脂質(zhì)水平，但不一定通過(guò)TAG的積聚來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了證明TAG在這些植物的葉中的積聚，可以比較從這些植物的葉中提取的脂質(zhì)總量與未轉(zhuǎn)化植物或用空二元載體轉(zhuǎn)化的植物的脂質(zhì)總量。確保植物在相同環(huán)境條件下生長(zhǎng)，并且葉樣品在生理學(xué)上是等效的。使用FAMES GC-MS分析，用適當(dāng)?shù)膬?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，可以實(shí)現(xiàn)全部脂質(zhì)提取物的定量(參見Winichayakul等人，2008Delivery ofgrasses with high levels of unsaturated, protected fatty acids. Proceedingsof the New Zealand Grass land Association, 70:211-216)?；蛘?，使用 Folsch 方法(Folsch 等人,1957J. Folsch, M. Lees 及 G. A. Slone-Stanley, Asimple method for thedetermination of total lipid extraction and purification, Journal of BiologicalChemistry 226 (1957)，第497-507頁(yè))，可以提取全部脂質(zhì)，并通過(guò)裝備有Restek(RestekCorp.，Bellefonte, PA) RTX65TG柱的GC-MS，使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)定量。從過(guò)度表達(dá)擬南芥DGATl (S205A)及芝麻種子油質(zhì)蛋白構(gòu)建體(01eo_0-0或01eo_l-l 或 01eo_l-3 或 01eo_3-l 或 01eo_3-3，SEQ ID NO 11-20，圖 1-5)的植物，取出葉樣品，并使用多克隆抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗血清，通過(guò)SDS-PAGE/免疫印跡進(jìn)行分析?？伞⒁钥闯?，發(fā)現(xiàn)重組油質(zhì)蛋白在擬南芥的葉中積聚(圖12)。油質(zhì)蛋白/改良油質(zhì)蛋白蛋白在同一細(xì)胞(例如葉細(xì)胞)中的同時(shí)表達(dá)及積聚，將導(dǎo)致產(chǎn)生被嵌有油質(zhì)蛋白的磷脂單層包囊的甘油三酯油體；這已經(jīng)在酵母中(Ting等人，1997)及在種子中(Abell等人，2004)由未改良油質(zhì)蛋白證明。來(lái)自轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉的油體制品從表達(dá)DGATl (S205A)及芝麻種子油質(zhì)蛋白構(gòu)建體(01eo_0_0或01eo_l_l或01eo_l-3 或 01eo_3-l 或 01eo_3-3，SEQ ID NO 11-20，圖 1-5)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉，可以提取油體。通過(guò)如實(shí)施例6中所述測(cè)量OB完整性及乳劑穩(wěn)定性，可以評(píng)估在油質(zhì)蛋白肽中增加潛在交聯(lián)位點(diǎn)的數(shù)量對(duì)這樣的植物的OB的影響。在每個(gè)親水臂中含有三個(gè)以上半胱氨酸殘基的油質(zhì)蛋白的設(shè)計(jì)及構(gòu)建當(dāng)與DGATl (S205A)共表達(dá)時(shí)，ole-3, 3系具有相當(dāng)高水平的脂質(zhì)(呈TAG形式)水平增加，而含有ole-0，0的系不具有高于過(guò)度表達(dá)DGATl的對(duì)照系的脂質(zhì)水平增加。ole-1, I、ole-1, 3和ole_3，I表明，在葉中脂質(zhì)積聚水平與經(jīng)工程改造至每個(gè)臂中的半胱氨酸數(shù)量的增加之間存在關(guān)聯(lián)(表3)。表3.表達(dá)載體對(duì)照、單獨(dú)的DGATl (S205A)或DGATl (S205A)和不同形式的油質(zhì)蛋白(不含有額外的半胱氨酸，或在每個(gè)親水臂中含有最多3個(gè)額外半胱氨酸)的擬南芥屬葉的脂肪酸組成(表示為％干重)
單獨(dú)的
薦勝 DGATl, DGATl DGAIl DGATl DGAT 丨 DGATl酸特 DGAT1SA +OLEO-O +OLEl-I 十 OLE 1-3 +OLE 3-1 +OLE 3-3性我體對(duì)照 #2__( #1 丨) (的)__( #5)__(#18)__(#47)
CIfiiO0.55-0.0350.55 土 0.0010.54±C).0140.57±0.(X)10.68±0.042*0.620.0840.95土0.049*
C16:10.085土0.007 ().1()5±().0()7().11^).0010.13A0I4O.i 士0.0010.135^).021Q.ii±0.001
€16:30.34=0.0210.41 ±0.0280.42進(jìn)(K,70.48^().0280.51 ±0.0350.55±0.D7t*0.62 士<—>.049*
Cim0.095x0.0070,075^0.00 .1土0. 丨0.0.345±0.007*().2土<>.()14*0.61 土》.014*
C18:20.55-0.0140.46+0.0350.56-^).0140,77-H).()49* ,97-H),007*0.79+0.113*1.H2+0.1B*
