專利名稱：用于制備產(chǎn)生期望的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求于2009年11月19日提交的日本專利申請(qǐng)?zhí)?009-264398以及于2009年11月20日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/263，285的優(yōu)先權(quán)，其完整內(nèi)容通過引用并入到本文中。本發(fā)明涉及將編碼期望的多肽的DNA導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域中的方法。本發(fā)明還涉及用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，以及用于產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的方法。本發(fā)明還涉及用于上述方法中的細(xì)胞和基因打靶載體。背景領(lǐng)域響應(yīng)抗原刺激而產(chǎn)生的抗體的親和力在體內(nèi)隨時(shí)間而升高。這被稱為“親和力成熟”。在活化后活躍分裂的抗原特異性B細(xì)胞中，在抗體可變區(qū)基因中高頻率地發(fā)生體細(xì)胞突變。親和力成熟通過從不同的突變B細(xì)胞的群體中嚴(yán)格地選擇高親和力的B細(xì)胞克隆來進(jìn)行?；谠撛瓌t，常規(guī)上通過重復(fù)地免疫動(dòng)物和制備雜交瘤來生產(chǎn)單克隆抗體。但是，制 備抗體需要大量的勞動(dòng)和時(shí)間，且制備出的抗體的抗原特異性和親和力不能改變。然而，在許多情況下，為了制藥或診斷試劑的用途，需要進(jìn)一步改善制備出的抗體的特異性和親和力。出于該目的，目前通常使用噬菌體展示方法，這是一種體外技術(shù)。在噬菌體展示方法中，可以比雜交瘤方法更快速地實(shí)施選擇抗體的方法。但是，已知噬菌體展示方法存在問題。例如，抗體的成功產(chǎn)生在很大程度上依賴于文庫的質(zhì)量，由于Fv結(jié)構(gòu)域是作為重組svFv展示在噬菌體上的，因而當(dāng)從scFv制備完整抗體并表達(dá)時(shí)，特異性經(jīng)常改變。特別是對(duì)于該方法而言關(guān)鍵性的突變文庫的制備需要大量的工作和先進(jìn)的DNA重組技術(shù)。認(rèn)為如果利用體外培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)來重現(xiàn)體內(nèi)抗體生產(chǎn)系統(tǒng)，可以快速高效地生產(chǎn)抗體。具有向抗體基因?qū)胪蛔兊哪芰Φ腄T40雞B細(xì)胞系適用于該目的，理由如下(I)由于它們自發(fā)地導(dǎo)入突變的能力，可以通過簡(jiǎn)單地培養(yǎng)DT40細(xì)胞而生產(chǎn)多種抗體文庫；(2)因?yàn)镈T40細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)抗體并將它們分泌到培養(yǎng)上清液中，所以可以基于抗原結(jié)合來選擇特定克??；(3)由于非常高的同源重組效率，因而可以通過基因敲除等方便地修飾DT40細(xì)胞的功能。本發(fā)明人建立了 DT40-SW細(xì)胞系，其中DT40的一種突變特征(mutation feature)可以任意開啟和關(guān)閉。然后，本發(fā)明人開發(fā)了用于在體外使用DT40-SW生產(chǎn)抗體的方法(專利文件I和非專利文件I)。使用該方法，本發(fā)明人通過開啟突變特征并培養(yǎng)，成功的從抗體文庫中制備了抗各種抗原的抗體，包括難以通過常規(guī)方法獲得的抗體(非專利文件2和3)。此外，該方法允許通過進(jìn)一步導(dǎo)入突變到制備出的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中以產(chǎn)生多種多樣的抗體，并重復(fù)進(jìn)行抗體選擇，而實(shí)現(xiàn)抗體親和力成熟(專利文件2)。通過該方法制備的抗體是雞IgM抗體，親和力成熟僅對(duì)于通過該方法制備的這些抗體是可能的。因此，如果該方法可以應(yīng)用于通過雜交瘤方法、噬菌體展示方法等制備的抗體，則將是非常有用的技術(shù)，因?yàn)樗梢杂糜诟纳品e累的單克隆抗體的特異性和親和力。改善通過雜交瘤方法獲得的抗體的性質(zhì)需要使用體外系統(tǒng)，例如噬菌體展示方法。但是，基于噬菌體展示的抗體功能改變不一定是簡(jiǎn)單的技術(shù)。同時(shí)，對(duì)于具有突變能力的細(xì)胞系(例如DT40)，已通過向其自身的抗體基因?qū)胪蛔兌鴮⑵渥魑膸?非專利文件
2、4和5)。但是，尚未有關(guān)于使用此類細(xì)胞系修飾外源抗體基因的報(bào)道。引用列表專利文獻(xiàn)PTLl :日本專利申請(qǐng)公開號(hào)(JP-A) 2006-109711(未審查，已公開的日本專利申請(qǐng))
PTL2 JP-A(Kokai)2009-60850PTL3 W02007/026661非專利文獻(xiàn)NPLl Kanayama, N.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 327，70-75Todo, K.等人，J. Biosci. Bioeng. 102，478-481 (2006)Kanayama, N.等人，YAKUGAKU ZASSHI 129,11-17(2009) Cumbers, S. J.等人，Nat. Biotechnol. 20，1129-1134 (2002)Seo, H.等人，Nat. Biotechnol. 23，731-735 (2005)Fawell 等人，Characterization and colocalization of steroid binding anddimerization activities in the mouse estrogen receptor. Cell (1990),第 60 卷，(6)第953-62頁Danielian等人，Identification of residues in the estrogen receptor thatconfer differential sensitivity to estrogen and hydroxytamoxifen. Mol Endocrinol(1993)，第 7 卷，(2)，第 232-40 頁Littlewood 等人,A modified oestrogen receptor ligand-binding domain asan improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic AcidsRes (1995)，第 23 卷，(10)，第 1686 頁Zhang 等人，Inducible site-directed recombination in mouse embryonicstem cells. Nucleic Acids Res (1996),第 24 卷,(4),第 543-8 頁發(fā)明概述技術(shù)問題如果可以將編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的基因?qū)氲娇贵w生產(chǎn)細(xì)胞(例如DT40)的抗體基因座中，則可以利用抗體生產(chǎn)細(xì)胞的導(dǎo)入突變的能力來修飾DNA。但是，用于將外源DNA導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體基因座中的有效技術(shù)尚未被研發(fā)出來。本發(fā)明是鑒于上述情況實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供將編碼期望的氨基酸序列的DNA導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域中的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供用于制備產(chǎn)生多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，用于產(chǎn)生多肽的方法，用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，和用于產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供用于上述方法中的細(xì)胞和包含所述細(xì)胞的試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供用于上述方法的基因打靶載體，以及包含所述載體的細(xì)胞和試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供包含編碼雞抗體重鏈可變區(qū)的DNA的DNA，包含所述DNA的載體，和包含所述DNA或載體的細(xì)胞。解決問題的手段本發(fā)明人開發(fā)了用于將編碼期望的氨基酸序列的DNA高效地導(dǎo)入到DT40-SW的抗體可變區(qū)基因座中的方法，DT40-SW是源自DT40雞B細(xì)胞系的突變細(xì)胞系，具有自發(fā)導(dǎo)入突變的能力。該方法允許通過突變所導(dǎo)入的DNA而修飾多肽，使其具有更好的功能。特別是，本發(fā)明人揭示了 DT40細(xì)胞系的抗體重鏈可變區(qū)基因座的核苷酸序列。藉此，本發(fā)明人成功的構(gòu)建了能夠用編碼期望的氨基酸序列的DNA高效地取代DT40細(xì)胞系的抗體重鏈可變區(qū)基因座的打靶載體。
本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)的，并涉及以下內(nèi)容[I]將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼包含抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的方法，包括將包含DNA構(gòu)建體的打靶載體導(dǎo)入抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的步驟，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。[2] [I]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，且其中⑶的DNA包括在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，且(3)的DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除。[3]選擇細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ;和(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞。[4] [3]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，且(3)的DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶而從DNA構(gòu)建體中被去除。[5] 一種制備產(chǎn)生多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟
(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ；
(b)選擇其中在DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和(c)從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。[6] [5]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，且(3)的DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除。[7] [5]的方法，其中步驟(a)至(c)定義如下(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和(C)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從該細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA。[8] [5]至[7]中任一項(xiàng)的方法，其中所生產(chǎn)的多肽被展示在細(xì)胞的表面上，和/或被分泌到細(xì)胞外。[9] [4]、[6]和[7]中任一項(xiàng)的方法，其中利用所述標(biāo)記基因的表達(dá)作為指標(biāo)來選擇所述細(xì)胞。[10] [3]、[4]、[6]、[7]和[9]中任一項(xiàng)的方法，其中利用內(nèi)源性抗體表達(dá)在所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的缺失作為指標(biāo)來選擇所述細(xì)胞。[11] 一種制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)通過向表達(dá)AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；
(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和(c)從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。[12] [11]的方法，其中步驟(a)至(c)定義如下(a)通過向表達(dá)AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允
許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和(c)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從所述細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA。[13] 一種制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞中AID基因表達(dá)可以人為開啟和關(guān)閉，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和(c)從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除(3)的DNA ；(d)開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和(e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。[14] [13]的方法，權(quán)利要求13的方法，其中步驟(a)至(e)定義如下(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，其中所述打靶載體包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和
(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除，其中該抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，且抗體生產(chǎn)細(xì)胞包含這樣的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA，位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA能夠被位點(diǎn)同一性重組酶倒位，并包含外源性AID基因；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；(C)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從所述細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位 點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA ；(d)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而使位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA轉(zhuǎn)位，以開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和(e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。[15] [13]的方法，其中步驟(a)至(e)定義如下(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，其中抗體生產(chǎn)細(xì)胞中內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，且該抗體生產(chǎn)細(xì)胞包含DNA構(gòu)建體，其包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNAjP位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶轉(zhuǎn)位，并包含外源性AID基因，和包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA的DNA構(gòu)建體，其中在所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，位點(diǎn)特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，在沒有胞外刺激的條件下不活化，其中所述打靶載體包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ;(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；(C)通過對(duì)步驟(b)中選擇的細(xì)胞的胞外刺激活化位點(diǎn)特異性重組酶的活性，使所述位點(diǎn)特異性重組酶在所述細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)，藉此從所述細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA ；(d)通過對(duì)步驟(b)中選擇的細(xì)胞的胞外刺激活化位點(diǎn)特異性重組酶的活性，使所述位點(diǎn)特異性重組酶在所述細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)，藉此使所述位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA轉(zhuǎn)位，以開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和(e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。
[16] [11]至[15]中任一項(xiàng)的方法，其中所產(chǎn)生的導(dǎo)入了突變的多肽被展示在細(xì)胞表面上和/或分泌到細(xì)胞之外。[17] [11]至[16]中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)中利用標(biāo)記基因的表達(dá)作為指標(biāo)選擇細(xì)胞。[18] [11]至[17]中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)中利用抗體生產(chǎn)細(xì)胞中內(nèi)源性抗體表達(dá)的缺失作為指標(biāo)選擇細(xì)胞。[19] [15]的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶是位點(diǎn)特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的融合蛋白；且其中能夠結(jié)合雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體充當(dāng)胞外刺激。[20] [19]的方法，其中雌激素受體或其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是小鼠突變型雌激素受體，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突變型雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；且其中能夠結(jié)合雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體是4-羥泰米芬。[21] [11]至[20]中任一項(xiàng)的方法，其中抗體生產(chǎn)細(xì)胞具有下列特性(a)在該抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，XRCC3基因的兩個(gè)等位基因中僅一個(gè)是失活的；和(b)與具有XRCC3基因的兩個(gè)等位基因的細(xì)胞相比，導(dǎo)入點(diǎn)突變的頻率是升高的。[22] [21]的方法，其中在XRCC3基因的兩個(gè)等位基因的任一個(gè)中，第6個(gè)外顯子是失活的。[23] [11]至[22]中任一項(xiàng)的方法，其中抗體生產(chǎn)細(xì)胞是B細(xì)胞。[24] [23]的方法，其中B細(xì)胞源自雞。[25] [2]、[4]、[6]、[7]、[9]、[10]、[12]、[14]和[15]中任一項(xiàng)的方法，其中位點(diǎn)特異性重組酶和位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列的組合是下列(i)或(ii)(i)位點(diǎn)特異性重組酶是Cre重組酶，且位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列是IoxP序列；(ii)位點(diǎn)特異性重組酶是FLP重組酶，且位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列是FRT序列。[26] [I]至[25]中任一項(xiàng)的方法，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區(qū)的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。[27] [26]的方法，其中期望的氨基酸序列是抗體可變區(qū)的氨基酸序列。[28] [I]至[25]中任一項(xiàng)的方法，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。[29] 一種用于產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA的方法，包括下述步驟(a)通過[5]_[8]和[11]_[24]中任一項(xiàng)的方法制備產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞；
(b)從步驟(a)制備的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中分離編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA。[30] 一種用于產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡姆椒?，包括下述步驟(a)通過[5]_[8]和[11]_[24]中任一項(xiàng)的方法制備產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞；(b)從步驟(a)生產(chǎn)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中或從來自所述細(xì)胞的分泌產(chǎn)物中分離所述多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯?。[31]產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡姆椒?，包括下述步驟(a)通過[29]的方法產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA ；(b)分離由步驟(a)生產(chǎn)的DNA編碼的多肽。
[32]抗體生產(chǎn)細(xì)胞，其中包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域與DNA構(gòu)建體同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。[33] [32]的細(xì)胞，其中(3)的DNA是這樣的DNA :其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，且其包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除。[34] [32]或[33]的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞表達(dá)AID基因。[35] [32]或[33]的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞是其中AID基因表達(dá)可以被人為開啟和關(guān)閉的細(xì)胞。[36] [35]的細(xì)胞，其中內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，且細(xì)胞包括這樣的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ;和位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶轉(zhuǎn)位，并且包含外源性AID基因。[37] [36]的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞還包含如下所述的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA，其中該位點(diǎn)特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少胞外刺激的條件下不活化。[38] [37]的細(xì)胞，其中位點(diǎn)特異性重組酶是位點(diǎn)特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的融合蛋白。[39] [38]的細(xì)胞，其中雌激素受體或其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是小鼠突變型雌激素受體，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突變型雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。[40] [32]至[39]中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞具有下列特性(a)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，XRCC3基因的兩個(gè)等位基因中僅一個(gè)是失活的；和(b)與具有XRCC3基因的兩個(gè)等位基因的細(xì)胞相比，導(dǎo)入點(diǎn)突變的頻率是升高的。[41] [40]的細(xì)胞，其中在XRCC3基因的兩個(gè)等位基因的任一個(gè)中，第6個(gè)外顯子是失活的。
[42] [32]至[41]中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中抗體生產(chǎn)細(xì)胞是B細(xì)胞。[43] [42]的細(xì)胞，其中B細(xì)胞源自雞。[44] [33]和[36]-[39]中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中位點(diǎn)特異性重組酶和位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列的組合是下列⑴或(ii):(i)位點(diǎn)特異性重組酶是Cre重組酶，且位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列是IoxP序列；(ii)位點(diǎn)特異性重組酶是FLP重組酶，且位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列是FRT序列。[45] [32]至[44]中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體
