專利名稱：針對非功能性低聚p2x7受體的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嘌呤受體、其抗體以及相關(guān)的用于結(jié)合到所述受體上的片段，涉及所述抗體以及片段的生產(chǎn)，并且涉及所述抗體和片段用于癌癥檢測和治療的用途。
背景技術(shù)：
在本說明書中對于任何現(xiàn)有技術(shù)的引用不是、并且不應(yīng)當(dāng)被當(dāng)成是這樣一種承認(rèn)或任何形式的建議，即該現(xiàn)有技術(shù)形成了在澳大利亞或任何其他司法管轄區(qū)域中的公知常識的一部分或該現(xiàn)有技術(shù)可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員合理地被預(yù)期被確定、理解并且視為是相關(guān)的。嘌呤(P2X)受體是ATP-門控陽離子選擇通道。每個受體由三種蛋白質(zhì)亞基或單體組成。迄今為止，已經(jīng)鑒定了七種分離的編碼P2X單體的基因fZXpPZXyPZXyPZXpPZXp P2X6、P2X7。P2X7受體是特別感興趣的，因為這些受體的表達被理解為是限于具有經(jīng)歷程序性細胞死亡可能性的細胞，例如胸腺細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、巨噬細胞以及單核細胞。在正常穩(wěn)態(tài)(例如在紅細胞上)中存在一些P2X7受體的表達。有趣的是，在被理解為不能經(jīng)歷程序性細胞死亡的細胞(例如癌前期細胞以及腫瘤細胞)上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了含有一種或多種在Pro210(根據(jù)SEQ ID NO 1)處具有順式異構(gòu)化并且缺乏ATP結(jié)合功能的單體的P2X7受體。該受體的這種同種型已經(jīng)被稱為“非功能”受體?？贵w是從用一種包含Pro210的肽的進行免疫產(chǎn)生的，Pro210處于與非功能性P2X7受體的順式結(jié)合。然而，它們并不結(jié)合到能夠結(jié)合ATP的？2&受體上。因此，這些抗體對于選擇性地檢測許多形式的癌以及造血癌癥(haemopoietic cancer)以及用于治療這些病癥的一些是有用的。W002/057306A1和W003/020762A1均討論了用于在處于單克隆抗體形式的功能性P2X7抗體與非功能性P2X7抗體之間進行區(qū)分的探針。迄今為止，獲得以所希望的親和力結(jié)合到活細胞上的非功能性P2X7受體的血清學(xué)試劑已經(jīng)是非常困難的。在癌癥的檢測和治療應(yīng)用中，較高親和力的試劑通常是所希望的。對于改進的結(jié)合到P2X7受體上的試劑，特別是能夠在活細胞上的ATP與非ATP結(jié)合受體之間進行辨別的新的抗體以及其片段，存在著一種需要。對于表現(xiàn)出優(yōu)先結(jié)合到P2X7受體上的抗體及其片段也存在著一種需要，因為一旦靶細胞已經(jīng)死亡，該抗體以降低的結(jié)合到P2X7受體上的能力表達在活細胞上。發(fā)明概述在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式I定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；
CDR1、CDR2和CDR3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列(帶電荷的/極性的/芳香族的)(帶電荷的/芳香族的)XXXY(芳香族的/脂肪族的)(帶電荷的/中性的)(中性的/脂肪族的)。X貫穿本說明書代表任何氨基酸。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體Ρ2Χ7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式I定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3 具有一個氨基酸序列N(Y/F) XXXY (Y/F) EX。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式^定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；CDR1、CDR2和CDR3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列N(Y/F)(中性的)(帶電荷的)(中性的)Y(Y/F)E(中性的)。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式4定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列NFLESYFEA。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式3定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)； 其中CDR3具有一個氨基酸序列N(Y/F)(帶電荷的)(中性的)(帶電荷的)Y(Y/F)E(中性的)。
在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式泛定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列NYRGDYYET。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式I定義 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中⑶R3具有一個氨基酸序列H(芳香族的)XXXYYNI。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式§定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中⑶R3具有一個氨基酸序列H(Y/F)(中性的)(帶電荷的(帶電荷的)YYNI。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式￡定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列H(Y/F)(中性的)(帶電荷的(中性的)YYNI。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式過定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中
