專利名稱：針對GPVI的新的拮抗劑抗體及其Fab片段及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了與人血小板膜蛋白糖蛋白VI (GPVI)特異性結(jié)合的新的抗體及其單價片段或衍生物。本發(fā)明的抗體是來自雜交瘤克隆390的抗體和與同被來自雜交瘤克隆390的抗體識別的構(gòu)象表位類似的表位結(jié)合的抗體。這些抗體和Fab片段能夠阻斷膠原結(jié)合，因此防止血小板被膠原活化。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生所公開的抗體和Fab片段的雜交瘤克隆和表達質(zhì)粒。本發(fā)明還涉及單價抗體片段在制造用于治療血栓形成和其它血管疾病的研究試劑、診斷劑及免疫治療劑中的用途。另一方面，本發(fā)明涉及防止受體通過患者特異性抗Fab抗體誘導的受體聚簇而活化的方法。發(fā)明背景 血小板功能在動脈血栓形成和心血管疾病中十分重要。目前，用抗血小板藥物治療患有心血管疾病的患者是理所當然的事。盡管各種臨床上成功的抗血小板治療的可獲得性，但仍然存在對新治療的未被滿足的巨大醫(yī)學需求。這種不足主要是由當前可獲得的藥物的功效有限所造成的，特別是在藥物功效一安全性(出血)相關(guān)性方面。干擾血小板活化和粘附的早期事件(一種不被當前使用的藥物靶向的機制)，可能是改進功效一安全性邊緣(margin)的有吸引力的方法。膠原受體糖蛋白(GPVI)在血小板活化的這些早期事件中非常重要，因此是干擾這個機制的主要靶標(Nieswandt B和Watson SP, Blood. 2003年7月15日；102 (2) :449-61)。已使用來自小鼠和人的血小板,在幾個體外和體內(nèi)系統(tǒng)中描述了GPVI的抗血小板和抗血栓形成作用。缺乏GPVI的血小板變得對膠原(內(nèi)皮下基質(zhì)最重要的血栓形成組分之一)無反應(Lockyer S.等，Thromb Res. 2006 ; 118 (3) : 371-80)。此夕卜，小鼠研究表明，GPVI缺陷引起有效抑制受損血管壁上的動脈血栓形成，而又不增加對自發(fā)性出血的易感性。所有這些數(shù)據(jù)表明，GPVI代表治療動脈血栓形成的有效而安全的靶標。GPVI在起始血栓形成中的重要作用表明，抑制該受體可有益于動脈血栓形成綜合征。這利 用了生物治療性蛋白(例如抗體)這種用于抑制GPVI的具有臨床意義的策略。而且，由于GPVI與其配體膠原的相互作用似乎涉及擴大的蛋白質(zhì)表面，因此與其它策略相比，使用抑制性GPVI結(jié)合蛋白更可能成功干擾這種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。在若干動物模型中已顯示了 GPVI功能被抗體和Fab片段抑制的概念的體內(nèi)證明。仍需要GPVI活性的臨床有效抑制劑。GPVI是只在血小板和巨核細胞上表達的主要膠原受體。與膠原結(jié)合誘導受體聚簇和隨后的血小板活化。這是血栓形成的起始事件之一?，F(xiàn)有抗血小板藥物通過靶向這個過程的晚期事件而干擾血栓形成。這些藥物的嚴重副作用是長期出血，這就限制了它們的使用。有若干系列證據(jù)顯示，靶向血栓形成的早期事件(例如GPVI)可以是高度抗血栓形成的，又不對出血易患性有重大影響。通過中和單克隆抗體(mAb)，可成功地抑制膠原和GPVI之間的相互作用。然而，因為mAb是二價分子，因此它們可誘導GPVI-受體聚簇，并因此誘導血小板活化。為了克服這一點，開發(fā)了單價抗體片段例如Fab片段。遺憾的是，這些單價抗GPVI Fab片段的深度安全性特征分析揭示了仍以患者特異 性方式誘導血小板活化的潛力。為了提供用于治療缺血性事件的安全治療藥，不得不消除所開發(fā)的Fab分子的這種活化潛力。直到現(xiàn)在，這個問題都未得到解決。發(fā)明概述
在第一個方面，本發(fā)明提供與人GPVI和與靈長類動物GPVI特異性結(jié)合的新的單克隆抗體(來自克隆390)。另一方面，本發(fā)明涉及來源于來自克隆390的抗GPVI mAb的可變結(jié)構(gòu)域序列的重組Fab片段。這些抗GPVI抗體和Fab片段識別人GPVI蛋白的Dl和D2結(jié)構(gòu)域中的特異性構(gòu)象表位?？笹PVI mAb和Fab片段兩者能夠抑制膠原與GPVI結(jié)合。將抗GPVI Fab片段人源化并進行改造，旨在改進其與人GPVI的親和力。對人源化變體的生物物理特征進行了描述。 除了抑制膠原以外，抗GPVI Fab片段還能夠抑制在富含人血小板的血漿和人全血兩者中膠原誘導的血小板聚集。這些Fab片段還能夠在膠原包覆的表面上抑制流動中的血栓形成。因此，抗體在人中抑制GPVI似乎成為有吸引力的抗血栓形成策略。出人意料的是，本發(fā)明的抗GPVI Fab誘導GPVI耗盡表型。因此，能夠誘導GPVI耗盡表型的抗GPVI Fab片段構(gòu)成本發(fā)明的另一個目的。本發(fā)明還提供用于防止Fab片段被預先存在的抗體識別的方法，所述方法在于通過加入分子掩蔽(mask) Fab的C末端。本發(fā)明還提供用于防止Fab片段被針對Fab C末端的新抗體識別的方法，所述方法在于通過加入分子掩蔽Fab的C末端。本發(fā)明還提供用于防止在使用抗GPVI Fab時血小板活化的方法，其中通過加入分子掩蔽Fab的C末端。本發(fā)明的另一個目的是在C末端攜帶分子的Fab片段。還提供DNA和蛋白質(zhì)序列以及用于表達本發(fā)明的抗GPVI和Fab片段的載體。本發(fā)明的抗血栓形成藥可用于治療血栓形成性疾病或血管疾病。本發(fā)明還提供包含藥學有效量的本發(fā)明的GPVI特異性單克隆抗體片段與合適賦形劑的抗血栓形成組合物。在本發(fā)明的另一方面，所述抗體可用于診斷有風險的需要抗血栓形成治療的患者。本發(fā)明還包括用于診斷的包括抗GPVI抗體或其片段的試劑盒。本發(fā)明還提供用于制備本發(fā)明的GPVI抗體、抗體片段和掩蔽的抗體Fab片段的方法。發(fā)明詳述
在第一個方面，本發(fā)明提供與人GPVI特異性結(jié)合的新的單克隆抗體和其片段，特別是來自雜交瘤克隆390的抗GPVI mAb。本發(fā)明的抗體拮抗GPVI的全部或部分活性。在本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明人證實，在Fab重鏈(HC) C末端上加入肽具有避免Fab分子被一些患者中預先存在的抗Fab抗體識別的掩蔽作用，從而防止血小板活化和相關(guān)副作用。本文所用“來自雜交瘤克隆390的單克隆抗體”或“來自克隆390的單克隆抗體”是指由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 8限定的抗體及其衍生物，包括人源化抗體、Fab片段和人源化Fab片段或尤其本申請所述這些分子的任何改進形式。