恒定區(qū)的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。[46] [45]的方法，其中期望的氨基酸序列是抗體可變區(qū)的氨基酸序列。[47] [32]至[44]中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。[48]包含[32]至[47]中任一項(xiàng)的細(xì)胞的試劑盒。[49] 一種包含DNA構(gòu)建體的基因打靶載體，所述構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)包含克隆位點(diǎn)的DNA ;和(3)如下所述的DNA :其能夠從DNA構(gòu)建體中被去除，并抑制由插入到⑵的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生；其中所述基因打靶載體用于同源重組所述DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域。[50] [49]的載體，其中(3)的DNA是如下所述的DNA :其能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，且其位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，并包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因。[51] [49]或[50]的載體，其中編碼期望的氨基酸序列的DNA被插入到克隆位點(diǎn)中。[52] [49]-[51]中任一項(xiàng)的載體，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區(qū)的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。[53] [52]的載體，其中期望的氨基酸序列是抗體可變區(qū)的氨基酸序列。[54] [49]-[51]中任一項(xiàng)的載體，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。[55]包含[49]-[54]中任一項(xiàng)的打靶載體的細(xì)胞。[56]包含[49]_[54]中任一項(xiàng)的打靶載體的試劑盒。[57]包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的DNA。[58]包含[57]的DNA的載體。[59]包含[57]的DNA或[58]的載體的細(xì)胞。發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了用于將編碼期望的氨基酸序列的DNA導(dǎo)入抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體可變區(qū)基因座中的打靶載體。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過將編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA導(dǎo)入抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體可變區(qū)基因座中，在特定條件下產(chǎn)生期望的多肽。此外，可以利用抗體生產(chǎn)細(xì)胞導(dǎo)入突變的能力來產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽。本發(fā)明可用于多肽的功能性修飾。
附圖簡(jiǎn)介圖I :圖I展示了導(dǎo)入外源抗體可變區(qū)基因和可變區(qū)被取代了的嵌合抗體的示意圖。A顯示了抗體基因座和用于導(dǎo)入外源抗 體可變 區(qū)基因的方法的示意圖。通過基因打靶，用外源抗體可變區(qū)基因取代雞抗體可變區(qū)基因來修飾DT40細(xì)胞基因組的抗體基因座，使得細(xì)胞表達(dá)包含外源抗體可變區(qū)和雞抗體恒定區(qū)的嵌合抗體。B顯示了可變區(qū)被取代了的嵌合抗體的示意圖。由于可變區(qū)基因的取代，抗體被表達(dá)為外源抗體可變區(qū)和雞抗體恒定區(qū)的嵌合體。圖2 :圖2展示了產(chǎn)生包含外源抗體可變區(qū)和雞抗體恒定區(qū)的嵌合抗體的DT40的制備方法的示意圖。A顯示了打靶載體的結(jié)構(gòu)。B顯示了打靶后細(xì)胞的抗體基因座結(jié)構(gòu)。C顯示了在通過Cre重組酶去除藥物抗性基因后的抗體基因座結(jié)構(gòu)，所述Cre重組酶在打靶后用4-羥泰米芬處理細(xì)胞而激活。D顯示了制備導(dǎo)入了外源抗體可變區(qū)基因的DT40細(xì)胞的示例性示意圖。圖3 :圖3顯示了抗體重鏈可變區(qū)基因的限制性酶切圖。用星號(hào)(*)標(biāo)記的限制性位點(diǎn)源自ADASH II。圖4:圖4展示了 VH打靶載體I中的限制性位點(diǎn)的位置的示意圖。A顯示了雞抗體重鏈可變區(qū)基因的序列，和外源抗體可變區(qū)基因所插入的限制性位點(diǎn)的位置。B顯示了向VH打靶載體I中插入外源抗體可變區(qū)基因的方法。帶箭頭的虛線分別指示編碼信號(hào)肽、VH和JH的區(qū)域。垂直的箭頭指示信號(hào)肽的切割位點(diǎn)。圖5 :圖5顯示了構(gòu)建VH打祀載體的示意圖。A顯示來自雞抗體重鏈基因的XbaI-NotI片段，該片段被用于構(gòu)建VH打靶載體。B至E顯示了用于構(gòu)建VH打靶載體的示意圖。F顯示了 VH打靶載體2的結(jié)構(gòu)。圖6 :圖6展示了 VH打靶載體2中的限制性位點(diǎn)的位置的示意圖。A顯示了雞抗體重鏈可變區(qū)基因的序列，和外源抗體可變區(qū)基因所插入的限制性位點(diǎn)的位置。B顯示了向VH打靶載體2中插入外源抗體可變區(qū)基因的方法。帶箭頭的虛線分別指示編碼信號(hào)肽、VH和JH的區(qū)域。垂直的箭頭指示信號(hào)肽的切割位點(diǎn)。圖7 :圖7展示了 VL打靶載體I中的限制性位點(diǎn)的位置的示意圖。A顯示了雞抗體輕鏈可變區(qū)基因的序列，和外源抗體可變區(qū)基因所插入的限制性位點(diǎn)的位置。B顯示了向VL打靶載體I中插入外源抗體可變區(qū)基因的方法。帶箭頭的虛線分別指示編碼信號(hào)肽、VL和幾的區(qū)域。垂直的箭頭指示信號(hào)肽的切割位點(diǎn)。圖8 :圖8顯示了構(gòu)建VL打祀載體的的示意圖。A顯示了在雞抗體輕鏈基因周圍的片段，該片段被用于構(gòu)建VL打靶載體。B和C顯示了用于構(gòu)建VL打靶載體I的的示意圖。D顯示了 VL打靶載體2的結(jié)構(gòu)。圖9 :圖9展示了 VL打靶載體2中的限制性位點(diǎn)的位置的示意圖。A顯示了雞抗體輕鏈可變區(qū)基因的序列，和外源抗體可變區(qū)基因所插入的限制性位點(diǎn)的位置。B顯示了向VL打靶載體2中插入外源抗體可變區(qū)基因的方法。帶箭頭的虛線分別指示編碼信號(hào)肽、VL和幾的區(qū)域。垂直的箭頭指示信號(hào)肽的切割位點(diǎn)。

圖10 :圖10展不了小鼠VHT基因打祀的不意圖和照片。A顯不了一種小鼠VHT基因打靶載體的結(jié)構(gòu)，以及在打靶后雞抗體重鏈可變區(qū)基因周圍的基因組結(jié)構(gòu)。B顯示了實(shí)施驗(yàn)證打靶后的內(nèi)源性抗體重鏈基因的PCR結(jié)果。VHT是其中小鼠VHT基因被打靶的克隆，發(fā)現(xiàn)在該克隆中缺少對(duì)應(yīng)于重排鏈的條帶。SW指沒有打靶的DT40-SW。C顯示了為驗(yàn)證打靶后的內(nèi)源性抗體重鏈基因的結(jié)構(gòu)而實(shí)施的Southern印跡結(jié)果。SW是沒有打靶的DT40-SW，而C2和C3是通過PCR發(fā)現(xiàn)缺少對(duì)應(yīng)于重排鏈的條帶的克隆。左側(cè)的C2和C3對(duì)顯示了在4-羥泰米芬處理前的結(jié)果，而右側(cè)的對(duì)顯示了在4-羥泰米芬處理后的結(jié)果。圖11 :圖11展示了圖表， 該圖表顯示在小鼠VHT基因被打靶的細(xì)胞中的抗體表達(dá)。A顯示了細(xì)胞表面上的IgM抗體表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。在小鼠VHT基因成功被打靶的VHT細(xì)胞中，細(xì)胞表面的抗體表達(dá)缺失。B顯示了在4-羥泰米芬處理后的IgM抗體表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。4-羥泰米芬處理恢復(fù)了 A的細(xì)胞中的細(xì)胞表面抗體表達(dá)。C顯示了 VHT表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。如B所示的恢復(fù)了抗體表達(dá)的細(xì)胞表達(dá)了導(dǎo)入的小鼠抗體基因(VHT)。D顯示了在4-羥泰米芬處理后，在克隆的細(xì)胞(C2和C3)中的抗體表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。在4-羥泰米芬處理后，在克隆的細(xì)胞中也觀察到了穩(wěn)定的抗體表達(dá)。圖12A:圖12A顯示了誘變后的突變分析的結(jié)果。該結(jié)果是通過對(duì)DT40-SW進(jìn)行突變分析獲得的。餅圖表示克隆總數(shù)和突變克隆數(shù)。圖12B :圖12B顯示了誘變后的突變分析的結(jié)果。該結(jié)果是通過對(duì)C2進(jìn)行突變分析獲得的。下劃線表示VHT的CDR結(jié)構(gòu)域。餅圖表示具有突變的克隆數(shù)。表格顯示了突變的核苷酸。圖12C:圖12C顯示了誘變后的突變分析的結(jié)果。該結(jié)果是通過對(duì)C3進(jìn)行突變分析獲得的。下劃線表示VHT的CDR結(jié)構(gòu)域。餅圖表示具有突變的克隆數(shù)。表格顯示了突變的核苷酸。圖13 :圖13用展不了小鼠λ I基因打祀的不意圖和照片。A顯不了一種小鼠λ基因打靶載體的結(jié)構(gòu)，以及在打靶后雞抗體輕鏈可變區(qū)基因周圍的基因組結(jié)構(gòu)。B顯示了為了驗(yàn)證打靶后的內(nèi)源性抗體輕鏈基因的結(jié)構(gòu)而實(shí)施的PCR的結(jié)果。VHT-λ I-Β4是一個(gè)基因被打靶的克隆。SW指沒有打靶的DT40-SW。C顯示為了驗(yàn)證打靶載體插入到雞抗體輕鏈基因中而實(shí)施的PCR的結(jié)果。圖14 :圖14顯示了小鼠VHT和λ I基因被打靶、且改變了抗體表達(dá)的細(xì)胞的制備流程圖。圖15 :圖15的示意圖顯示了在小鼠VHT和λ I基因被打靶的細(xì)胞中的嵌合抗體表達(dá)。顯示抗體在小鼠VHT和λ I基因被打靶的細(xì)胞(VHT-λ I克隆Β4)中有表達(dá)。VHT-λ I克隆B4、DT40-SW細(xì)胞(陰性對(duì)照)和QM小鼠脾細(xì)胞(陽性對(duì)照)在用或不用抗小鼠VHT的抗體(α-Id)或抗小鼠λ輕鏈的抗體(α-λ1、2、3)染色之后，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。圖16 :圖16顯示為了評(píng)估在小鼠VHT和λ I基因被打靶的細(xì)胞(VHT-λ 1Β4)中的抗體輕鏈基因表達(dá)而實(shí)施的PCR的示意圖和照片。
圖17 :圖17顯示為了評(píng)估在小鼠VHT和λ I基因被打靶的細(xì)胞(VHT-λ 1Β4)中的抗體表達(dá)而實(shí)施的ELISA的結(jié)果。A顯示了對(duì)IgM抗體表達(dá)水平的評(píng)估。B顯示了對(duì)抗體特異性的評(píng)估。圖18 :圖18顯示了在小鼠λ I基因被打靶的細(xì)胞中，小鼠λ I抗體中導(dǎo)入的突變
的頻率。圖19 :圖19顯示了抗體重鏈可變區(qū)的上游區(qū)域一個(gè)片段的序列(SEQ ID Ν0:4)。該示意圖顯示了通過DNA步行方法鑒別的抗體重鏈可變區(qū)基因上游區(qū)域的序列。該序列只包括新鑒別出的部分。圖20 :圖20顯示了在DT40的抗體重鏈可變區(qū)基因周圍的核苷酸序列(SEQ IDNO:7)。該序列包括圖3中顯示了限制性酶切圖譜的抗體重鏈可變區(qū)基因的完整核苷酸序列。下劃線(第1-3120位和第3882-7891位)顯示了新鑒別的核苷酸序列。第1-3223位 5’上游區(qū)；第3224-3269和3453-3463位編碼信號(hào)肽的序列(第3270-3452位的序列是內(nèi)含子，通過剪接去除；第3224-3269和3453-3463位的序列連接在一起形成信號(hào)肽序列);第3464-3839位抗體重鏈可變區(qū)基因的區(qū)域，不包括信號(hào)肽；第3840-7931位3’下游區(qū)。實(shí)施例中描述的VH打靶載體是使用第1829-3223位(從BamHI位點(diǎn)至緊鄰在起始密碼子之前的核苷酸)和第3869-6548位(從緊鄰在JH編碼區(qū)之后的SacII位點(diǎn)至XhoI位點(diǎn))的序列作為臂，以及第3224-3463位的序列作為信號(hào)肽制備的。圖21 :圖21顯示了 VH打靶載體I的核苷酸序列(SEQ ID NO: 10)。該序列包括圖5Ε中顯示的結(jié)構(gòu)的完整核苷酸序列，但不包括載體骨架部分。單下劃線指示信號(hào)肽序列，雙下劃線指示IoxP序列。圖22 :圖22顯示了 VH打靶載體2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 13)。該序列包括圖5F中顯示的結(jié)構(gòu)的完整核苷酸序列，但不包括載體骨架部分。下劃線指示信號(hào)肽序列，雙下劃線指示IoxP序列。圖23 :圖23顯示了 VL打靶載體I的核苷酸序列(SEQ ID NO: 18)。該序列包括圖SC中顯示的結(jié)構(gòu)的完整核苷酸序列，但不包括載體骨架部分。下劃線(第1869-1914和2040-2056位)指示信號(hào)肽序列，雙下劃線指示IoxP序列。與雞抗體輕鏈基因周圍的序列同源的臂區(qū)域位于第1-1868(不包括信號(hào)肽序列)和第5011-6870位。圖24 :圖24顯示了 VL打靶載體2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 20)。該序列包括圖8D中顯示的結(jié)構(gòu)的完整核苷酸序列，但不包括載體骨架部分。下劃線(第1869-1914和2040-2056位)指示信號(hào)肽序列，雙下劃線指示IoxP序列。與雞抗體輕鏈基因周圍的序列同源的臂區(qū)域位于第1-1868(不包括信號(hào)肽序列)和第5002-6861位。圖25 :圖25顯示了一種突變雌激素受體的他莫昔芬結(jié)合位點(diǎn)的序列(SEQIDN0:40)。突變位點(diǎn)用下劃線表示。由于G變?yōu)镃的核苷酸取代，密碼子編碼的氨基酸從甘氨酸(G)變?yōu)榫彼?R)。圖26 :圖26顯示了被用作AID表達(dá)盒的雞AID cDNA核苷酸序列。下劃線部分(第6-597位)顯示了編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域。圖27 :圖27顯示了用于與突變雌激素受體融合的修飾的Cre重組酶基因的核苷酸序列。融合蛋白中消除了末端的終止密碼子。下劃線部分(第4-21位)顯示了源自SV40大T抗原的核轉(zhuǎn)位信號(hào)。
圖28 :圖28展示了雞VL基因打靶的示意圖和照片。A顯示了雞VL基因打靶載體的結(jié)構(gòu)，和打靶后雞抗體輕鏈可變區(qū)基因周圍的基因組結(jié)構(gòu)。B顯示為了評(píng)估打靶后的內(nèi)源性抗體輕鏈基因的結(jié)構(gòu)而實(shí)施的PCR的結(jié)果。CVL-C4是打靶的克隆。C顯示為了評(píng)估打靶載體在雞抗體輕鏈基因中的插入而實(shí)施的PCR的結(jié)果。圖29 :圖29展示了靶向雞VL基因表達(dá)的位移圖解。圖30 :圖30顯示了導(dǎo)入到打靶的雞VL基因中的突變頻率。實(shí)施方案的說明本發(fā)明涉及將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的方法,包括將包含DNA構(gòu)建體的打靶載體導(dǎo)入抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的步驟，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。在本文中，打靶載體也被稱為“基因打靶載體”。將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的方法也被稱為“用于向抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體可變區(qū)基因的基因座中導(dǎo)入編碼期望的氨基酸序列的DNA的方法”?？贵w生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域也可以稱為“抗體基因的基因座中的DNA”、“編碼抗體可變區(qū)的DNA周圍的區(qū)域”、“包含編碼抗體可變區(qū)的DNA和位于其5’側(cè)的啟動(dòng)子區(qū)的區(qū)域”、“包含編碼抗體可變區(qū)的DNA和在其5’側(cè)的DNA的區(qū)域”、“包含編碼抗體可變區(qū)的DNA和其3’側(cè)的DNA的區(qū)域”、“包含編碼抗體可變區(qū)的DNA和位于所述DNA的5，和3，側(cè)翼的DNA”等等。本發(fā)明的打靶載體除上述(I)至(3)的DNA以外，還可以包含與抗體基因的基因座中的DNA同源的DNA。與抗體基因的基因座中的DNA同源的DNA也可以稱為“包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的周圍的區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA”、“包含與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA 5’側(cè)的啟動(dòng)子區(qū)的5’側(cè)的區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA”、“包含與編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)的區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA”、“與編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA同源的DNA”、“與編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)的DNA同源的DNA”、“包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’和3’側(cè)側(cè)翼的DNA區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA”等等。在本文中，“5，側(cè)的DNA”也可以稱為“5，側(cè)上游區(qū)域的DNA”，而“3，側(cè)的DNA”也可以稱為“3’側(cè)下游區(qū)域的DNA”。當(dāng)本發(fā)明的載體被導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中時(shí)，在包含與編碼抗體可變區(qū)的DNA周圍的區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的基因組中的編碼抗體可變區(qū)的DNA周圍的區(qū)域之間發(fā)生同源重組。其結(jié)果是，抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域被包含上述⑴至⑶的DNA的DNA構(gòu)建體取代。當(dāng)上述(I)的DNA是位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的啟動(dòng)子時(shí)，上述(I)的DNA也可以稱為“包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA周圍的區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA”。此外，包含與編碼抗體可變區(qū)的DNA周圍的區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA也可以稱為“包含與編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’和3’側(cè)側(cè)翼的DNA區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA”。在此情況下，本發(fā)明的方法也可以將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的方法，包括將包含DNA構(gòu)建體的打靶載體導(dǎo)入抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的步驟，所述DNA構(gòu)建體包含(I)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(2)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA?！鞍c抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA周圍的DNA區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA”也可以被稱為“載體臂”或“臂”。特別地，“與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA同源的DNA”也可以稱為“上游臂”、“5’側(cè)臂”或“左臂”。此外，“與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)的DNA同源的DNA”也可以稱為“下游臂”、“3’側(cè)臂”或“右臂”。一般認(rèn)為較長的臂是優(yōu)選的；但是，臂僅需要具有基因打靶通常使用的長度(A. Joyner, 〃Gene Targeting" , IRL Press Practical Approach series, OxfordUniv. Press)。例如而非限制，右臂和左臂的長度可以是Ikb或更長，總長度可以是3kb或更長。同時(shí)，載體的全長優(yōu)選是12kbp或更短，但并不限于此(J.-M. Buesrstedde和S. Takeda 編著，Subcellular Biochemistry 第 40 卷Reviews and Protocols in DT40Research, Springer(2006))。在本發(fā)明中，“與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA同源的DNA”包括具有位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的啟動(dòng)子的DNA和不具有所述啟動(dòng)子的DNA。當(dāng)“與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA同源的DNA”不具有位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的啟動(dòng)子時(shí)，所述DNA也可以稱為“包含與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的啟動(dòng)子區(qū)的5’側(cè)區(qū)域同源的核苷酸序列的DNA”。在本發(fā)明中，“與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3 ’側(cè)的DNA同源的DNA”包括具有抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體恒定區(qū)編碼DNA的DNA和不具有所述編碼DNA的DNA。在本發(fā)明中，臂或載體臂的核苷酸序列不必與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA周圍的DNA區(qū)域完全同源(相同)，只需要具有允許同源重組的一定程度的相似性?？梢愿鶕?jù)抗體生產(chǎn)細(xì)胞的類型，恰當(dāng)?shù)剡x擇在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中發(fā)揮功能的功能性啟動(dòng)子DNA。在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子DNA包括但不限于雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和人延伸因子 la (EF-Ia)啟動(dòng)子(Yang, S. Y.等人，J. Exp. Med. 203:2919-2928 (2006)) 病毒啟動(dòng)子DNA的實(shí)例包括但不限于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Kanayama，N.等人，NucleicAcids Res. 34, elO (2006))和勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子(Arakawa, H.等人，NucleicAcids Res. 36，el(2008))。在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子DNA包括源自抗體生產(chǎn)細(xì)胞的啟動(dòng)子和位于編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的抗體基因啟動(dòng)子DNA。在本文中，“編碼期望的氨基酸序列的DNA”也可以稱為“編碼人工氨基酸序列的DNA”或“編碼目的氨基酸序列的DNA”。、
期望的氨基酸序列包括但不限于抗體可變區(qū)的氨基酸序列(抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈可變區(qū))、酶的氨基酸序列、受體的氨基酸序列和人工肽序列。當(dāng)編碼期望的氨基酸序列的DNA不含信號(hào)肽編碼DNA時(shí)，可以將編碼信號(hào)肽的DNA插入到基因打靶載體中編碼期望的氨基酸序列的DNA的5’側(cè)，以便增強(qiáng)由編碼期望的氨基酸序列的DNA編碼的多肽的細(xì)胞表面表達(dá)或分泌。信號(hào)肽編碼DNA可以插入到這樣的位點(diǎn)，所述位點(diǎn)使得在從信號(hào)肽編碼DNA和編碼期望的氨基酸序列的DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA中兩個(gè)肽編碼區(qū)合框相連。例如，可以在信號(hào)肽編碼DNA和編碼期望的氨基酸序列的DNA之間插入內(nèi)含子。或者，如下所述，上述⑶的DNA可以插入到信號(hào)肽編碼DNA和編碼期望的氨基酸序列的DNA之間。對(duì)信號(hào)肽編碼DNA沒有限制，只要它具有在抗體生產(chǎn)細(xì)胞的表面上表達(dá)多肽或從抗體生產(chǎn)細(xì)胞分泌多肽的能力。信號(hào)肽編碼DNA包括源自抗體生產(chǎn)細(xì)胞的和編碼位于抗體可變區(qū)的5’側(cè)的信號(hào)肽的DNA。此類信號(hào)肽包括但不限于雞抗體重鏈或輕鏈的信號(hào)肽、哺乳動(dòng)物(例如人和小鼠)的抗體重鏈或輕鏈的信號(hào)肽，和鳥類或哺乳動(dòng)物的分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞因子或生長因子的信號(hào)肽。 編碼期望的氨基酸序列的DNA可以來自任何物種。DNA可以源自與抗體生產(chǎn)細(xì)胞來源相同的物種，或者源自不同的物種。此外，DNA可以是編碼人為修飾的多肽，例如嵌合多肽的DNA?！鞍谕陌被嵝蛄械亩嚯摹卑ǖ幌抻诎谕陌被嵝蛄信c抗體恒定區(qū)的氨基酸序列的多肽?！鞍谕陌被嵝蛄械亩嚯摹卑ǖ幌抻诎铝邪被嵝蛄械亩嚯?嵌合多肽)抗體可變區(qū)(抗體重鏈可變區(qū)或抗體輕鏈可變區(qū))的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)(抗體重鏈恒定區(qū)或抗體輕鏈恒定區(qū))的氨基酸序列；酶的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)的氨基酸序列(抗體重鏈恒定區(qū)或抗體輕鏈恒定區(qū))；或受體的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)的氨基酸序列(抗體重鏈恒定區(qū)和抗體輕鏈恒定區(qū))。在本文中，“抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生的DNA”指通過在存在所述DNA的條件下阻斷任何下列步驟，來抑制包含期望的氨基酸序列的多肽的正常產(chǎn)生的DNA 編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄；含有編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的區(qū)域的mRNA的剪接；mRNA的翻譯；和包含期望的氨基酸序列的多肽的加工(例如，折疊)。上述(3)的DNA也可以稱為“抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，所述DNA包括在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除”。本發(fā)明的標(biāo)記基因優(yōu)選在其3’末端含有多聚A(腺苷酸)附加序列。多聚A附加序列終止標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到各種啟動(dòng)子，并選擇恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子。此類啟動(dòng)子包括但不限于例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子和EFla啟動(dòng)子。選擇標(biāo)記基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因；突光蛋白基因，例如GFP和DsRed ;以及生色酶的基因，例如β -半乳糖苷酶(IacZ)和β -內(nèi)酰胺酶。優(yōu)選的將啟動(dòng)子和標(biāo)記基因可操作地連接在一起，使得標(biāo)記基因可以通過啟動(dòng)子表達(dá)。在本文中，“可操作地連接”意指標(biāo)記基因與在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA連接，使得轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子DNA的結(jié)合誘導(dǎo)標(biāo)記基因的表達(dá)。因而，當(dāng)標(biāo)記基因與另 一個(gè)基因連接并形成與它的基因產(chǎn)物的融合蛋白時(shí)，由于轉(zhuǎn)錄因子與標(biāo)記基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，融合蛋白的表達(dá)被誘導(dǎo)，這也包括在“可操作地連接”的含義中。位點(diǎn)特異性重組酶和位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列的組合包括Cre重組酶和IoxP的組合，以及FLP重組酶和FRT的組合，但不限于此。在本發(fā)明中，位點(diǎn)特異性的重組酶識(shí)別序列可以是突變序列，只要它被位點(diǎn)特異性的重組酶識(shí)別。對(duì)于IoxP序列，參見下列文件Hoess 等人，Pl site-specific recombination:nucleotide sequence of therecombining sites.Proc Natl Acad Sci USA(1982)79 卷(11)第 3398-402 頁Hoess和 Abremski, Interaction of the bacteriophage Pl recombinase Crewith the recombining site IoxP. Proc Natl Acad Sci USA (1984)第 81 卷⑷第 1026-9頁對(duì)于FLP重組酶的序列，參見下列文件Hartley 和 Donelson, Nucleotide sequence of the yeast plasmid.Nature (1980)第 286 卷(5776)第 860-865 頁對(duì)于FRT序列，參見下列文件Hartley 和 Donelson, Nucleotide sequence of the yeast plasmid.Nature (1980)第 286 卷(5776)第 860-865 頁Andrews 等人，The FLP recombinase of the 2 micron circle DNA ofyeast: interaction with its target sequences. Cell(1985)第 40 卷(4)第 795-803 頁Gronostajski 和 Sadowski, Determination of DNA sequences essential forFLP-mediated recombination by a novel method. J Biol Chem(1985)第 260 卷(22)第12320-7 頁Senecoff 等人，The FLP recombinase of the yeast 2-micronplasmid:characterization of its recombination site. Proc Natl Acad Sci USA (1985)第 82 卷(21)第 7270-4 頁。對(duì)本發(fā)明的基因打靶載體沒有限制，只要它們?cè)试S在上述的DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間的同源重組。本發(fā)明的基因打靶載體包括例如下文⑷和⑶的載體。⑷用于將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其中該載體包含所述DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體從載體DNA鏈的5’端至3’端包含下文(I)至(3)的DNA (I)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ;和(3)編碼期望的氨基酸序列的DNA。
