專利名稱：序列依賴性聚集的制作方法
序列依賴性聚集本文中報(bào)道了用于降低濃縮溶液中免疫球蛋白聚集的方法，通過將免疫球蛋白重鏈的第四框架區(qū)(即，J元件中)中的一個或兩個突變回復(fù)為親水性或天然的種系氨基酸殘基。
背景技術(shù)：
由于其化學(xué)和物理性質(zhì)，例如分子量和包括次級修飾在內(nèi)的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造，免疫球蛋白的下游加工是非常復(fù)雜的。濃縮的免疫球蛋白溶液不僅是配制藥物所需，而且是下游加工(DSP)獲得用于經(jīng)濟(jì)處理和儲藏應(yīng)用的較低體積的中間物所需。免疫球蛋白的最終制劑還需要高度濃縮的溶液。例如，用于皮下應(yīng)用的免疫球蛋 白濃度需要高于100mg/ml,即，約150mg/ml。但至少一些免疫球蛋白在100mg/ml或更高的非生理性高濃度下傾向于聚集。在WO 2009/000098中，報(bào)道了基于單鏈抗體改造和優(yōu)化的序列。發(fā)明概述本文中報(bào)道了用于降低濃縮溶液中免疫球蛋白聚集的方法。發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白重鏈第四框架區(qū)中的兩個甚至單個回復(fù)的突變可以降低聚集形成，允許提供具有降低的聚集物(aggregate)含量的、高度濃縮的回復(fù)免疫球蛋白變體溶液。因此，本文作為單個方面報(bào)道的是降低溶液中的免疫球蛋白聚集的方法，用于修飾免疫球蛋白的方法，用于生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，和用于人源化免疫球蛋白的方法。本文報(bào)道的所有方法都包括下列步驟a)比對免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列與參照氨基酸序列，獲得最大水平的氨基酸序列同一性，b)鑒別免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列和參照氨基酸序列中所比對的具有不同氨基酸殘基的氨基酸序列位置，c)通過用存在于參照氨基酸序列中的各蘇氨酸或絲氨酸殘基取代b)鑒別的位置上在免疫球蛋白第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列中的氨基酸殘基或至少一個氨基酸殘基，修飾免疫球蛋白氨基酸序列，其中在該取代位置氨基酸殘基在參照氨基酸序列中是蘇氨酸或絲氨酸，并且其中氨基酸殘基在免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列中不是蘇氨酸且不是絲氨酸，d)任選的提供編碼修飾的免疫球蛋白氨基酸序列的核酸序列。在一個實(shí)施方案中，僅確定和改變不同的蘇氨酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，免疫球蛋白第四框架區(qū)的參照氨基酸序列是氨基酸序列XXXXTTXTXSS(SEQ ID NO :01)，其中x表示除蘇氨酸和絲氨酸以外的任何氨基酸殘基。在另一實(shí)施方案中，參照氨基酸序列是氨基酸序列xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO :11),其中在1、2、3、4、7和9位的x表示除蘇氨酸和絲氨酸以外的任何氨基酸殘基，而在6位的X表示蘇氨酸，10和11位的X表示絲氨酸，從而在步驟b)中鑒別出參照氨基酸序列與免疫球蛋白重鏈第四框架區(qū)的氨基酸序列在第5和/或第8位的蘇氨酸殘基的差異，并在步驟c)中修飾。在一個實(shí)施方案中，參照氨基酸序列是人種系氨基酸序列。在本文報(bào)道的所有方面的一個實(shí)施方案中，方法包括下列步驟
a)比對免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列與氨基酸序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :02)，或氨基酸序列 WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO :03)，或氨基酸序列WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO :04)，或氨基酸序列 WGQGITVTVSS (SEQ ID NO :05)，或氨基酸序列WGKGTTVTVSS (SEQ ID NO :06)，獲得最大水平的氨基酸序列同一性，b)鑒別免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列和參照氨基酸序列中所比對的具有不同氨基酸殘基的氨基酸位置，c)通過用參照氨基酸序列中存在的各蘇氨酸或絲氨酸殘基取代b)中鑒別的位置上的在第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列中的氨基酸殘基，修飾免疫球蛋白，其中在該位置的氨基酸殘基在參照氨基酸序列中是蘇氨酸或絲氨酸，并且其中在該位置的氨基酸殘基在免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列中不是蘇氨酸且不是絲氨酸，d)任選的提供編碼修飾的免疫球蛋白氨基酸序列的核酸序列。在本文報(bào)道的方面的一個實(shí)施方案中，方法包括提供或確定免疫球蛋白重鏈的第四框架區(qū)的氨基酸序列的步驟作為第一步。