術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，具體地講涵蓋任何同種型(例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)的單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體、嵌合抗體和抗原結(jié)合片段?？赏ㄟ^重組方法，例如在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體文庫，或者通過用抗原或編碼抗原的核酸免疫動物，產(chǎn)生與特定抗原有反應性的抗體。典型的IgG抗體由通過二硫鍵連接的兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成。每條重鏈和輕鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)。每個可變區(qū)含有3個稱為“互補決定區(qū)”(“CDR”)或“超變區(qū)”的區(qū)段，其主要負責與抗原的表位結(jié)合。它們常稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3，從N端順序編號。可變區(qū)中較高度保守的部分稱為“構(gòu)架區(qū)”。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗體及其片段(包括抗體Fab片段)包含由SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22和SEQ ID NO:23限定的6個⑶R。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體及其片段(包括抗體Fab片段)包含由SEQID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:38,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:23 限·定的6個CDR。在另一個具體方面，本發(fā)明的抗體Fab片段包含
(a)重鏈可變區(qū)(HCVR)的互補決定區(qū)(CDR)，其具有由SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20 (或SEQ ID NO:38)限定的氨基酸序列；和
(b)輕鏈可變區(qū)(LCVR)的互補決定區(qū)(CDR)，其具有由SEQID NO:21, SEQ ID NO:22(或SEQ ID NO:39)和SEQ ID NO:23限定的氨基酸序列；和
其中可將各CDR的至少2個氨基酸殘基變成另一個氨基酸殘基而又不直接破壞與GPVI表位殘基的接觸。本文所用“直接破壞與GPVI表位殘基的接觸”是指改變與GPVI表位殘基接觸并描述于本文提供實施例的晶體結(jié)構(gòu)中的抗體氨基酸殘基。本文所用“VH”是指抗體免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFV、dsFV、Fab、Fab’或F(ab’)2片段的重鏈。提及“VL”時是指抗體免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’ 或 F (ab，)2 片段的輕鏈。“多克隆抗體”是在一個或多個其它不同抗體之中或在一個或多個其它不同抗體存在下產(chǎn)生的抗體。一般而言，多克隆抗體是由一種B淋巴細胞在產(chǎn)生不同抗體的若干其它B淋巴細胞存在下產(chǎn)生的。多克隆抗體一般可直接獲自經(jīng)免疫的動物。本文所用的“單克隆抗體”是獲自基本均質(zhì)的抗體群的抗體，即形成該群的抗體基本相同，除了可以少量存在的可能的天然存在的突變。這些抗體針對單一表位，因此是高特異性的。本文所用術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”、抗體的“抗原結(jié)合片段”等包括任何天然存在的、酶法可獲得的、合成的或遺傳改造的與抗原特異性結(jié)合形成復合物的多肽或糖蛋白?？刹捎萌魏魏线m的標準技術(shù)，例如蛋白水解消化或涉及編碼抗體可變結(jié)構(gòu)域和任選恒定結(jié)構(gòu)域的DNA的操作和表達的重組遺傳工程技術(shù)，從例如完整抗體分子得到抗體的抗原結(jié)合片段?？乖Y(jié)合片段的非限制性實例包括(i) Fab片段；(ii) F(ab’)2片段；(iii) Fd片段；(iv) Fv片段；(V)單鏈Fv (scFv)分子；(vi) dAb片段；和(vii)由模擬抗體超變區(qū)(例如分離互補決定區(qū)(CDR))的氨基酸殘基組成的最小識別單元。其它經(jīng)改造的分子例如雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和微型抗體(minibody),也包括在本文所用表述“抗原結(jié)合片段”內(nèi)。本文所用術(shù)語“Fab片段”相當于抗體的輕鏈(LC)加部分重鏈(HC)。Fab分子通過蛋白酶切割I(lǐng)gG分子而產(chǎn)生，或通過表達重組分子而產(chǎn)生。通常除去重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的部分(Fe部分)。本文所用術(shù)語“掩蔽的Fab片段”或“掩蔽的Fab”相當于含有抗體輕鏈(LC)加部分重鏈(HC)的Fab片段，且其中HC的C端被肽延伸以掩蔽Fab不被患者中預先存在的抗體識別。
采用只含有胞外Dl和D2結(jié)構(gòu)域的人重組GPVI蛋白，通過小鼠免疫技術(shù)產(chǎn)生雜交瘤，來獲得本發(fā)明的抗體。用于免疫的蛋白質(zhì)的序列相當于SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4。首先針對其識別人GPVI蛋白的能力，但也針對其阻斷膠原與人GPVI蛋白結(jié)合的能力以及以高親和力與GPVI蛋白結(jié)合的能力，對所得到的mAb進行選擇。所述抗體與靈長類動物GPVI具有交叉反應性(如圖2所示)，而對鼠、大鼠、狗、豬或兔GPVI不存在交叉反應性。所選擇的mAb能夠以PM親和力與人GPVI蛋白結(jié)合(如表I所示)，并以小于10μ g/mL的IC50值阻斷膠原與人GPVI蛋白結(jié)合(如圖IA所示)。該抗體還能夠阻斷膠原與非人靈長類動物GPVI結(jié)合(如圖IB所示)。另一方面，本發(fā)明涉及來源于來自克隆390的抗GPVI mAb的可變結(jié)構(gòu)域序列的重組Fab片段。Fab片段可通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備。例如，可通過無花果蛋白酶切割獲得蛋白水解Fab片段，或者可通過將所需序列克隆至表達載體中來制備重組Fab片段(例如如實施例3B中所述)。像抗GPVI mAb 一樣，F(xiàn)ab片段能夠抑制膠原與GPVI結(jié)合。使Fab片段與GPVI共結(jié)晶，通過X射線晶體學分析以確定被GPVI蛋白上的Fab識別的表位。該分析可供界定包括人GPVI胞外結(jié)構(gòu)域的Dl和D2結(jié)構(gòu)域兩者的構(gòu)象表位。用于表位的編號系統(tǒng)相當于除去20個殘基信號序列的GPVI，如圖16和SEQ ID N0:32所