(A)的載體可在編碼期望的氨基酸序列的DNA的5’側(cè)具有編碼信號(hào)肽的DNA。在此情況下，載體可以在⑵的DNA和(3)的DNA之間具有信號(hào)肽編碼DNA?；蛘撸d體可以在(I)的DNA和⑵的DNA之間具有信號(hào)肽編碼DNA。但是，載體不限于該實(shí)例。(B)用于將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其中該載體包含所述DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含，從載體DNA鏈的5’端至3’端，下文⑴至(3)的DNA:(I)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。(B)的載體還可在編碼期望的氨基酸序列的DNA的5’側(cè)具有編碼信號(hào)肽的DNA。在此情況下，載體可以在(I)的DNA和(2)的DNA之間具有信號(hào)肽編碼DNA。但是，載體不限于該實(shí)例。(A)的載體還可以描述為用于將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含，從載體DNA鏈的5’至3’端，下述⑴至(iii)的DNA:(i)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)區(qū)域同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)區(qū)域同源的DNA的DNA，其中⑴的DNA從載體DNA鏈的5’至3’端包含下列(α )和(β ):(α)在抗體生廣細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ;和( β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。上述基因打靶載體可在(ii)的DNA的5’側(cè)(更上游)具有編碼信號(hào)肽的DNA。更具體而言，基因打靶載體可在U)的DNA和(β)的DNA之間，或者在(β)的DNA和(ii)的DNA之間具有信號(hào)肽編碼DNA。但是，載體不限于這些實(shí)例。(iii)的DNA可具有編碼抗體恒定區(qū)的DNA。(i)的同源DNA可以與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA重組。當(dāng)基因打靶載體的靶標(biāo)是重鏈可變區(qū)時(shí)，5’側(cè)的DNA包括但不限于，例如這樣的DNA片段其起自雞抗體重鏈基因座中編碼抗體重鏈可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA的5’末端核苷酸，并延伸直到位于起始點(diǎn)上游(5’側(cè))DNA區(qū)域的第一個(gè)BamHI，或第一個(gè)XhoI，或第一個(gè)XbaI位點(diǎn)?；蛘撸?dāng)基因打靶載體的靶是輕鏈可變區(qū)時(shí)，5’側(cè)的DNA包括但不限于，例如這樣的DNA片段其起自雞抗體輕鏈基因座中編碼抗體輕鏈可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA的5’末端核苷酸，并延伸直到位于起始點(diǎn)上游(5，側(cè))DNA區(qū)域的第一個(gè)SacI或第一個(gè)BamHI位點(diǎn)。當(dāng)使用編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA作為起點(diǎn)制備5’側(cè)的DNA時(shí)，抗體基因啟動(dòng)子已包括在5’側(cè)的DNA內(nèi)。在此情況下,不必向載體中插入啟動(dòng)子DNA。此外，(iii)的同源DNA可以與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)的DNA重組。當(dāng)基因打靶載體的靶標(biāo)是重鏈可變區(qū)時(shí)，3’側(cè)的DNA包括但不限于，例如這樣的DNA片段其起自雞重鏈抗體基因座中編碼抗體重鏈可變區(qū)的DNA的3’末端核苷酸，并延 伸直到位于起始點(diǎn)下游(3’側(cè))DNA區(qū)域的第一個(gè)XhoI或第一個(gè)ClaI位點(diǎn)?；蛘?，當(dāng)基因打靶載體的靶標(biāo)是輕鏈可變區(qū)時(shí)，3’側(cè)的DNA包括但不限于，例如這樣的DNA片段其起自雞輕鏈抗體基因座中編碼抗體輕鏈可變區(qū)的DNA的3’末端核苷酸，并延伸直到位于起始點(diǎn)下游(3’側(cè))DNA區(qū)域的第一個(gè)ClaI或第一個(gè)EcoRI位點(diǎn)。上述(A)的基因打靶載體還可以描述為用于將DNA構(gòu)建體和抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，所述載體包含DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體從載體DNA鏈的5’至3’端包含下述⑴至(V)的DNA (i)與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)區(qū)域同源的DNA ；(ii)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(iii)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ；(iv)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(V)與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)區(qū)域同源的DNA。上述基因打靶載體可在(iv)的DNA的5’側(cè)具有編碼信號(hào)肽的DNA。(V)的DNA可具有編碼抗體恒定區(qū)的DNA。本發(fā)明的靶向重鏈可變區(qū)的基因打靶載體可以基于下面列舉的DNA片段來設(shè)計(jì)，其中每個(gè)片段都含有雞抗體重鏈基因的基因座周圍的區(qū)域。但是，基因打靶載體不限于這些實(shí)例。BamHI-XhoI 片段BamHI-ClaI 片段XhoI-XhoI 片段XhoI-ClaI 片段XbaI-XhoI 片段XbaI-ClaI 片段本發(fā)明的靶向輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體可以基于下面列舉的DNA片段設(shè)計(jì)，其中每個(gè)片段都含有雞抗體輕鏈基因的基因座周圍的區(qū)域。但是，基因打靶載體不限于這些實(shí)例。SacI-ClaI 片段BamHI-EcoRI 片段SacI-ClaI 片段BamHI-EcoRI 片段在本發(fā)明中，限制性位點(diǎn)不限于天然存在于雞抗體基因的基因座中的位點(diǎn)?？梢?br> 使用添加有期望的限制性位點(diǎn)的引物，通過PCR擴(kuò)增獲得含有限制性位點(diǎn)的DNA片段。本發(fā)明的限制性位點(diǎn)還包括因此產(chǎn)生的位點(diǎn)。本發(fā)明的靶向重鏈可變區(qū)的基因打靶載體也可以描述為包含這樣的DNA構(gòu)建體的基因打靶載體，所述DNA構(gòu)建體包含包含從抗體可變區(qū)的編碼區(qū)的5’側(cè)的BamHI位點(diǎn)至緊鄰于雞重鏈抗體基因座中的起始密碼子之前的核苷酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:44)的DNA片段；在抗體可變區(qū)的編碼區(qū)的3’側(cè)包含SacII-XhoI片段(SEQ ID NO:45)的DNA片段；和包含上述(ii)的DNA的DNA片段。包含SEQ ID NO:44的DNA片段包括但不限于包含更多的5’側(cè)區(qū)域的DNA片段。包含SEQ ID NO:45的DNA片段包括但不限于包含更多的3’側(cè)區(qū)域的DNA片段。本發(fā)明的靶向輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體也可以描述為包含這樣的DNA構(gòu)建體的基因打靶載體，所述DNA構(gòu)建體包含包含從SacI位點(diǎn)至緊鄰于雞輕鏈抗體基因座中的起始密碼子之前的核苷酸核苷酸序列(SEQ ID NO:46)的DNA片段；包含SEQ ID NO:47的核苷酸序列的DNA片段；和包含上述(ii)的DNA的DNA片段。包含SEQ ID NO:46的DNA片段包括但不限于包含更多的5’側(cè)區(qū)域的DNA片段。包含SEQ ID NO:47的DNA片段包括但不限于包含更多的3’側(cè)區(qū)域的DNA片段。本發(fā)明的基因打靶載體可具有所有的上述特征。上述(A)的本發(fā)明的基因打靶載體可以描述為靶向重鏈可變區(qū)的基因打靶載體，具體而言是用于將DNA構(gòu)建體和抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體重鏈可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含，從載體DNA鏈的5’至3’端，下述⑴至(iii)的DNA (i)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體重鏈可變區(qū)的DNA的5’側(cè)同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體重鏈可變區(qū)的DNA的3’側(cè)同源的DNA的DNA，其中⑴的DNA從載體DNA鏈的5’至3’端包括下列(α )和(β ):( α )在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ;和( β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ；上述(A)的本發(fā)明的基因打靶載體可以描述為靶向輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體，具體而言是用于將DNA構(gòu)建體和抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體輕鏈可變區(qū)的DNA的區(qū)域的同源重組基因打靶載體，其中載體包含DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體從載體DNA鏈的5’至3’端包含下述⑴至(iii)的DNA (i)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體輕鏈可變區(qū)的DNA的5’側(cè)同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體輕鏈可變區(qū)的DNA的3’側(cè)同源的DNA的DNA，其中⑴的DNA從載體DNA鏈的5’至3’端包括下列(α )和(β ):(α)在抗體生廣細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ;和
( β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。上述靶向重鏈或輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體可在(ii)的DNA的5’側(cè)具有編碼信號(hào)肽的DNA。更具體而言，載體可在(α)的DNA和(β)的DNA之間，或者可以在(β)的DNA與(ii)的DNA之間具有信號(hào)肽編碼DNA。但是，載體不限于這些實(shí)例。(iii)的DNA可具有編碼抗體恒定區(qū)的DNA。上述(B)的基因打靶載體也可以稱為用于將DNA構(gòu)建體和抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體從載體DNA鏈的5’至3’端包含下文⑴至(iii)的DNA (i)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)同源的DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)同源的DNA 的 DNA，其中⑴的DNA包含(α )在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ;和(iii)的DNA包含(β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ;和 ( α )的DNA與(ii)的DNA可操作地連接。⑴和(iii)的同源DNA如上所述。上述基因打靶載體可在(ii)的DNA的5’側(cè)具有編碼信號(hào)肽的DNA。更具體而言，基因打靶載體可在(α)的DNA和(ii)的DNA之間具有信號(hào)肽編碼DNA。但是，載體不限于這些實(shí)例。(iii)的DNA可具有編碼抗體恒定區(qū)的DNA。上述(B)的基因打靶載體也可以稱為用于將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體從載體DNA鏈的5’至3’端包含下文⑴至(V)的DNA (i)與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)同源的DNA ；(ii)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(iii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和
(iv)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ;和(V)與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)同源的DNA。上述基因打靶載體可在(iii)的DNA的5’側(cè)具有編碼信號(hào)肽的DNA。(V)的DNA可具有編碼抗體恒定區(qū)的DNA。在上述⑶中描述的基因打靶載體也可以稱為靶向重鏈可變區(qū)的基因打靶載體，具體而言，稱為用于將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體重鏈可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體從載體DNA鏈的5 ’至3’端包含下文⑴至(iii)的DNA ⑴包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體重鏈可變區(qū)的DNA的5’側(cè)同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體重鏈可變區(qū)的DNA的3’側(cè)同源的DNA的DNA。其中，⑴的DNA包含(α )在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ;和(iii)的DNA包含(β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ;和( α )的DNA與(ii)的DNA可操作地連接。在上述(B)中描述的基因打靶載體也可以稱為靶向輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體，具體而言，稱為用于將DNA構(gòu)建體和抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體輕鏈可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其中載體包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體從載體DNA鏈的5 ’至3’端包含下文⑴至(iii)的DNA (i)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體輕鏈可變區(qū)的DNA的5’側(cè)同源的 DNA 的 DNA ；(ii)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(iii)包含與抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組DNA中的編碼抗體輕鏈可變區(qū)的DNA的3’側(cè)同源的DNA的DNA。其中，⑴的DNA包含(α )在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ;和(iii)的DNA包括(β )抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ;和( α )的DNA與(ii)的DNA可操作地連接。上述靶向重鏈或輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體可在(ii)的DNA的5’側(cè)具有信號(hào)肽。更具體而言，所述載體可在U)的DNA和(ii)的DNA之間具有編碼信號(hào)肽的DNA。但是，所述載體不限于該實(shí)例。(iii)的DNA可具有編碼抗體恒定區(qū)的DNA。
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上述(B)的載體可額外地在編碼期望的氨基酸序列的DNA的3’側(cè)包含剪接供體共有序列。此類剪接供體共有序列包括但不限于“AG GTRAGT”(R _旨A或G :下劃線部分是內(nèi)含子序列)。當(dāng)剪接供體共有序列與編碼期望的氨基酸序列的DNA連接時(shí)，需要在剪接供體共有序列之前恰當(dāng)?shù)靥砑踊騽h除核苷酸，以使得編碼期望的氨基酸序列的區(qū)域與編碼抗體恒定區(qū)的區(qū)域在剪接后的mRNA中合框連接。在上述(B)的載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA((ii)的DNA)優(yōu)選盡可能地靠近抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生、且能夠從DNA構(gòu)建體中被去除的DNA (( β )的DNA)。此外，當(dāng)(β )的DNA包括標(biāo)記基因時(shí)，優(yōu)選在標(biāo)記基因的3’側(cè)具有多聚A附加序列。本發(fā)明提供了上述基因打靶載體。本發(fā)明還提供了在上述打靶載體中具有克隆位點(diǎn)代替編碼期望的氨基酸序列的DNA的打靶載體。更具體而言，本發(fā)明提供了用于將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的基因打靶載體，其 中該載體包含這樣的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)包含克隆位點(diǎn)的DNA ;和(3)抑制由插入到⑵的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。(3)的DNA還可以被描述為能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生的DNA,該DNA位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，并包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因。標(biāo)記基因可以在其3’側(cè)具有多聚A序列。編碼期望的氨基酸序列的DNA可以插入到本發(fā)明的基因打靶載體的克隆位點(diǎn)中。此類克隆位點(diǎn)包括但不限于多克隆位點(diǎn)。下文顯示了上述⑶的載體中編碼期望的氨基酸序列的DNA被克隆位點(diǎn)取代的載體實(shí)例。但是，本發(fā)明的載體不限于這些實(shí)例。SEQ ID Ν0:10(圖21)是本發(fā)明的靶向重鏈可變區(qū)的基因打靶載體的核苷酸序列的實(shí)例。具體而言，本發(fā)明提供了包括這樣的DNA構(gòu)建體的打靶載體，所述DNA構(gòu)建體包含SEQ ID NO: 10 (特別是第1-7277位的核苷酸序列)。在圖21 (SEQ ID NO: 10)中，第1-1395位的核苷酸對(duì)應(yīng)于與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA同源的DNA序列(到編碼抗體可變區(qū)的DNA的起始密碼子緊鄰前方為止的含有啟動(dòng)子的序列)；第1396-1441位的核苷酸對(duì)應(yīng)于編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA ；第1442-1624位的核苷酸對(duì)應(yīng)于內(nèi)含子DNA ；第1625-1635位的核苷酸對(duì)應(yīng)于編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA ；第1671-1704 位的核苷酸對(duì)應(yīng)于 loxP_RE 的 DNA 序列(TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO :37))；第1711-2697位的核苷酸對(duì)應(yīng)于包含標(biāo)記物的多聚A附加序列的DNA ；第2720-3142位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的DNA序列；第3186-4527位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的啟動(dòng)子序列；第4555-4588 位的核苷酸對(duì)應(yīng)于 loxP_LE 的 DNA 序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA(SEQ ID NO :38))；
以及第4598-7277位的核苷酸對(duì)應(yīng)于與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)的DNA同源的DNA序列；第1442-1624位的核苷酸(內(nèi)含子DNA)通過剪接被去除，由此第1397-1441位的核苷酸與第1625-1635的核苷酸相連而形成信號(hào)肽序列。作為實(shí)例，上述打靶載體使用突變的IoxP序列(Albert H.，等人，PlantJ. 7:649(1995) ；Araki K·,等人，Nucleic Acids Res. 25:868 (1997))。本發(fā)明使用用于DT40的標(biāo)記基因(Arakawa H. , BMC Biotechnol. 1:7 (2001))。用于DT40的標(biāo)記基因描述如上。在上述載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA被插入編碼信號(hào)肽的DNA和loxP_RE的DNA序列之間。此外，本發(fā)明的靶向重鏈可變區(qū)的基因打靶載體的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)例顯示在 SEQ ID N0:13(圖22)中。具體而言，本發(fā)明提供了包含這樣的DNA構(gòu)建體的打靶載體，所述DNA構(gòu)建體包含SEQ ID NO: 13 (特別是第5-7266位的核苷酸序列)。在圖22(SEQ ID NO: 13)中，第5-1399位的核苷酸對(duì)應(yīng)于與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA同源的DNA序列(到編碼抗體可變區(qū)的DNA的起始密碼子緊鄰前方為止的含有啟動(dòng)子的序列)；第1400-1445位的核苷酸對(duì)應(yīng)于編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA ；第1446-1628位的核苷酸對(duì)應(yīng)于內(nèi)含子DNA ；第1629-1639位的核苷酸對(duì)應(yīng)于編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA ；第1660-1693 位的核苷酸對(duì)應(yīng)于 loxP_RE 的 DNA 序列(TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO :37))；第1700-2686位的核苷酸對(duì)應(yīng)于包含標(biāo)記基因的多聚A附加序列的DNA ；第2709-3131位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因序列的DNA序列；第3175-4516位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的啟動(dòng)子序列；第4544-4577 位的核苷酸對(duì)應(yīng)于 loxP_LE 的 DNA 序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA(SEQ ID NO :38))以及第4587-7266位的核苷酸對(duì)應(yīng)于與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)的DNA同源的DNA序列。第1446-1628位的核苷酸(內(nèi)含子DNA)通過剪接被去除，因而第1400-1445位的核苷酸與第1629-1639位的核苷酸相連形成信號(hào)肽序列。在上述載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA插入編碼信號(hào)肽的DNA和loxP_RE的DNA序列之間。此外，本發(fā)明的靶向輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體的核苷酸序列的實(shí)例顯示在SEQID N0:18(圖23)中。具體而言，本發(fā)明提供了包含這樣的DNA構(gòu)建體的打靶載體，所述DNA構(gòu)建體包含SEQ ID NO: 18 (特別是第1-6870位的核苷酸序列)。在圖23 (SEQ ID NO: 18)中，第1-1868位的核苷酸對(duì)應(yīng)于與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA同源的DNA序列(到編碼抗體可變區(qū)的DNA的起始密碼子緊鄰前方為止的含有啟動(dòng)子的序列)；第1869-1914位的核苷酸對(duì)應(yīng)于編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA ；第1915-2039位的核苷酸對(duì)應(yīng)于內(nèi)含子DNA ；第2040-2056位的核苷酸對(duì)應(yīng)于編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA ；第2085-2118位的核苷酸對(duì)應(yīng)于loxP_LE的DNA 第2146-3487位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的啟動(dòng)子序列；第3531-3953位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的DNA ；第3976-4962位的核苷酸對(duì)應(yīng)于包含標(biāo)記基因的多聚A附加序列的DNA ； 第4969-5002位的核苷酸對(duì)應(yīng)于loxP_RE的DNA序列；以及第5011-6870位的核苷酸對(duì)應(yīng)于與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)的DNA同源的DNA序列。第1915-2039位的核苷酸(內(nèi)含子DNA)通過剪接被去除，因而第1869-1914位的核苷酸與第2040-2056位的核苷酸連接形成信號(hào)肽序列。在上述載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA被插入編碼信號(hào)肽的DNA和loxP_LE的DNA序列之間。此外，本發(fā)明的靶向輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體的核苷酸序列的一個(gè)實(shí)例顯示在SEQ ID N0:20(圖24)中。具體而言，本發(fā)明提供了包含這樣的DNA構(gòu)建體的打靶載體，所述DNA構(gòu)建體包含SEQ ID NO: 20 (特別是第1-6861位的核苷酸序列)。