在一個實(shí)施方案中，參照序列是氨基酸序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :02)。在另一個實(shí)施方案中，參照氨基酸序列是xxxxTxxTxxx (SEQID NO :11)。在一個實(shí)施方案中，確定了在參照氨基酸序列的第5和/或第8位的蘇氨酸殘基的差異。在一個實(shí)施方案中，僅確定和改變蘇氨酸殘基的差異。在本文報(bào)道的一個方面，方法是生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，包括下列步驟a)比對免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列與參照氨基酸序列xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO :01)或 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO :11),獲得最大水平的氨基酸序列同一I"生， b)鑒別免疫球蛋白第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列和參照氨基酸序列中在第5和/或第6和/或第8和/或第10和/或第11位上具有不同氨基酸殘基的所比對的氨基酸序列位置，c)通過用如參照氨基酸序列中的各蘇氨酸或絲氨酸殘基取代b)中鑒別的位置上的在第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列中的氨基酸殘基，修飾免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列，其中在該位置的氨基酸殘基在參照氨基酸序列中是蘇氨酸或絲氨酸，并且其中在該位置的氨基酸殘基在免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列中不是蘇氨酸且不是絲氨酸，d)培養(yǎng)包含編碼修飾的免疫球蛋白重鏈氨基酸序列的核酸和編碼相應(yīng)的輕鏈氨基酸序列的核酸的哺乳動物細(xì)胞，用于表達(dá)免疫球蛋白重鏈和輕鏈，e)從哺乳動物細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收免疫球蛋白，從而生產(chǎn)免疫球蛋白。在一個實(shí)施方案中，參照氨基酸序列是氨基酸序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:02)，或氨基酸序列 WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO :03)，或氨基酸序列 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:04)，或氨基酸序列 WGQGITVTVSS (SEQ ID NO :05)，或氨基酸序列 WGKGITVTVSS (SEQ ID NO:06)。在一個實(shí)施方案中，修飾免疫球蛋白第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列的步驟是用如參照 氨基酸序列中所存在的各個蘇氨酸殘基取代第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列中在b)中鑒別的位置上的氨基酸殘基，所述位置在參照序列中是蘇氨酸，而在第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列中不是蘇氨酸。在另一個實(shí)施方案中，修飾是在至少一個鑒別的位置上的。在一個實(shí)施方案中，參照氨基酸序列是氨基酸序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :02)。在一個實(shí)施方案中，免疫球蛋白是人或人源化的免疫球蛋白。在另一個實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞或HEK細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，確定了在參照氨基酸序列的第5和/或8位上的蘇氨酸殘基的差異。本文報(bào)道的另一個方面是人源化免疫球蛋白的方法，包括下列步驟a)比對免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列與參照氨基酸序列xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO :01)或 xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO : 11),獲得最大水平的氨基酸序列同一I"生，b)鑒別免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列與參照氨基酸序列中所比對 的具有不同氨基酸殘基的氨基酸序列位置，c)通過用參照序列中的各個蘇氨酸或絲氨酸殘基取代b)中鑒別的位置上的在第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列中的氨基酸殘基，人源化免疫球蛋白，其中所述位置的氨基酸殘基在參照氨基酸序列中是蘇氨酸或絲氨酸，并且其中所述位置的氨基酸殘基在免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列中不是蘇氨酸且不是絲氨酸，d)任選的提供編碼人源化免疫球蛋白的核酸序列。