Cm-31.67=:0.056丨.91 土1.78^).0)4I.6K^).(CHL74±().0141.9±0.282.2^().056*
C20:0表出未&出未檢出未檢出未檢出未檢出0.054土0.003 —
總脂質(zhì)(經(jīng)證實(shí)為TAG)的增加與經(jīng)工程改造至親水域中的半胱氨酸的數(shù)量之間的相關(guān)性指示，半胱氨酸的數(shù)量可為影響所希望的TAG水平的手段。因此，設(shè)計(jì)每個(gè)親水臂含有超過(guò)3個(gè)半胱氨酸的新構(gòu)建體。每個(gè)親水臂不可能放置無(wú)限數(shù)量的半胱氨酸；這些限制包括 臂的長(zhǎng)度一如果添加額外殘基為半胱氨酸制造空間，則最終疏水域相互作用的程度將降低，因?yàn)樗鼈兊慕佑|半胱氨酸的能力將受它們移至OB上的自由度的限制。 維持+、_及兩親殘基的比例一如果這些殘基的平衡及這些殘基的分布顯著地變化，則親水臂可能實(shí)際上不與OB的表面相互作用，并因而不能提供任何保護(hù)對(duì)抗脂肪酶或聚結(jié)。 硫可用性一如果硫是有限的，則增加每個(gè)油質(zhì)蛋白分子中的半胱氨酸的數(shù)量 可能使植物處于營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激下。通過(guò)置換氨基酸及主要預(yù)測(cè)為中性或帶電而非疏水的那些氨基酸，將原始半胱氨酸-油質(zhì)蛋白工程改造成在每個(gè)臂中攜帶3個(gè)相對(duì)均勻間隔的未配對(duì)半胱氨酸。據(jù)推斷，油質(zhì)蛋白需要具有特定水平的負(fù)電荷，且在C端中，這似乎可通過(guò)K(Lys)來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此繼續(xù)執(zhí)行用額外半胱氨酸交換帶電或中性殘基的策略，可能在防止聚結(jié)方面造成較差穩(wěn)定性。此外，在N端親水區(qū)中，經(jīng)工程改造的半胱氨酸之間留下的殘基似乎太少，以致不能在維持帶正電與帶負(fù)電氨基酸之間的間距和擺動(dòng)的同時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行殘基置換。因此，向N端及C端添加額外殘基(半胱氨酸)，而非用半胱氨酸置換現(xiàn)存殘基?；蛘?，已經(jīng)使用具有更長(zhǎng)親水臂的油質(zhì)蛋白。還設(shè)計(jì)了兩種額外的構(gòu)建體(Ole-5, 6和Ole-6, 7)。這些構(gòu)建體的每個(gè)臂中的半胱氨酸殘基并非故意不平衡，而是經(jīng)編排，以試圖在每個(gè)半胱氨酸之間通常得到4-5個(gè)殘基。實(shí)際上，為了將N端臂中的半胱氨酸增加至6個(gè)，必須生成額外殘基(與現(xiàn)存殘基的置換相反)；這是通過(guò)從Ole-3, 3復(fù)制前6個(gè)殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)。與其設(shè)計(jì)全新的核苷酸序列，不如(適當(dāng)時(shí))添加編碼半胱氨酸的三聯(lián)體TGT，以生成01e_5，6。就額外谷氨酰胺殘基而言，使用密碼子三聯(lián)體GGA。就在01e_6_7上的額外N端6個(gè)殘基而言,復(fù)制ole_3, 3的N端,并融合在讀碼框中。將亞克隆策略設(shè)計(jì)成與初始半胱氨酸油質(zhì)蛋白相同，即通過(guò)Notl/Ndel亞克隆進(jìn)油受體中。隨后，通過(guò)LR反應(yīng)將其重組至pRSHl中(Winichayakul等人，2008)。擬南芥屬DGATl (S205A)及油質(zhì)蛋白基本上置于它們自身的CaMV35s啟動(dòng)子及OCS終止子下。DGAl及油質(zhì)蛋白克隆都含有UBQlO內(nèi)含子。使用NetGene2來(lái)預(yù)測(cè)01e_5，6及01e_6，7的剪接圖樣。預(yù)測(cè)01e_5，6及01e_6，都在指導(dǎo)鏈上僅具有一個(gè)供體及受體位點(diǎn)(預(yù)測(cè)二者具有極高識(shí)別機(jī)率)，且在互補(bǔ)鏈上無(wú)位點(diǎn)。數(shù)據(jù)表明，含有1，3或3，I半胱氨酸的油質(zhì)蛋白確實(shí)積聚可檢測(cè)水平的TAG，但這當(dāng)然小于3，3半胱氨酸油質(zhì)蛋白(1，I積聚痕量，而0，0不積聚)。這甚至更有力地提示，5，6及6，7油質(zhì)蛋白可能比3，3構(gòu)建體積聚甚至更多TAG。不久將獲得來(lái)自5，6及6，7構(gòu)建體的第一資料。將含有經(jīng)工程改造的半胱氨酸及DGATI的油質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型擬南芥中將5個(gè)二硫化物-油質(zhì)蛋白/DGATl (S205A)基因構(gòu)建體及一個(gè)對(duì)照(含有DGATl(S205A)、但不含有油質(zhì)蛋白的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)移至植物二元載體pRShl中(Winichayakul等人，2008)，并使用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型擬南芥中。遵照傳統(tǒng)花序浸潰方法的修改版，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道，花序浸潰趨向于損傷發(fā)育中的長(zhǎng)角果，這是由于去污劑存在于接種物中(Martinez-Trujillo等人，2004)。因此,使用微量移液器向每個(gè)花逐滴接種。一周之后，重復(fù)該接種操作，以將接種物引入新近發(fā)育的花中。