在圖24(SEQ ID NO:20)中，第1-1868位的核苷酸對(duì)應(yīng)于與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的5’側(cè)的DNA同源的DNA序列(到編碼抗體可變區(qū)的DNA的起始密碼子緊鄰前方為止的含有啟動(dòng)子的序列)；第1869-1914位的核苷酸對(duì)應(yīng)于編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA ；第1915-2039位的核苷酸對(duì)應(yīng)于內(nèi)含子DNA ；第2040-2056位的核苷酸對(duì)應(yīng)于編碼抗體可變區(qū)的信號(hào)肽的DNA ；第2076-2109位的核苷酸對(duì)應(yīng)于loxP_LE的DNA序列第2137-3478位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的啟動(dòng)子序列；第3522-3944位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的DNA序列；第3967-4953位的核苷酸對(duì)應(yīng)于標(biāo)記基因的多聚A附加序列的DNA序列；第4960-4993位的核苷酸對(duì)應(yīng)于loxP_RE的DNA序列以及第5002-6861位的核苷酸對(duì)應(yīng)于與位于抗體生產(chǎn)細(xì)胞的編碼抗體可變區(qū)的DNA的3’側(cè)的DNA同源的DNA序列。第1915-2039位的核苷酸(內(nèi)含子DNA)通過剪接被去除，因而第1869-1914位的核苷酸與第2040-2056位的核苷酸相連形成信號(hào)肽序列。在上述載體中，編碼期望的氨基酸序列的DNA被插入編碼信號(hào)肽的DNA和loxP_LE的DNA序列之間。對(duì)用于將本發(fā)明的打靶載體導(dǎo)入細(xì)胞中的方法沒有任何特別的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所選擇的抗體生產(chǎn)細(xì)胞選擇恰當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移方法。當(dāng)抗體生產(chǎn)細(xì)胞是例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，方法的實(shí)例包括但不限于例如磷酸鈣沉淀方法、核微注射、原生質(zhì)體融合、DEAE-葡聚糖方法、細(xì)胞融合、Lipofectamine (GIBCO BRL)方法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、使用FuGENE6 試劑(Boehringer-Mannheim)的方法，和電穿孔。本發(fā)明的抗體生產(chǎn)細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類型和源自任何動(dòng)物物種，只要其可以產(chǎn)生抗體?？梢允褂美缭醋匀?、小鼠、綿羊、大鼠、兔和雞，及其細(xì)胞系和突變細(xì)胞系的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。抗體生產(chǎn)細(xì)胞還包括但不限于B細(xì)胞、人伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B細(xì)胞系18-81，和小鼠未成熟B細(xì)胞系WEHI-231。抗體生產(chǎn)細(xì)胞優(yōu)選包括源自雞的B細(xì)胞，例如源自雞抗體生產(chǎn)細(xì)胞的DT40和DT40-SW細(xì)胞系。DT40細(xì)胞系是源自B淋巴瘤的細(xì)胞系，其特征是2號(hào)染色體三體性(Bab a, T. ff. , Giroir, B. P.和Humphries, E.H. ,Virology 144:139-151,1985)。此外，可以使用野生型DT40細(xì)胞系或由本發(fā)明人建立的DT40-SW細(xì)胞系，后者的抗體突變特征可以通過可逆地開啟和關(guān)閉控制突變特征的AID基因的表達(dá)來調(diào)控(開和關(guān))(細(xì)節(jié)描述在Kanayama, N. , Todo, K. , Reth, M. , Ohmori, H.Biochem. Biophys. Res. Commn. 327:70-75(2005)和 JP-A(Kokai)2006-109711 中)。本發(fā)明的抗體生產(chǎn)細(xì)胞還包括通過基因操作而被人為賦予抗體生產(chǎn)能力的細(xì)胞。此類具有人為賦予的抗體生產(chǎn)能力的細(xì)胞不必能夠生產(chǎn)完整的抗體分子。細(xì)胞可以具有產(chǎn)生包含抗原結(jié)合必需的抗體可變區(qū)的抗體片段的能力。細(xì)胞可以生產(chǎn)嵌合抗體、人源化抗體或能夠結(jié)合抗原的非天然分子，或所述分子的片段。 本發(fā)明的抗體生產(chǎn)細(xì)胞可具有下述特征。本發(fā)明還涉及選擇如下所述的細(xì)胞的方法，在所述細(xì)胞中DNA構(gòu)建體和抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已經(jīng)發(fā)生了同源重組，其中所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼的期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。可以通過上述方法實(shí)現(xiàn)同源重組。發(fā)生了重組的細(xì)胞可以例如使用標(biāo)記基因表達(dá)作為指標(biāo)來加以選擇?；蛘?，可以利用抗體生產(chǎn)細(xì)胞中內(nèi)源性抗體表達(dá)的缺失作為指標(biāo)來選擇細(xì)胞。可選的，可以通過組合上述兩種指標(biāo)來選擇細(xì)胞。但是，選擇方法不限于上述實(shí)例。在DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間發(fā)生了同源重組的細(xì)胞變得不能產(chǎn)生內(nèi)源性抗體。因此，可以使用細(xì)胞表面有無內(nèi)源性抗體表達(dá)作為指標(biāo)來選擇發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。在本發(fā)明中，上述(3)的DNA的存在抑制了包含期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生。更具體而言，上述(3)的DNA的存在抑制了包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生。出于該理由，即使當(dāng)信號(hào)肽與包含期望的氨基酸序列的多肽連接以將多肽展示在細(xì)胞表面時(shí)，只要存在上述(3)的DNA，則包含多肽和抗體恒定區(qū)的多肽不會(huì)被展示在細(xì)胞表面。因此，可以以細(xì)胞表面上的抗體分子的有無作為指標(biāo)，使用抗抗體恒定區(qū)的抗體進(jìn)行檢測(cè)，來高效地選擇發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。利用細(xì)胞表面上的抗體分子的有無作為指標(biāo)的細(xì)胞選擇可以通過例如流式細(xì)胞儀、固定有抗體的磁珠(該抗體特異性結(jié)合抗體生產(chǎn)細(xì)胞所生產(chǎn)的抗體)等來實(shí)施。但是選擇方法不限于這些實(shí)例。
上述(3)的DNA優(yōu)選包括藥物抗性基因作為標(biāo)記基因來對(duì)細(xì)胞生長施加選擇壓力。此類藥物抗性基因包括但不限于，例如抗生素抗性基因，如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因。本發(fā)明還涉及用于制備產(chǎn)生多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法?？梢酝ㄟ^使用本文描述的方法獲得重組細(xì)胞，并使用下文所述方法從細(xì)胞的基因組DNA中去除下述DNA來制備生產(chǎn)多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。必要時(shí)，所述方法可包括選擇已去除了下文所述DNA的細(xì)胞的步驟?？梢允褂枚嚯牡漠a(chǎn)生作為指標(biāo)選擇已去除了下文所述DNA的細(xì)胞。在本文中，將被去除的DNA是 抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ;更具體而言，抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除。本發(fā)明還涉及用于制備產(chǎn)生多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體，允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和(C)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在所述細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA。在本發(fā)明的用于制備產(chǎn)生多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法中，位點(diǎn)特異性重組酶與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列反應(yīng)，由此，從抗體生產(chǎn)細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA。位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA抑制編碼期望的氨基酸序列的DNA和編碼抗體恒定區(qū)的DNA兩者或其中一種的轉(zhuǎn)錄，從而抑制編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄物的正常產(chǎn)生?；蛘撸挥趦蓚€(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA抑制編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的正常轉(zhuǎn)錄剪接，或者抑制所述翻譯產(chǎn)物的翻譯或加工(例如，折疊)，從而抑制編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄物的正常產(chǎn)生。因此，通過去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，恢復(fù)包含期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生。當(dāng)包含期望的氨基酸序列的多肽連接于信號(hào)肽時(shí)，該多肽被展示在細(xì)胞表面或分泌到細(xì)胞夕卜。在此情況下，基于細(xì)胞表面展示的多肽的有無，評(píng)估位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA是否已經(jīng)被去除。此外，可以通過細(xì)胞表面上展示多肽的存在來評(píng)估對(duì)編碼抗體可變區(qū)的區(qū)域的成功打靶。在本發(fā)明的用于制備產(chǎn)生多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法中，當(dāng)信號(hào)肽被連接于多肽或初始存在于多肽中時(shí)，肽被展示在細(xì)胞表面或分泌到細(xì)胞外。在本發(fā)明的方法中，(i)可以將包含編碼抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列作為期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶載體導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中。此外，(ii)可以將包含編碼抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列作為期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶載體導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)將(i)的載體導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞生產(chǎn)這樣的抗體，所述抗體包含內(nèi)源性抗體輕鏈以及具有內(nèi)源性抗體重鏈恒定區(qū)和插入到載體中的外源性抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體重鏈。
或者，當(dāng)將(ii)的載體導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中時(shí),細(xì)胞生產(chǎn)這樣的抗體,所述抗體包含內(nèi)源性抗體重鏈和具有內(nèi)源性抗體輕鏈恒定區(qū)及插入到載體中的外源性抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體重鏈。或者，當(dāng)將⑴和(ii)的載體導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞生產(chǎn)這樣的抗體，其包含抗體重鏈和抗體輕鏈，所述抗體重鏈具有內(nèi)源性抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列和插入到(i)的載體中的外源性抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，所述抗體輕鏈具有內(nèi)源性抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列和插入到(ii)的載體中的外源性抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。本發(fā)明涉及用于制備產(chǎn)生上述抗體的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)通過向表達(dá)AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體，允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并且能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和(c)從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。必要時(shí)，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括下述步驟(d)選擇已去除了(3)的DNA的細(xì)胞。已去除了(3)的DNA的細(xì)胞可以使用多肽的產(chǎn)生作為指標(biāo)來選擇。本發(fā)明的打靶載體除上述(I)至(3)的DNA以外，還可包括與抗體基因座的DNA同源的DNA。此外，當(dāng)編碼期望的氨基酸序列的DNA沒有信號(hào)肽編碼DNA時(shí)，可以在基因打靶載體中編碼期望的多肽的DNA的5’側(cè)插入編碼信號(hào)肽的DNA，以增強(qiáng)由該DNA編碼的多肽的細(xì)胞表面表達(dá)或分泌。
“導(dǎo)入了突變的多肽”也可以稱為“修飾的多肽”。突變包括取代、插入、缺失、添加，及其組合。在本發(fā)明的方法中，(i)可以將包含編碼抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列作為期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶載體導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中。此外，(ii)可以將包含編碼抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列作為期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶載體導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)(i)的載體被導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生這樣的抗體，所述抗體包含內(nèi)源性抗體輕鏈，以及具有內(nèi)源性抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列和插入到載體中的外源性抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體重鏈。 或者，當(dāng)(ii)的載體被導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中時(shí),細(xì)胞產(chǎn)生這樣的抗體,所述抗體包含內(nèi)源性抗體重鏈，以及具有內(nèi)源性抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列和插入到載體中的外源性抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體輕鏈?；蛘?，當(dāng)⑴和(ii)的載體被導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生這樣的抗體，所述抗體包含抗體重鏈和抗體輕鏈，所述抗體重鏈具有內(nèi)源性抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列和插入到(i)的載體中的外源性抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，所述抗體輕鏈具有內(nèi)源性抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列和插入到(ii)的載體中的外源性抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。作為AID基因表達(dá)的結(jié)果，突變以一定的頻率不僅導(dǎo)入到編碼內(nèi)源性抗體可變區(qū)氨基酸序列的DNA中，而且還導(dǎo)入到插入到(i)的載體中的編碼抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA中，以及插入到(ii)的載體中的編碼抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA中。因此，細(xì)胞生成在期望的抗體可變區(qū)中導(dǎo)入了突變的抗體。本發(fā)明涉及用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的抗體的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法。在上述用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法中，步驟(a)中(3)的DNA還可以被描述為這樣的DNA :其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除。此外，步驟(C)還可以被描述為通過使位點(diǎn)特異性重組酶在細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA。在本發(fā)明中，表達(dá)AID基因的細(xì)胞包括具有內(nèi)源性AID基因并可以表達(dá)該基因的細(xì)胞。更具體而言，此類細(xì)胞包括雞B細(xì)胞系DT40、人伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B細(xì)胞系18-81，和小鼠未成熟B細(xì)胞系WEHI-231，但不限于此。當(dāng)細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性AID基因時(shí)，通過重組向抗體可變區(qū)基因座中插入的編碼期望的氨基酸序列的DNA中導(dǎo)入突變。本發(fā)明還提供了用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體，允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；
(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并且能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA，其中，在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，AID基因表達(dá)可以人為地開啟和關(guān)閉；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；(c)從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除(3)的DNA ；(d)開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和(e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。 在上述用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法中，步驟(d)還可以被描述為選擇細(xì)胞表面不展示內(nèi)源性抗體的細(xì)胞的步驟，選擇表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞的步驟，或者選擇表達(dá)標(biāo)記基因并在細(xì)胞表面不展示內(nèi)源性抗體的細(xì)胞的步驟。本發(fā)明還涉及用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體，允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除；其中抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，且抗體生產(chǎn)細(xì)胞包含這樣的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA ;和位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，并且包含外源性AID基因，而且能夠被位點(diǎn)特異性重組酶倒位的DNA ；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；(c)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在所述細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA ；(d)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)，使位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA倒位，以開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和(e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體，允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含
(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除；其中抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，且抗體生產(chǎn)細(xì)胞包含DNA構(gòu)建體，其包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ;和位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間、并能夠被位點(diǎn)同一 性重組酶倒位、而且包含外源性AID基因的DNA ;和包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA的DNA構(gòu)建體，其中在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，位點(diǎn)特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下被活化，而在缺少胞外刺激的條件下不活化；(b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；(c)通過對(duì)細(xì)胞施加胞外刺激，活化位點(diǎn)特異性重組酶的活性，使位點(diǎn)特異性重組酶在細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)，從而從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA ；(d)通過應(yīng)用胞外刺激于細(xì)胞，活化位點(diǎn)特異性重組酶的活性，使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列反應(yīng)，使位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA倒位，開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和(e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。在本發(fā)明的用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法中，當(dāng)信號(hào)肽連接于或初始存在于多肽中時(shí)，肽被展示在細(xì)胞表面或分泌到細(xì)胞外。在本發(fā)明的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，可以通過使位點(diǎn)特異性重組酶在細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)，調(diào)控AID基因表達(dá)的有無(可開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá))。因此，可以開始或終止向編碼期望的氨基酸序列的DNA中導(dǎo)入突變。當(dāng)AID基因表達(dá)被開啟時(shí)，導(dǎo)入突變的功能活化，誘變?cè)诰幋a期望的氨基酸序列的DNA中以持續(xù)的方式發(fā)生。另一方面，當(dāng)AID基因表達(dá)被關(guān)閉時(shí)，DNA誘變保持被阻斷的狀態(tài)。S卩，一旦關(guān)閉表達(dá)，突變的DNA在關(guān)閉后不能進(jìn)一步突變，因此突變得以維持。有時(shí)，在啟動(dòng)AID基因表達(dá)后，突變導(dǎo)入到DNA中需要時(shí)間。如果在開始AID基因表達(dá)后不立即開始DNA誘變，則優(yōu)選培養(yǎng)細(xì)胞一定時(shí)間(例如，一個(gè)月)。培養(yǎng)條件可以是“40°C，在存在5%C02的條件下”，但不限于此。通過開/關(guān)AID基因表達(dá)作為調(diào)控基因突變的機(jī)制，可以將突變導(dǎo)入到編碼期望的氨基酸序列的靶DNA中?；蛘?，可以在已經(jīng)導(dǎo)入某些數(shù)量的突變后，阻止DNA中發(fā)生進(jìn)一步的突變事件。通過使位點(diǎn)特異性重組酶與抗體生產(chǎn)細(xì)胞反應(yīng)，位于位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA被去除，由此恢復(fù)包含期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生。通過選擇已發(fā)生上述過程的細(xì)胞，可以獲得生產(chǎn)包含期望的氨基酸序列的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。此外，通過選擇此類細(xì)胞，可以獲得包含期望的氨基酸序列的多肽和編碼所述多肽的DNA。必要時(shí)，可以將與位點(diǎn)特異性重組酶反應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間，直到細(xì)胞產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽為止。同時(shí)，本發(fā)明的表達(dá)AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞可以是這樣的細(xì)胞，其中的AID基因表達(dá)的有無可以人為調(diào)控。此類細(xì)胞包括但不限于通過將外源性AID基因?qū)氲讲痪哂袃?nèi)源性AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中而制備的細(xì)胞，和通過將外源性AID基因?qū)氲骄哂惺Щ畹腁ID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中而制備的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含AID基因與在細(xì)胞內(nèi)有功能的啟動(dòng)子可操作地連接的DNA的載體，獲得導(dǎo)入了外源性AID基因的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到各種啟動(dòng)子并選擇合適的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子包括但不限于，例如P -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子和EFla啟動(dòng)子。此外，本發(fā)明的抗體生產(chǎn)細(xì)胞包括這樣的細(xì)胞，其內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，并包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含 在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ;和包含外源性AID基因，并位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，其中位于位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA可以通過位點(diǎn)特異性重組酶倒位。在本文中，DNA構(gòu)建體有時(shí)被稱為“外源性AID基因構(gòu)建體”?！氨还δ苄云茐牡幕颉币部梢苑Q為“失活的基因”、“被刪除的基因”或“被敲除的基因”?；蚴Щ畎ɑ虮磉_(dá)的完全和部分的抑制。在本文中，基因失活意指基因表達(dá)被基因的核苷酸序列中的部分缺失、取代、插入、添加等抑制。“抑制基因表達(dá)”還包括表達(dá)基因但所廣生的蛋白質(zhì)不具有正常功能的情況。在本發(fā)明中，因?yàn)閮蓚€(gè)等位基因中僅一個(gè)是失活的，故可以實(shí)現(xiàn)AID基因的雜合敲除(JP 2006-109711 ;Biochem. Biophys. Res. Commun. 327:70(2005))。可以通過例如使用基因打靶載體進(jìn)行同源重組，來實(shí)現(xiàn)AID基因敲除。同源重組是通過使染色體中的基因和外源DNA同源重組來修飾目的基因的方法?；虼虬休d體可攜帶選擇標(biāo)記作為插入物，來鑒別已發(fā)生同源重組的細(xì)胞。此類選擇標(biāo)記基因包括但不限于抗生素抗性基因如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因；熒光蛋白基因，例如GFP和DsRed;以及生色酶的基因，例如￠-半乳糖苷酶(IacZ)和P -內(nèi)酰胺酶?？梢詫⒍嗑跘附接于標(biāo)記基因的3’偵U。本發(fā)明的外源性AID基因構(gòu)建體優(yōu)選整合到抗體生產(chǎn)細(xì)胞的基因組中。對(duì)外源性AID基因構(gòu)建體在基因組中的整合位置沒有特殊限定。但是，構(gòu)建體可以整合到例如內(nèi)源基因座的一個(gè)等位基因中的位置上(JP 2006-109711 ；Biochem. Biophys. Res.Commun. 327:70 (2005))。在此情況下，基于例如JP2006-109711的圖3中的信息，構(gòu)建包括這樣的DNA構(gòu)建體的AID基因打靶載體，所述DNA構(gòu)建體包含這樣的DNA，其中在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA與位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的外源AID基因(例如，SEQ ID NO: 50 ( 26)，GeneBank登錄號(hào)XM 416483)可操作地連接。將該載體導(dǎo)入到細(xì)胞中。結(jié)果在上述DNA構(gòu)建體和抗體生產(chǎn)細(xì)胞的內(nèi)源性AID基因之間發(fā)生同源重組。由此能夠獲得基因組中整合了外源性AID基因構(gòu)建體的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。啟動(dòng)子包括但不限于上述啟動(dòng)子。位于位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的外源AID基因可以通過位點(diǎn)特異性重組酶的反應(yīng)倒位。當(dāng)外源AID基因與啟動(dòng)子DNA按相同的方向放置時(shí)，因?yàn)閱?dòng)子DNA與外源AID基因是可操作地連接的，AID基因表達(dá)。同時(shí)，當(dāng)外源AID基因相對(duì)于啟動(dòng)子DNA按相反的方向放置時(shí)，AID基因不表達(dá)。如果內(nèi)源性AID基因是無活性的，但細(xì)胞中存在外源性AID基因構(gòu)建體，并使位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞反應(yīng)，重組酶識(shí)別細(xì)胞中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列，并使位于兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的區(qū)域倒位(即，AID基因相對(duì)于啟動(dòng)子的方向由相反的方向變?yōu)橄嗤姆较颍蛴上嗤姆较蜃優(yōu)橄喾吹姆较?。