CDR3具有一個氨基酸序列HYSKEYYNI。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式U定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列HFQRGYYNI。 在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式U定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中⑶R3具有一個氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)XXXYY (帶電荷的)(中性的)。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式垃定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYDV0在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式Ii定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYEV0在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式邊定義FR1-CCDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列YFPLVYYDV。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式邊定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中 FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；CDRl、CDR2和CDR3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列NYL PMYYEV 在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式H定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中 CDR3具有一個氨基酸序列Y (帶電荷的)XXXY (中性的)(中性的)(中性的)。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式M定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；CDRl、CDR2和CDR3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列YHVIQYLGP。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式坦定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中^ 1 1、？1 2、？1 3和？1 4各自是框架區(qū)；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中⑶R3具有一個選自下組的氨基酸序列，該組由以下各項組成HYSSRFFDV、NFKLMYYNV、NYRGDYYET、HFSRGYYDV、NFLESYFEA、NYL PMYYEV, HYIKVYYEA, HYSSRFFEV、NFRVMFFKA、HFQRGYYNI、HYSSRFFEV、YHVIQYLGP, HYSKEYYNI、YFPLVYYDV、DFTVPFYNA、NYDKKYFDV、YFPLVYYDVo在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式迪定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDRl具有一個氨基酸序列KASQNVGTNVA。⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上實施方案的氨基酸序列。 在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式紅定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；CDRl、CDR2和CDR3各自是互補決定區(qū)；其中⑶Rl具有一個氨基酸序列SYYMS。⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上實施方案的氨基酸序列。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式益定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR2具有一個氨基酸序列SASFRYS。⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上實施方案的氨基酸序列。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式益定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDR2 具有一個氨基酸序列 AINSNGGSTYYPDTVKG。⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上實施方案的氨基酸序列。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式M定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中
FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中CDRl具有一個氨基酸序列KASQNVGT NVACDR2具有一個氨基酸序列SASFRYS⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上實施方案的氨基酸序列。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式組定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；⑶Rl、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)；其中⑶Rl具有一個氨基酸序列SYYMS。CDR2 具有一個氨基酸序列 AINSNGGSTYYPDTVKG⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上實施方案的氨基酸序列。在一個實施方案中，在此提供了一種根據(jù)以上描述的任何實施方案的抗原結(jié)合位點，其中 FRl 是 MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC 或 DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS。在一個實施方案中，在此提供了一種根據(jù)以上描述的任何實施方案的抗原結(jié)合位點，其中 FR2 是 WYQQKPGQSPKALIY 或 WVRQTPEKRLELVA。在一個實施方案中，在此提供了一種根據(jù)以上描述的任何實施方案的抗原結(jié)合位點，其中 FR3 是 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC 或 RFTISRDNAKNTIYLQMSSLKSEDTAFYYCTR。在一個實施方案中，在此提供了一種根據(jù)以上描述的任何實施方案的抗原結(jié)合位點，其中 FR4 是 FGSGTRLEIK 或 WGAGTTVTVSS。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式迷定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-連接物-FRla-CDRla-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a_FR4a其中FRl、FR2、FR3、FR4、FRla, FR2a、FR3a 和 FR4a 各自是框架區(qū)；CDR1、CDR2、CDR3、CDRla、CDR2a、CDR3a各自是互補決定區(qū)；其中CDRl具有一個氨基酸序列KASQNVGTNVACDR2具有一個氨基酸序列SASFRYS⑶R3具有任何描述⑶R3序列的以上實施方案的氨基酸序列或QQYNSYPFT。⑶Rla具有一個氨基酸序列SYYMS。CDR2a 具有一個氨基酸序列 AINSNGGSTYYPDTVKG當(dāng)⑶R3是任何描述⑶R3序列的以上實施方案的氨基酸序列時，⑶R3a具有任何描述CDR3序列的以上實施方案的氨基酸序列或QQYNSYPFT (SEQ ID NO :33)。FRl 具有氨基酸序列 MADIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC (SEQ ID NO :25)FR2 具有氨基酸序列 WYQQKPGQSPKALIY (SEQ ID NO 26)FR3 具有氨基酸序列 GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFC(SEQ ID NO :27)FR4 具有氨基酸序列 FGSGTRLEIK (SEQ ID NO :28)FRla 具有氨基酸序列 DVKLVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFS (SEQ ID NO :29)FR2a 具有氨基酸序列 WVRQTPEKRLELVA (SEQ ID NO :30)FR3a 具有氨基酸序列 RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAFYYCTR(SEQ ID NO :31)FR4a 具有氨基酸序列 WGAGTTVTVSS (SEQ ID NO 32)。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式ZL定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；CDRl、CDR2和CDR3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列(帶電荷的/極性的/芳香族的)(芳香族的)(帶電荷的/中性的)(帶電荷的)(帶電荷的/中性的)Y(芳香族的)(帶電荷的)(中性的)。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式M定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；CDRl、CDR2和CDR3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3具有一個氨基酸序列(帶電荷的/極性的/芳香族的)(F/Y)(帶電荷的/中性的)(R/Κ)(帶電荷的/中性的)Y(Y/F) (E/D)V。在一個實施方案中，在此提供了一種用于結(jié)合到受體P2X7上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式M定義FR1-CCDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)；CDRl、CDR2和CDR3各自是互補決定區(qū)；其中CDR3 具有一個氨基酸序列(H/N) (F/Y) (S/D) (R/K) (G/K) Y (Y/F) DV。在一個實施方案中，通式26的連接物是一個具有15個氨基酸殘基的氨基酸序列。典型地，該連接物主要包含甘氨酸和絲氨酸殘基。優(yōu)選地，該連接物是GGGGSGGGGSGGGGS。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合位點具有包含HFSRGYYDV或NYDKKYFDV的⑶R3氨基酸序列。
在一個實施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合位點具有由HFSRGYYDV或NYDKKYFDV組成的⑶R3氨基酸序列。在其他實施方案中，在此提供了一種具有如以上描述的序列，或包括如在此描述的CDR和/或FR序列并且包括一個或多個用于增加所述位點結(jié)合到P2X7受體上的親和力的突變的抗原結(jié)合位點。在另一個實施方案中，在此提供了一種如在此描述的抗原結(jié)合位點，其中形成FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4中的一個或多個的氨基酸序列是人類序列。在另一個實施方案中，在此提供了一種如在此描述的抗原結(jié)合位點，其中形成FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4中的一個或多個的氨基酸序列是犬或貓序列。該抗原結(jié)合位點可以被工程化為具有來自特定動物的序列，例如它可以是嵌合體的(即，含有一些但并非所有的在接收該抗體的個體中發(fā)現(xiàn)的序列)?？商娲?，它可以由異基因序列或同基因序列組成。后者的一個例子是用于狗的治療中的狗抗體。