發(fā)明詳述發(fā)現(xiàn)在第四免疫球蛋白重鏈框架區(qū)的氨基酸序列中，兩個乃至單個蘇氨酸和/或絲氨酸氨基酸殘基改變?yōu)樾〉氖杷曰蚍菢O性氨基酸殘基(例如，異亮氨酸或丙氨酸)增加免疫球蛋白在溶液中形成聚集體的傾向，尤其是在高鹽濃度和/或高免疫球蛋白濃度的溶液中。通過回復(fù)改變的氨基酸殘基回到天然存在的蘇氨酸和/或絲氨酸殘基，明顯降低在溶液中，尤其是在濃縮溶液中形成聚集體的傾向。在一個方面，本文報(bào)道的方法是降低免疫球蛋白在溶液中聚集的方法，包括下列步驟-通過就第四框架區(qū)氨基酸序列比較氨基酸序列與參照氨基酸序列，確定免疫球蛋白重鏈的第四框架區(qū)氨基酸序列中的一個或多個蘇氨酸和/或絲氨酸殘基是否已經(jīng)改變，-通過修飾至少一個改變的蘇氨酸和/或絲氨酸殘基恢復(fù)至參照的蘇氨酸和/或絲氨酸殘基，回復(fù)免疫球蛋白的氨基酸序列，從而降低免疫球蛋白在溶液中的聚集。術(shù)語“比對”代表排列兩條或多條氨基酸序列，獲得最大水平的氨基酸序列同一性和保守性的過程。包括確定分子序列的位置同源性，涉及同源分子中氨基酸或核苷酸的并列。結(jié)果是以顯示最大統(tǒng)計(jì)學(xué)相似性區(qū)域的形式展示所比較的序列。涉及參照氨基酸序列時(shí)，“最大水平的氨基酸序列同一性”定義為在比對序列和需要時(shí)引入空位后，獲得了最大的百分比序列同一性，且不考慮任何保守性取代作為序列同一性的一部分，候選氨基酸序列中與參照氨基酸序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。出于確定氨基酸序列同一性的目的，可以以多種方式實(shí)現(xiàn)比對，例如使用公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對氨基酸序列的恰當(dāng)參數(shù)，包括在所比較的氨基酸序列全長獲得最大比對時(shí)需要的任何算法。然而，出于本文的目的，氨基酸序列同一性”值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2產(chǎn)生的。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech, Inc.授權(quán),源代碼公開在美國版權(quán)局(U. S. Copyright Office, Washington D. C. , 20559)中的用戶文件中，注冊為美國版權(quán)登記號TXU510087。ALIGN-2是公眾可從Genentech，Inc. , South SanFrancisco,California獲得的，或者可以用源代碼匯編。ALIGN-2程序應(yīng)該匯編用于UNIX操作系統(tǒng)，包括數(shù)字化UNIXV4. OD。所有的序列比較參數(shù)都是用ALIGH-2設(shè)置的，且不改變。在ALIGN-2用于氨基酸序列比較的情況下，給定的氨基酸序列A與給定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(可選的可以稱為與給定的氨基酸序列B具有或包括某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)計(jì)算如下分?jǐn)?shù)X/Y的100倍其中X是在A和B的程序比對中，被序列比對程序ALIGN-2評為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，而其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)。可以理解，當(dāng)氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度時(shí)，A與B的％氨基酸序列同一性不等于B與A的％氨基酸序列同一性。在本文報(bào)道的方法的另一方面，是修飾免疫球蛋白的方法，包括下列步驟 -通過就第四框架區(qū)氨基酸序列比較氨基酸序列與參照氨基酸序列，確定免疫球蛋白重鏈的第四框架區(qū)氨基酸序列中的一個或多個蘇氨酸和/或絲氨酸殘基是否已經(jīng)改變，-通過修飾至少一個改變的蘇氨酸和/或絲氨酸殘基恢復(fù)至參照的蘇氨酸和/或絲氨酸殘基，回復(fù)免疫球蛋白的氨基酸序列，從而修飾免疫球蛋白。在本文報(bào)道的方法的一個方面，是人源化免疫球蛋白的方法，包括下列步驟-通過比較嵌合免疫球蛋白、移植CDR的免疫球蛋白、降低或去T細(xì)胞表位的免疫球蛋白，或其變體的重鏈第四框架區(qū)的氨基酸序列與參照氨基酸序列的第四框架區(qū)，確定一個或多個蘇氨酸和/或絲氨酸殘基是否已經(jīng)被不同的氨基酸殘基替換，-通過修飾至少一個改變的蘇氨酸和/或絲氨酸殘基恢復(fù)至如參照氨基酸序列中的蘇氨酸和/或絲氨酸殘基，回復(fù)免疫球蛋白的氨基酸序列，從而人源化免疫球蛋白。術(shù)語“第四框架區(qū)氨基酸序列”表示免疫球蛋白的重鏈的第四框架區(qū)的氨基酸序列。