/Jn ο在本發(fā)明的一個方面，提供與人GPVI構(gòu)象表位特異性結(jié)合并接觸人GPVI殘基(包括Ser 43、Arg 67和Asp 81)的分離抗體或抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明的另一方面，抗體或抗原結(jié)合片段額外與兩個或更多個選自以下的GPVI殘基接觸Pro4、Lys7、Glu40、Lys41> Leu42、Ser44> Ser45、Arg46、Arg65> Trp76> Leu78、Pro79> Ser80> Gln82、Serl65 和Argl66。在本發(fā)明的另一方面，抗體或抗原結(jié)合片段額外與3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上、12個以上、13個以上、14個以上、15 個以上選自以下的 GPVI 殘基接觸Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Trp76> Leu78、Pro79> Ser80> Gln82、Serl65 和 Argl66。本文所用“接觸殘基”定義為這樣的殘基其與GPVI抗原殘基的距離或反向距離小于4. 5 A，如應用例如CCP4軟件包的NCONT軟件程序或等同軟件程序，在GPVI抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與GPVI抗原之間的晶體結(jié)構(gòu)中測量。在一個實施方案中，抗體Fab片段與人GPVI的構(gòu)象表位結(jié)合并接觸人GPVI殘基，其包括 Ser 43、Arg 67 和 Asp 81。在另一個實施方案中，抗體Fab片段與人GPVI的構(gòu)象表位結(jié)合并接觸人GPVI殘基，其包括Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Serl65、Argl66。本發(fā)明的mAb識別相同的構(gòu)象表位，因為Fab片段含有來自克隆390的抗GPVImAb的可變結(jié)構(gòu)域序列。因此，另一方面，本發(fā)明提供抗GPVI抗體(包括Fab片段)，其識別包含于人GPVI蛋白的胞外Dl和D2結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象表位。因此，另一方面，本發(fā)明提供單克隆抗GPVI抗體，其識別包含以下氨基酸的構(gòu)象表位
Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46。
另一方面，本發(fā)明提供抗GPVI抗體，其識別包含以下氨基酸的構(gòu)象表位
Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82。在另一個實施方案中，抗GPVI抗體識別包含以下氨基酸的構(gòu)象表位
Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、
Gln820在另一個實施方案中，抗GPVI抗體識別包含以下氨基酸的構(gòu)象表位
Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Serl65、Argl66。在另一個實施方案中，抗GPVI抗體識別存在于下列氨基酸中的構(gòu)象表位
Pro4、Lys7、Glu40、Lys41、Leu42、Ser43、Ser44、Ser45、Arg46、Arg65、Arg67、Trp76、
Leu78、Pro79、Ser80、Asp81、Gln82、Serl65、Argl66。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗體Fab片段主要包括人GPVI的Dl結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的抗體可定義為這樣的單克隆抗GPVI抗體，其(i)完全抑制包含SEQ IDNO. 6的HC和SEQ ID NO. 8的LC的抗體與人GPVI結(jié)合，和(ii)與類似于被包含SEQ IDNO. 6的HC和SEQ ID NO. 8的LC的抗體識別的構(gòu)象表位的表位或該構(gòu)象表位的一部分結(jié)合，通過生物物理學方法例如表面等離振子共振(如描述于Karlsson R, Larsson A. (2004),J. Mol. Biol. 248，389_415 的 Biacore)測定的親和力為至少 10 nM (KD 彡 1(Γ8 M)。本文所用術(shù)語“KD”是指特定抗體/抗原相互作用的解離常數(shù)。反映人GPVI蛋白與本發(fā)明的抗體和Fab之間的相互作用的Kd包括在[10〃 ；10_1°]區(qū)間內(nèi)。對人GPVI有特異性的抗體表現(xiàn)Kd = 10_7 M，優(yōu)選Kd = 10_8 M，更優(yōu)選Kd = 10_9 M。具有最高親和力的抗體可為Kd = 10, M以下，例如10_n M或10_12M。術(shù)語“特異性結(jié)合”等意指抗體或其抗原結(jié)合片段與GPVI抗原形成在生理條件下相對穩(wěn)定的復合物。特異性結(jié)合可以解離常數(shù)為I xlO—6 M以下為特征。用于測定兩個分子是否特異性結(jié)合的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例如實施例2和實施例3中的平衡透析、表面等離振子共振等。例如，用于本發(fā)明上下文的“特異性結(jié)合”人GPVI的抗體包括以例如在表面等離振子共振測定中測量的下列Kd結(jié)合人GPVI或其部分的抗體小于約1000 nM、小于約500 nM、小于約300 nM、小于約200 nM、小于約100 nM、小于約90 nM、小于約80 nM、小于約70 nM、小于約60 nM、小于約50 nM、小于約40 nM、小于約30 nM、小于約20 nM、小于約10 nM、小于約5nM、小于約4 nM、小于約3 nM、小于約2 nM、小于約I nM或小于約O. 5 nM?！氨砦弧笔强乖峡贵w與之結(jié)合的位點。如果抗原是聚合物，例如蛋白質(zhì)或多糖，則通過抗原聚合物折疊而使連續(xù)殘基或非連續(xù)殘基緊密靠近而形成表位。在蛋白質(zhì)中，由連續(xù)氨基酸形成的表位通常保持暴露在變性溶劑中，被稱為“線性表位”，而由非連續(xù)氨基酸形成的表位通常在所述暴露下喪失，被稱為“構(gòu)象表位”。本文所用術(shù)語“相似表位”涉及這樣一組氨基酸，其位于與由結(jié)晶學分析描述的實際參與來自克隆390的抗體和人GPVI蛋白胞外結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的氨基酸相同的區(qū)域。相似表位可包括若干差異，例如在參比表位附近多達5個氨基酸差異。相似表位還可在鑒定為形成表位的氨基酸(即與GPVI蛋白相互作用的氨基酸)中存在一個或多個修飾。鑒定為參比表位的一部分的一個或多個氨基酸可缺失，且一個或多個其它氨基酸殘基可存在以形成相似表位。例如，與來自雜交瘤克隆390的抗體相比，可改變多達5個氨基酸而又不影響抗體特性。因此，針對一種特異性抗體的表位所處的區(qū)域包括一些潛在的其它相互 作用氨基酸。鑒于此，相似表位可定義為與參比抗體競爭結(jié)合的區(qū)域。當中和抗體與這類區(qū)域結(jié)合時，受體的一個或多個細胞信號轉(zhuǎn)導途徑被抑制，導致靶向受體或更多通常有效的蛋白質(zhì)的一個或多個生物功能特異性受損。本文所用“中和”或“封閉性”抗體應指這樣的抗體，其與GPVI的結(jié)合⑴干擾GPVI和膠原之間的相互作用，(ii)和/或(iv)導致GPVI的至少一種生物功能受抑制。由GPVI中和抗體或封閉性抗體引起的抑制不一定完全，只要采用合適的測定法可檢測即可。本文描述了用于檢測GPVI抑制的示例性測定法。例如，在美國專利6，448，380中說明了與特定生物活性有關(guān)的蛋白質(zhì)中存在拓撲區(qū)。可使用GPVI-Fc融合蛋白作為俘獲抗原，通過競爭性ELISA測定法，選擇與得自克隆390的抗體一樣識別類似表位的抗體。將用GPVI-Fc融合蛋白包被的板與雜交瘤上清液或得自克隆390的抗體或抗原結(jié)合片段一起溫育。不同抗GPVI抗體(通過任何標準技術(shù)標記)與表位封閉的GPVI結(jié)合的缺乏表明識別類似表位?？赏ㄟ^競爭性Biacore分析實施等同的選擇策略，該分析中GPVI被固定，而得自克隆390的抗體(片段)用來封閉表位。接著，針對與表位封閉的GPVI的結(jié)合，對候選的其它GPVI結(jié)合抗體進行分析。因此，可選擇識別與本發(fā)明抗體識別的表位類似的表位的抗體，并可采用X射線分析，通過共晶體結(jié)構(gòu)分析進一步表征。本發(fā)明還涉及人源化和經(jīng)改造的抗GPVI抗體及其片段。在本發(fā)明的情況下，采用之前W02009/032661中描述的方法使抗GPVI Fab片段人源化，但是可以使用本領(lǐng)域已知的任何人源化方法。根據(jù)對Fab與GPVI的晶體復合物的分析，引入若干突變用于人源化，目的在于改進Fab對人GPVI的親和力。因此，產(chǎn)生了 LC的3種變體和HC的5種變體。分別將用于LC (VL)和HC (VH)的這些Fab變體概括于表6和表7。在所有可能的組合中，本發(fā)明特別涉及下列組合