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該抗體從中衍生的動物可以包括家養(yǎng)動物、伴侶動物或農(nóng)場動物,包括狗、貓、奶牛、豬、馬以及羊。在另一個實施方案中，在此提供了一種抗？2&受體免疫球蛋白可變域，抗體、Fab、dab、scFv，包括具有在此描述的序列的抗原結(jié)合位點，或包括如在此描述的⑶R和/或FR序列。在另一個實施方案中，在此提供了一種雙鏈抗體或三鏈抗體，包括具有在此描述的序列的抗原結(jié)合位點，或包括如在此描述的CDR和/或FR序列。在另一個實施方案中，在此提供了一種融合蛋白，包括如在此描述的抗原結(jié)合位點、免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體或三鏈抗體，。在另一個實施方案中，在此提供了一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物處于如在此描述的結(jié)合到一種標(biāo)記或細胞毒劑上的形式的抗原結(jié)合位點，免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體或三鏈抗體的形式。 在另一個實施方案中，在此提供了如在此描述的一種用于結(jié)合到免疫球蛋白可變域的抗原結(jié)合位點上的抗體、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白或偶聯(lián)物。在另一個實施方案中，在此提供了一種核酸，該核酸編碼抗原結(jié)合位點，或如在此描述的⑶R和/或FR序列；或如在此描述的一種免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFV、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白或偶聯(lián)物。在另一個實施方案中，在此提供了一種包含在此描述的核酸的載體。在另一個實施方案中，在此提供了一種包含在此描述的載體或核酸的細胞。在另一個實施方案中，在此提供了一種由此衍生的包括在此描述的細胞的動物或組織。在另一個實施方案中，在此提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包括抗原結(jié)合位點，或包括如在此描述的CDR和/或FR序列；或如在此描述的一種免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白或偶聯(lián)物，以及一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在另一個實施方案中，在此提供了一種診斷組合物，該藥物組合物包括抗原結(jié)合位點，或包括如在此描述的CDR和/或FR序列；或如在此描述的一種免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白或偶聯(lián)物，一種稀釋劑以及任選地一種標(biāo)記。在另Iv實施方案中，在此提供了一種試劑盒或制造物品，該試劑盒或制造物品包括抗原結(jié)合位點，或如在此描述的CDR和/或FR序列；或如在此描述的一種免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白或偶聯(lián)物。在另一個實施方案中，在此提供了一種根據(jù)如在此描述的⑶R1、⑶R2、FRl、FR2、FR3和FR4的一個或多個的序列用于生產(chǎn)一種結(jié)合到P2X7受體上的抗原結(jié)合位點的用途。在另一個實施方案中，在此提供了一種抗原結(jié)合位點，或如在此描述的CDR和/或FR序列用于生產(chǎn)具有增加的P2X7受體親和力的抗P2X7受體抗原結(jié)合位點的用途。
在另一個實施方案中，在此提供了一種從抗原結(jié)合位點或如在此描述的CDR和/或FR序列突變產(chǎn)生的核酸分子的文庫，其中所述文庫中的至少一種核酸分子編碼了用于結(jié)合到P2X7受體上的一種抗原結(jié)合位點。在另一個實施方案中，在此提供了一種用于生產(chǎn)如在此描述的抗？2乂7抗原結(jié)合位點的方法，包括在如在此描述的一個細胞或動物中表達如在此描述的一種核酸。在另一個實施方案中，在此提供了一種用于治療個體中的癌癥或與非功能性P2X7受體表達有關(guān)的病癥或疾病的方法，包括以下步驟對一位需要癌癥或所述病癥或疾病治療的個體提供在此描述的一種抗原結(jié)合位點、免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白、偶聯(lián)物或藥物組合物。在另一個實施方案中，在此提供了如在此描述的抗原結(jié)合位點，免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白、偶聯(lián)物或藥物組合物用于制造一種治療癌癥或與非功能性P2X7受體表達有關(guān)的病癥或疾病的藥物的用途。在另一個實施方案中，在此提供了用于治療癌癥或與非功能性P2X7受體表達有關(guān)的病癥或疾病的如在此描述的抗原結(jié)合位點、免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白、偶聯(lián)物或藥物組合物。在另一個實施方案中，在此提供了一種用于診斷癌癥或與非功能性P2X7受體表達有關(guān)的病癥或疾病的方法，包括以下步驟將有待確定癌癥的存在或缺乏的組織或細胞與一種試劑接觸，該試劑處于如在此描述的一種抗原結(jié)合位點、免疫球蛋白可變域、抗體、Fab、dab、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、融合蛋白、偶聯(lián)物或診斷組合物的形式,然后檢測該試劑與組織或細胞的結(jié)合。該方法可以在體內(nèi)或體外操作。典型地，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合位點結(jié)合到非功能性P2X7受體上，尤其是其中P2X7的Pro210是順式構(gòu)象的受體。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合位點不結(jié)合到非功能性P2X7受體上，尤其是其中P2X7的Pro210是反式構(gòu)象的受體。典型地，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合位點結(jié)合到活細胞上的非功能性P2X7受體上。