該氨基酸序列起自免疫球蛋白重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)3 (CDR 3) C端緊鄰的氨基酸殘基，結(jié)束于重鏈可變結(jié)構(gòu)域的最后一個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)Kabat確定免疫球蛋白重鏈的⑶R 3的氨基酸殘基。術(shù)語“嵌合免疫球蛋白”表示這樣的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括源自第一物種的免疫球蛋白的氨基酸殘基，和源自不同于第一物種的第二物種的氨基酸殘基。如果受體物種是人，則嵌合免疫球蛋白是“人源化的免疫球蛋白”。對于大部分情況，人源化的免疫球蛋白是源自人免疫球蛋白(受體(recipient)或接納體(acceptor)免疫球蛋白)的，其中根據(jù)Kabat和/或Chothia和/或其他編號系統(tǒng)確定的一個或多個高變區(qū)的氨基酸序列變?yōu)榉侨宋锓N(供體免疫球蛋白)的高變區(qū)的氨基酸序列。這樣的人源化免疫球蛋白被稱為“移植CDR的免疫球蛋白”，在所述免疫球蛋白中，人接納體免疫球蛋白的根據(jù)Kabat和/或Chothia和/或其他編號系統(tǒng)的整個高變區(qū)被相應(yīng)的非人供體免疫球蛋白的氨基酸殘基替換。示例性的非人供體免疫球蛋白是小鼠、大鼠、兔、狗、倉鼠、羊或非人靈長類的免疫球蛋白，具有與目標(biāo)抗原理想的特異性和親和力(參見例如，Morrison, S. L.等人，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ;US 5, 202, 238 ；US 5,204,244)。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化免疫球蛋白可以包括其他修飾，例如未見于接納體免疫球蛋白或供體免疫球蛋白中的氨基酸殘基。此類修飾導(dǎo)致此類受體或供體免疫球蛋白的變體，所述變體與相應(yīng)的親本序列是同源但不相同的。人源化免疫球蛋白任選的還將包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)，通常是人免疫球蛋白的。在一個實(shí)施方案中，免疫球蛋白是嵌合的免疫球蛋白，或移植CDR的免疫球蛋白，或降低或去T細(xì)胞表位的免疫球蛋白，或其變體。在一個實(shí)施方案中，免疫球蛋白包括人重鏈恒定區(qū)或其變體。在另一實(shí)施方案中，人恒定區(qū)是IgGl亞類的，或IgG4亞類的，IgG2亞類的，IgG3亞類的，或是SEQ ID N0:07或SEQ ID N0:08，或是其變體。在一個實(shí)施方案中，以這樣的方式修飾恒定區(qū)，使得可以檢測不到任何下文定義的Fe Y受體(例如，F(xiàn)cyRIIIa)結(jié)合和/或Clq結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，恒定區(qū)是人恒定區(qū)，且是人IgG4亞類的恒定區(qū)或者是從人IgGl亞類突變的Fe部分。在另一個實(shí)施 方案中，恒定區(qū)是包括突變L234A和L235A的人IgGl亞類(根據(jù)全長確定的位置，即，包括可變結(jié)構(gòu)域、人IgGl重鏈氨基酸序列)的恒定區(qū)。當(dāng)1864表現(xiàn)出降低的？(￥受體(FcyRIIIa)結(jié)合時(shí)，其他IgG亞類的免疫球蛋白表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297 (缺少 Fe 碳水化合物)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434 或 / 和 His435 是改變時(shí)也提供降低的 Fe y 受體結(jié)合的殘基(Shields, R. L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ;Lund，J.等人，F(xiàn)ASEBJ. 9 (1995) 115-119 ；Morgan, A.等人，Immunology 86 (1995) 319-324 ;EP 0307434)。在一個實(shí)施方案中，恒定區(qū)是針對IgG4亞類或IgGl或IgG2亞類的Fe y受體結(jié)合的，在L234、L235和/或D265具有突變和~/或含有PVA236突變。在一個實(shí)施方案中，突變是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236 (PVA236意指IgGl的233至236位氨基酸的氨基酸序列ELLG或IgG4的EFLG(以一字母代碼給出)被PVA替換)。在另一實(shí)施方案中，突變是IgG4的S228P，和IgGl的L234A和L235A。免疫球蛋白的恒定區(qū)直接參與ADCC (抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和CDC (補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)。不結(jié)合Fe Y受體和或補(bǔ)體因子Clq的免疫球蛋白不引發(fā)抗體-依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。術(shù)語“去T細(xì)胞表位的免疫球蛋白”表示經(jīng)修飾通過去除人T細(xì)胞表位(蛋白質(zhì)中具有結(jié)合MHC II類分子的能力的肽序列)而去除或降低免疫原性的免疫球蛋白。