當(dāng)長(zhǎng)角果已干枯時(shí)，收集種子，隨后洗凈，并種植，以供篩選轉(zhuǎn)化體。通過(guò)BASTA選擇，執(zhí)行轉(zhuǎn)化體的篩選，并使用分離比率分析，針對(duì)BASTA抗性來(lái)選擇純合的轉(zhuǎn)化體。將含有經(jīng)工程改造的半胱氨酸及DGATI的油質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型白三葉草中根據(jù)Voisey等人，(1994)的規(guī)程，執(zhí)行向白三葉草中的轉(zhuǎn)化。 稱量種子，以提供約400-500個(gè)子葉(即200-250個(gè)種子)，以供解剖用(0. 06克=100個(gè)種子)。在離心管中，用70%乙醇沖洗種子I分鐘。通過(guò)在漂白劑(5%有效氯)中在圓筒式混合器上震蕩15分鐘，進(jìn)行表面殺菌，然后在無(wú)菌水中洗滌四次。使種子在4°C膨潤(rùn)過(guò)夜。在土壤桿菌品系GV3101中維持用于轉(zhuǎn)化擬南芥屬(上述)的相同構(gòu)建體，且將其接種至含有濃度為100mg/L的壯觀霉素的25mL MGL培養(yǎng)液(表4)中。在28°C，在旋轉(zhuǎn)式震蕩器(200rpm)上使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜(16小時(shí))。通過(guò)離心(3000Xg，10分鐘)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。去除上清液，并在5mL IOmMMgSO4溶液中再懸浮細(xì)胞。使用解剖顯微鏡，從種子剖開子葉。首先，去除種皮及胚乳。用解剖刀，通過(guò)將刀刃置于子葉之間且切割其余主莖，使子葉與根部分離。將子葉外植體收獲在無(wú)菌濾盤上的CR7培養(yǎng)基中。為了轉(zhuǎn)化，向每個(gè)剖開的子葉分配3ul 土壤桿菌懸浮液的等分試樣。密封平板，并在25°C、在16小時(shí)光周期下培養(yǎng)。在72小時(shí)共培養(yǎng)期之后，將轉(zhuǎn)化的子葉轉(zhuǎn)移至含有補(bǔ)充有草胺膦(2. 5mg/L)及特美汀(300mg/L)的CR7培養(yǎng)基的平板中，并返回到培養(yǎng)室中。在芽再生之后，將外植體轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有草胺膦(2. 5mg/L)及特美汀(300mg/L)的CR5培養(yǎng)基中。將再生芽每周繼代培養(yǎng)3次至含有選擇物的新鮮CR5培養(yǎng)基中。隨著根形成發(fā)生，將小苗轉(zhuǎn)移至含有CRO培養(yǎng)基(含有草胺膦選擇物)的盆中。在此階段，將大塊再生物分成單個(gè)小苗。隨后，將在選擇壓力下生長(zhǎng)的整個(gè)生根植物罐裝于無(wú)囷泥炭塊(peat plug)中。植物一旦在泥炭塊中生長(zhǎng)，隨后轉(zhuǎn)移至溫室中。表4.用于白三葉草轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基組成
FAMES GC/MS結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因白三葉草(含有DGATl (S205A)及01e_3，3或01e_5，6或Ole 6，7)具有升高的總?cè)~脂質(zhì)特性(圖17)。葉脂質(zhì)的最高水平與經(jīng)工程改造至油質(zhì)蛋白中的半胱氨酸的最高數(shù)量之間具有一般的相關(guān)性。FAMES GC/MS結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因白三葉草(含有DGATl (S205A)及01e_3，3或01e_5，6或01e6，7)具有升高的C18:l及C18:2葉脂質(zhì)特性(圖18)(也如在擬南芥屬中所見)。在用含有最高數(shù)量的經(jīng)工程改造的半胱氨酸的油質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)化的植物中，發(fā)現(xiàn)了葉C18:l及C18:2的最高水平。葉(及種子)中的油體裝配的測(cè)定使用免疫印跡分析(用抗-芝麻種子油質(zhì)蛋白抗體，Scott等人，2007),進(jìn)行其它篩選，以測(cè)定過(guò)度表達(dá)油質(zhì)蛋白蛋白的系。使用此方法，使用蔗糖密度梯度從推定轉(zhuǎn)化體的T2種子提取油體(0B)，或在變性/還原緩沖液中從葉提取總蛋白，并在SDS-PAGE中分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜，用針對(duì)芝麻油質(zhì)蛋白產(chǎn)生的抗體進(jìn)行挑戰(zhàn)(Scott等人，2007)。在500iiL OB緩沖液(IOmM磷酸鈉pH 7. 5，含有600mM蔗糖)中，從25mg種子提取粗油體(0B)。在13，OOOXg離心之后，小心地抽出水層，并使脂肪墊層再懸浮于200 ii LOB緩沖液中，而不干擾底部的沉淀物。向20 ii L每種OB提取物中加入4X加載染料及IOX還原劑，加熱至70°C 5分鐘，并加載于4-12%聚丙烯酰胺凝膠上，以供免疫印跡分析。在a-芝麻油質(zhì)蛋白抗體(第一抗體)中以1:750稀釋度溫育印跡I小時(shí)，并在第二抗體中(1:10，000)再溫育I小時(shí)。油質(zhì)蛋白在種子中天然地表達(dá)，而在葉中則不然。然而，因?yàn)槲覀円言贑aMV35s啟動(dòng)子的控制下共表達(dá)DGATl及油質(zhì)蛋白，所以可預(yù)期到，這將使得在葉中積聚可檢測(cè)水平的油質(zhì)蛋白。使用針對(duì)芝麻油質(zhì)蛋白產(chǎn)生的抗體，通過(guò)免疫印跡，分析來(lái)自在種子中高度表達(dá)重組油質(zhì)蛋白(通過(guò)免疫印跡分析鑒別)的轉(zhuǎn)化系的葉。