在一些實施方案中，這些抗原結(jié)合位點不結(jié)合或以非常低的或不可檢測的親和力結(jié)合到在死亡的或漸死細胞上的非功能受體上。無論本發(fā)明的抗原結(jié)合位點結(jié)合或不結(jié)合到P2X7受體上，可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法確定。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗原結(jié)合位點以在大約IpM至大約IuM范圍內(nèi)的親和力(Kd)結(jié)合到在活細胞上的？2&受體上。典型地，當(dāng)該抗原結(jié)合位點是IgM的一部分時，對于活細胞上的？2乂7受體的親和力是在大約IpM至大約InM之間，優(yōu)選大約IpM至大約50pM。典型地，當(dāng)該抗原結(jié)合位點是IgG的一部分時，對于活細胞上的P2X7受體的親和力是在大約IpM至大約InM之間,優(yōu)選大約IpM至大IOOpM之間。典型地，當(dāng)該抗原結(jié)合位點是Fab的一部分時，對于活細胞上的P2X7受體的親和力是在大約IOOpM至大約IOOnM之間，優(yōu)選大約InM至大約ΙΟΟηΜ。典型地，當(dāng)該抗原結(jié)合位點是scFV的一部分時,對于活細胞上的P2X7受體的親和力是在大約IOnM至大約I μ M之間，優(yōu)選大約IOnM至大約ΙΟΟηΜ。典型地，當(dāng)該抗原結(jié)合位點是dab的一部分時，對于活細胞上的P2X7受體的親和力是在大約IOnM至大約10 μ M之間，優(yōu)選大約IOOnM至大約I μ Μ。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合位點以及包含它們的分子能夠誘導(dǎo)凋亡。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合位點以及包含它們的分子能夠誘半胱天冬氨酸酶激活。附圖簡要說明
圖I.全長人 Ρ2Χ7 受體(SEQ ID NO :1)。圖2. Ρ2Χ7 受體的胞外域序列。Ρ2Χ7 受體(47-306) (SEQ ID NO 2) (ECD2)是 SEQID NO : I的氨基酸47至306。這些氨基酸刪去(struck-through) 了指定的從全長？2乂7受體序列中缺失的氨基酸。圖3. P2X7 受體的胞外域序列。P2X7 受體(47-332) (SEQ ID NO 3) (ECDl)是 SEQID NO 1的氨基酸47至332。這些氨基酸刪去了指定的從全長P2X7受體序列中缺失的氨基酸。圖4.對于2F6VH的表達載體結(jié)構(gòu)。圖5.對于2F6Vl的表達載體結(jié)構(gòu)。圖6. (a) 2F6scFv序列，具有用于檢測的添加的His標(biāo)簽(SEQ ID NO 4)。所顯示的2F6scFV序列具有以下組織結(jié)構(gòu)(以從N端到C-端的順序)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-連接物-FRla-CDRla-FR2a-CDR2a-FR3a-CDR3a-FR4a-AAA- Flag 表位標(biāo)簽(DYKDDDDK) -AAA-His標(biāo)簽。(b)通過尺寸排阻HPLC的重組2F6 IgG2a的純化。通過HPLC分離重組IgG2a并且顯示了一個實例HPLC色譜圖。圖 7. 2F6mIgG2a 純化的 HP-SEC。圖8.顯示最終抗體產(chǎn)物純度的SDS PAGE。圖9. (a)體外細胞抑制測定。使用細胞活力檢測(Cell Titer Blue Assay),發(fā)現(xiàn)針對在癌細胞上表達的非功能P2X7受體的三聚物形式的初始抗體的IgM形式抑制了細胞生長。顯示了一個實例，其中看到對照IgM抗體濃度從2. 5增加到40μ g/mL對于細胞生長(左欄)沒有作用而2F6在相同劑量范圍內(nèi)在3天的生長測定中抑制了細胞生長(右欄)。(b)、(c)、(d)同樣地通過與IgM形式的抗體孵育來抑制其他細胞類型。經(jīng)過5天比經(jīng)過3天的生長被抑制到一個更大的程度。相對于使用對照IgM抗體所獲得的控制生長曲線，對生長數(shù)據(jù)作圖。C0L0205生長經(jīng)過3天顯著被抑制并且這些細胞甚至在2. 5 μ g/mL的低劑量下經(jīng)過5天而被消除。這表明表達輕微不同水平的受體的不同細胞系或多或少對于抗體結(jié)合是敏感的。(e)相反，重組IgG2a形式的抗體顯示出更弱的細胞抑制，如在過3天獲得的以下圖中所示。細胞生長抑制測定(細胞活力測試，Cell Titer Blue)顯示，與使用IgM形式抗體引出的抑制作用相比，IgG2a形式的抗體具有降低的腫瘤細胞生長抑制，與實際上含有兩個而不是十個結(jié)構(gòu)域的IgG的結(jié)合親和力降低一致。

圖10.細胞殺傷測定中的阻斷反應(yīng)。細胞活力生長抑制測定用于以MCF-7乳癌細胞系經(jīng)過三天的細胞生長。注意，在右欄中的活的對照細胞不具有抗體或肽。左手欄是使用含500 μ g/mL肽表位(E200-300表位在圖中描述為200/300)的10 μ g/mL 2F6IgM抗體孵育的細胞得到的信號，通過在三個中間欄中的數(shù)據(jù)證明足以阻斷細胞生長抑制作用，顯示了生長抑制不受對應(yīng)的50 μ g/mL,5 μ g/mL或0 μ g/mL肽的存在的影響。在2F6中暴露5天之后發(fā)生細胞生長的完全抑制。圖11.由2F6誘導(dǎo)的具有與凋亡的復(fù)活有關(guān)的半胱天冬氨酸酶3/7活化的細胞死亡機制。在這個實驗中,左側(cè)顯示吉西他濱對照藥物的作用，已知其通過誘導(dǎo)C0L0205癌細胞中的凋亡而激活半胱天冬氨酸酶。相反，藥物或抗體的缺乏沒有作用(僅有細胞的欄)。經(jīng)過3天時間過程的實驗中，高達40 μ g/mL劑量的對照IgM的存在同樣對半胱天冬氨酸酶的激活沒有作用，同時增加2F6抗體的量顯示出與通過抗體誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)的半胱天冬氨酸酶3/7激活的穩(wěn)定增加。 圖12.通過2F6IgM的直接細胞殺傷。在對照IgM抗體(a)和2F6IgM(b)存在24小時下的MCF-7細胞的共焦顯微圖象。圖13. (a)結(jié)合到活4T1腫瘤細胞上的2_2_lhFc,顯示了一些膜結(jié)合(x40obj)。(b)結(jié)合到瀕死細胞上的2-2-lhFc連同來自已經(jīng)被殺死的細胞的膜碎片。(c)結(jié)合到活LL腫瘤細胞上的2-2-lhFc，顯示了清楚的膜結(jié)合。(d)結(jié)合到已經(jīng)被殺死的細胞的膜碎片上的 2-2-lhFcο圖14. (a)結(jié)合到活4T1腫瘤細胞上的2F6hIgGl，顯示了清楚的膜結(jié)合(x40obj)。