因此，當(dāng)AID基因相對(duì)于啟動(dòng)子的方向由相反的方向變?yōu)橄嗤姆较驎r(shí)，AID基因表達(dá)從關(guān)閉變?yōu)殚_啟。相反的，當(dāng)AID基因相對(duì)于啟動(dòng)子的方向由相同的方向變?yōu)橄喾吹姆较驎r(shí)，AID基因表達(dá)從開啟變?yōu)殛P(guān)閉。更具體而言，當(dāng)細(xì)胞含有外源性AID基因構(gòu)建體，且啟動(dòng)子和AID基因在構(gòu)建體中按相同的方向排列時(shí)，通過位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞的反應(yīng)，將外源性AID基因的方向反轉(zhuǎn)為相對(duì)于啟動(dòng)子相反的方向。這終止AID基因表達(dá)，因此停止向由已整合到抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組中的、編碼期望的氨基酸序列的DNA表達(dá)的多肽中導(dǎo)入突變。如果即使當(dāng)位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，外源性AID基因構(gòu)建體的外源性AID基因方向也沒有反轉(zhuǎn)，則由于AID基因與基因的啟動(dòng)子按相同方向排列，啟動(dòng)子將驅(qū)動(dòng)AID基因構(gòu)建體表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，可以通過在位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞的反應(yīng)后，選擇啟動(dòng)子與AID基因按相同方向排列的細(xì)胞，獲得產(chǎn)生包含期望的氨基酸序列的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明還允許產(chǎn)生包含期望的氨基酸序列的多肽和編碼所述多肽的DNA。或者，當(dāng)細(xì)胞含有外源性AID基因構(gòu)建體，且啟動(dòng)子和AID基因在構(gòu)建體中按相反的方向排列時(shí)，通過使位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞反應(yīng)，將外源性AID基因的方向反轉(zhuǎn)為相對(duì)于啟動(dòng)子相同的方向。這啟動(dòng)AID基因表達(dá)，由此向由已整合到抗體生產(chǎn)細(xì)胞基因組中的、編碼期望的氨基酸序列的DNA表達(dá)的多肽中導(dǎo)入突變。如果即使當(dāng)使位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞反應(yīng)時(shí)，外源性AID基因構(gòu)建體的外源性AID基因方向也沒有反轉(zhuǎn)，則AID基因仍然維持相對(duì)于基因啟動(dòng)子相反的方向排列，啟動(dòng)子介導(dǎo)的AID基因表達(dá)仍然終止。根據(jù)本發(fā)明，可以通過在位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞的反應(yīng)后，選擇啟動(dòng)子與AID基因按相同方向排列的細(xì)胞，獲得產(chǎn)生修飾的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明還允許產(chǎn)生編碼所述修飾的多肽的DNA。有利的是，設(shè)計(jì)含有兩個(gè)標(biāo)記基因的外源性AID基因構(gòu)建體，所述標(biāo)記基因之一與AID基因方向相同，另一個(gè)以相對(duì)于AID基因相反的方向插入，因?yàn)檫@允許使用標(biāo)記基因之一進(jìn)行選擇，不論AID基因相對(duì)于啟動(dòng)子放置的方向是相同還是相反的。此類構(gòu)建體包括具有下列特征的外源性AID基因構(gòu)建體
包含從5’至3’端含有下列序列的DNA序列的外源性AID基因構(gòu)建體第一位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列，正向的第一標(biāo)記基因，反向的第二標(biāo)記基因，
反向的AID基因，和第二位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列。必須設(shè)計(jì)構(gòu)建體使得任一標(biāo)記基因僅當(dāng)與啟動(dòng)子排列方向相同時(shí)才表達(dá)。例如，當(dāng)使用GFP基因作為上述構(gòu)建體中的第二標(biāo)記基因時(shí)，優(yōu)選在第二標(biāo)記基因和AID基因之間插入IRES序列，以獲得高水平的GFP基因表達(dá)。例如，可以使用從5’至3’端含有下列序列的DNA構(gòu)建體正向的啟動(dòng)子，第一位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列，正向的第一標(biāo)記基因，正向的多聚A附加序列，反向的多聚A附加序列，反向的第二標(biāo)記基因，反向的IRES序列，反向的AID基因，和相對(duì)于第一位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列方向相反的第二位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列。 在備選的實(shí)施方案中，可以使用導(dǎo)入了 DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，所述構(gòu)建體中的AID基因位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間。在此情況下，通過位點(diǎn)特異性重組酶的作用切出AID基因，從而該細(xì)胞成為不可逆的AID缺陷。為了再次開啟細(xì)胞中的AID基因表達(dá)，需要將AID基因重新導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，可以使用該方法，因其能夠以100%的效率完全關(guān)閉AID基因。外源性AID基因構(gòu)建體可具有多種類型的標(biāo)記基因，以高效地選擇AID基因按特定方向排列的克隆。此類選擇標(biāo)記基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因；熒光蛋白基因，例如GFP和DsRed ;以及生色酶的基因，例如^ -半乳糖苷酶(IacZ)和P -內(nèi)酰胺酶。當(dāng)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子和AID基因在外源性AID基因構(gòu)建體中按相同方向排列，因而AID基因處于可表達(dá)的形式時(shí)，設(shè)計(jì)DNA構(gòu)建體，將標(biāo)記基因放置在與AID基因相同的方向，使得標(biāo)記基因也可以表達(dá)。在此情況下，表達(dá)標(biāo)記基因的抗體生廣細(xì)胞也可以表達(dá)AID基因。因此，可以使用標(biāo)記基因的表達(dá)作為指標(biāo)(基于表型)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。另一方面，當(dāng)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子和AID基因在外源性AID基因構(gòu)建體中按相反方向排列，因而AID基因處于不可表達(dá)的狀態(tài)時(shí)，設(shè)計(jì)DNA構(gòu)建體，將標(biāo)記基因放置在與AID基因相反的方向(將標(biāo)記基因放置在與啟動(dòng)子相同的方向)，使得標(biāo)記基因可以表達(dá)。在此情況下，表達(dá)標(biāo)記基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞不表達(dá)AID基因。因此，可以使用標(biāo)記基因的表達(dá)作為指標(biāo)(基于表型)選擇沒有AID基因表達(dá)的細(xì)胞。
在本發(fā)明中，不論AID基因表達(dá)是處于開或者關(guān)的狀態(tài)，都能夠選出產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的細(xì)胞。從分離的細(xì)胞中分離導(dǎo)入了期望的突變的多肽或者編碼所述多肽的DNA,并測(cè)試看是否為期望的多肽或編碼所述多肽的DNA。如果分離的多肽或DNA不是導(dǎo)入了期望的突變的多肽或者編碼所述多肽的DNA，而細(xì)胞內(nèi)AID基因表達(dá)處于開的狀態(tài)，則可以進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞。隨著細(xì)胞培養(yǎng)更長的時(shí)間，多肽中積累更多的突變。因此，可以從進(jìn)一步培養(yǎng)的細(xì)胞中分離多肽或者編碼多肽的DNA，并測(cè)試其是否為導(dǎo)入了期望的突變的多肽或編碼所述多肽的DNA。另一方面，如果分離的多肽或DNA不是導(dǎo)入了期望的突變的多肽或者編碼所述多肽的DNA，而細(xì)胞內(nèi)AID基因表達(dá)處于關(guān)的狀態(tài)，則開啟細(xì)胞內(nèi)的AID基因表達(dá)。這導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生進(jìn)一步導(dǎo)入突變的多肽?？梢詮募?xì)胞中分離導(dǎo)入了突變的多肽或者編碼所述多肽的DNA,并測(cè)試其是否為導(dǎo)入了期望的突變的多肽或編碼所述多肽的DNA。本發(fā)明的方法的實(shí)例描述如下。但是，方法不限于該實(shí)例。 (I)例如，將本發(fā)明的基因打靶載體導(dǎo)入到不表達(dá)AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中(AID基因表達(dá)關(guān)閉了的抗體生產(chǎn)細(xì)胞)。成功導(dǎo)入了載體的細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源性抗體分子。即使將本發(fā)明的基因打靶載體導(dǎo)入到表達(dá)AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中(AID基因表達(dá)開啟了的抗體生產(chǎn)細(xì)胞)，成功導(dǎo)入了載體的細(xì)胞也不表達(dá)內(nèi)源性抗體分子。(2)選擇不表達(dá)內(nèi)源性抗體分子的細(xì)胞。(3)然后，使位點(diǎn)特異性重組酶與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列反應(yīng)。通過重組酶去除位于位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，使細(xì)胞表達(dá)多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)氨基酸序列的嵌合蛋白)。此外，與細(xì)胞反應(yīng)的位點(diǎn)特異性重組酶反轉(zhuǎn)了 AID基因在外源性AID基因構(gòu)建體中的方向。AID基因的倒位導(dǎo)致基因表達(dá)(開啟AID基因表達(dá))。但是，在一些情況下，可能不發(fā)生AID基因的倒 位。這導(dǎo)致AID基因的表達(dá)開啟和關(guān)閉的細(xì)胞的混合物。(4)之后，選擇生產(chǎn)多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)氨基酸序列的嵌合蛋白)和表達(dá)AID基因的細(xì)胞?；蛘?，選擇產(chǎn)生多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)氨基酸序列的嵌合蛋白)但不表達(dá)AID基因的細(xì)胞。當(dāng)選擇后一種細(xì)胞時(shí)，使位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞進(jìn)一步反應(yīng)。選擇通過該處理開啟了 AID基因表達(dá)的細(xì)胞。(5)之后，從所選擇的表達(dá)AID基因和多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)氨基酸序列的嵌合蛋白)的細(xì)胞中分離產(chǎn)生具有期望的性質(zhì)的多肽的細(xì)胞?；蛘?，培養(yǎng)所選細(xì)胞一定時(shí)間，然后從培養(yǎng)細(xì)胞中選擇產(chǎn)生具有期望的性質(zhì)的多肽的細(xì)胞。可以在分離細(xì)胞之前或之后，通過位點(diǎn)特異性重組酶與細(xì)胞的反應(yīng)，關(guān)閉AID基因表達(dá)。(6)當(dāng)沒有獲得產(chǎn)生具有期望的性質(zhì)的多肽(包含期望的氨基酸序列和抗體恒定區(qū)氨基酸序列的嵌合蛋白)的細(xì)胞時(shí)，可以在培養(yǎng)細(xì)胞一定時(shí)間后重復(fù)步驟(5)。如果AID基因表達(dá)在(5)中關(guān)閉，則在培養(yǎng)之前再次開啟表達(dá)。(7)可以從分離的細(xì)胞中分離DNA，以驗(yàn)證導(dǎo)入到DNA中的突變的存在。可以使用下文描述的方法分離導(dǎo)入了突變的多肽或編碼所述多肽的DNA?？梢酝ㄟ^確定導(dǎo)入了突變的多肽的活性或者多肽編碼DNA的核苷酸序列，評(píng)估導(dǎo)入了突變的多肽或編碼所述多肽的DNA是否是感興趣的?；蛘撸?dāng)導(dǎo)入了突變的多肽是抗體、細(xì)胞因子或其他時(shí)，與抗原或配體的結(jié)合活性(特異性、親和力等)可用作指標(biāo)，或者當(dāng)多肽是酶等時(shí)，可以使用酶活性作為指標(biāo)，來測(cè)試導(dǎo)入了突變的多肽或編碼所述多肽的DNA是否是感興趣的。使用上述方法，可以從制備得到的細(xì)胞群中分離出產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的克隆。此外，可以通過在所獲得的克隆中開啟AID基因表達(dá)和重復(fù)進(jìn)行誘變，獲得產(chǎn)生導(dǎo)入了更多期望的突變的多肽的克隆。通過使用在所生產(chǎn)的多肽中期望的性質(zhì)的有無作為指標(biāo)來篩選，可以選擇產(chǎn)生具有期望的性質(zhì)的多肽的克隆。此類篩選可以在從細(xì)胞中分離多肽后進(jìn)行，或者使用沒有分離多肽的細(xì)胞進(jìn)行。在本文中，可以將編碼信號(hào)肽的DNA插入到在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的DNA和編碼期望的氨基酸序列的DNA之間，使得多肽展示在細(xì)胞表面或分泌到細(xì)胞外。當(dāng)多肽分泌到細(xì)胞外時(shí)，可以使用培養(yǎng)上清液實(shí)施篩選。在如上所述選擇細(xì)胞后，可以從細(xì)胞中分離DNA，來確定導(dǎo)入到核苷酸序列中的突變。在本發(fā)明中，位點(diǎn)特異性重組酶可以通過例如下述方法與細(xì)胞反應(yīng)。但是，方法不限于這些實(shí)例。 (I)將四環(huán)素、強(qiáng)力霉素等添加到含有這樣的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞中，所述構(gòu)建體中，連接有(或包含)核轉(zhuǎn)位信號(hào)的編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA被置于受四環(huán)素、強(qiáng)力霉素等調(diào)控的啟動(dòng)子3’偵U。*Gossen, M. Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression inmammalian cells by tetracycline responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci.USA89:5547-5551.*Gossen, M. , Freundl ieb, S. , Bende r, G. , Muller, G. , Hi I len, ff. Bujard, H.(1995)Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells. Science268:1766-1769.*Url inger, S. , Baron, U. , Thel lmann, M. , Hasan, M. T. , Bujard, H. Hi I len, ff.(2000)Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptionalactivators:Novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 97(14) :7963-7968.(2)將用于表達(dá)位點(diǎn)特異性重組酶的載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)。(3)將連接(或包含)核轉(zhuǎn)位信號(hào)的位點(diǎn)特異性重組酶導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。(4)向含有DNA構(gòu)建體的細(xì)胞應(yīng)用胞外刺激(例如，4_羥泰米芬)，所述構(gòu)建體包含編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA，所述位點(diǎn)特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少刺激的條件下不活化。本發(fā)明的抗體生產(chǎn)細(xì)胞可含有包含這樣的DNA的DNA構(gòu)建體，所述DNA中，在細(xì)胞內(nèi)有功能的啟動(dòng)子DNA與編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA可操作地連接。在下文中，該DNA構(gòu)建體有時(shí)被稱為“位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建體”。如上所述,在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子包括但不限于￠-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子和EFl a啟動(dòng)子。位點(diǎn)特異性重組酶可以是處于這樣的形式在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少刺激的條件下不活化。此類位點(diǎn)特異性重組酶包括，但不限于位點(diǎn)特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的融合蛋白。
在本發(fā)明的位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建體中，可將核轉(zhuǎn)位信號(hào)插入到位點(diǎn)特異性重組酶的N末端。此外，優(yōu)選將多聚A附加序列置于編碼位點(diǎn)特異性重組酶、或者編碼位點(diǎn)特異性重組酶與包含雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的融合蛋白的DNA的3’端。同時(shí)，本發(fā)明的位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建體可包括選擇標(biāo)記基因。此類選擇標(biāo)記基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、滅瘟素S脫氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、組氨醇脫氫酶基因、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因；突光蛋白基因，例如GFP和DsRed ;以及生色酶例如@ -半乳糖苷酶(IacZ)和￠-內(nèi)酰胺酶的基因。多聚A可以附接到標(biāo)記 基因的3’端。只要本發(fā)明的雌激素受體具有配體結(jié)合活性，則對(duì)其沒有限制。雌激素受體包括野生型(例如，SEQ ID NO: 52和53)和突變的雌激素受體。突變的雌激素受體包括只應(yīng)答4-羥泰米芬而不應(yīng)答真正的配體一雌二醇的受體。更具體而言，突變的雌激素受體包括但不限于在第525位包含甘氨酸的氨基酸取代的突變雌激素受體。當(dāng)雌激素作為抗體生產(chǎn)細(xì)胞來源的物種的性激素時(shí)，或者當(dāng)抗體生產(chǎn)細(xì)胞對(duì)雌激素具有響應(yīng)性時(shí)，優(yōu)選使用雌激素結(jié)合活性受損的突變雌激素受體。當(dāng)使用融合蛋白形式的受體時(shí)，可以將它的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與位點(diǎn)特異性重組酶融合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備突變雌激素受體，例如根據(jù)下文所示文件(I)中描述的方法(該文件描述了多種類型的變體的制備)。同時(shí)，文件(2)報(bào)告了一種在其氨基酸序列的第525位包含精氨酸取代甘氨酸的突變雌激素受體只應(yīng)答4-羥泰米芬而不應(yīng)答真正的配體雌二醇。此外，文件(3)和(4)公開了以融合蛋白的形式使用突變雌激素受體的他莫昔芬結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過恰當(dāng)?shù)貐⒖歼@些文件，制備位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建體。在本文描述的實(shí)施例中，使用Cre重組酶(例如，SEQ ID N0:51(圖27))與突變雌激素受體的他莫昔芬結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:40和41 (圖25))融合的突變雌激素受體。用于實(shí)施例中的突變雌激素受體描述在文件(4)(例如，圖I)中。(I)Fawell 等人，Characterization and colocalization of steroid bindingand dimerization activities in the mouse estrogen receptor. Cell (1990)vol. 60 (6)pp.95-362(2) Danielian 等人，Identification of residues in the estrogenreceptor that confer differential sensitivity to estrogen and 輕泰米芬.MolEndocrinol(1993)vol. 7(2)pp. 232-40(3) Littlewood 等人，A modified oestrogen receptor ligand-binding domainas an improved switch for the regulation of heterologous proteins. Nucleic AcidsRes (1995) vol. 23(10)pp. 1686(4) Zhang 等人，Inducible site-directed recombination in mouse embryonicstem cells. Nucleic Acids Res(1996)vol. 24(4)pp. 543-8本發(fā)明的位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建體包括但不限于具有下文所述結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體(對(duì)應(yīng)于上述文件(4)的圖I中示例的構(gòu)建體)。包含下列(I)和⑵的DNA的構(gòu)建體，其中(I)的DNA與⑵的DNA可操作地連接(上述文件(4)的圖Ia中被稱為“pANCreMer”的構(gòu)建體)(I)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；