下表5總結(jié)了所產(chǎn)生的推定轉(zhuǎn)化體的數(shù)量及在種子及葉中表達(dá)重組油質(zhì)蛋白的植物的數(shù)量。表5
^_.....表葉涵.物..中..............
基因構(gòu)建體芝麻種子油質(zhì)蛋白有處于適當(dāng)大小的具有處于適當(dāng)
ID^抗體)分析的系種陽(yáng)性免疫反應(yīng)帶的欠小的陽(yáng)性免
BASTAit性) 子的數(shù)量系的數(shù)目疫反應(yīng)帶的系
_____的數(shù)目_
pRShl-DCATl8N/AS/A
(S205A )對(duì)照____________________
pRShl-DGATl 14I73
(S205A )
-OleJ-0__________
「05351 pRSllHDGAT1 2211I
LUWbJ (S205A)
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pRSlilDCATt..............................20..........................................................................................................................................................S...................................................................................................................................................................................I..................................................................................................................................................................................................I............................................................................................................................................. (S205A)
-0le-1-3
PRShT=Dfi AT1..............................23..........................................................................................................................................................1....................................................................................................................................................................................4..................................................................................................................................................................................................2...........................................................................................................................................
(S205A )
-Ole-3-1
pRSlilDCATt 5412165 (S205A)
-Ole-3-3_____應(yīng)指出，積聚在葉中的重組油質(zhì)蛋白的水平顯著低于種子中的水平。然而，在葉中積聚可檢測(cè)水平的單個(gè)系的比例比單獨(dú)表達(dá)油質(zhì)蛋白時(shí)大得多(Roberts Lab，未公開資料)，這表明，DGATl與油質(zhì)蛋白在葉中的共表達(dá)已導(dǎo)致更高水平的油質(zhì)蛋白的積聚。分析來(lái)自共表達(dá)DGATI (S205A)及二硫化油質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的葉使來(lái)自在種子中過(guò)度表達(dá)油質(zhì)蛋白蛋白的純合系的種子發(fā)芽，以允許生長(zhǎng)2、3、4或5周。收獲足量葉材料，以用于FAMES GC-MS以及使用RTX 65-TG Restek柱的GC-MS，它們能夠在無(wú)衍生作用下分離及鑒別游離的脂肪酸、二?；视汀⑾烏?、固醇酯及三酰基甘油。用于FAMES-GC/MS分析的材料的制備將IOmg冷凍干燥的葉粉末置于13X IOOmm螺旋帽試管中，向其中加入10 ii L未甲基化的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品(C15:0FA，4mg/mL，溶解于庚烷中)。