(b)僅結(jié)合到瀕死細胞上的2F6hIgGl。(c)結(jié)合到活LL腫瘤細胞上的2F6hIgGl，顯示了清楚的膜結(jié)合。(d)結(jié)合到瀕死細胞上的2F6hIgGl，沒有結(jié)合到相鄰的表達功能能力(function-capable)的P2X7受體的紅細胞上。圖15.通過2F6hIgGl在4T1同基因異種移植模型中到第14天時肺轉(zhuǎn)移數(shù)目的抑制。腫瘤體積的總減小為89%，其中在治療組中大多數(shù)轉(zhuǎn)移的體積比未治療組中的轉(zhuǎn)移的體積小得多。圖16.在路易斯肺(LL)同基因異種移植模型中到第11天時肺轉(zhuǎn)移數(shù)目的抑制。五個組是未治療對照(組l)、10mg/kg的羊多克隆E200-300(組2)、lmg/kg(組3)以及10mg/kg (組4)的2F6hIgGl以及5mL/kg每天的索拉非尼(組5)。綿羊多克隆和2F6hIgGl兩者都與具有96%抑制的索拉非尼等效。圖17.來自2F6的⑶R3序列的親和力成熟。親和力成熟的scFv/Fab衍生物的氨基酸序列作為突變體克隆而列出，其中野生型(WT)2F6CDR3序列在清單的頂部。圖18. IgM、IgG2a和Fab鉛的ELISA。鉛親和力成熟的2F6衍生的ELISA (對于IgM和IgG2a，水平為O. 01-12. 5 μ g/mL ;對于Fab為O. 1-100 μ g/mL)。對于初始IgM和重組IgG2a的EC5tl值分別測量為O. 14和I. 6 μ g/mL。WT Fab顯示了非常低的EC5tl，而選自ScFv篩選(#10、#21、#42和#66)的鉛親和力成熟的Fab種類結(jié)合緊密得多，具有在2-4 μ g/mL范圍內(nèi)的EC5tl,或者比WT強125倍，從而匹配該完全形成的IgG2a抗體的親和力。圖19. (a)針對重組Fab結(jié)合到活的結(jié)腸直腸C0L0205腫瘤細胞上的流式細胞術(shù)結(jié)果。使用σ抗FLAG 二級抗體(#F4049)來檢測初級抗體的結(jié)合。WT 2F6Fab在相同的濃度范圍內(nèi)結(jié)合微弱。對于四個鉛Fab的EC50與從ELISA測量獲得的值非常相似。(b)對于前列腺PC3細胞獲得了非常相似的改進的結(jié)合結(jié)果。圖20.對不同的重組2F6IgG2a制劑進行比較，以確定與親和力成熟的Fab相比的WT格式的抗體對PC3細胞的相對結(jié)合強度。使用Rockland IgG2a#010-001_332用于對照以確定背景(菱形)。全格式化的WT抗體的結(jié)合與通過鉛Fab引出的結(jié)合相當(dāng)。圖21.通過流式細胞術(shù)確定了對于通過鉛Fab結(jié)合到人淋巴細胞上的功能性P2X7受體上的缺乏的驗證。σ抗FLAG抗體#F4049用作二級抗體。Abeam HLA抗體用作對照。沒有檢測到在背景以上的結(jié)合，如通過在左手欄的僅僅二次信號所確定的。沿著X軸從左到右的初級抗體的順序與圖例從上到下的順序相同。圖22.對于高親和力的純化羊多克隆抗體結(jié)合到PC3細胞上的流式細胞術(shù)結(jié)果，顯示了比WT 2F6 hIgG2a顯著更強的結(jié)合并且表明當(dāng)轉(zhuǎn)化成二價IgG結(jié)合物時從廣泛的親和力成熟的Fab的預(yù)期改進。
發(fā)明詳細說明現(xiàn)在將更詳細地提及本發(fā)明的某些實施方案。雖然本發(fā)明將結(jié)合這些實施方案進行說明，將理解的是并不旨在將本發(fā)明限于這些實施方案。相反，本發(fā)明旨在將涵蓋如在由權(quán)利要求書所定義的包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的多種替代方案、修改、以及等效物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會認(rèn)識到類似于或等同于在此描述的那些的許多方法和材料，它們可以用于本發(fā)明的實踐中。本發(fā)明絕非限于所描述的這些方法和材料。將理解的是在本說明書中披露并且定義的本發(fā)明擴展到所提及的或根據(jù)正文或附圖中明顯的兩個或更多個單獨的特征的所有替代組合。所有這些不同的組合構(gòu)成了本發(fā)明的不同替代方面。如在此使用的，除了上下文另外要求以外，術(shù)語“包括”comprise")，以及該詞語的變體，例如“包括”("comprising ")以及“包括comprises")和“包括comprised")不旨在排除其他的添加物、組分、整數(shù)或步驟。本發(fā)明提供了能夠結(jié)合到由活細胞表達的非功能性P2X7受體上的抗原結(jié)合位點。這些受體處于更高水平的低聚物形式。這種低聚物形式是相關(guān)聯(lián)的兩種或更多種P2X7受體單體。典型地，該低聚物形式是三個P2X7受體單體的三聚物。本發(fā)明的結(jié)合更高水平的低聚P2X7形式的抗原結(jié)合位點的一個優(yōu)點是，與僅僅結(jié)合單體的P2X7受體的抗體相比，將會降低從溶解的或凋亡的細胞釋放的P2X7受體的單體形式的隱蔽(sequestration)。為了解釋本說明書的目的，以下定義將應(yīng)用并且在適當(dāng)時所使用的單數(shù)術(shù)語還包括復(fù)數(shù)并且反之亦然。在所列出的任何定義與通過引用結(jié)合在此的任何文獻沖突的情況下，以下列出的定義將優(yōu)先。“嘌呤受體”通常是指使用嘌呤(如ATP)作為配體的一種受體?！癙2X7受體”通常是指由三個蛋白質(zhì)亞基或單體形成的嘌呤受體，其中至少一個單體具有基本上如在SEQ ID NO 1中示出的氨基酸序列(參見圖I)?！?？2&受體”可以是如下描述的功能或非功能性受體?！癙2X7受體”包括天然發(fā)生的P2X7受體變體，例如其中P2X7單體是剪接變體、等位基因變體以及包含天然發(fā)生的形成P2X7受體的截短的或分泌形式的單體的同種型(例如由細胞外結(jié)構(gòu)域序列組成的形式或其截短的形式)、天然發(fā)生的變體形式(例如，可替代地剪接形式)以及天然發(fā)生的等位基因變體。在本發(fā)明的某些實施方案中，在此披露的天然序列P2X7單體多肽是成熟的或全長的天然序列多肽，包含在SEQ IDN01中示出的全長氨基酸序列。在某些實施方案中，？2&受體可以具有修飾的氨基酸序列，例如顯示在SEQ ID NO :1中的序列中的不同氨基酸可以被置換、缺失，或可以插入一個殘基?！肮δ苄訮2X7受體”通常是指具有用于結(jié)合到ATP上的結(jié)合位點或裂縫的P2X7受體的一種形式。當(dāng)結(jié)合到ATP上時，該受體形成了一種孔狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使得鈣離子能夠進入胞質(zhì)溶膠中，其一個結(jié)果可能是程序性細胞死亡。