分別對應于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 10 的 VLl 與 VHl分別對應于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 11 的 VLl 與 VH2分別對應于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 12 的 VLl 與 VH3分別對應于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 13 的 VLl 與 VH4分別對應于 SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 14 的 VLl 與 VH5分別對應于 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 11 的 VL2 與 VH2分別對應于 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 11 的 VL3 與 VH2分別對應于 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 13 的 VL3 與 VH4
在一個優(yōu)選的實施方案中，抗GPVI Fab的人源化變體是對應于SEQ ID NO. 15與SEQID NO. 12的VLl與VH3的締合。在本發(fā)明的一個方面，可通過加入標簽或氨基酸突出端(肽)，對抗GPVI抗體的VH進一步修飾以掩蔽抗體不被預先存在的抗體識別?？蓪?個以上組氨酸殘基的序列，特別是(His)6 或(His)7 或(His)8 或者例如 GlyGlyGlyGlySer 或(GlyGlyGlyGlySer) 2 等單元加到重鏈C端上。本文所用“經(jīng)改造的Fab片段”是指經(jīng)遺傳改造以在c端含有重鏈肽突出端的Fab片段。該突出端導致將之前的c端掩蔽，并防止Fab片段被預先存在的抗Fab抗體識別和 彡口口 在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供包含人源化重鏈(HC)氨基酸序列和人源化輕鏈(LC)氨基酸序列和c端突出端的組合的經(jīng)改造的Fab片段。經(jīng)改造的Fab片段還包含選自以下的重鏈可變區(qū)(HCVR)氨基酸序列和輕鏈可變區(qū)(LCVR)氨基酸序列的組合
(a)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 10)；
(b)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 11)；
(c)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 12)；
(d)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 13)；
(e)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 14)；
(f)LCVR (SEQ ID NO. 16)和 HCVR (SEQ ID NO. 11)；
(g)LCVR (SEQ ID NO. 17)和 HCVR (SEQ ID NO. 11);和
(h)LCVR (SEQ ID NO. 17)和 HCVR (SEQ ID NO. 13)。其中c 端突出端選自 SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36 和 SEQ ID NO:37。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明涉及這樣的單克隆抗體，其包含SEQ ID NO. 6的HC和SEQ ID NO. 8的LC或與這些序列有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性但保持與所述單克隆抗體相同活性的序列。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的抗體Fab片段包含(a)具有由SEQ ID NO:6限定的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)具有由SEQ ID N0:8限定的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的抗GPVI抗體和Fab的核酸。在一個實施方案中，核酸分子編碼抗GPVI抗體的HC和/或LC。在一個優(yōu)選的實施方案中，單一核酸編碼抗GPVI抗體的HC，另一個核酸分子編碼抗GPVI抗體的LC。在一個具體的實施方案中，編碼來自雜交瘤390的抗體的HC和LC多肽的核酸或多核苷酸分別對應于SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 7或與這些序列有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性但保持與所述單克隆抗體相同活性的序列。編碼選自SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 17的多肽或與這些序列有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性但保持與所述單克隆抗體相同活性的序列的多核苷酸也是本發(fā)明的組成部分。本發(fā)明提供包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。在一個實施方案中，所述載體含有編碼抗GPVI抗體的HC的多核苷酸。在另一個實施方案中，所述多核苷酸編碼抗GPVI抗體的LC0本發(fā)明還提供包含編碼融合蛋白、修飾抗體、抗體片段及其探針的多核苷酸分子的載體。本發(fā)明的載體含有SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 7的多核苷酸或編碼選自以下的多肽的任何多核苷酸SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ IDNO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16 和 SEQID NO. 17，或與這些序列有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性但保持與所述單克隆抗體相同活性的序列。