(2)其中下列⑴和(ii)的DNA合框連接的DNA ；(i)編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA，其包含緊鄰于起始密碼子之后的編碼核轉(zhuǎn)位信號(hào)的DNA片段；和(ii)編碼雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的DNA。包含下列(I)和(2)的DNA的構(gòu)建體，其中(I)的DNA與(2)的DNA可操作地連接(上述文件(4)的圖Ib中被稱為“pANMerCreMer”的構(gòu)建體)(I)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)下列⑴和(ii)的DNA按(ii) - (i) - (ii)的順序從載體DNA鏈的5’至3’端合框連接的DNA ； (i)編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA，其包含緊鄰于起始密碼子之后的編碼核轉(zhuǎn)位信號(hào)的DNA片段；和(ii)編碼雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的DNA。優(yōu)選的是，編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA在其3’端包含多聚A附加序列?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將制備的位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建體導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，獲得含有此類位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建體的細(xì)胞。優(yōu)選地，導(dǎo)A的位點(diǎn)特異性重組酶基因構(gòu)建體整合到基因組中。位點(diǎn)特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少刺激的條件下不活化。在本文中，“在存在胞外刺激的條件下活化”意指通過刺激，位點(diǎn)特異性重組酶表達(dá)成能夠轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中的活性形式，或者所表達(dá)的位點(diǎn)特異性重組酶轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中。換言之，意味著位點(diǎn)特異性重組酶變?yōu)槟軌蚺c細(xì)胞基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列反應(yīng)并特異性切割所述識(shí)別序列的狀態(tài)。因此，位點(diǎn)特異性重組酶可以是任何形式，只要編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA響應(yīng)于刺激而表達(dá)或者所述位點(diǎn)特異性重組酶響應(yīng)于刺激而活化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到各種用于刺激-響應(yīng)性表達(dá)或激活的調(diào)控系統(tǒng)，和從中選擇恰當(dāng)?shù)南到y(tǒng)。位點(diǎn)特異性重組酶構(gòu)建體包括例如這樣的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體中編碼雌激素受體或包括其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的基因與位點(diǎn)特異性重組酶cDNA合框連接，使得位點(diǎn)特異性重組酶可以作為與雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的融合蛋白表達(dá)(詳細(xì)內(nèi)容參見JP-A(Kokai) 2006-109711的實(shí)施例)。在此情況下，當(dāng)將胞外刺激施加于細(xì)胞時(shí)，位點(diǎn)特異性重組酶活化。因此，只有在施加時(shí)，位點(diǎn)特異性重組酶才活化(意味著上述融合蛋白轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，因此位點(diǎn)特異性重組酶可以與位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列反應(yīng))，從而使含有AID基因且位于位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的區(qū)域倒位。與此同時(shí)，位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的含有啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因的DNA被去除。胞外刺激包括但不限于對(duì)雌激素受體或其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的刺激。“對(duì)雌激素受體或其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的刺激”包括但不限于用雌激素(例如，雌二醇)及其衍生物(例如雌激素激動(dòng)劑4-羥泰米芬)的刺激。本發(fā)明的抗體生產(chǎn)細(xì)胞可具有下列(a)和(b)的特征。(a)在抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，XRCC3基因的兩個(gè)等位基因中僅有一個(gè)是失活的。(b)相比具有兩個(gè)XRCC3基因的等位基因的細(xì)胞，導(dǎo)入點(diǎn)突變的頻率升高。
對(duì)于編碼源自抗體生產(chǎn)細(xì)胞的蛋白質(zhì)的DNA，其AID基因介導(dǎo)的誘變主要通過被稱為基因轉(zhuǎn)變(conversion)的機(jī)制發(fā)生。也會(huì)發(fā)生由單核苷酸取代造成的點(diǎn)突變，但頻率很低。同時(shí)，已報(bào)道了在基因轉(zhuǎn)化突變占主導(dǎo)地位的DT40細(xì)胞中轉(zhuǎn)變突變模式的方法，從基因轉(zhuǎn)變(conversion)變?yōu)辄c(diǎn)突變。已知可以通過僅失活兩個(gè)XRCC3等位基因之一而在細(xì)胞中誘導(dǎo)點(diǎn)突變(X射線修復(fù)互補(bǔ)缺陷修復(fù)，中華倉鼠細(xì)胞3中)(JP-A(Kokai) 2009-60850)。因此，本發(fā)明還包括兩個(gè)XRCC3等位基因中僅一個(gè)失活的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。XRCC3是維持染色體穩(wěn)定性和修復(fù)受損DNA的基因，并參與細(xì)胞內(nèi)的同源重組。雞XRCC3基因具有8個(gè)外顯子。雞XRCC3基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID N0:39。SEQ IDNO:39中8個(gè)外顯子的位置顯示如下外顯子1，第I至215位；外顯子2，第216至284位；
外顯子3，第285至422位；外顯子4,第423至635位；外顯子5,第636至790位；外顯子6，第791至1003位；外顯子7，第1004至1050位；和外顯子8,第1051至1935位。在本發(fā)明的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，存在于細(xì)胞的同源染色體中的兩個(gè)XRCC3等位基因中僅一個(gè)可以被失活?；虻氖Щ钊缟纤觥？梢酝ㄟ^例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如使用上述打靶載體的同源重組方法，來制備基因失活的細(xì)胞。在本發(fā)明中，可以分隔雞XRCC3基因的8個(gè)外顯子中的任一個(gè)。可以分割多個(gè)外顯子。優(yōu)選分割第6個(gè)外顯子。用于本發(fā)明中的抗體生產(chǎn)細(xì)胞包括但不限于B細(xì)胞、人伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B細(xì)胞系18-81，和小鼠未成熟B細(xì)胞系WEHI-231?？贵w生產(chǎn)細(xì)胞優(yōu)選包括源自雞的B細(xì)胞，例如源自雞抗體生產(chǎn)細(xì)胞的DT40和DT40-SW細(xì)胞系。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA的方法，包括下述步驟(a)通過本文所述的制備抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，制備產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞；和(b)從步驟(a)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中分離編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法分離DNA。本發(fā)明的產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞包括在細(xì)胞表面展示多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞；將多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯姆置诘郊?xì)胞外的抗體生產(chǎn)細(xì)胞；和在細(xì)胞質(zhì)中含有多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡姆椒?，包括下述步驟(a)通過本文所述的制備抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，制備產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞；和(b)從步驟(a)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞或其分泌材料中分離多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯摹?br> 當(dāng)抗體生產(chǎn)細(xì)胞在細(xì)胞表面展示多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯臅r(shí)，可以通過在溶解膜級(jí)分后進(jìn)行親和層析來分離多肽?；蛘撸?dāng)抗體生產(chǎn)細(xì)胞將多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯姆置诘郊?xì)胞外時(shí)，可以在濃縮培養(yǎng)上清液后進(jìn)行親和層析來分離多肽?；蛘撸?dāng)抗體生產(chǎn)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯臅r(shí)，可以在制備無細(xì)胞提取物后通過親和層析純化等來分離多肽。
本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA的方法，包括下述步驟(a)通過上述生產(chǎn)編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA的方法，產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA ;和(b)收集由步驟(a)生產(chǎn)的DNA編碼的多肽。一旦獲得了編碼期望的多肽的DNA，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過公知的方法從DNA制備多肽。此類方法包括但不限于例如這樣的方法將攜帶DNA作為插入物的基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中，以收集細(xì)胞分泌的多肽。本發(fā)明還提供了抗體生產(chǎn)細(xì)胞，所述細(xì)胞中在包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域和DNA構(gòu)建體之間已經(jīng)發(fā)生了同源重組，其中所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ;和(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。包含在本發(fā)明的細(xì)胞中的DNA構(gòu)建體描述如上。本發(fā)明的細(xì)胞可具有本文描述的所有特征。此類細(xì)胞包括但不限于下述細(xì)胞。包含下列(a)至(C)或(a)至(d)的DNA構(gòu)建體的抗體生產(chǎn)細(xì)胞，所述細(xì)胞中在包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域和下列(a)的DNA構(gòu)建體之間已經(jīng)發(fā)生了同源重組，且所述細(xì)胞的內(nèi)源性AID基因被功能性破壞(a) DNA構(gòu)建體，包括(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ；(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA,該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除；(b) DNA構(gòu)建體，包含在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ;和位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，且其能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶轉(zhuǎn)位，并包含外源性AID基因；(C)DNA構(gòu)建體，包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少刺激的條件下不活化；和(d)包括這樣的XRCC3基因的DNA構(gòu)建體，其中所述基因的兩個(gè)等位基因之一中的第6個(gè)外顯子是失活的。(c)的DNA構(gòu)建體還可以被描述為這樣的DNA構(gòu)建體，其包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA，和編碼位點(diǎn)特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的融合蛋白的DNA?？梢酝ㄟ^上述方法制備此類細(xì)胞。含有上述(a)至(C)的DNA構(gòu)建體的細(xì)胞包括但不限于DT40-SW細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含本文中描述的細(xì)胞的試劑盒。 所述試劑盒可用于例如將編碼期望的氨基酸序列的DNA插入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域中?；蛘?，所述試劑盒可用于制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明的試劑盒除本文描述的細(xì)胞外，還可包含本文描述的打靶載體。本發(fā)明還提供了本文描述的打靶載體。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的打靶載體的細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可用于例如制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的細(xì)胞。此類細(xì)胞包括但不限于下文所述的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的打靶載體的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒可用于讓包含編碼抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域與DNA構(gòu)建體之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含(I)在所述細(xì)胞中執(zhí)彳丁功能的啟動(dòng)子DNA ；(2)編碼期望的氨基酸序列的DNA ；(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA。本發(fā)明的試劑盒可包括本文中描述的抗體生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的DNA。此類DNA可用作構(gòu)建本發(fā)明的基因打靶載體的材料，并可以從雞來源的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中分離，例如通過實(shí)施例中描述的方法。本發(fā)明中新鑒別的序列是SEQ ID N0:7的核苷酸序列中的第1-3120位和第3882-7891位的核苷酸。本發(fā)明還提供了插入了本發(fā)明的DNA的載體。例如，當(dāng)使用大腸桿菌作為宿主時(shí)，對(duì)所述載體沒有特殊的限制，只要本發(fā)明的載體具有供大腸桿菌中復(fù)制用的“起點(diǎn)(ori) ” (例如，JM109、DH5 a、HBlOl和XLlBlue)以允許在大腸桿菌等中大規(guī)模擴(kuò)增和制備該載體，并且進(jìn)一步具有用于選擇轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的基因(例如，允許使用試劑(如青霉素、四環(huán)素、卡那霉素和氯霉素)區(qū)分的藥物抗性基因)即可。此類載體包括例如M13載體、pUC載體、pBR322、pBluescript和pCR-Script。對(duì)于cDNA亞克隆和切出，除上述載體外，可以使用例如PGEM-T、pDIRECT和pT7。當(dāng)使用載體產(chǎn)生由本發(fā)明的DNA編碼的多肽時(shí)，表達(dá)載體是特別有效的。例如，當(dāng)目標(biāo)是在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，表達(dá)載體需要具有上述用于在大腸桿菌中擴(kuò)增的性質(zhì)。此外，當(dāng)使用大腸桿菌(例如，JM109、DH5 a、HBlOl和XLl-Blue)作為宿主時(shí)，載體需要具有用于在大腸桿菌中高效表達(dá)的啟動(dòng)子，例如，IacZ啟動(dòng)子(Ward 等人，Nature 341，544-546，1989 ；FASEB J. 6，2422-2427，1992)、araB 啟動(dòng)子(Better等人，Science240, 1041-1043, 1988)或17啟動(dòng)子。除上述載體外，此類載體包括PGEX-5X-1 (Pharmacia)、“QIAexpress 系統(tǒng)”(QIAGEN)、pEGFP 和 pET。
此外，載體可含有用于多肽分泌的信號(hào)序列。當(dāng)產(chǎn)生多肽到大腸桿菌的周質(zhì)空間中時(shí)，可使用PelB信號(hào)序列(Lei, S. P.等人，J. Bacteriol. 169，4379，1987)作為用于多肽分泌的信號(hào)序列?？梢酝ㄟ^例如氯化鈣方法或電穿孔方法將載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。除大腸桿菌載體外，用于表達(dá)本發(fā)明的DNA的載體包括例如源自哺乳動(dòng)物(例如，pcDNA3(Invitrogen)、pEGF-BOS(Nucleic Acids Res. 18(17)，5322，1990)、pEF 和 pCDM8)、昆蟲細(xì)胞(例如，“Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(GIBC0-BRL)和pBacPAK8)、植物(例如，pMHl和pMH2)、動(dòng)物病毒(例如，pHSV、pMV和pAdexLcw)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，pZIPneo)、酵母(例如，“畢赤酵母表達(dá)試劑盒”(Invitrogen)、pNVll和SP-Q01)和枯草芽孢桿菌(例如，PPL608和pKTH50)的表達(dá)載體。為了在動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO、COS和NIH3T3細(xì)胞)中表達(dá)，載體需要具有在此類細(xì)胞中表達(dá)必需的啟動(dòng)子，例如SV40啟動(dòng)子(Mulligan等人，(1979)Nature 277:108)、MMLV-LTR 啟動(dòng)子、EFl a 啟動(dòng)子(Mizushima 等人，(1990)Nucleic Acids Res. 18:5322)或CMV啟動(dòng)子。更優(yōu)選的，載體具有用于選擇轉(zhuǎn)化子的基因(例如，允許使用藥物(例如，新霉素和G418)區(qū)分的藥物抗性基因)。具有此類性質(zhì)的載體包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 p0P13?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如電穿孔方法,將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。本發(fā)明還提供了導(dǎo)入了本發(fā)明的DNA或載體的細(xì)胞。對(duì)導(dǎo)入了本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞沒有特殊的限制?？梢允褂美绱竽c桿菌和各種類型的動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可用作例如用于生產(chǎn)和表達(dá)本發(fā)明多肽的生產(chǎn)系統(tǒng)。多肽生產(chǎn)細(xì)胞包括體外和體內(nèi)系統(tǒng)。此類體外生產(chǎn)系統(tǒng)包括使用真核細(xì)胞或原核細(xì)胞的系統(tǒng)。真核細(xì)胞，例如動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞，可用作宿主。已知的動(dòng)物細(xì)胞包括例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO (J. Exp. Med. (1995) 108:945)、C0S、3T3、骨髓瘤、BHK (幼倉鼠腎)、HeLa和Vero ;兩棲動(dòng)物細(xì)胞，例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞(Valle等人，(1981)Nature291，358-340);和昆蟲細(xì)胞，例如Sf9, Sf21和Tn5。特別是對(duì)于CHO細(xì)胞，優(yōu)選使用DHFR基因缺陷的 dhfr-CHO(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77:4216-4220)和 CHO K-I (Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60:1275)。在動(dòng)物細(xì)胞中，CHO優(yōu)選用于大規(guī)模表達(dá)?？梢詫⑤d體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，例如通過磷酸鈣方法、DEAE-葡聚糖方法、使用陽離子脂質(zhì)體DOTAP (Boehringer-Mannheim)的方法、電穿孔方法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法等。植物細(xì)胞包括例如煙草來源的細(xì)胞，已知作為多肽生產(chǎn)細(xì)胞。可以使用來自這些細(xì)胞的愈傷組織培養(yǎng)物。已知的真菌細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，例如酵母屬，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),和絲狀真菌,如曲霉屬，包括黑曲霉(Aspergillus niger)。使用原核細(xì)胞的生產(chǎn)細(xì)胞包括使用細(xì)菌細(xì)胞的系統(tǒng)。已知的細(xì)菌細(xì)胞包括大腸桿菌(例如，JM109、DH5alpha 和 HB101)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。本說明書引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文件都通過引用整合到本文中。
實(shí)施例在下文中，將參照實(shí)施例具體描述本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不應(yīng)視為局限于此。、
本發(fā)明人和其他研究小組證實(shí)了當(dāng)目標(biāo)基因整合到DT40或Ramos細(xì)胞的抗體基因的基因座中時(shí)，目標(biāo)基因被突變(Wang，L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 101, 16745-16749(2004) ；Kanayama, N.等人，Nucleic Acids Res. 34，elO (2006);Arakawa, H.等人，Nucleic Acids Res. 36，el (2008))?；谏鲜鍪聦?shí)，本發(fā)明人認(rèn)為如果建立用于導(dǎo)入外源基因到具有下列特征的DT40中的系統(tǒng)，可以使用基于DT40的抗體生產(chǎn)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)有效的外源抗體親和力成熟。(I)在導(dǎo)入的抗體基因中發(fā)生突變。(2)由導(dǎo)入基因編碼的抗體表達(dá)并展示在細(xì)胞表面。(3)由導(dǎo)入基因編碼的抗體表達(dá)并分泌到培養(yǎng)上清液中?？贵w基因的基因座包括啟動(dòng)子和下游各外顯子，所述各外顯子包括編碼前導(dǎo)肽的外顯子，前導(dǎo)肽含有靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所需要的信號(hào)；編碼可變區(qū)的外顯子；和編碼恒定區(qū)的 外顯子(圖I)。在重鏈中，恒定區(qū)包括多個(gè)外顯子。抗體是以分泌的形式還是以膜結(jié)合的形式表達(dá)取決于外顯子的用法。因此，本發(fā)明人認(rèn)為用于構(gòu)建具有上述特征的系統(tǒng)的最有效的方法是用外源抗體基因的可變區(qū)取代雞抗體基因座中的可變區(qū)外顯子(圖1A)。本發(fā)明人認(rèn)為，通過用來源于外源抗體的可變區(qū)取代重鏈和輕鏈基因的可變區(qū)，可以制備出抓這樣的DT40，其表達(dá)具有來源于外源抗體的可變區(qū)以及雞來源的恒定區(qū)的嵌合抗體(圖2)。生產(chǎn)表達(dá)嵌合抗體的DT40要求如下(I)分離和結(jié)構(gòu)解析雞抗體基因；和(2)構(gòu)建用于取代雞抗體基因座中的可變區(qū)外顯子的打靶載體。隨著基因組分析的進(jìn)展，抗體輕鏈基因區(qū)域的核苷酸序列是已知的；但是，重鏈僅有部分信息可用。因此，本發(fā)明人分離和測(cè)序了未鑒別的抗體重鏈區(qū)域?；谒沂镜男畔?，本發(fā)明人構(gòu)建了各種用于取代抗體可變區(qū)基因的打靶載體，并將它們導(dǎo)入DT40-SW細(xì)胞內(nèi)。但是，發(fā)現(xiàn)具有目的修飾基因的細(xì)胞的獲得效率低于常規(guī)的基因敲除。之后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了有效的解決方案，并發(fā)現(xiàn)可以只通過本發(fā)明的方法建立有效生產(chǎn)嵌合抗體的細(xì)胞。此外，本發(fā)明人嘗試通過使用所制備的細(xì)胞的突變機(jī)制將突變導(dǎo)入外源抗體基因中，并成功地以可與野生型DT40-SW導(dǎo)入突變到其內(nèi)源性抗體基因中相比較的效率，將突變導(dǎo)入到抗體基因中。本發(fā)明的實(shí)施例詳細(xì)示例如下。(I)克隆和分析雞抗體重鏈基因可變區(qū)基因上游和下游的基因片段是構(gòu)建可變區(qū)基因打靶載體必需的。對(duì)雞抗體重鏈基因已進(jìn)行了一定程度的分析(Reynaud, C-A.等人，Cell59, 171-183(1989) ；Kitao, H. , Immunol. Lett. 52, 99-104 (1996) ；Kitao, H.等人，Int.Immunol. 12, 959-968 (2000)) 0但是，對(duì)于在可變區(qū)基因周圍的區(qū)域只有極少的信息?？贵w重鏈基因被認(rèn)為是非常不穩(wěn)定的(Reynaud, C-A.等人，Cell59，171-183 (1989))。但是，原因尚不清楚。在本發(fā)明中，雞抗體重鏈可變區(qū)基因是從DT40制備的基因組DNA文庫(由東京大學(xué)的Shunichi Takeda博士提供)中分離的。為了制備探針，通過DNA步移方法分離在抗體重鏈可變區(qū)基因的上游區(qū)域。使用KOD-pIus DNA聚合酶(T0Y0B0)在25微升的反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR。在第一輪PCR中，使用針對(duì)JH下游區(qū)域的引物(cJH1R1:5，-GGGGTACCCGGAGGAGACGATGACTTCGG-3’ ；SEQ ID NO: I)作為反義引物，而用不同的序列作為有義引物。使用DT40基因組DNA作為模板，如下進(jìn)行PCR:進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的(940C，15秒；68°C (-0. 7°C /循環(huán))，30秒；和68°C，4分)，再進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的(94°C，15秒；57°C，30秒；和68°C，4分)。第二輪PCR使用5微升的第一輪PCR混合物作為模板，反義引物(cJH-R:5，-CTTCGGTCCCGTGGCCCCATGCGTCGAT-3’ ；SEQ ID NO :2)和與第一輪PCR相同的有義引物。第二輪PCR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的(94°C，15秒；62°C，30秒；和68°C，4分)。PCR使用TdT-2 (5’-GGITCAATGTAGTCCAGTCC-3’ ；SEQ ID NO: 3)作為有義引物，產(chǎn)生約 Ikb 的PCR產(chǎn)物。因此，將產(chǎn)品克隆到pCR-Blunt載體(Invitrogen)中。產(chǎn)品的序列分析揭示了它含有雞抗體重鏈VDJ基因序列，以及一段可變區(qū)基因上游區(qū)域的已知序列((M30319 ；Reynaud, C-A.等人，Cell59，171-183 (1989))，和一段 464bp 的更上游序列(圖 19 ；SEQ ID NO:4) 為了克隆在抗體重鏈可變區(qū)周圍的區(qū)域中的基因，使用PCR DIG探針合成試劑盒(Roche)與上述基因片段作為模板以及有義引物 (CHCupF-Xba:5，-GTGGCCATTCTAGAATTAATTGCACC-3 ;SEQ ID NO:5)，和反義引物(CHCupR-Bam:5，-GGAGGGATCCGGCTTCGTTAGC-3’ ；SEQ ID NO :6) 一起制備 DIG 標(biāo)記