向該混合物中，加入ImL經(jīng)過(guò)5%2，2- 二甲氧基丙烷處理的鹽酸的甲醇溶液試劑(使用無(wú)水甲醇將ImL的3M溶液稀釋至1M)，作為水清除劑。隨后用N2氣沖洗該試管，之后立即以特氟隆-襯里的蓋子密封，且在80°C加熱I小時(shí)。在試管已冷卻至室溫之后，添加10111預(yù)甲基化的標(biāo)準(zhǔn)物(411^/1^溶解于庚烷中的C17:0)。向此混合物中添加0. 6mL庚烷及I. OmL 0. 9% (w/v)NaCl，并通過(guò)渦旋徹底混合。在室溫、在500rpm離心I分鐘之后，收集100 U L頂層(含有庚烷)，將其轉(zhuǎn)移至放入棕色小瓶中的平底玻璃插入物中，以供GC/MS分析。FAMES GC/MS 分析使用SGE 毛細(xì)柱 BPX70 (50mx0. 22mmx0. 25 u m),分析 FAMES GC/MS。GC-MS 的條件如下溫度程序化成以15°C /分鐘的速率從80°C達(dá)到150°C，隨后以8V /分鐘的速率達(dá)到250°C，且保持等溫10分鐘。以分割模式注入樣品；總流量為28. 4mL/min ;柱流量為0. 82mL/min ;且清洗流量為3. OmL/min。壓力保持在150kPa ;離子源溫度為200°C，且界面溫度保持在260°C。通過(guò)質(zhì)譜法，以始于50m/z且終于350m/z的掃描模式，獲取目標(biāo)化合物。TAG及極性脂質(zhì)提取使用Ruiz_L6pez等人，(2003)的修改方法，提取TAG。簡(jiǎn)而言之，為進(jìn)行各TAG分析，將34-80mg冷凍干燥的葉粉末置于去了皮重的13-mm螺旋帽試管中，并稱重，添加2. 4mL0. 17M NaCl的MeOH溶液，并通過(guò)渦旋進(jìn)行混合。在添加4. 8mL庚烷及10 y L內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品(C14:0,10 ug/uL)之后，輕輕混合懸浮液，并在80°C水浴中在無(wú)震蕩的情況下溫育2小時(shí)。在冷卻至室溫以后，將上相(含有脂質(zhì))轉(zhuǎn)移至新的螺旋帽試管中，在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干燥。最終，將干燥粉末再懸浮于100 UL庚烷中，充分混合，隨后轉(zhuǎn)移至放入棕色玻璃小瓶中的平底玻璃插入物中，以供TAG分析。TAG GC-MS 分析在Hewlett Packard (HP)GC 及 Shimadzu Scientific Instruments Inc. MS(QP2010)上執(zhí)行TAG分析。用RESTEK毛細(xì)柱MXT_65TG(65% 二苯基-35% 二甲基聚硅氧烷，30. OmXO. IOiim厚度X 0. 25mm直徑)，以電子碰撞(EI)電離模式執(zhí)行所有分析。氦用作載運(yùn)氣體。將所有樣品以無(wú)分流模式注入I. Oii I等分試樣中，柱流量為I. 2mL/min。氣相色譜儀程序化成以15°C /min的速率從200達(dá)到370°C，并在370°C保持等溫15分鐘。將樣品 注射器口溫度保持在350°C，柱爐溫為200°C，壓力為131. lkPa，清洗流量為3. OmL/min。質(zhì)譜分析條件如下在GC-MS操作期間，離子源溫度保持在260°C，在70eV的電離電壓、60 u A的發(fā)射電流及350°C的界面溫度，獲得質(zhì)譜。截獲模式為，以5000的速度，每次掃描0. 25秒進(jìn)行掃描。始于9min且終于25min,收集具有45m/z至1090m/z的質(zhì)荷比的色譜峰。實(shí)施例8 :經(jīng)工程改造以在N端及C端親水臂中含有額外半胱氨酸殘基的其它油質(zhì)蛋白、油體鈣蛋白及油體固醇蛋白申請(qǐng)人:已對(duì)芝麻種子油質(zhì)蛋白登錄號(hào)AAD42942 (即，置換預(yù)測(cè)在具有半胱氨酸的OB的表面上的帶電殘基)使用相同策略，以將半胱氨酸工程改造進(jìn)油質(zhì)蛋白、油體鈣蛋白及油體固醇蛋白的N端及C端親水臂中。在有些情況下，可能僅置換相對(duì)均勻間隔開的帶負(fù)電荷的氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)。在芝麻油質(zhì)蛋白AAD42942的情況下，有時(shí)必須損害電荷置換。應(yīng)指出，在以下實(shí)施例中，兩種油體鈣蛋白(AAB71227及AAF13743)在它們的C端臂中含有兩個(gè)內(nèi)源性的半胱氨酸。這些物質(zhì)未經(jīng)工程改造。為了確定氨基酸置換的位置，將每種蛋白與呈原始形式以及在每個(gè)親水臂中含有I或3個(gè)半胱氨酸的形式(即，ole_0, 0;ole_l, I ;ole_3, I ;ole_l, 3;ole_3, 3)的芝麻油質(zhì)蛋白(AAD42942)相比對(duì)。隨后用灰色框突出每個(gè)親水臂的N端或C端中的潛在谷氨酸和天冬氨酸(通過(guò)疏水性繪圖判定)，相關(guān)的賴氨酸、精氨酸和谷氨酰胺殘基也如此處理(它們?cè)谥ヂ橛唾|(zhì)蛋白(AAD42942)中全部成功地改變)。隨后考慮這些殘基向半胱氨酸的突變以及它們彼此之間的間距。然后，僅用原始肽序列及經(jīng)工程改造的序列展現(xiàn)最終置換。在此情況下，僅有3個(gè)半胱氨酸被工程改造至每個(gè)臂中，然而，該數(shù)量可能更大或更少。一種替代方案必須與分離的每種蛋白一起使用，且簡(jiǎn)單地通過(guò)用疏水性繪圖鑒別親水區(qū)起始，隨后開始用最適當(dāng)?shù)膸щ姲被徇M(jìn)行置換的過(guò)程。下表6顯示了已被申請(qǐng)人改良以將半胱氨酸引入親水部分中的額外油質(zhì)蛋白及 油體鈣蛋白表6.