為了表達本發(fā)明的抗GPVI抗體或Fab的HC、HC和/或LC的片段，將編碼所述HC和/或LC的多核苷酸插入表達載體，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯序列有效連接。表達載體包括質(zhì)粒、YAC、黏粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、EBV衍生的附加體及技術(shù)人員可了解的適宜確保所述重鏈和/或輕鏈表達的所有其它載體。技術(shù)人員應認識到，可將編碼HC/或HC片段和LC的多核苷酸克隆至不同載體或相同載體中。在一個優(yōu)選的實施方案中，將所述多核苷酸克隆至相同載體中。本發(fā)明的多核苷酸和包含這些分子的載體可用于轉(zhuǎn)化合適的哺乳動物或微生物宿主細胞。轉(zhuǎn)化可以是通過將多核苷酸導入細胞宿主的任何已知方法。這類方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括葡聚糖介導的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣沉淀、Polybrene介導的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包封入脂質(zhì)體、生物射彈注射和將DNA直接顯微注射入核。本發(fā)明的人源化和經(jīng)改造的變體具有拮抗GPVI途徑活性的完整功能。具體講，它們能夠抑制膠原與GPVI結(jié)合。它們還能夠在人富含血小板的血漿和人全血兩者中抑制膠原誘導的血小板聚集。另外，它們還能夠在膠原包覆的表面上抑制流動中的血栓形成。本發(fā)明的抗GPVI Fab片段與GPVI結(jié)合的特征在于血小板表面上發(fā)生GPVI耗盡表型。這是一種新的和未預料到的抗GPVI Fab片段的作用機制?？赏ㄟ^被這些分子靶向的新的表位來測定本文所述Fab片段的這種獨特性質(zhì)。本文所用“GPVI耗盡表型”是指當抗體或抗原結(jié)合片段在血小板表面上與GPVI受體分子結(jié)合時，防止血小板上GPVI途徑的活化的細胞狀態(tài)。這種GPVI耗盡表型可取決于兩種不同的機制(i)從細胞表面除去或耗盡GPVI受體，或者(ii)抗體或抗原結(jié)合片段以不可逆方式與GPVI受體分子結(jié)合，使得保持對受體的抑制持續(xù)細胞壽命。兩種情況下的表型只有隨血小板更新而逆轉(zhuǎn)。這些抗GPVI Fab片段誘導GPVI耗盡表型的事實呈現(xiàn)功效方面的兩個優(yōu)勢
i)如果受體脫落至少是該機制的部分，則該過程一般不依賴于Fab與GPVI結(jié)合。這就意味著如果一部分細胞表面GPVI被Fab占據(jù)(例如30%)可誘導脫落，則脫落過程不限于被Fab占據(jù)的30%的GPVI受體，而是還擴大到游離GPVI。這就意味著用顯著較少的Fab可實現(xiàn)100%的GPVI封閉(通過耗盡)。ii)抑制作用具有長期作用已知Fab片段具有非常短的血漿半壽期，約為1-2小時，這對于其中靶標需要長久抑制的幾種適應癥可能是有問題的。至于所述受體的耗盡或不可逆占據(jù)的機制，該作用的持續(xù)時間(根據(jù)藥效動力學性質(zhì))將與Fab的藥代動力學性質(zhì)無關(guān)聯(lián)。這是因為血小板不能夠置換被影響的受體，一旦誘導耗盡或不可逆抑制，則受體在血小板壽命內(nèi)保持缺乏或不可獲得。這相當于作用持續(xù)時間延長至數(shù)天，這取決于血小板的半壽期(人血小板為10天)。所有這些性質(zhì)表明本發(fā)明的Fab是治療栓形成疾病和血管疾病的合適的候選藥物。基于抗體的生物學的重要靶標類別是可被單克隆抗體以高特異性封閉的膜受體。IgG形式的全長抗體通過其Fv部分結(jié)合并封閉其靶標。Fe部分向這些分子中加入其它功能，導致抗體衍生細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(⑶C)。這些活性常常是mAb作用方式(MoA)、尤其是腫瘤學應用的重要組成部分。然而，在其它應用領(lǐng)域，ADCC/⑶C活性不必減到最低或者不是必需的。因此，需要多種缺乏Fe部分的抗體片段，例如Fab分子。開發(fā)單價抗體片段的另一個原因來源于祀標生物學(target biology)。許多膜受 體在受體聚簇后開始信號轉(zhuǎn)導Uf^BGPVI)。如果這類受體應被封閉，則單價抗體片段是精選的天然形式。對于許多臨床應用而言，抗體片段例如Fab片段是比完整抗體適合得多的形式。這種優(yōu)勢取決于將其與完整抗體相區(qū)分來的Fab片段的若干獨特性質(zhì)，具體地說
-單價如果應避免分子的交聯(lián)，則需要-缺乏Fe結(jié)構(gòu)域如果Fe功能是不必要的或不需要的，則需要-低分子量測定藥代動力學和藥效動力學行為以及組織分布為了在給予患者后保持抗體Fab片段的這些所需性質(zhì)，應避免Fab片段與非靶標分子的相互作用。如前所述，通過IgG分子重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(Fe部分)的缺失獲得Fab片段。遺憾的是，F(xiàn)e的除去暴露出新的C端(或C端)肽，即新表位(neoepitope)。在人中能夠與Fab片段的C末端特異性相互作用的一類特定的蛋白質(zhì)已有報道，并被鑒定為針對抗體片段(例如 Fab)的預先存在的抗體(Kormeier 等(1968) J. Immunol. 100 (3) ; 612-21 ；Persselin 和 Stevens (1985) J. Clin. Invest. 76 ;723_30)。這些預先存在的抗體在生命早期形成，并且是患者依賴性的。至于作為新的治療藥的單克隆抗體和抗體片段的開發(fā)，預先存在的抗Fab抗體的存在出于上述原因限制并使治療性Fab分子的使用復雜化。另外，如前所述，F(xiàn)ab的C末端是用于產(chǎn)生抗體的優(yōu)選表位(Christopoulos C等，1994)。然而，即使在患者沒有或有少量抗C端的預先存在的抗體的情況下，在給予治療性Fab后可能出現(xiàn)針對該表位的新抗體的產(chǎn)生，導致對與預先存在的抗體所述一樣的這種限制。實際上，治療性Fab分子被抗Fab C端表位的預先存在的抗體或新的抗體結(jié)合可改變分子的藥代動力學和藥效動力學行為(例如受體活化而非抑制，根據(jù)從單價成為二價分子的變化)、產(chǎn)生新的復合物和功能(例如加入具有其所有效應子功能的抗體Fe部分)和改變復合物的大小，其也可具有組織分布的結(jié)果。因此，這種現(xiàn)象代表了需要避免的顯著安全性和功效風險。為了避免這些限制，可按本發(fā)明對抗GPVI Fab分子的描述，通過在Fab的C末端添加分子來掩蔽被抗Fab抗體識別的新表位。這個原理對于開發(fā)全部治療性抗體片段是必需的，其中靶標生物學防止使用二價分子(例如在受體通過聚簇活化的情況下)，因此嚴格需要利用單價分子。因此，為了能夠?qū)λ谢颊哌M行最安全的治療，以及避免患者特異性藥代動力學和藥效動力學變異性，應對Fab分子進行修飾以掩蔽在C末端產(chǎn)生的Fab特異性新表位，所述表位可被預先存在的或新產(chǎn)生的抗Fab片段抗體識別。本發(fā)明涉及其中將分子加到C端的Fab片段。該分子可以是肽或任何其它分子類型，能夠掩蔽表位但又不干擾Fab與靶標結(jié)合。在一個具體的實施方案中，能夠掩蔽Fab片段的新表位的所述分子是可包含1-100個氨基酸、1-50個氨基酸、1-20個氨基酸、1-15個氨基酸或1_10個氨基酸的肽。例如，His標簽、G4S或(G4S) 2序列段肽可構(gòu)成合適的分子。