的探針。使用上述探針，根據(jù)Roche提供的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程篩選插入了來自DT40基因組DNA的約20kb片段的ADASH II噬菌體文庫。從噬菌體文庫中獲得了 2個(gè)陽性克隆(200，OOOpfu)。將源自兩個(gè)克隆之一的約20kb的NotI片段亞克隆到pBluescript II SK中。然后，從亞克隆獲得含有重鏈可變區(qū)基因及其上游(約3. 5kb)和下游(約4. Okb)區(qū)域的XbaI-NotI片段(共計(jì)約8kbp)。針對(duì)XbaI-NotI片段構(gòu)建限制性酶切圖(圖3)，并分析序列。結(jié)果顯示片段含有7891bp的雞抗體重鏈基因(圖20 ；SEQ ID NO:7)。發(fā)現(xiàn)整個(gè)區(qū)域，除了可變區(qū)基因周圍761bp的區(qū)域(其包括Reynaud, C-A等人報(bào)道的序列(Cell 59，171-183(1989)))之外，是之前尚未報(bào)道過的新序列。使用該序列構(gòu)建用于重鏈可變區(qū)基因的打靶載體。(2)構(gòu)建用于重鏈可變區(qū)的基因打靶載體為了插入外源抗體可變區(qū)基因，在信號(hào)肽序列周圍和JH下游的內(nèi)含子中導(dǎo)入了限制性位點(diǎn)(圖4_6、21和22)。構(gòu)建了兩種打靶載體，它們的導(dǎo)入到信號(hào)肽序列中的限制性位點(diǎn)不同。(VH打靶載體I ;圖4、5和21)修飾編碼VH基因的第3和第4個(gè)氨基酸的密碼子，構(gòu)成PvuII位點(diǎn)(圖4A)。這導(dǎo)致所編碼的氨基酸對(duì)從蘇氨酸/亮氨酸變?yōu)楣劝滨０?亮氨酸。此外，用小鼠單克隆抗體中相對(duì)頻繁使用的谷氨酸取代VH的第I個(gè)氨基酸。此外，在JH的下游導(dǎo)入一個(gè)SpeI位點(diǎn)。由于PvuII消化產(chǎn)生平末端，將待插入的外源抗體可變區(qū)基因的5’端設(shè)計(jì)為平末端。此外，在JH的3’端附接剪接供體共有序列和SpeI位點(diǎn)(5’-ggtgagtactagt-3’ ；SEQ IDNO:42)(圖4B)?；蛘撸鍿peI位點(diǎn)，也可以連接AvrII、XbaI或NheI位點(diǎn)到外源抗體可變區(qū)基因上，因?yàn)橛肁vrII、XbaI或NheI消化產(chǎn)生與SpeI消化相同的粘性末端。上述設(shè)計(jì)允許插入多種抗體基因片段。通過寡核苷酸接頭將雞抗體重鏈基因的XbaI-NotI片段插入到pBluescript IISK載體中，所述載體事先用PvuII消化去除多克隆位點(diǎn)(圖5A)。使用雞抗體重鏈基因作為模板，以及靠近BamHI位點(diǎn)的有義引物(CHFup Ik-Bam:5’-GTGGGATCCCTAATTAATGTTGGCG-3’ ；SEQ ID NO:8)和靠近信號(hào)肽序列的反義引物(CJH4R-PS S:5’-TATTCCGCGGACTAGTACGTCAGCTGAACCTCCGCCATCAGCCCTGTGGGGA-3’ ；SEQ ID NO:9)一起制備PCR片段，所述片段含有PvuII、SpeI和SacII位點(diǎn)。用該P(yáng)CR片段取代小鼠抗體重鏈基因的BamHI-SacII部分(圖5B)。相繼去除上游的XbaI-BamHI和下游的XhoI-NotI 部分(圖 5C)。使用接頭(5，-CAGATCTGGC-3，；SEQ ID NO:43)導(dǎo)入 BglII 位點(diǎn)(圖 OT)。
使用BamHI 從 pLoxBsr (Arakawa, H.等人，BMC Biotechnol. 17 (2001))切出含有位于IoxP序列之間的P肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子DNA、滅瘟素S抗性基因和多聚A附加序列的DNA片段，并插入到BglII位點(diǎn)(圖5E)?？梢允褂闷渌鸇NA構(gòu)建體，只要它們含有位于IoxP序列之間的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，例如藥物抗性基因。對(duì)含有位于IoxP序列之間的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因的DNA構(gòu)建體而言，其相對(duì)于靶基因的取向沒有限制。對(duì)于該實(shí)施例中使用的載體，以與抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄方向相反的方向插入滅瘟素S抗性基因。VH打靶載體I的序列顯示在圖21(SEQ ID NO: 10)中。(VH打靶載體2 ;圖5、6和22)為了允許在信號(hào)肽的緊鄰后方插入外源抗體可變區(qū)基因，修飾信號(hào)肽的末端核苷酸序列，使其具有SphI位點(diǎn)(圖6A)。JH側(cè)的結(jié)構(gòu)與VH打靶載體I的結(jié)構(gòu)相同。當(dāng)外源抗體基因在不改變結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的序列的條件下插入到載體中時(shí)，在基因的5’端附接上一個(gè)SphI位點(diǎn)和一個(gè)核苷酸“g”(5’-gcatgcg-3’)，在3’末端附接上一段剪接供體共有序列和一個(gè)SphI位點(diǎn)(5，-ggtgagtactagt-3’ ；SEQ ID NO:42)，與VH打祀載體I的情況相同(圖6B)?；蛘撸鍿peI位點(diǎn)，也可以附接AvrII、XbaI或NheI位點(diǎn)到外源抗體可變區(qū)基因上，因?yàn)橛肁vrII、XbaI或NheI消化產(chǎn)生與SpeI消化相同的粘性末端。使用雞抗體重鏈基因作為模板，以及用于上游區(qū)域的有義引物(VHupF2:5’ -TTAGAAGGGGACAAATTAATGAGGAAACACGACTTTGG-3’ ；SEQ ID NO:11)和具有SpeI 和 SphI 位點(diǎn)的反義引物(VHupR2:5’ -CGACTAGTCCGCATGCAGCCCTGTGGGGAAGGGCAGAGAGCGCTGAC-3’ ；SEQ ID NO:12)一起制備基因片段。在該片段的SfiI和SpeI位點(diǎn)消化片段，并取代VH打靶載體I的VH打靶載體I的片段(圖5F)。對(duì)含有位于IoxP序列之間的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因的DNA構(gòu)建體而言，其相對(duì)于靶基因的方向沒有限制。對(duì)于該實(shí)施例中使用的載體，按相對(duì)于抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄方向相反的方向插入滅瘟素S抗性基因。VH打靶載體2的序列顯示在圖22 (SEQ IDNO: 13)中。(3)構(gòu)建用于輕鏈可變區(qū)的基因打靶載體與抗體重鏈的情況相同，為了插入外源抗體可變區(qū)基因，在信號(hào)肽序列周圍和JL下游的內(nèi)含子中導(dǎo)入了限制性位點(diǎn)(圖7-9、23和24)。構(gòu)建了兩種打靶載體，它們的導(dǎo)入到信號(hào)肽序列中的限制性位點(diǎn)不同。
(VL打靶載體I ;圖7、8和23)修飾編碼VL基因的第2和第3個(gè)氨基酸的密碼子，構(gòu)成HpaI位點(diǎn)(圖7A)。這導(dǎo)致所編碼的氨基酸對(duì)從亮氨酸/蘇氨酸變?yōu)槔i氨酸/天冬氨酸。此外，如上關(guān)于VH打靶載體所述，在幾的下游導(dǎo)入SpeI位點(diǎn)。由于HpaI消化產(chǎn)生平末端，將待插入的外源抗體可變區(qū)基因的5’端設(shè)計(jì)為平末端。此外，在JL的3’端附接剪接供體共有序列和SpeI位點(diǎn)(5，-ggtgagtactagt-3’ ；SEQ ID N0:42)(圖 7B)?；蛘?代替 SpeI 位點(diǎn)，也可將 Avrll、XbaI或NheI位點(diǎn)附接到外源抗體可變區(qū)基因上，因?yàn)橛肁vrll、XbaI或NheI消化產(chǎn)生與SpeI消化相同的粘性末端。上述設(shè)計(jì)允許插入多種抗體基因片 段。雞輕鏈基因已經(jīng)被克隆(Reynaud,C.-A.，等人，Cell 40，283-291 (1985))，且已經(jīng)通過基因組分析揭示了基因周圍的核苷酸序列(International Chicken GenomeSequencing Consortium, Nature 432, 695-716(2004))(圖 8A)。因此，利用下述引物，使用從DT40細(xì)胞提取的基因組DNA作為模板，通過PCR制備基因片段。使用有義引物(IgLU53:5，-ACGACCCTGGCACCAACAGAGACCTGC-3’ ；SEQ ID NO: 14)和具有 HpaI 和 SpeI 位點(diǎn)的反義引物(IgLU32:5’ -ACTAGTTGGTTAACCGCTGCCTGCACCAGGGAACCTGGAG-3’ ；SEQ ID NO: 15)擴(kuò)增抗體輕鏈可變區(qū)基因的5’上游區(qū)域。使用具有SpeI和BamHI 位點(diǎn)的有義引物(IgLD53:5，-ACTAGTCTCGGATCCTCTTCCCCCATCGTGAAATTGTGAC-3’ ；SEQ ID NO:16)和反義引物(IgLD34:5，-AGCGGGTGGAGCCATCGATGACCCAATCCACAGTCA-3’ ；SEQ ID NO:17)擴(kuò)增3’下游區(qū)域。將獲得的PCR產(chǎn)物克隆到pCR-Blunt載體(Invitrogen)中。用SacI和SpeI切出5’側(cè)片段，并將其作為插入物插入到含有3’側(cè)片段的載體中(圖8B)。使用BamHI切出含有位于IoxP序列之間的P肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子DNA、滅瘟素S抗性基因和多聚A附加序列的DNA片段，或者含有位于IoxP序列之間的P肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子DNA、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因和多聚A附加序列的DNA片段(Arakawa, H.等人，BMC Biotechnol. 17(2001))，并插入到SpeI位點(diǎn)下游的BamHI位點(diǎn)中(圖8C)。可以使用其他DNA構(gòu)建體，只要它們含有位于IoxP序列之間的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，例如藥物抗性基因。對(duì)于含有位于IoxP序列之間的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因的DNA構(gòu)建體，其相對(duì)于靶基因的方向沒有限制。對(duì)于該實(shí)施例中使用的載體而言，按與抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄方向相同的方向插入標(biāo)記基因。VL打靶載體I的序列顯示在圖23 (SEQ ID NO: 18)中。(VL打靶載體2 ;圖8、9和24)在與VH打靶載體2的情況相同，為了允許在信號(hào)肽的緊鄰后方插入外源抗體可變區(qū)基因，修飾信號(hào)肽的末端核苷酸序列，使其具有SphI位點(diǎn)(圖9A)。JL側(cè)的結(jié)構(gòu)與VL打靶載體I的結(jié)構(gòu)相同。當(dāng)外源抗體基因在不改變結(jié)構(gòu)基因區(qū)域的序列的條件下插入到載體中時(shí)，一個(gè)SphI位點(diǎn)和核苷酸“a”(5’ -gcatgca-3’)被附接到5’端，而一段剪接供體共有序列和SphI位點(diǎn)(5，-ggtgagtactagt-3’ ；SEQ ID NO: 42)被附接到3’端，與VL打靶載體I的情況相同(圖9B)?；蛘?，代替SpeI位點(diǎn)，可以將AvrII、XbaI或NheI位點(diǎn)附接到外源抗體可變區(qū)基因，因?yàn)橛肁vrll、XbaI或NheI消化產(chǎn)生與SpeI消化相同的粘性末端。與VL打靶載體I的情況相同，使用DT40的基因組DNA作為模板，以及上述用于5’區(qū)域的上游有義引物和具有SpeI和SphI位點(diǎn)的反義引物(IgLU33:5’-GAACTAGTGCTGCATGCACCAGGGAACCTGGAGAGGGAG-3' ；SEQ ID NO: 19) 一起通過 PCR 制備基因片段，然后將其克隆到pCR-Blunt載體中。用SacI和SpeI切出克隆的片段，并用它取代VL打靶載體I的SacI-SpeI片段(圖8D)。對(duì)含有位于IoxP序列之間的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因的DNA構(gòu)建體而言，其相對(duì)于靶基因的方向沒有限制。對(duì)于該實(shí)施例中使用的載體，按與抗體輕鏈基因的轉(zhuǎn)錄方向相同的方向插入標(biāo)記基因。VL打靶載體2的序列顯示在圖24(SEQ ID NO:20)中。(4)導(dǎo)入和突變小鼠單克隆抗體可變區(qū)基因作為模型，通過載體將源自小鼠單克隆抗體17. 2. 25 (抗半抗原4_羥基_3_硝基苯基乙?；?NP))的可變區(qū)基因?qū)氲紻T40中，評(píng)估細(xì)胞的抗體表達(dá)和突變。(導(dǎo)入小鼠抗體重鏈可變區(qū)基因)
使用TRIzol (Invitrogen)從產(chǎn)生抗NP IgM抗體的雜交瘤中提取總RNA (Kanayama, N.,等人，J. Tmmuno 1. 169, 6865-6874 (2002)),所述雜交瘤是從敲入(knock in) 了抗NP單克隆抗體17. 2. 25的抗體重鏈的小鼠的脾細(xì)胞制備的(準(zhǔn)單克隆小鼠，Cascalho, M.,等人，Science 272, 1649-(1996)) 使用 Superscript II 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和oligo-dT引物從RNA合成cDNA。使用cDNA作為模板，與有義引物(VHTF:5’-GAGGITCAGCTGCAGCAGTCTGGG-3’ ；SEQ ID NO: 21)和具有 SpeI 位點(diǎn)的反義引物(VHT_Spe_S: 5’ -ACTAGTACTCACCTGAGGAGACGGTGACT-3’ ；SEQ ID NO: 22) —起通過 PCR 擴(kuò)增抗 NP 抗體重鏈可變區(qū)(VHT)。用SpeI消化PCR片段，將其插入到用PvuII和SpeI消化的VH打靶載體I中(圖IOA)。使用DT40-SW作為用于導(dǎo)入構(gòu)建的打靶載體的宿主細(xì)胞，DT40-SW是通過修飾DT40雞B細(xì)胞系產(chǎn)生的，具有自發(fā)導(dǎo)入突變到抗體基因中的能力。DT40-SW具有下列特征。(i)當(dāng)導(dǎo)入用于在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)Cre重組酶/雌激素受體融合蛋白的DNA構(gòu)建體時(shí),細(xì)胞組成型地表達(dá)無活性的Cre重組酶/雌激素受體融合蛋白。(ii)內(nèi)源性AID基因座的兩個(gè)等位基因之一是缺陷的，另一個(gè)被由CAG啟動(dòng)子表達(dá)的AID基因取代，并位于2個(gè)按相反方向排列的IoxP序列之間。(iii)AID基因依次連接于與AID基因的方向相同IRES、GFP基因和多聚A附加序列，以及與AID基因的方向相反的多聚A附加序列和嘌呤霉素抗性基因，并插入在2個(gè)IoxP序列之間。(iv)當(dāng)向細(xì)胞添加4-輕泰米芬時(shí)，(i)的Cre重組酶活化,并使含有位于IoxP序列之間的AID基因的(ii)或(iii)的DNA構(gòu)建體倒位。因此，當(dāng)AID基因按與CAG啟動(dòng)子相同的方向排列時(shí)，AID基因被表達(dá)；而當(dāng)它相對(duì)于啟動(dòng)子排列的方向相反時(shí)，該基因不表達(dá)。(V)對(duì)于表達(dá)AID基因的細(xì)胞，可以作為表達(dá)GFP基因的細(xì)胞加以分離，同時(shí)，對(duì)于不表達(dá)AID基因的細(xì)胞，可以基于嘌呤霉素抗性基因表達(dá)所致的藥物抗性(Kanayama，N.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 327，70-75 ；JP-A (Kokai) 2006-109711)來加以選擇。通過下列方法將打靶載體轉(zhuǎn)染到DT40-SW中。通過BamHI消化將15微克載體線性化，與IxlO7個(gè)DT40-SW細(xì)胞混合。將500微升所獲得的懸浮液置入具有4mm狹縫的電穿杯中。使用Gene Pulser Xcell (Bio-Rad),在550V和25 ii F下進(jìn)行電穿孔。在電穿孔后，將細(xì)胞懸浮在IOml生長培養(yǎng)基(PRMI1640 (Invitrogen), 10%胎牛血清(Invitrogen)和1%雞血清(Sigma))中，培養(yǎng)24小時(shí)。然后，向細(xì)胞中加入IOml的2x選擇培養(yǎng)基(補(bǔ)充了滅痕素S(Kaken Pharmaceutical Co.)的生長培養(yǎng)基)。滅痕素S的終濃度是20微克/ml。將細(xì)胞等分到96孔板中，培養(yǎng)10至14天。使用終濃度為20微克/ml的滅瘟素S選擇獲得16個(gè)克隆集落。對(duì)形成集落的細(xì)胞用藻紅蛋白標(biāo)記的抗雞IgM小鼠單克隆抗體(Southern Biotechnology)進(jìn)行染色,并使用FACS Calibur (BD Bioscience)分析。當(dāng)成功地打靶了基因后，細(xì)胞變得不能表達(dá)抗體重鏈。因此，選擇5個(gè)用抗雞IgM抗體染色為陰性的克隆。為了在基因水平評(píng)估這些克隆，在內(nèi)源性抗體重鏈基因的等位基因中，對(duì)于從VDJ重組獲得的等位基因使用有義引物(cVH1F2:5’-GGCGGCTCCGTCAGCGCTCTCT-3’ ；SEQ ID NO:23)和反義引物(cJH_R: 5’-CTTCGGTCCCGTGGCCCCATGCGTCGAT-3’ ；SEQ ID NO:2)進(jìn)行擴(kuò)增；而對(duì)于胚胎等位基因則使用有義引物CVH1F2 和反義引物(cVHl 內(nèi)含子-R:5’-ITCACCGCCTTGGGITGCAACGGTGG-3’ ；SEQ ID NO :24)加以擴(kuò)增(圖10B)。
基于上述結(jié)果，選出了 3個(gè)不產(chǎn)生與VDJ重組后的內(nèi)源性重鏈可變區(qū)基因?qū)?yīng)的條帶的克隆(圖10B)。這提示，由VDJ重組獲得的等位基因被目的基因打靶了。通過基因組Southern印跡分析驗(yàn)證了打靶效應(yīng)(圖10C)。從每個(gè)克隆分離基因組DNA。在EcoRI消化后，將DNA電泳，并轉(zhuǎn)化到Hybond N尼龍膜(GE Healthcare)上。然后，使用DIG標(biāo)記的用于克隆基因座DNA的基因片段作為探針，進(jìn)行檢測(cè)。從分析的3個(gè)克隆中，選擇了克隆C2和C3，因?yàn)樗鼈兠黠@顯示出由于插入的標(biāo)記基因而造成的更長的條帶。通過流式細(xì)胞術(shù)，確認(rèn)了所選定的克隆如載體設(shè)計(jì)所預(yù)期的那樣不產(chǎn)生抗體(圖11A)。因此，基于細(xì)胞表面缺少抗體表達(dá)，可以通過選擇已實(shí)現(xiàn)了外源基因打靶的細(xì)胞，來高效制備導(dǎo)入了目的外源基因的細(xì)胞。(表達(dá)小鼠抗體重鏈可變區(qū))當(dāng)如前所述(Kanayama,N.等人，B i o chem. B i ophy s Re s Commun. 327, 70-75(2005))用50nM 4-羥泰米芬處理這些細(xì)胞時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞表面具有恢復(fù)的IgM抗體表達(dá)的細(xì)胞(圖11B)，且所述細(xì)胞缺少藥物抗性。與該結(jié)果一致的是，在Southern印跡分析中可見由于缺少藥物抗性基因造成的條帶遷移(圖10D)。用VHT⑶R3-特異性抗獨(dú)特型大鼠單克隆抗體(R2. 438 ;由T. Imanishi-Kari博士提供)染色細(xì)胞(Kanayama, N.等人，J. Immunol. 169，6865-6874(2002))(圖 11C)。觀察到的染色強(qiáng)度與用作陽性對(duì)照的整合了 VHT的小鼠B細(xì)胞的強(qiáng)度是可比較的。因此，證實(shí)了細(xì)胞表達(dá)整合到DT40-SW中的VHT基因。在開啟抗體表達(dá)后，通過有限稀釋亞克隆C2和C3克隆。還通過流式細(xì)胞術(shù)分析亞克隆的細(xì)胞的細(xì)胞表面抗體表達(dá)(圖11D)。從每個(gè)克隆分離RNA，并從RNA制備cDNA?；蚱问褂靡锿ㄟ^PCR擴(kuò)增。通過測(cè)序分析評(píng)估可變區(qū)基因和恒定區(qū)基因之間的剪接。結(jié)果證實(shí)，附接在可變區(qū)基因的3’端的剪接位點(diǎn)如設(shè)計(jì)地那樣在執(zhí)行功能，因此可變區(qū)基因的外顯子和恒定區(qū)基因的外顯子如預(yù)期地彼此連接。換言之，證實(shí)了通過上述方法導(dǎo)入的外源抗體重鏈可變區(qū)基因可以正常地轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而表達(dá)為與雞抗體重鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。雖然驗(yàn)證了表面的抗體表達(dá)，但表達(dá)水平略低于野生型。這提示因?yàn)檩p鏈源自雞抗體，所以嵌合抗體的表達(dá)效率降低?？赡艿慕鉀Q方案是用對(duì)應(yīng)于外源抗體重鏈的輕鏈取代所述輕鏈。
(向小鼠抗體重鏈可變區(qū)中導(dǎo)入突變)為了分析所制備的VHT表達(dá)細(xì)胞的VHT基因中的突變，通過使用之前報(bào)道過的方法(Kanayama, N.等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 327，70-75 (2005))開啟 AID 基因表達(dá)，激活細(xì)胞的突變機(jī)制。在用4-羥泰米芬處理細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞儀以單細(xì)胞分離GFP+細(xì)胞(即，對(duì)突變關(guān)鍵性的AID表達(dá)被開啟的細(xì)胞)，并培養(yǎng)30天。
從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離基因組DNA。使用引物CVH1F2 (5’ -GGCGGCTCCGTCAGCGCTCTCT-3’ ；SEQ ID N0:25)和CJH1R2(5’-GCCGCAAATGATGGACCGAC-3’ ；SEQ ID NO:26)，通過PCR擴(kuò)增重鏈可變區(qū)，并將其克隆到pCR-Blunt載體中。通過測(cè)序分析克隆。在C2和C3克隆中觀察到突變的頻率(圖12B和C)可與野生型DT40-SW中的突變頻率相比較(圖12A)。換言之，驗(yàn)證了上述方法可用于導(dǎo)入突變，由此對(duì)導(dǎo)入到DT40的雞重鏈可變區(qū)基因座中的任意外源抗體的可變區(qū)基因進(jìn)行修飾?？梢酝ㄟ^使用VH打靶載體2產(chǎn)生相同的效應(yīng)。(導(dǎo)入小鼠抗體輕鏈可變區(qū)基因)從上述生產(chǎn)抗NP IgM抗體的雜交瘤的總RNA中制備cDNA。使用cDNA作為模板，與針對(duì) \ I 輕鏈可變區(qū)基因的有義引物 mIgVL51(5’-ACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCT-3’ ；SEQ ID NO:27)和反義引物mIgVL133 (5’ -GTTCTAGACACTCACCTAGGACAGTCAGTTTGGTTCCT-3’ ；SEQ ID NO: 28) 一起，擴(kuò)增入I可變區(qū)基因片段。然后，用XbaI消化片段，并插入到VL打靶載體I的HpaI-SpeI位點(diǎn)中。將15微克載體通過用SacI消化線性化，并通過電穿孔導(dǎo)入到如上所述制備的表達(dá)小鼠VHT的克隆C2中。和重鏈的情況一樣，對(duì)于來自在滅瘟素S選擇下形成的克隆(45個(gè)克隆)的細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞表面的抗體表達(dá)。通過選擇缺少抗體表達(dá)的細(xì)胞，獲得了 10個(gè)陽性克隆。從這10個(gè)克隆中選擇5個(gè)克隆，并從細(xì)胞中提取基因組DNA。使用下列上游引物IgLU-up(5，-TGCCTGGGGTAAGGGTAGTACTCTGTGC-3’ ；SEQ ID NO:29)和 cJL12(5，-AACGGTAGGGGATCCGAGACTAG-3’ ；SEQ ID NO:30)，和下列下游引物BSR1(5，-GAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTITCCTTCAGAATTGC-3’ ；SEQ ID NO:31)和cCL3 (5，-GCAGAGTCAGCACTAGTTCAGTGTCGTGTT-3，；SEQ ID NO:32)，通過PCR評(píng)估打靶載體的整合(圖13B)。此外，使用PCR評(píng)估針對(duì)從VJ重組生成的、并產(chǎn)生的抗體等位基因的打靶，使用引物CVLF6(5，-CAGGAGCTCGCGGGGCCGTCACTGATTGCCG-3’ ；SEQ ID NO:33)和 CVLR3(5，-GCGCAAGCTTCCCCAGCCTGCCGCCAAGTCCAAG-3’ ；SEQ ID NO:34)(圖 13C)。在成功打靶的細(xì)胞中觀察到了 PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增(圖13B)。此外，以由于整合到產(chǎn)生抗體的等位基因中而導(dǎo)致的條帶損失作為指標(biāo)來選擇克隆(圖13C)。結(jié)果顯示，在所有的克隆中都實(shí)現(xiàn)了用目的基因在期望位置的打靶。此外，證實(shí)了細(xì)胞表面抗體表達(dá)作為篩選目的細(xì)胞的指標(biāo)是非常有效的。(表達(dá)抗體輕鏈可變區(qū)基因)在導(dǎo)入小鼠X I到具有小鼠VHT的C2中所制備的細(xì)胞中，使用了 B4克隆進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。和重鏈的情況一樣，當(dāng)用4-羥泰米芬處理這些細(xì)胞時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞表面具有恢復(fù)的IgM抗體表達(dá)的細(xì)胞，并且所述細(xì)胞缺少藥物抗性(圖14)。此外，將抗體表達(dá)被開啟的B4進(jìn)行有限稀釋，并通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞中的小鼠X I鏈可變區(qū)的表達(dá)。用預(yù)期結(jié)合小鼠、鏈可變區(qū)的生物素化大鼠單克隆抗體(抗-IgXl、X2和入3輕鏈；克隆R26_46;BD Bioscience)處理細(xì)胞，然后用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素將其可視化。結(jié)果顯示，細(xì)胞表達(dá)小鼠 ' 鏈可變區(qū)(圖15)。用抗獨(dú)特型抗體也檢測(cè)到了 VHT的表達(dá)。因此，可認(rèn)為導(dǎo)入的小鼠抗體重鏈和輕鏈在細(xì)胞表面彼此結(jié)合地表達(dá)。從每個(gè)克隆分離RNA，并從RNA制備cDNA。通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析所擴(kuò)增的基因片段，驗(yàn)證導(dǎo)入的可變區(qū)基因和恒定區(qū)基因之間的剪接。使用引物mIgVL51和cCL3評(píng)估嵌合輕鏈基因的mRNA的生成，而使用引物cVLl和cCL3評(píng)估內(nèi)源性IgL基因的mRNA生成。對(duì)克隆B4僅擴(kuò)增了嵌合的輕鏈cDNA。該結(jié)果證實(shí)了附接于外源可變區(qū)基因的3’端的剪接位點(diǎn)如設(shè)計(jì)的那樣發(fā)揮功能，由此可變區(qū)基因和恒定區(qū)基因的外顯子如預(yù)期的那樣彼此連接(圖16)。使用“actin3”(5’-CTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGCCAGC-3’ ；SEQ ID NO:35)和“actin4”(5，-TTCATGAGGTAGTCCGTCAGGTCACGGCCA-3’ ；SEQ ID NO:36)擴(kuò)增P -肌動(dòng)蛋白基因，作為內(nèi)標(biāo)。測(cè)序分析揭示了在剪接連接處發(fā)生了精確的剪接。使用ELISA，測(cè)定導(dǎo)入了小鼠VHT/入I的B4克隆的培養(yǎng)上清液中的分泌抗體。用山羊抗雞IgM抗體(Bethyl)包被96孔板。使用HRP-標(biāo)記的山羊抗雞IgM抗體(Bethyl)，將培養(yǎng)上清液中生產(chǎn)的抗體的量與DT40-SW生產(chǎn)的抗體量比較。結(jié)果顯示細(xì)胞以可與DT40-SW相比較的水平生產(chǎn)抗體(圖17A)。此外，通過前述方法將NP 與牛血清白蛋白綴合(Kanayama, N.,等人，J. Immunol. 169，6865-6874(2002)),用該綴合物作為抗原包被96孔板。使用HRP-標(biāo)記的山羊抗雞IgM抗體檢測(cè)培養(yǎng)上清液中的抗體的抗原結(jié)合。產(chǎn)生VHT/ A I抗體的克隆B4的培養(yǎng)上清液表現(xiàn)出與NP綴合抗原的結(jié)合，與陽性對(duì)照情況相似(圖17B)，陽性對(duì)照使用HRP-標(biāo)記的山羊抗小鼠IgM抗體(Vector)分析產(chǎn)生小鼠抗NP IgM抗體的雜交瘤的上清液。同時(shí)，由DT40-SW生產(chǎn)的抗體不結(jié)合NP綴合抗原。因此，證實(shí)了克隆B4產(chǎn)生NP特異性抗體。換言之，顯示了通過上述方法導(dǎo)入的外源抗體重鏈可變區(qū)基因可以正常地轉(zhuǎn)錄和翻譯成為與雞抗體輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。此外，本發(fā)明人成功的制備了這樣的DT40細(xì)胞，其表達(dá)保留原始功能的嵌合抗體，其中重鏈和輕鏈可變區(qū)都被小鼠來源的外源抗體的相應(yīng)區(qū)域取代。(向小鼠抗體輕鏈可變區(qū)中導(dǎo)入突變)用4-羥泰米芬處理表達(dá)小鼠VHT/ X I的B4和B7克隆的細(xì)胞。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)按單細(xì)胞分離GFP+細(xì)胞(即，對(duì)誘變至關(guān)重要的AID的表達(dá)被開啟的細(xì)胞)，并培養(yǎng)30天。從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離基因組DNA。使用引物CVLF6(SEQ ID NO: 37)和CVLR3 (SEQ IDNO: 38)，通過PCR擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)，將其克隆到pCR-Blunt載體中并測(cè)序。在B4和B7克隆中觀察到突變的頻率可與野生型DT40-SW中的突變頻率相比較(圖18)。換言之，驗(yàn)證了上述方法可用于導(dǎo)入突變，由此對(duì)導(dǎo)入到DT40的雞輕鏈可變區(qū)基因座中的任意外源抗體的可變區(qū)基因進(jìn)行修飾?？梢酝ㄟ^使用VL打靶載體2產(chǎn)生相同的效應(yīng)。(5)導(dǎo)入雞抗體輕鏈可變區(qū)如下所述制備DT40的抗體輕鏈可變區(qū)基因。自從未開啟過突變機(jī)制的DT40-SW的總RNA中合成cDNA。使用該cDNA作為模板，與有義引物(cVLl: 5’ -ACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCGGGA-3’ ；SEQ ID NO:48)和具有 SpeI 位點(diǎn)的反義引物(c.TLl: 5’-CGAGACTAGTTCAGCGACTCACCTAGGACGGTCAG-3’ ；SEQ ID NO:49) —起通過 PCR擴(kuò)增雞抗體輕鏈可變區(qū)(cVL)。用SpeI消化所獲得的PCR片段，將其插入到VL打靶載體I的HpaI-SpeI位點(diǎn)中(圖28A)。通過SacI消化將載體線性化，通過電穿孔導(dǎo)入到DT40-SW細(xì)胞中。在電穿孔后，用終濃度為20微克/ml的滅瘟素S進(jìn)行選擇。用藻紅蛋白標(biāo)記的抗雞IgM小鼠單克隆抗體染色形成集落的細(xì)胞(54個(gè)克隆)，并使用FACS Calibur分析。為了獲得被打靶的細(xì)胞，用抗雞IgM抗體染色來選擇變得不能表達(dá)抗體重鏈的細(xì)胞(3個(gè)克隆)。為了在基因水平評(píng)估這些克隆，從細(xì)胞中提取基因組DNA，并通過使用引物對(duì)IgLU-up和cJLl2，以及BSRl和cCL3進(jìn)行PCR來測(cè)試打靶載體的整合(圖28B)。此外，使用引物CVLF6和CVLR3進(jìn)行PCR來評(píng)估針對(duì)由于VJ重組而產(chǎn)生的等位基因的打靶(圖28C)。結(jié)果顯示，在所有的克隆中均實(shí)現(xiàn)了使用目的基因的打靶。從中選擇C2克隆。如上所述，當(dāng)用4-羥泰米芬處理這些克隆時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞表面上具有恢復(fù)的IgM抗體表達(dá)的細(xì)胞(圖29)。 此外，從開啟了抗體表達(dá)的細(xì)胞中，通過流式細(xì)胞術(shù)按單細(xì)胞分離GFP+細(xì)胞(即，對(duì)誘變至關(guān)重要的AID的表達(dá)被開啟的細(xì)胞)，并培養(yǎng)30天。從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離基因組DNA。使用引物CVLF6和CVLR3，通過PCR擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)，將其克隆到pCR-Blunt載體中并 測(cè)序。在導(dǎo)入的雞抗體輕鏈可變區(qū)基因中觀察到突變的頻率可與野生型DT40-SW中的突變頻率相比較(圖30)。換言之，驗(yàn)證了通過上述方法以與野生型基因中可比較的突變頻率向DT40的雞輕鏈可變區(qū)基因中導(dǎo)入了突變。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了用于向抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體可變區(qū)基因的基因座中導(dǎo)入編碼期望的氨基酸序列的DNA的打靶載體。根據(jù)本發(fā)明，可以通過將編碼包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞的抗體可變區(qū)基因的基因座中，在特定條件下產(chǎn)生期望的多肽。此外，可以利用抗體生產(chǎn)細(xì)胞導(dǎo)入突變的能力來產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽。本發(fā)明可用于多肽的功能性修飾。