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，其編碼包括至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多核苷酸，其中所述改良油質(zhì)蛋白包括至少兩個(gè)半胱氨酸，其中至少一個(gè)為人工引入。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其中所述改良油質(zhì)蛋白各自包括 i)至少兩個(gè)人工引入的半胱氨酸， ii)至少三個(gè)人工引入的半胱氨酸， iii)至少四個(gè)人工引入的半胱氨酸， iv)至少五個(gè)人工引入的半胱氨酸， V)至少六個(gè)人工引入的半胱氨酸， Vi)至少七個(gè)人工引入的半胱氨酸， Vii)至少八個(gè)人工引入的半胱氨酸， Viii)至少九個(gè)人工引入的半胱氨酸， ix)至少十個(gè)人工引入的半胱氨酸， X)至少^ 個(gè)人工引入的半胱氨酸， xi)至少十二個(gè)人工引入的半胱氨酸， xii)至少十三個(gè)人工引入的半胱氨酸，或 xiii)至少十四個(gè)人工引入的半胱氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述改良油質(zhì)蛋白包括至少一個(gè)在N端親水區(qū)中的半胱氨酸及至少一個(gè)在C端親水區(qū)中的半胱氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其中所述半胱氨酸基本上均勻地分布于所述油質(zhì)蛋白的N端與C端親水區(qū)之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼融合蛋白，所述融合蛋白包括與目的蛋白融合的所述改良油質(zhì)蛋白。
構(gòu)建體
7.—種遺傳構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體,其包含根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的遺傳構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體,其中所述多核苷酸構(gòu)建體可操作地連接至啟動(dòng)子序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的遺傳構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子序列能夠在植物中驅(qū)動(dòng)所述多核苷酸的表達(dá)。
宿主細(xì)胞
10.一種宿主細(xì)胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
11.一種宿主細(xì)胞，其被遺傳修飾以表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，或所述多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物。
12.—種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建體。
也表達(dá)TAG合成酶的宿主細(xì)胞
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其也被遺傳修飾以表達(dá)三酰基甘油(TAG)合成酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其包含表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包括編碼三?；视?TAG)合成酶的核酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，其中所述核酸可操作地連接至啟動(dòng)子序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其中所述與編碼三酰基甘油(TAG)合成酶的核Ife連接的啟動(dòng)子序列能夠在植物中驅(qū)動(dòng)所述核Ife序列的表達(dá)。
宿主細(xì)胞類型
17.根據(jù)權(quán)利要求10至16中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其為選自細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、藻類細(xì)胞和植物細(xì)胞的宿主細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求10至16中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其為植物細(xì)胞。
植物
19.一種植物,其包含根據(jù)權(quán)利要求18所述的植物細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物，其表達(dá)由根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的改良油質(zhì)蛋白。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物，其在所述植物的營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)所述改良油質(zhì)蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物，其在所述植物的種子中表達(dá)所述改良油質(zhì)蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的植物，其在所述植物的花粉中表達(dá)所述改良油質(zhì)蛋白。
也表達(dá)TAG酶的植物
24.根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)所述的植物，其也被遺傳修飾以表達(dá)三酰基甘油(TAG)合成酶。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的植物，其中所述三?；视?TAG)合成酶在與所述改良油質(zhì)蛋白相同的組織中表達(dá)。
26.根據(jù)權(quán)利要求19至25中任一項(xiàng)所述的植物，其與合適的對(duì)照植物相比，表達(dá)約0.5至約4.0倍的總脂質(zhì)。
具有人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白多肽
27.一種改良油質(zhì)蛋白，其由根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
28.—種改良油質(zhì)蛋白，其包括至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的改良油質(zhì)蛋白，其包括至少兩個(gè)半胱氨酸，其中至少一個(gè)為人工引入。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的改良油質(zhì)蛋白，其包括 i)至少兩個(gè)人工引入的半胱氨酸， ii)至少三個(gè)人工引入的半胱氨酸， iii)至少四個(gè)人工引入的半胱氨酸， iv)至少五個(gè)人工引入的半胱氨酸， V)至少六個(gè)人工引入的半胱氨酸， vi)至少七個(gè)人工引入的半胱氨酸， Vii)至少八個(gè)人工引入的半胱氨酸， Viii)至少九個(gè)人工引入的半胱氨酸， ix)至少十個(gè)人工引入的半胱氨酸，x)至少i個(gè)人工引入的半胱氨酸， xi)至少十二個(gè)人工引入的半胱氨酸， xii)至少十三個(gè)人工引入的半胱氨酸，或 xiii)至少十四個(gè)人工引入的半胱氨酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的改良油質(zhì)蛋白，其包括至少一個(gè)在N端親水區(qū)中的半胱氨酸和至少一個(gè)在C端親水區(qū)中的半胱氨酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的改良油質(zhì)蛋白，其中所述半胱氨酸基本上均勻地分布于所述油質(zhì)蛋白的N端與C端親水區(qū)之間。