另一方面，本發(fā)明涉及在其重鏈C末端攜帶分子的Fab。在具體實施方案中，在其C末端攜帶分子的Fab片段特異性識別GPVI。在一個優(yōu)選的實施方案中，在前述Fab片段中選擇該Fab片段。在一個具體的實施方案中，F(xiàn)ab重鏈的序列相當于包含SEQ ID NO. 29或SEQ IDNO. 30 或 SEQ ID NO. 31 的序列。在另一個實施方案中，F(xiàn)ab重鏈的序列相當于存在于SEQ ID NO. 29或SEQ IDNO. 30 或 SEQ ID NO. 31 中的序列。本發(fā)明還涉及防止Fab片段被針對C末端的預先存在的抗體或新抗體識別的方法，所述方法在于通過加入分子來掩蔽C末端。因此，該分子可供防止不需要的Fab-抗體復合物的產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及防止在使用抗GPVI Fab時血小板活化的方法，所述方法在于通過加入分子掩蔽Fab的C末端。另一方面，本發(fā)明涉及用于制備在其C末端攜帶分子的修飾的Fab的方法，所述方法包括以下步驟
a.將分子加到Fab的C末端
b.在合適的系統(tǒng)中產(chǎn)生修飾的Fab，包括在細菌、酵母或哺乳動物細胞系中
c.純化修飾的Fab
可將所產(chǎn)生的Fab在合適的溶液中進一步配制。另一方面，本發(fā)明在于本發(fā)明說明書中描述的抗GPVI抗體、特是Fab片段，在治療以下某些臨床適應癥時防止血栓形成事件中的用途例如急性冠狀動脈綜合征、經(jīng)皮冠狀動脈介入、缺血性中風、頸動脈狹窄或外周動脈閉塞性疾病。此外，它可用于預防再狹窄和動脈粥樣硬化。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的抗GPVI抗體，特別是Fab片段與合適賦形劑的組合物。該組合物可用于治療血栓形成性疾病和血管疾病。另一方面，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的抗體的方法。在本發(fā)明的另一方面，抗體可用于診斷GPVI表達變化。已描述了血小板表面上GPVI表達的變化以及血漿中可溶性GPVI (GPVI的切割的胞外結(jié)構(gòu)域)的出現(xiàn)和濃度與病理生理學狀況(例如急性冠狀動脈綜合征、短暫性缺血發(fā)作或中風)可能極為相關(guān)(Bigalke B 等，Eur J Neurol. , 2009 年 7 月 21 日；Bigalke B.等，Semin ThrombHemost. 2007 年 3 月;33 ⑵:179-84)。因此，這些參數(shù)的測量可用來鑒定有前述病況風險、需要抗血栓形成治療和對抗GPVI治療可能特別敏感的患者。因此，本文所述抗體和抗體片段可用作確定血小板表面上以及血漿樣品中GPVI的存在情況和數(shù)量變化的診斷工具和作為診斷試劑盒的組成部分?？贵w及其片段可用來診斷可獲益于抗血栓形成治療的有風險的患者。用于診斷患者中GPVI變化的這種方法，可包 括(i)使所述患者的血小板或血漿樣品與本發(fā)明的抗體或其Fab片段接觸，(ii)測量所述抗體或Fab與存在于所述樣品中的細胞的結(jié)合，和(iii)將步驟(ii)中測量的結(jié)合與正常參比受試者或標準的結(jié)合進行比較。本發(fā)明還包括檢測人GPVI表達變化的診斷試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的抗體或其片段。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可作為ELISA測定試劑盒提供。在本發(fā)明的另一方面，針對在給予本發(fā)明的掩蔽Fab或其它抗體之前抗Fab抗體的存在情況篩選患者。本發(fā)明還提供制備本發(fā)明的抗GPVI抗體或Fab片段的方法，所述方法包括以下步驟
a.培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明的一個HC或HC片段和一個LC的DNA序列的細胞系
b.純化在培養(yǎng)基中表達的抗體或Fab
c.以合宜的形式配制抗體
為了表達本發(fā)明的抗體，可以使用能夠產(chǎn)生免疫球蛋白的任何表達細胞系。可以使用來源于哺乳動物的表達細胞系以及任何其它表達系統(tǒng)，例如酵母細胞(A. H. Horwitz等PNAS. 1988年 11 月；85(22) : 8678-82)或細菌細胞(Chiba Y, Jigami Y. Curr Opin ChemBiol. 2007 年 12 月；11(6) : 670-6)?？赏ㄟ^例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法實現(xiàn)抗體的純化?？贵w的配制取決于這類抗體預期應用。根據(jù)應用，例如藥物應用、獸醫(yī)應用或診斷應用，可凍干或者不凍干、溶于合適的溶液。應注意的是，這種一般說明以及下面的詳細說明只是示例性和說明性的，并且對于本發(fā)明不應是限制性的。說明書中包括的


了旨在解釋本發(fā)明原理的幾個本發(fā)明的實施方案。附圖簡述
圖I :膠原結(jié)合的抑制，通過競爭ELISA。(A)針對hGPVI-Fc和(B)針對彌猴GPVI-Fc的劑量依賴性(IC50)。圖2 :通過ELISA對針對人和靈長類動物GPVI選擇的雜交瘤mAb進行交叉反應性分析。圖3 :通過無花果蛋白酶切割來自雜交瘤克隆390的IgG產(chǎn)生的Fab。圖4 :通過抗GPVI Fab片段(VLl與VH3)抑制膠原誘導的血小板聚集。圖5 :表明在Fab和人GPVI胞外結(jié)構(gòu)域蛋白之間的相互作用的晶體學數(shù)據(jù)。(A)GPVI蛋白的D2結(jié)構(gòu)域和Fab之間的相互作用。(B)在GPVI蛋白的Dl結(jié)構(gòu)域和Fab之間的相互作用。(C) GPVI蛋白的D1-D2結(jié)構(gòu)域和Fab之間的相互作用。圖6 :在膠原誘導的全血聚集中抗GPVI Fab片段抑制活性的IC50曲線的實例。
圖7 :抗GPVI-Fab片段抑制流動中血栓形成的實例。圖8 :抗GPVI Fab以濃度依賴性方式引起GPVI表面表達的降低。圖9 :抗GPVI Fab以時間依賴性方式引起顯著的GPVI耗盡。圖10 -M GPVI Fab對離體全血血小板聚集的作用(激動劑1 μ g/ml)。A—在Img/kg IV推注給予后。B—在3 mg/kg IV推注給予后。圖11 :全血血小板聚集測定中抗GPVI Fab的體外活性(激動劑1 μ g/ml)。圖12 : IV推注給予抗GPVI Fab對血小板計數(shù)的作用。A — 3ml/kg的PBS溶媒(對照)之后。B—O. 01 mg/kg 的抗 GPVI FAb 之后。C一O. I mg/kg 的抗 GPVI FAb 之后。D—I mg/kg 的抗 GPVI FAb 之后。E—3 mg/kg 的抗 GPVI FAb 之后。
圖13 :在iv給予抗GPVI Fab后，血小板上GPVI受體表達的FACS分析。垂直線把左側(cè)GPVI陰性血小板與右側(cè)GPVI陽性血小板分隔開來。A—給藥前。B—給藥后24小時。C一給藥后48小時。D—給藥后72小時。E—給藥后150小時。圖14 -M GPVI Fab對血小板活化的作用。在對照組圖中，加入驚厥肽。組圖A中，在IgG耗盡后加入Fab。在組圖B中，加入修飾的Fab。圖 15 =A-Fab 對照；B—Fab_His 標簽；C—FabGly4Ser 和 Fab-(Gly4Ser) 2。圖16 :除去20個殘基信號序列的GPVI (對應于SEQ ID NO:32)。黑體殘基表示與抗體CDR接觸的構(gòu)象表位。
實施例實施例I :GPVI的重組胞外Dl和D2結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生 A—hGPVI-hFc融合表汰質(zhì)粒(hGPVI-hFc)的構(gòu)津