權(quán)利要求
1.一種將DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組的方法，包括將包含DNA構(gòu)建體的打靶載體導(dǎo)入抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的步驟，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的 DNA。
2.權(quán)利要求I的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，且(3)的DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除。
3.選擇細(xì)胞的方法，包括下述步驟 (a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的DNA ;和 (b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，且(3)的DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從DNA構(gòu)建體中被去除。
5.一種制備產(chǎn)生多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟 (a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的 DNA ； (b)選擇其中在DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和 (c)從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。
6.權(quán)利要求5的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，且其中⑶的DNA包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，且(3)的DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除。
7.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(a)至(C)定義如下(a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除； (b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和 (c)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從該細(xì)胞的基因組DNA中去除所述位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn) 特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA。
8.權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的方法，其中所產(chǎn)生的多肽被展示在所述細(xì)胞的表面上，和/或被分泌到所述細(xì)胞外。
9.權(quán)利要求4、6和7中任一項(xiàng)的方法，其中利用所述標(biāo)記基因的表達(dá)作為指標(biāo)來選擇所述細(xì)胞。
10.權(quán)利要求3、4、6、7和9中任一項(xiàng)的方法，其中利用所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞中內(nèi)源性抗體表達(dá)的缺失作為指標(biāo)來選擇所述細(xì)胞。
11.一種制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟 (a)通過向表達(dá)AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的 DNA ； (b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和 (c)從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除(3)的DNA。
12.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(a)至(c)定義如下 (a)通過向表達(dá)AID基因的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除； (b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和 (C)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從該細(xì)胞的基因組DNA中去除位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA。
13.一種制備產(chǎn)生導(dǎo)入了突變的多肽的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的方法，包括下述步驟 (a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入包含DNA構(gòu)建體的打靶載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞中AID基因表達(dá)能夠被人為開啟和關(guān)閉，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的 DNA ； (b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞；和 (c)從步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組DNA中去除(3)的DNA; (d)開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和 (e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的方法，其中步驟(a)至(e)定義如下 (a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入打祀載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組，其中所述打靶載體包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除，其中該抗體生產(chǎn)細(xì)胞中的內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，且抗體生產(chǎn)細(xì)胞包含這樣的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含 在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA, 位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶倒位，并包含外源性AID基因； (b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞； (c)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而從該細(xì)胞的基因組DNA中去除所述位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA ； (d)通過使位點(diǎn)特異性重組酶在步驟(b)中選擇的細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)而使所述位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA倒位，以開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和(e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求13的方法，其中步驟(a)至(e)定義如下 (a)通過向抗體生產(chǎn)細(xì)胞中導(dǎo)入打祀載體而允許DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間同源重組， 其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞中內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，且該抗體生產(chǎn)細(xì)胞包含 DNA構(gòu)建體，其包含 在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA,和 位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA能夠通過 位點(diǎn)特異性重組酶倒位，并包含外源性AID基因，和 包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和編碼所述位點(diǎn)特異性重組酶的DNA的DNA構(gòu)建體， 其中在所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，所述位點(diǎn)特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在沒有該胞外刺激的條件下不活化， 其中所述打靶載體包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并且能夠通過所述位點(diǎn)特異性重組酶從該DNA構(gòu)建體中被去除； (b)選擇其中在所述DNA構(gòu)建體與所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域之間已發(fā)生同源重組的細(xì)胞； (c)通過對(duì)步驟(b)中選擇的細(xì)胞的胞外刺激活化位點(diǎn)特異性重組酶的活性，使所述位點(diǎn)特異性重組酶在該細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)，藉此從該細(xì)胞的基因組DNA中去除所述位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的 DNA ； (d)通過對(duì)步驟(b)選擇中細(xì)胞的胞外刺激活化位點(diǎn)特異性重組酶的活性，使所述位點(diǎn)特異性重組酶在該細(xì)胞的基因組中的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列處反應(yīng)，藉此使所述位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA倒位，以開啟和關(guān)閉AID基因表達(dá)；和 (e)選擇表達(dá)AID基因的細(xì)胞。
16.權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)的方法，其中所產(chǎn)生的導(dǎo)入了突變的多肽被展示在所述細(xì)胞表面上和/或分泌到所述細(xì)胞之外。
17.權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)中利用所述標(biāo)記基因的表達(dá)作為指標(biāo)選擇所述細(xì)胞。
18.權(quán)利要求11至17中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)中利用抗體生產(chǎn)細(xì)胞中內(nèi)源性抗體表達(dá)的缺失作為指標(biāo)選擇所述細(xì)胞。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶是位點(diǎn)特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的融合蛋白；且其中由能夠結(jié)合雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體充當(dāng)所述胞外刺激。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述雌激素受體或其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是小鼠突變型雌激素受體，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突變型雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；且其中所述能夠結(jié)合雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體是4-羥泰米芬。
21.權(quán)利要求11至20中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞具有下列特性 (a)在該抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，XRCC3基因的兩個(gè)等位基因中僅一個(gè)是失活的；和 (b)與具有XRCC3基因的兩個(gè)等位基因的細(xì)胞相比，導(dǎo)入點(diǎn)突變的頻率是升高的。
22.權(quán)利要求21的方法，其中在XRCC3基因的兩個(gè)等位基因的任一個(gè)中，第6個(gè)外顯子是失活的。
23.權(quán)利要求11至22中任一項(xiàng)的方法，其中該抗體生產(chǎn)細(xì)胞是B細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述B細(xì)胞源自雞。
25.權(quán)利要求2、4、6、7、9、10、12、14和15中任一項(xiàng)的方法，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶和位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列的組合是下列⑴或(ii) (i)所述位點(diǎn)特異性重組酶是Cre重組酶，且所述位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列是IoxP序列； ( )所述位點(diǎn)特異性重組酶是FLP重組酶，且所述位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列是FRT序列。
26.權(quán)利要求I至25中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區(qū)的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述期望的氨基酸序列是抗體可變區(qū)的氨基酸序列。
28.權(quán)利要求I至25中任一項(xiàng)的方法，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。
29.一種用于產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA的方法，包括下述步驟 (a)通過權(quán)利要求5-8和11-24中任一項(xiàng)的方法制備產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞；和 (b)從步驟(a)制備的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中分離編碼所述多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA。
30.一種用于產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡姆椒?，包括下述步驟 (a)通過權(quán)利要求5-8和11-24中任一項(xiàng)的方法制備產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡目贵w生產(chǎn)細(xì)胞；和 (b)從步驟(a)生產(chǎn)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞中或從來自所述細(xì)胞的分泌產(chǎn)物中分離所述多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯摹?br> 31.產(chǎn)生多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡姆椒ǎㄏ率霾襟E (a)通過權(quán)利要求29的方法產(chǎn)生編碼多肽或?qū)肓送蛔兊亩嚯牡腄NA;和 (b)分離由步驟(a)生產(chǎn)的DNA編碼的多肽。
32.抗體生產(chǎn)細(xì)胞，其中包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域與DNA構(gòu)建體同源重組，所述DNA構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)編碼期望的氨基酸序列的DNA;和 (3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并能夠從該DNA構(gòu)建體中被去除的 DNA。
33.權(quán)利要求32的細(xì)胞，其中(3)的DNA是這樣的DNA:其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，并位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，且其包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因，并能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除。
34.權(quán)利要求32或33的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞表達(dá)AID基因。
35.權(quán)利要求32或33的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞是其中AID基因表達(dá)能夠被人為開啟和關(guān)閉的細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的細(xì)胞，其中內(nèi)源性AID基因被功能性破壞，且該細(xì)胞包括這樣的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含 在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA ;和 位于兩個(gè)按相反方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間的DNA，該DNA能夠通過 位點(diǎn)特異性重組酶倒位，并且包含外源性AID基因。
37.權(quán)利要求36的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞還包含如下所述的DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含在所述細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和編碼位點(diǎn)特異性重組酶的DNA，其中該位點(diǎn)特異性重組酶在存在胞外刺激的條件下活化，而在缺少該胞外刺激的條件下不活化。
38.權(quán)利要求37的細(xì)胞，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶是位點(diǎn)特異性重組酶與雌激素受體或包含其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的融合蛋白。
39.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中雌激素受體或其雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是小鼠突變型雌激素受體，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突變型雌激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
40.權(quán)利要求32至39中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞具有下列特性 (a)在所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞中，XRCC3基因的兩個(gè)等位基因中僅一個(gè)是失活的；和 (b)與具有XRCC3基因的兩個(gè)等位基因的細(xì)胞相比，導(dǎo)入點(diǎn)突變的頻率是升高的。
41.權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中在XRCC3基因的兩個(gè)等位基因的任一個(gè)中，第6個(gè)外顯子是失活的。
42.權(quán)利要求32至41中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述抗體生產(chǎn)細(xì)胞是B細(xì)胞。
43.
44.權(quán)利要求33和36-39中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述位點(diǎn)特異性重組酶和位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列的組合是下列(i)或(ii): (i)所述位點(diǎn)特異性重組酶是Cre重組酶，且所述位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列是IoxP序列； (ii)所述位點(diǎn)特異性重組酶是FLP重組酶，且所述位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列是FRT序列。
45.權(quán)利要求32至44中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區(qū)的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。
46.權(quán)利要求45的細(xì)胞，其中所述期望的氨基酸序列是抗體可變區(qū)的氨基酸序列。
47.權(quán)利要求32至44中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。
48.包含權(quán)利要求32至47中任一項(xiàng)的細(xì)胞的試劑盒。
49.一種包含DNA構(gòu)建體的基因打靶載體，所述構(gòu)建體包含 (1)在所述細(xì)胞中執(zhí)打功能的啟動(dòng)子DNA； (2)包含克隆位點(diǎn)的DNA;和 (3)如下所述的DNA:其能夠從所述DNA構(gòu)建體中被去除，并抑制由插入到 (2)的DNA中的DNA編碼的、包含期望的氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生； 其中所述基因打靶載體用于將所述DNA構(gòu)建體與抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域同源重組。
50.權(quán)利要求49的載體，其中(3)的DNA是如下所述的DNA:其能夠通過位點(diǎn)特異性重組酶從所述DNA構(gòu)建體中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA編碼的、包含期望的 氨基酸序列的多肽的產(chǎn)生，且其位于兩個(gè)按相同方向排列的位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列之間，并包含在細(xì)胞中執(zhí)行功能的啟動(dòng)子DNA和標(biāo)記基因。
51.權(quán)利要求49或50的載體，其中編碼期望的氨基酸序列的DNA插入到所述克隆位點(diǎn)中。
52.權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)的載體，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗體恒定區(qū)的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。
53.權(quán)利要求52的載體，其中所述期望的氨基酸序列是抗體可變區(qū)的氨基酸序列。
54.權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)的載體，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗體重鏈或輕鏈。
55.包含權(quán)利要求49-54中任一項(xiàng)的打靶載體的細(xì)胞。
56.包含權(quán)利要求49-54中任一項(xiàng)的打靶載體的試劑盒。
57.包含SEQID NO:7的核苷酸序列的DNA。
58.包含權(quán)利要求57的DNA的載體。
59.包含權(quán)利要求57的DNA或權(quán)利要求58的載體的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的目標(biāo)是提供將編碼期望的氨基酸序列的DNA導(dǎo)入到抗體生產(chǎn)細(xì)胞的包含編碼抗體可變區(qū)的DNA的區(qū)域中的方法。本發(fā)明人研發(fā)了用于將編碼期望的氨基酸序列的DNA高效地導(dǎo)入DT40-SW的抗體可變區(qū)基因座的方法，DT40-SW是DT40雞B細(xì)胞系的突變株，具有自發(fā)導(dǎo)入突變的能力。這允許誘變所導(dǎo)入的DNA，以修飾多肽使其具有更好的功能。特別是，本發(fā)明人揭示了DT40細(xì)胞系的抗體H鏈可變區(qū)基因座的核苷酸序列?；谠摪l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人成功地構(gòu)建了打靶載體，所述打靶載體允許高效地利用編碼期望的多肽的基因取代DT40細(xì)胞系的抗體H鏈可變區(qū)基因座。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102762728SQ201080061858
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者大森齊, 藤井忍, 金山直樹 申請(qǐng)人:株式會(huì)社免疫工學(xué)研究所