含有包含人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白的融合蛋白
33.一種融合蛋白，其包含根據(jù)權(quán)利要求27至32中任一項(xiàng)所述的改良油質(zhì)蛋白及目的蛋白。
包含改良油質(zhì)蛋白的油體
34.一種油體，其包含根據(jù)權(quán)利要求27至32中任一項(xiàng)所述的改良油質(zhì)蛋白。
35.一種油體，其包含至少兩種根據(jù)權(quán)利要求27至32中任一項(xiàng)所述的改良油質(zhì)蛋白。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的油體，其中所述至少兩種改良油質(zhì)蛋白經(jīng)由在所述改良油質(zhì)蛋白的半胱氨酸殘基之間的至少一個(gè)二硫橋彼此交聯(lián)。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的油體，其中所述改良油質(zhì)蛋白不交聯(lián)。
38.根據(jù)權(quán)利要求34至36中任一項(xiàng)所述的油體，其另外包含融合蛋白，所述融合蛋白包括與目的蛋白融合的油質(zhì)蛋白。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的油體，其中所述融合蛋白中的所述油質(zhì)蛋白不包括人工引入的半胱氨酸。
包含具有改良油質(zhì)蛋白的融合蛋白的油體
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的油體，其中所述融合蛋白中的所述油質(zhì)蛋白包括在其油質(zhì)蛋白部分中的人工引入的半胱氨酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的油體，其包含至少兩種融合蛋白，所述至少兩種融合蛋白各自包括人工引入的半胱氨酸。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的油體，其中所述至少兩種融合蛋白經(jīng)由在所述融合蛋白的所述改良油質(zhì)蛋白部分中的半胱氨酸殘基之間的二硫橋彼此交聯(lián)。
乳劑(包含改良油質(zhì)蛋白)
43.一種乳劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求27至32中任一項(xiàng)所述的改良油質(zhì)蛋白。
乳劑(包含油體)
44.一種乳劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求34至42中任一項(xiàng)所述的油體。
組合物(包含改良油質(zhì)蛋白)
45.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求27至32中任一項(xiàng)所述的改良油質(zhì)蛋白。
組合物(包含油體)
46.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求34至42中任一項(xiàng)所述的油體。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的組合物，其包含所述油體及合適的載體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述載體經(jīng)緩沖以具有適當(dāng)氧化還原環(huán)境，以便達(dá)到所述改良油質(zhì)蛋白的希望交聯(lián)度。
49.根據(jù)權(quán)利要求45至48中任一項(xiàng)所述的組合物，其經(jīng)配制以供皮膚施用。
包含本發(fā)明的油體的植物及其部分
50.一種植物或其部分，其包含根據(jù)權(quán)利要求34至42中任一項(xiàng)所述的油體。
51.一種植物營(yíng)養(yǎng)組織，其包含根據(jù)權(quán)利要求34至42中任一項(xiàng)所述的油體。
52.一種植物種子，其包含根據(jù)權(quán)利要求34至42中任一項(xiàng)所述的油體。
包含本發(fā)明的油體的動(dòng)物飼料
53.一種動(dòng)物飼料，其包含根據(jù)權(quán)利要求34至42中任一項(xiàng)所述的油體。
54.一種動(dòng)物飼料，其包含根據(jù)權(quán)利要求19至26和50至52中任一項(xiàng)所述的植物或其部分或組織。
方法 用于生產(chǎn)油體的方法
55.一種用于生產(chǎn)油體的方法，所述方法包括下述步驟組合 a)至少兩種根據(jù)權(quán)利要求27至32中任一項(xiàng)所述的改良油質(zhì)蛋白、三?；视停? b)磷脂。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其包括通過(guò)控制所生產(chǎn)油體的氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)所述油體中改良油質(zhì)蛋白的交聯(lián)度的額外步驟。
57.根據(jù)權(quán)利要求55或56所述的方法，其中所述改良油質(zhì)蛋白中的至少一些為融合蛋白的一部分，其中所述融合蛋白包含改良油質(zhì)蛋白及目的蛋白。
體內(nèi)組合的所有組分(體內(nèi)油體)
58.根據(jù)權(quán)利要求55至57中任一項(xiàng)所述的方法，其中在宿主細(xì)胞內(nèi)組合a)、b)及c)的組分。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述改良油質(zhì)蛋白。
60.根據(jù)權(quán)利要求58或59所述的方法，其中宿主細(xì)胞被遺傳修飾以表達(dá)所述改良油質(zhì)蛋白。
其中宿主細(xì)胞也表達(dá)TAG酶的方法
61.根據(jù)權(quán)利要求58至60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞也被遺傳修飾以表達(dá)三?；视?TAG)合成酶。
62.根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞形成有機(jī)體的一部分。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述有機(jī)體為植物。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述植物積聚的脂質(zhì)比合適的對(duì)照植物多約50% 至約 400%。
純化體內(nèi)生產(chǎn)的油體的額外方法步驟
65.根據(jù)權(quán)利要求58至64中任一項(xiàng)所述的方法，其包括從所述細(xì)胞或有機(jī)體純化所述油體的額外步驟。
改變體內(nèi)生產(chǎn)的經(jīng)純化油體的交聯(lián)度的額外方法步驟
66.根據(jù)權(quán)利要求58至65中任一項(xiàng)所述的方法，其包括通過(guò)控制經(jīng)純化油體的氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)所述體內(nèi)生產(chǎn)的經(jīng)純化油體中改良油質(zhì)蛋白的交聯(lián)度的額外步驟。