通過該方法，鑒別在肽和特異性結(jié)合口袋的氨基酸側(cè)鏈與MHC II類結(jié)合溝之間的相互作用。改變所鑒別的免疫原性區(qū)消除免疫原性。此類方法一般描述在例如WO 98/52976或WO 98/08097中。術(shù)語“其變體”表示包含保守性序列修飾或改變的糖基化模式的免疫球蛋白。術(shù)語“保守性序列修飾”表示這樣的氨基酸取代，所述取代包括用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換氨基酸殘基。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有3分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。另一種類型的免疫球蛋白變體改變了免疫球蛋白的原始糖基化模式。改變意指刪除免疫球蛋白中可見的一個或多個糖基化位點(diǎn)，和/或?qū)胍粋€或多個免疫球蛋白中不存在的糖基化位點(diǎn)。免疫球蛋白的糖基化通常是N連接的。N連接指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈連接。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸是酶促連接碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列，其中X可以是任
何氨基酸。在一個實(shí)施方案中，參照序列是SEQ ID NO 02至06的序列，或SEQ ID NO 01的序列，或SEQ ID N0:11的序列。在另一個實(shí)施方案中，確定和回復(fù)的是被取代的蘇氨酸殘基。下文中用抗-IL13Ra I抗體和抗0X40L抗體示例了本發(fā)明。相應(yīng)的氨基酸序列和、生產(chǎn)方法報(bào)道在WO 2006/072564和WO 2006/029879中(其通過引用整合)。這些抗體僅用于示例本文報(bào)道的方面，而不代表任何限制。所附權(quán)利要求中提出了本發(fā)明的范圍?？筥IL13Ra I抗體在下文中標(biāo)注為親本抗體，具有WGQGTLVIVSS(SEQ ID NO :09)的第四重鏈框架區(qū)氨基酸序列。與SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 11的氨基酸序列的比較顯示如下。II0xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO :01)，或xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO :11)與WGQGTLVIVSS (SEQ ID NO :09)可見氨基酸序列之間的一個差異是SEQ ID NO :09的第8位的異亮氨酸殘基而非SEQ ID N0:01或SEQ ID NO :11中的蘇氨酸殘基。因此，已生產(chǎn)了異亮氨酸殘基被回復(fù)回蘇氨酸殘基的變體抗體。當(dāng)親本抗體表現(xiàn)出高水平的聚集物形成時(shí)，回復(fù)的變體抗體具有明顯降低的形成聚集物的傾向。在圖I中，顯示了在30mg/ml的抗體濃度和50°C和不同的離子強(qiáng)度下，親本抗IL13Ra I抗體的聚集物的尺寸增加速率(nm/h)。圖I中還顯示了用變體抗IL13Ra I抗體獲得的速率，作為與親本抗IL13Ra I抗體單個和唯一的差異，所述變體中重鏈氨基酸序列第四框架區(qū)的第115位氨基酸上的異亮氨酸殘基(與SEQ ID NO =OlUl和09的第8位對應(yīng))已回復(fù)為蘇氨酸。單個回復(fù)的突變降低了在所有受檢離子強(qiáng)度下聚集物尺寸增加的速率。在圖2中，顯示了在相同制劑中40°C儲藏9周的兩個樣品的分析用尺寸排阻層析。各自的數(shù)據(jù)列舉在下表I中。表I :儲藏在40°C下9周的樣品的分析數(shù)據(jù)相對相對面積相對面積相對增加面積低分子量高分子量 HMW單體化合物化合物 [%]__[%] [%1 [%] _
儲藏在-80 r的親本抗 98.6 0.041.4-
-I LI 3 Ral抗體(參照值)
在40X下儲藏9周的親本抗丨93.7 4.22.048.9
-IL13Ral 抗體
儲藏在-801C的變體抗 97.3 0.12.5-
-ILBRal抗體(參照值)
在40X下儲藏9周的變體抗 93.2 3.92.913.4
-IL13R 1 抗體可以看出，相比親本抗體，回復(fù)的變體抗體形成聚集的傾向降低了超過50 %。在圖3中顯示了重鏈殘基I至130的Kyte-Doolittle圖，使用親本抗IL13Ra I抗體的9個殘基的分析或平均窗口。在第四框架區(qū)中，圖表現(xiàn)出整個重鏈最高的疏水性值。在圖4中顯示了變本抗IL13Ra I抗體的重鏈的Kyte-Doolittle圖。可見第四框架區(qū)的疏水性值在回復(fù)的變體抗體中明顯降低了。在圖5中顯示了重鏈殘基I至130的Kyte-Doolittle圖，使用抗0X40L抗體的9個殘基的分析/平均窗口。在該情況下還可見第四重鏈框架區(qū)中是最高的疏水性值。通過分析第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列，可以確定如下所示的氨基酸改變。