在正常穩(wěn)態(tài)中，功能性P2X7受體的表達通常限制于經(jīng)歷程序性死亡的細胞，如胸腺細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、巨噬細胞以及單核細胞。還可以在紅細胞上存在一些功能性P2X7受體表達?！胺枪δ苄訮2X7受體”通常是指其中一個或多個單體具有在Pro210順式異構(gòu)化的P2X7受體的形式(根據(jù)SEQ ID N0:1)。這種異構(gòu)化可能是從導(dǎo)致該單體錯折疊的任何分子事件產(chǎn)生的，包括例如單體基本序列的突變或異常的翻譯后加工。異構(gòu)化的一個結(jié)果是該受體不能結(jié)合到ATP上。在這些情況下，該受體不能形成孔并且這限制了鈣離子可以進入到胞質(zhì)溶膠中的程度。非功能性P2X7受體表達在廣泛的上皮癌和造血癌上。在此使用的“胞外域”(ECD)是P2X7受體(47-306) (SEQ ID NO :2，參見圖 2) (ECD2) 以及卩2父7受體(47-332) (SEQ ID NO 3) (ECDl)。P2X7 受體(47-306) (SEQ ID NO 2)是 SEQID NO 1 的氨基酸 47 至 306。P2X7 受體(47-332) (SEQ ID NO :3，參見圖 3)是 SEQ ID NO I的氨基酸47至332。I.“抗體”或“免疫球蛋白”或“Ig”是在血液、或其他體液或脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的Y球蛋白蛋白，它們在免疫系統(tǒng)中起作用以結(jié)合到抗原上，由此識別并且中和外來物。抗體通常是由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。每個L鏈通過一個共價的二硫鍵連接到一個H鏈上。這兩個H鏈通過一個或多個二硫鍵(取決于該H鏈的同種型)彼此連接。每個H和L鏈還具有規(guī)則地間隔開的鏈內(nèi)二硫橋。H和L鏈定義了特異性Ig結(jié)構(gòu)域。更具體地說，每個H鏈在N端具有關(guān)于可變域(Vh)，之后是三個恒定域(Ch)(對于每個α和Y鏈)以及四個Ch結(jié)構(gòu)域(對于μ和ε同種型)。每個L鏈在N端具有一個可變域((')，之后在其另一端是一個恒定域(Q)。\與Vh對齊并且Q與重鏈的第一恒定域(ChI)對齊?？贵w可以指定到不同的類別或同種型。存在五種類別的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，具有分別指定為α、δ、ε、γ、和μ的重鏈。Y和α類別基于在Ch序列和功能方面的較小差異而進一步分成多個亞類，例如人類表達以下亞類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAldP IgA2。來自任何脊椎動物種類的L鏈基于其恒定域的氨基酸序列可以被指定為兩個明顯不同的類型之一，稱為K和入。該恒定域包括Fe部分，該部分包括通過二硫化合物結(jié)合的兩個H鏈的羥基端部分。通過在Fe區(qū)中的序列確定抗體Uf^BADCC)的效應(yīng)子功能，該區(qū)也是通過在某種類型的細胞上發(fā)現(xiàn)的Fe受體(FcR)識別的部分。V1^P \的配對一起形成了一個“可變區(qū)”或“可變域”，包括抗體的重鏈或輕鏈的氨基端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變域可以被稱為“VH”。輕鏈的可變域可以被稱為“VL”。V結(jié)構(gòu)域包括抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點影響了抗原的結(jié)合并且限定了一種特定抗體對于其特定抗原的特異性。V區(qū)跨過了大約110個氨基酸殘基并且由15-30個氨基酸的被稱為框架區(qū)(FR)(通常大約4)的相對不變伸展段(relatively invariant stretch)組成,該相對不變伸展段被極度易變的稱為“高變區(qū)”(通常大約3)的各自具有9-12個氨基酸長的更短的區(qū)域分開。這些FR大部分采取β片構(gòu)型并且高變區(qū)形成了連接β片結(jié)構(gòu)的環(huán)，并且在一些情況下形成了 β片結(jié)構(gòu)的一部分?！案咦儏^(qū)”，“HVR”或“HV”是指抗體可變域的區(qū)域，這些區(qū)域在序列方面是高變的和/或形成在結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)。通常，抗體包括六個高變區(qū)；三個在VH(H1、Η2、Η3)中，并且三個在VL(L1、L2、L3)中。在此使用并且包含了許多高變區(qū)的描繪。Kabat互補決定區(qū)(O)R)是基于序列可變性并且是最常使用的(Kabat等人Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed.(免疫學(xué)興趣的蛋白質(zhì)序列，第 5 版)Public HealthService, National Institutes of Health(美國國立衛(wèi)生研究院，公共衛(wèi)生署)，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))。 “框架”或“FR”殘基是除了在此定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變域殘基?！坝糜谛纬煽乖Y(jié)合位點的肽”通常是指可以形成針對抗原賦予抗原特異性的肽。例子包括全抗體或全抗體相關(guān)的結(jié)構(gòu)，包含一個可變域的全抗體片段、其可變域和片段，包括輕和重鏈，或包括一些但并非所有的高變區(qū)或恒定區(qū)的輕以及重鏈的片段。“完整的”或“全”抗體是包括抗原結(jié)合位點，連同Q以及至少重鏈恒定域ChI、Ch2和(^3。恒定域可以是天然序列的恒定域(例如，人類天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體?！叭贵w相關(guān)的結(jié)構(gòu)”包括多聚化形式的全抗體?！鞍粋€可變域的全抗體片段”包括Fab、Fab'、F(ab' )2、和Fv片段；雙鏈抗體、線性抗體、單鏈抗體分子；以及從抗體片段形成的多特異性抗體。Fab片段由整個L鏈與H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(Vh)以及一個重鏈的第一恒定域(ChI)組成。每個Fab片段相對于抗原結(jié)合是單價的，即，它具有單個抗原結(jié)合位點。