體外組合的組分(體外/人造油體)
67.根據(jù)權(quán)利要求55至57中任一項(xiàng)所述的方法，其中體外組合a)、b)及c)的組分。
改變體外/人造油體的交聯(lián)度的額外方法步驟
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其包括通過(guò)控制在其中組合a)、b)及c)的組分的氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)交聯(lián)度的額外步驟。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中在所述油體形成之后通過(guò)控制容納所述油體的氧化還原環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)交聯(lián)度。
油體
70.一種油體，其通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求65至69中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)生產(chǎn)。
油生產(chǎn)方法
71.—種生產(chǎn)油的方法,所述方法包括在有助于生產(chǎn)油的條件下，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求10至18中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求19至26中任一項(xiàng)所述的植物。
72.—種生產(chǎn)比合適的對(duì)照植物積聚更多油的植物的方法，所述方法包括提供用根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物,所述多核苷酸表達(dá)由所述多核苷酸編碼的改良油質(zhì)蛋白。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中所述植物也被編碼TAG合成酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化，以表達(dá)所述TAG合成酶且由此合成TAG。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中通過(guò)用根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸及編碼TAG合成酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化單個(gè)植物或植物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)所述植物。
75.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中如下生產(chǎn)所述植物通過(guò)使經(jīng)過(guò)根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化的第一植物與經(jīng)過(guò)編碼TAG合成酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化的第二植物雜交，以生產(chǎn)用根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸及編碼TAG合成酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。
76.根據(jù)權(quán)利要求72至75中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物積聚的脂質(zhì)比合適的對(duì)照植物多約50%至約400%。
77.根據(jù)權(quán)利要求71至76中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述油為TAG。
78.根據(jù)權(quán)利要求71至77中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述植物的營(yíng)養(yǎng)組織中生產(chǎn)油。
79.根據(jù)權(quán)利要求71至78中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物被加工成動(dòng)物飼料。
80.根據(jù)權(quán)利要求71至78中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物被加工成生物燃料原料。
81.一種用于在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)油體的方法，所述方法包括 a)將至少一種根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸引入宿主細(xì)胞中；以及 b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以表達(dá)所述改良油質(zhì)蛋白。
82.—種用于在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)油體的方法，所述方法包括 a)將至少一種根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸及編碼TAG合成酶的核酸分子引入宿主細(xì)胞中；以及 b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，以表達(dá)所述改良油質(zhì)蛋白及所述TAG合成酶。
83.根據(jù)權(quán)利要求71、77、81或82的方法，其中所述宿主細(xì)胞被加工成油級(jí)分。
84.根據(jù)權(quán)利要求83中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述油被加工成燃料、油化學(xué)品或營(yíng)養(yǎng)油或化妝油、多不飽和脂肪酸(PUFA )或它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了包括至少一個(gè)人工引入的半胱氨酸的改良油質(zhì)蛋白。本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)改良油質(zhì)蛋白的方法及組合物。本發(fā)明提供了編碼所述改良油質(zhì)蛋白的多核苷酸，及包含所述多核苷酸的構(gòu)建體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明也提供了在活體內(nèi)及活體外生產(chǎn)包含改良油質(zhì)蛋白的油體的方法。本發(fā)明也提供了在宿主細(xì)胞及植物中生產(chǎn)油的方法。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的油體、宿主細(xì)胞或植物的動(dòng)物飼料和生物燃料源。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102741411SQ201080058155
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者宋路泰·威尼查亞庫(kù), 尼古拉斯·約翰·羅伯茨, 瑪麗薩·羅丹, 理查德·威廉·斯科特 申請(qǐng)人:農(nóng)業(yè)研究有限公司