II0xxxxTTxTxSS (SEQ ID NO :01)，或xxxxTxxTxxx (SEQ ID NO :11),或WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO :02)與WGQGALVTVSS (SEQ ID NO : 10) 將該單個氨基酸改變回復(fù)回天然存在的種系蘇氨酸殘基降低了抗體的疏水性，如圖6中的Kyte-Doolittle圖所不。下列實(shí)施例、序列表和附圖都供幫助理解本發(fā)明，所附權(quán)利要求中提出了本發(fā)明的實(shí)際范圍。應(yīng)理解，可以在不脫離本發(fā)明的精神的條件下，對所述方法進(jìn)行修飾。序列表說明SEQ ID NO 01 xxxxTTxTxSS-參照氨基酸序列SEQ ID NO 02 WGQGTLVTVSS-部分的種系FR4/J-元件氨基酸序列
SEQ ID NO :03WGRGTLVTVSS-部分的種系FR4/J-元件氨基酸序列SEQ ID NO 04WGQGTMVTVSS-部分的種系FR4/J-元件氨基酸序列SEQ ID NO 05WGQGITVTVSS-部分的種系FR4/J-元件氨基酸序列SEQ ID NO 06WGKGITVTVSS-部分的種系FR4/J-元件氨基酸序列SEQ ID NO 07人IgGl重鏈恒定區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO 08人IgG4重鏈恒定區(qū)氨基酸序列
SEQ ID NO 09WGQGTLVIVSS-抗-IL13R a I 抗體的氨基酸序列SEQ ID NO 10WGQGALVTVSS-抗-0X40L 抗體的氨基酸序列SEQ ID NO: 11xxxxTxxTxxx-參照氨基酸序列


圖I :通過動態(tài)光散射確定的，在30mg/ml抗IL13Ra I抗體(a)和回復(fù)的抗體變體(b)的溶液中，顆粒大小隨單位時(shí)間增加的速率，所述溶液都是在20mM組氨酸緩沖液pH6 中的，在 50°C含有 O、140 和 500mMNaCl。圖2 30mg/ml抗IL13Ra I抗體和回復(fù)形式的兩種溶液的15小時(shí)的分析用尺寸排阻層析，所述溶液都是在10°c下存在500mM NaCl的條件下的。圖3 :重鏈殘基I至130的Kyte-Doolittle圖，分析窗口為親本抗IL13Ra I抗體的9個殘基。圖4 :重鏈殘基I至130的Kyte-Doolittle圖，分析窗口為變體抗IL13Ra I抗體的9個殘基。圖5 :重鏈殘基I至130的Kyte-Doolittle圖，分析窗口為親本抗0X40L抗體的9
個殘基。圖6 :重鏈殘基I至130的Kyte-Doolittle圖，分析窗口為變體抗0X40L抗體的9
個殘基。材料和方法分析用尺寸排阻層析使用TSK 3000S WXL 7. 8x300mm 柱(Tosoh, Stuttgart, Germany),通過分析用尺寸排阻層析確定高分子量種類(HMW)、抗體單體和低分子量種類(LMW)的含量。作為洗脫液，使用流速為0. 5ml/min的含有pH 7. 0的200mM KH2PO4和250mM KCl的緩沖溶液。每次運(yùn)行上樣150 Ug蛋白質(zhì)的量。通過280nm的UV吸光值實(shí)現(xiàn)檢測。動態(tài)光散射(DLS)DLS是用于測量顆粒大小的非侵入性技術(shù)，通常在亞微米的尺寸范圍。在本發(fā)明中，使用具有控溫的石英比色杯(25°C )的Zetasizer Nano S裝置(Malvern Instruments,Worcestershire, UK)監(jiān)控在Inm和6 ii m之間的尺寸范圍。在173°角檢測回散射激光的強(qiáng)度。強(qiáng)度波動的速率取決于顆粒擴(kuò)散的速度，而擴(kuò)散速度反過來受顆粒大小控制。因此，可以根據(jù)分析散射光強(qiáng)度的波動，生成顆粒尺寸的數(shù)據(jù)(Dahneke，B.E.(編著)，Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering,Wiley Inc.(1983) ;Pecora， R. ， Dynamic Light Scattering-Application of Photon CorrelationSpectroscopy, Plenum Press (1985))。使用 DTS 軟件(Malvern)的多個狹窄模式(narrowmode)計(jì)算強(qiáng)度的大小分布。實(shí)施例I生產(chǎn)變體抗IL13Ra I抗體將抗IL13Ra I抗體輕鏈和重鏈編碼基因分別裝配到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中。從而將編碼抗IL13R a I抗體輕鏈可變區(qū)和人K-輕鏈恒定區(qū)(CJ的基因區(qū)段連接抗IL13Ra I抗體重鏈可變區(qū)(Vh)和人Y I-重鏈恒定區(qū)(Cm-鉸鏈-Ch2-Ch3)的基因區(qū)段。關(guān)于自其密碼子選擇的人輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息給出在Kabat，E. A.，Wu, T. T.，Perry, H. M. , Gottesman, K. S.和 Foeller, C. Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第 5 版，NIH Publication No. 91-3242 (1991)中。抗 IL13Ral 抗體 k -輕鏈的轉(zhuǎn)錄單元由下列元件組成 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動子 合成的5’ -UT,包括Kozak序列 鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，包括信號序列內(nèi)含子 克隆的抗_IL13Ra I抗體可變輕鏈cDNA,在5’端安排了唯一的BsmI限制性位點(diǎn)，而在3’端安排了剪接供體位點(diǎn)和唯一的NotI限制性位點(diǎn) 基因組的人K-基因恒定區(qū)，包括內(nèi)含子2小鼠Ig-K增強(qiáng)子(Picard，D.和Schaffner, ff.，Nature 307 (1984)80-82)，和 人免疫球蛋白K -多聚腺苷酸化(“poly A”)信號序列。抗IL13Ra I抗體Y I-重鏈的轉(zhuǎn)錄單元由下列元件組成 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的即時(shí)早期增強(qiáng)子和啟動子 合成的5’ -UT,包括Kozak序列 修飾的鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，包括信號序列內(nèi)含子 克隆的抗-IL13Ra I抗體可變重鏈cDNA，在5’處安排了唯一的BsmI限制性位點(diǎn)，而在3’端安排了剪接供體位點(diǎn)和唯一的NotI限制性位點(diǎn) 基因組的人Y I-重鏈基因恒定區(qū)，包括小鼠Ig U-增強(qiáng)子(Neuberger, M. S.，EMBO J.2(1983)1373-1378) 人Y I-免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“poly A”)信號序列。除了抗IL13Rcil抗體K-輕鏈或Y I-重鏈的表達(dá)盒外，這些質(zhì)粒還含有 潮霉素抗性基因 EB病毒(EBV)的復(fù)制起點(diǎn)oriP 載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn),該復(fù)制起點(diǎn)允許該質(zhì)粒在大腸桿菌(E. coli)中復(fù)制,和 在大腸桿菌中賦予氨芐青霉素抗性的P -內(nèi)酰胺酶基因。使用QuickChange 定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene),通過定點(diǎn)誘變親本抗體表達(dá)質(zhì)粒，產(chǎn)生編碼變體抗IL13Ra I抗體Yl-重鏈的表達(dá)質(zhì)粒。氨基酸根據(jù)EU編號進(jìn)行編號(Edelman, G. M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85 ；Kabat, E. A.，Wu,T. T. , Perry, H. M. , Gottesman, K. S.和 Foeller, C. , (1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版，NIH Publication No. 91-3242)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO克隆生產(chǎn)130mg/升的變體抗IL13Ra I抗體。通過使用3個依次的層析步驟，進(jìn)行下游加工蛋白A層析、陽離子交換層析和陰離子交換層析。
實(shí)施例2通過動態(tài)光散射確定聚集體尺寸的增加速率為了跟蹤隨時(shí)間的聚集，以規(guī)律的時(shí)間間隔進(jìn)行動態(tài)光散射(DLS)測量。高鹽濃度穩(wěn)定了疏水性相互作用；因而預(yù)期與疏水性相關(guān)的聚集作用在高鹽濃度下更顯著。監(jiān)控平均顆粒大小(Z-平均半徑)的改變作為蛋白質(zhì)聚集的度量(圖I)。在30mg/ml的蛋白質(zhì)濃度下，在含有各種 NaCl 量的緩沖液(20mM His/His-HCl pH 6. 0+0/140/500mM NaCl)中透析樣品。在50°C的溫度下,在Wyatt DynaPro平板讀數(shù)器上對394孔微滴度板進(jìn)行DLS測量。實(shí)施例3變體抗IL13Ra I抗體的穩(wěn)定性測試通過在含有0或500mM NaCl的2 OmM Hi s/Hi s-HCl pH 6. 0中透析樣品，再在10°C孵育15h，實(shí)施誘導(dǎo)高分子量的化合物(HMW)。通過SEC HPLC監(jiān)控到相比未處理樣品的HMW形成(圖2)。
權(quán)利要求
1.提供編碼免疫球蛋白的核酸序列的方法，包括下列步驟 a)比對免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列與參照序列XXXXTTXTXSS(SEQIDNO :01)或xxxxTxxTxxx(SEQ ID NO :11),獲得最大水平的氨基酸序列同一11"生， b)鑒別第四重鏈框架區(qū)和參照序列中所比對的具有不同氨基酸殘基的氨基酸位置， c)通過用如參照序列中的各蘇氨酸或絲氨酸殘基取代b)中鑒別的位置上的第四重鏈框架區(qū)中的氨基酸殘基，修飾免疫球蛋白，所述鑒別的位置上的氨基酸殘基在參照序列中是蘇氨酸或絲氨酸，而在第四重鏈框架區(qū)中不是蘇氨酸也不是絲氨酸， d)提供編碼免疫球蛋白的核酸序列。