使用含有人cDNA的質(zhì)粒作為PCR模板，擴增編碼237個氨基酸殘基重鏈恒定區(qū)(包括人免疫球蛋白IgG的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域)的DNA片段。使用人基因組DNA作為PCR模板，擴增編碼205個氨基酸殘基人GPVI Dl和D2胞外結(jié)構(gòu)域的DNA片段。該人GPVI Dl和D2片段包括信號序列，相當于野生型蛋白質(zhì)(NP_057447/ Q9HCN6)的氨基酸M1-T205。將所得的編碼人GPVI Dl和D2及人Fe區(qū)的擴增、切割和純化的PCR產(chǎn)物通過連接PCR結(jié)合，并使用EcoRI和NotI位點，通過InFusion方法，連接至桿狀病毒表達載體PVL1393中。所得的GPVI-Fc ORF被列為SEQ ID NO. 1，其相應的蛋白質(zhì)序列被列為SEQ ID NO. 2。B—GPVI-tev-his 表達質(zhì)粒(GPVI-tev-his)的構(gòu)建
使用含有前述GPVI-Fc的質(zhì)粒作為PCR模板，擴增人GPVI Dl和D2胞外結(jié)構(gòu)域，其包括相當于野生型蛋白質(zhì)(Swissprot Q9HCN6)中的氨基酸M1-T205的信號序列。反向引物含有編碼tev切割識別序列和代表構(gòu)建體C端的His標簽的7個組氨酸殘基的DNA。所得的擴增PCR片段用限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI + NotI切割，并連接至桿狀病毒表達載體pVL1393中。所得ORF被列為SEQ ID NO. 3，其相應的蛋白質(zhì)序列被列為SEQ ID NO. 4。C—hGPVI-hFc 和 GPVI-tev-his 蛋白的表汰和純化
將生長在SF900 II無血清懸浮培養(yǎng)基(Invitrogen)中的SF9細胞用表達質(zhì)粒和FlashBac 桿狀病毒 DNA (Oxford Expression Technologies)共轉(zhuǎn)染。使用 Cellfectin 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)進行轉(zhuǎn)染。5小時后，將5%總胎牛血清加入轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中。將細胞在28°C下培養(yǎng)5天。含有重組病毒的培養(yǎng)上清液用于在含有5%胎牛血清的SF900 II懸浮培養(yǎng)基中進行較大規(guī)模的病毒擴增。對于蛋白質(zhì)表達,將生長在ExCell 405 (SAFC)中的HighFive (Invitrogen)細胞用適量的病毒母液轉(zhuǎn)導，并在27°C下培養(yǎng)72小時。在收獲細胞培養(yǎng)物后，上清液經(jīng)過濾澄清(O. 22 μ m)。對于純化，在A蛋白基質(zhì)(GE Healthcare)上俘獲Fe-融合GPVI蛋白變體，并通過pH變化洗脫。采用Superdex 200 (GE Healthcare)通過SEC對蛋白質(zhì)精加工(polish)和最終的超濾濃縮步驟后，蛋白質(zhì)用于ELISA和進一步的測定。對于純化，將有His標簽的GPVI蛋白變體直接從上清液中俘獲在IMAC基質(zhì)(HisTrap, GE Healthcare)上，并通過咪唑(imidazol)梯度洗脫。使用 Superdex 75 (GE Healthcare)通過SEC對蛋白質(zhì)精加工并超濾后，蛋白質(zhì)用于所示的實驗。實施例2 :功能性抗GPVI mAb的產(chǎn)生和選擇 A—抗GPVI mAb的產(chǎn)生
采用 Kilpatrick 等人(1997. Hybridoma 16 :381389)描述的 RIMMS 方法，產(chǎn)生 GPVI特異性抗體。在14天進程中以3-4天的間隔，使6-8周齡雌性BALB/c小鼠(S082342 ；CharlesRiver Labs, Bar Harbor, ME)各接受4輪用純化的可溶性有his標簽的GPVI蛋白(按照實施例I所述制備)免疫。對于在第O天的第一次免疫,將在Titermax佐劑(TierMax Gold Adjuvant ；Sigma#T2684)中乳化的5 μ g抗原沿小鼠背部皮下給予接近引流淋巴結(jié)的6個部位。在RIBI佐劑(Sigma Adjuvant系統(tǒng)；Sigma #S6322)中乳化的另外5 μ g抗原沿腹部給予6個并列部位。以類似方式，在第4、7和11天給予加強免疫。最后一次注射后4天，處死小鼠。無菌分離出雙側(cè)胭淋巴結(jié)、淺表腹股溝淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)和肱(branchial)淋巴結(jié)，用新鮮RPMI培養(yǎng)基洗滌。從淋巴結(jié)釋放出淋巴細胞，所得單一細胞懸液用RPMI培養(yǎng)基洗滌兩次后，使用聚乙二醇將其與P3X63-AG8. 653骨髓瘤細胞融合。融合后，將細胞混合物在培養(yǎng)箱中于37°C溫育16-24小時。將所得細胞制備物轉(zhuǎn)移到選擇性半固體培養(yǎng)基中，無菌鋪板于100 mm培養(yǎng)皿中，在37°C下溫育。開始選擇后10天，針對雜交瘤生長對板進行檢查，挑出可見集落，置于含有200μ L生長培養(yǎng)基的96孔板中。將96孔板保持在37 °C的培養(yǎng)箱中2_4天。B—識別人GPVI蛋白的mAb的篩選
使用GPVI-Fc融合蛋白(按照實施例I所述制備)作為俘獲抗原，通過ELISA進行抗GPVI IgG產(chǎn)生的初步篩選。板用GPVI-Fc融合蛋白包被，將雜交瘤上清液加到板中，通過使用與辣根過氧化物酶(Sigma ；#A9044)綴合的兔抗小鼠IgG檢測。通過加入TMB-H202緩沖液觀測抗體結(jié)合，并在450 nm的波長下讀數(shù)。在從96孔板選擇的367個雜交瘤中，129個雜交瘤對抗人GPVI抗體產(chǎn)生是陽性的，然后111個在細胞擴增后得到證實。C一抗GPVI mAb阻斷膠原與人GPVI結(jié)合的能力
在競爭ELISA結(jié)合測定法中，針對其阻斷膠原與人GPVI-Fc融合蛋白結(jié)合的能力進行了二次篩選以表征所有人GPVI特異性mAb的功能性質(zhì)。使用訂制的膠原包被的96孔板(Pierce)。將人GPVI-Fc融合蛋白和雜交瘤上清液的預溫育混合物加入板中，通過使用與辣根過氧化物酶(Sigma ；#A0170)綴合的山羊抗人IgG-Fc，檢測膠原-人GPVI-Fc復合物。通過加入TMB-H202緩沖液觀測抗體結(jié)合，并在450 nm的波長下讀數(shù)。在100個GPVI結(jié)合雜交瘤中，22個雜交瘤阻斷GPVI-Fc與膠原結(jié)合(閾值90%抑制)。采用如圖IA所示的競爭ELISA測定法，證實預選擇的mAb對人GPVI的阻斷性質(zhì)是劑量依賴性的。與通過使用小鼠IgG同種型測定試劑盒(SEROTEC ；#MMT1)測定的一樣，所有拮抗劑mAb與IgGl K是同種型(數(shù)據(jù)未顯示)。D—杭GPVI mAb的結(jié)合件質(zhì)
通過表面等離振子共振(BIAcore 2000)進行最后一次篩選以評價GPVI封閉性抗體的結(jié)合性質(zhì)。在該項分析中，我們評價了人GPVI蛋白與固定在共價連接CM芯片的抗Fe抗體
上的抗人 GPVI mAb 的相互作用。采用 Canziani 等，2004. Anal. Biochem. 325:301-307描述的方案，進行了各個mAb的結(jié)合動力學測定。所有封閉性mAb顯示與人GPVI呈(亞)納摩爾范圍的親和力(表I)。根據(jù)靶標親和力，選擇來自雜交瘤克隆390的抗體用于進一步開發(fā)。復I :選定的抗hGPVI mAb的親和力和締合速率/解離速率