2.人源化免疫球蛋白的方法，包括下列步驟 a)比對免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列與參照序列XXXXTTXTXSS(SEQIDNO :01)或xxxxTxxTxxx(SEQ ID NO :11),獲得最大水平的氨基酸序列同一11"生， b)鑒別第四重鏈框架區(qū)和參照序列中所比對的具有不同氨基酸殘基的氨基酸位置， c)通過用如參照序列中的各蘇氨酸或絲氨酸殘基取代b)中鑒別的位置上的第四重鏈框架區(qū)中的氨基酸殘基，人源化免疫球蛋白，所述鑒別的位置上的氨基酸殘基在參照序列中是蘇氨酸或絲氨酸，而在第四重鏈框架區(qū)中不是蘇氨酸也不是絲氨酸， d)任選的提供編碼人源化免疫球蛋白的核酸序列。
3.生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，包括下列步驟 a)比對免疫球蛋白的第四重鏈框架區(qū)的氨基酸序列與參照序列XXXXTTXTXSS(SEQIDNO :01)或xxxxTxxTxxx(SEQ ID NO :11),獲得最大水平的氨基酸序列同一11"生， b)鑒別第四重鏈框架區(qū)和參照序列中所比對的具有不同氨基酸殘基的氨基酸位置， c)通過用如參照序列中的各蘇氨酸或絲氨酸殘基取代b)中鑒別的位置上的第四重鏈框架區(qū)中的氨基酸殘基，修飾免疫球蛋白，所述鑒別的位置上的氨基酸殘基在參照序列中是蘇氨酸或絲氨酸，而在第四重鏈框架區(qū)中不是蘇氨酸也不是絲氨酸， d)培養(yǎng)包含編碼修飾的免疫球蛋白重鏈氨基酸序列的核酸和編碼相應(yīng)的輕鏈氨基酸序列的核酸的哺乳動物細(xì)胞，用于表達(dá)免疫球蛋白重鏈和輕鏈， e)從哺乳動物細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收免疫球蛋白，從而生產(chǎn)免疫球蛋白。
4.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其特征在于參照氨基酸序列是xxxxTxxTxxx(SEQID NO :11)。
5.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其特征在于鑒別和修飾的是在參照氨基酸序列的第5和/或8位上的蘇氨酸氨基酸殘基。
6.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其特征在于參照序列是序列WGQGTLVTVSS(SEQIDNO :02)，或序歹Ij WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO 03)，或序列 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO 04)，或序列 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO :05)，或序列 WGKGITVTVSS (SEQ ID NO :06)。
7.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其特征在于修飾步驟是 通過用如參照序列中的各蘇氨酸殘基取代在前述步驟中鑒別的位置上的在第四重鏈框架區(qū)中的氨基酸殘基，來修飾免疫球蛋白，所述鑒別的位置上的氨基酸殘基在參照序列中是蘇氨酸，而在第四重鏈框架區(qū)中不是蘇氨酸。
8.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其特征在于方法包括 提供或確定免疫球蛋白重鏈的第四框架區(qū)的氨基酸序列作為第一步。
9.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其特征在于免疫球蛋白是人或人源化的免疫球蛋白。
10.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其特征在于免疫球蛋白是嵌合的免疫球蛋白，或移植CDR的免疫球蛋白，或去T細(xì)胞表位的免疫球蛋白，或其變體。
11.根據(jù)權(quán)利要求3至10的任一項(xiàng)的方法，其特征在于哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞或HEK細(xì)胞。
全文摘要
本文報(bào)道了用于降低溶液中免疫球蛋白聚集的方法，包括步驟i)比較抗體重鏈的第四框架區(qū)的氨基酸序列與參照或種系序列，并且確定一個或多個蘇氨酸殘基和/或絲氨酸殘基是否已被不同的氨基酸殘基替換，和ii)通過將改變的蘇氨酸殘基和/或絲氨酸殘基回復(fù)回參照或種系序列的蘇氨酸或絲氨酸，修飾免疫球蛋白的氨基酸序列，從而降低溶液中免疫球蛋白的聚集。
文檔編號C07K16/00GK102666582SQ201080058439
公開日2012年9月12日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者H·克騰伯格, S·克洛斯特曼, S·紐曼, U·科內(nèi)特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司