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E—抗GPVI mAb與靈長類動物GPVI蛋白的交叉反應性性質(zhì)
通過ELISA，針對其結(jié)合靈長類動物GPVI-Fc蛋白的能力，對表I列舉的GPVI特異性mAb進行了評價。板用靈長類動物GPVI-Fc融合蛋白包被，將抗hGPVI mAb加入板中，用與辣根過氧化物酶(Sigma ；#A9044)綴合的兔抗小鼠IgG檢測。通過加入TMB-H202緩沖液觀測抗體結(jié)合，并在450 nm的波長下讀數(shù)。通過在半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對預選擇的雜交瘤進行克隆。以125個細胞/mL接種至培養(yǎng)皿中，針對GPVI結(jié)合、GPVI阻斷活性和與靈長類動物GPVI的交叉反應性篩選顯示顯著生長的克隆。如圖IB和圖2所示，所有mAb均與靈長類動物GPVI交叉反應。用于靈長類動物(食蟹猴(lfecaca /kscicWaris或cynomolgus) GPVI的胞外結(jié)構(gòu)域的序列如SEQ ID NO. 27和SEQ ID NO. 28所述。F—杭GPVI mAb的重鏈和輕鏈序列的測定
如下獲得編碼單克隆抗體可變結(jié)構(gòu)域的cDNA :用來自Qiagen的Oligotex試劑盒，從雜交瘤細胞中提取mRNA。利用Gene Racer試劑盒(Invitrogen)、55 °C下的轉(zhuǎn)錄酶Superscript III (Invitrogen)和表 2 所述引物(RACEM0G1 或 CKF0R),通過 RACE 方法,經(jīng)RT-PCR擴增相應的cDNA。用55°C下的聚合酶Phusion (Finnzymes)和亦在表2中描述的引物，通過PCR擴增cDNA片段。表2.用于RT-PCR和PCR的引物
權(quán)利要求
1.一種抗體Fab片段，其與人GPVI特異性結(jié)合并誘導GPVI耗盡表型。
2.權(quán)利要求I的抗體Fab片段，其中所述抗體Fab片段與人GPVI的構(gòu)象表位結(jié)合，并接觸包括Ser 43、Arg 67和Asp 81的人GPVI殘基。
3.權(quán)利要求I或2的抗體Fab片段，其中所述Fab片段包含 (a)重鏈可變區(qū)(HCVR)的互補決定區(qū)(CDR)，其具有由SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20限定的氨基酸序列；和 (b)輕鏈可變區(qū)(LCVR)的互補決定區(qū)(CDR)，其具有由SEQID NO:2U SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23限定的氨基酸序列；且 其中各CDR的至少2個氨基酸殘基可變成另一個氨基酸殘基而又不直接破壞與GPVI表位殘基的接觸。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的抗體Fab片段，其中所述抗體Fab片段包含SEQID NO. 6的重鏈和SEQ ID NO. 8的重鏈或與這些序列有至少80%同一性的序列，只要保持抗體Fab片段結(jié)合特異性即可。
5.前述權(quán)利要求中任一項的抗體Fab片段，所述抗體Fab片段是人源化的。
6.權(quán)利要求5的抗體Fab片段，其中所述人源化Fab片段包含選自以下的重鏈可變區(qū)(HCVR)氨基酸序列和輕鏈可變區(qū)(LCVR)氨基酸序列的組合(a)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 10)；(b)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 11)；(c)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 12)；(d)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 13)；(e)LCVR (SEQ ID NO. 15)和 HCVR (SEQ ID NO. 14)；(f)LCVR (SEQ ID NO. 16)和 HCVR (SEQ ID NO. 11)；(g)LCVR (SEQ ID NO. 17)和 HCVR (SEQ ID NO. 11);和(h)LCVR (SEQ ID NO. 17)和 HCVR (SEQ ID NO. 13)。
7.—種經(jīng)改造的Fab片段，其包含人源化重鏈(HC)氨基酸序列和人源化輕鏈(LC)氨基酸序列的組合，其中所述人源化重鏈還包含c端突出端，所述c端突出端包含額外的氨基酸殘基，且其中所述c端突出端防止被抗Fab抗體識別。
8.權(quán)利要求7的經(jīng)改造的Fab片段，其中所述c端突出端選自SEQID NO:35,SEQ IDNO:36 和 SEQ ID NO:37。
9.權(quán)利要求7或8的經(jīng)改造的Fab片段，其中所述Fab片段如權(quán)利要求1_6中任一項所限定。
10.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-9中任一項限定的抗體Fab片段和藥學上可接受的載體或賦形劑。
11.一種編碼選自以下的多肽的多核苷酸SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13,SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 17或與這些序列有至少80%同一性的序列，只要所述多肽保持其結(jié)合特異性即可。
12.一種用于制備權(quán)利要求1-9中任一項限定的抗體Fab片段的方法，所述方法包括以下步驟a.培養(yǎng)表達權(quán)利要求1-9限定的抗體Fab片段的細胞系， b.純化在培養(yǎng)基中表達的Fab片段， c.以合宜形式配制Fab片段。
13.權(quán)利要求1-9中限定的抗體Fab片段，其用于預防或治療血栓形成性疾病和血管疾病。
14.一種用于防止抗體Fab片段被預先存在的抗體識別的方法，所述方法在于通過加入分子掩蔽抗體Fab片段的c末端。
15.一種用于防止在使用抗GPVI Fab時血小板活化的方法，所述方法在于通過加入分子掩蔽抗體Fab片段的c末端。
全文摘要
本發(fā)明公開了與人血小板膜蛋白糖蛋白VI(GPVI)特異性結(jié)合的新的抗體及其單價片段或衍生物。本發(fā)明的抗體是來自雜交瘤克隆390的能夠誘導GPVI耗盡表型的抗體及其片段抗體。這些抗體和Fab片段能夠阻斷膠原結(jié)合，因此防止血小板被膠原活化。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生所公開的抗體和Fab片段的雜交瘤克隆和表達質(zhì)粒。本發(fā)明還涉及單價抗體片段在制備用于治療血栓形成及其它血管疾病的研究試劑、診斷劑及免疫治療劑中的用途。本發(fā)明還涉及在C末端攜帶分子的Fab，以及使用這類修飾的Fab防止Fab被抗體識別的方法。本發(fā)明涉及用于防止在使用抗GPVIFab時血小板活化的方法。
文檔編號C07K16/28GK102725309SQ201080061679
公開日2012年10月10日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者B.卡梅倫, C.恩格爾, C.朗格, C.科維伊, E.勞, F.布朗什, I.?？? J.克呂普, K.克魯爾, M.洛倫茨, N.博蘭, P.弗洛里安, P.沃內(nèi)羅夫, T.蘭格, T.達布杜比, V.米科爾 申請人:賽諾菲