Fab'片段與Fab片段的區(qū)別在于在ChI結(jié)構(gòu)域的羧基端具有另外的很少的殘基，包括一個或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab' -SH在此是對于Fab'命名的，其中該恒定域的一個或多個半胱氨酸殘基帶有一個游離的巰基。F(ah' )2片段大致地對應(yīng)于兩個具有二價抗原結(jié)合活性的二硫化物連接的Fab的片段并且仍然是能夠交聯(lián)抗原。“Fv”是包括一個完全抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。該片段由以緊密的非共價締合的一個重鏈的以及一個輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚物組成。在一個單鏈Fv(ScFv)種類中，一個重鏈以及一個輕鏈可變域可以通過一個柔性肽連接物共價連接，使得該輕鏈和重鏈能夠在一個類似于兩鏈Fv種類的“二聚”結(jié)構(gòu)中締合。從這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊發(fā)散出六個高變環(huán)(3個環(huán)各自來自H和L鏈)，這些環(huán)有助于氨基酸殘基用于抗原結(jié)合并且賦予抗原對抗體的結(jié)合特異性?！皢捂淔v”還縮寫為“sFv”或“scFv”是包含連接形成一個單一的多肽鏈的Vh和\抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，該scFv多肽進一步包括在該Vh和\結(jié)構(gòu)域之間的一個多肽連接物，使得該scFv形成了所希望的用于抗原結(jié)合的結(jié)構(gòu)。
“單一可變域”是Fv的一半(僅包含三個對于抗原特異的OTR)，該Fv具有識別并且結(jié)合抗原的能力，盡管比整個結(jié)合位點的親和力更低。“雙鏈抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，這些片段包括連接到在同一多肽鏈(VH-VL)中的一個輕鏈可變域(VL)上的重鏈可變域(VH)。小的抗體片段通過在該Vh與\結(jié)構(gòu)域之間構(gòu)建具有短連接物(大約5-10個殘基)的sFv片段(參見以上段落)而制備，使得實現(xiàn)了 V結(jié)構(gòu)域的鏈間配對但不是鏈內(nèi)配對，從而導(dǎo)致了一個二價片段，即，具有兩個抗原結(jié)合位點的片段。
雙鏈抗體可以是二價的或雙特異性的。雙特異性的雙鏈抗體是兩個“交換型” sFv片段的異源二聚體，其中這兩個抗體的Vh與\結(jié)構(gòu)域在不同的多肽鏈上存在。三鏈抗體和四鏈抗體通常也是本領(lǐng)域已知的。“分離的抗體”是已經(jīng)從其預(yù)先存在的環(huán)境中的組分鑒定并且分離和/或回收的抗體。污染組分是將會干擾對于抗體的治療用途的材料并且可以包括酶、激素以及其他蛋白質(zhì)性溶質(zhì)或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)?！叭丝贵w”是指具有相應(yīng)于由人產(chǎn)生的一種抗體的氨基酸序列和/或已經(jīng)使用用于制造如在此披露的人抗體的任何技術(shù)所制造的抗體。人抗體的定義確切地排除了包含非人的抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的不同技術(shù)生產(chǎn)，包括噬菌體展示文庫。人抗體可以通過將該抗原給予一種轉(zhuǎn)基因動物而制備，該轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)進行了改良以響應(yīng)于抗原激發(fā)而產(chǎn)生這樣的抗體，但是其內(nèi)源性位點已經(jīng)喪失能力。非人(例如嚙齒動物)的抗體的“人源化的”形式是包含衍生自非人抗體的最小序列的嵌合抗體。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自該受體的高變區(qū)的殘基被具有所希望的抗體特異性、親和力和能力的來自非人種類(供體受體)(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓或非人靈長類的高變區(qū)的殘基取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。此外，人源化抗體可以包括在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾以進一步改進抗體性能。通常，這種人源化抗體將包含基本上所有的至少一個、典型地兩個可變域，其中相應(yīng)于非人免疫球蛋白以及所有的或基本上所有的FR的所有的或基本上所有的高變環(huán)是人免疫球蛋白序列的那些。該人源化抗體任選地還包括至少一個免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe),典型地人免疫球蛋白的至少一部分?！皢慰寺】贵w”是指從基本上均質(zhì)性抗體的群體獲得的一種抗體，S卩，包含該群體的單獨的抗體是相同的，除了可能以較小的量存在的可能的天然發(fā)生的突變以外。單克隆抗體是高度特異性的，其直接針對在抗原上的單一抗原位點或決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體有利的是它們可以通過其他抗體未受污染地合成。單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備，或者使用重體DNA方法在細菌、真核動物或植物細胞中制造。這些“單克隆抗體”還可以從噬菌體抗體文庫中分離出。在此的單克隆抗體包括“嵌合的”抗體，其中重和/或輕鏈的一部分與對應(yīng)的衍生自一個特定種類的抗體或?qū)儆谝粋€特定抗體種類或亞類的序列相同或同源，而該一個或多個鏈的其余部分是與衍生自另一個種類的抗體的或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體連同此種抗體的片段中的對應(yīng)序列相同或同源，只要他們表現(xiàn)出所希望的生物活性即可。在此感興趣的嵌合抗體包括“靈長類化的(primatized) ”的抗體,這些抗體包含衍生自非人靈長類(例如舊世界猴、猩猩等)的可變域抗原結(jié)合序列以及人類恒定區(qū)序列。術(shù)語“抗-P2X7受體抗體”或“結(jié)合到P2X7受體上的抗體”是指能夠以足夠的親和力結(jié)合到P2X7受體上使得該抗體作為一種診斷和/或治療劑在靶向P2X7受體(典型地非功能性P2X7受體)中是有用的抗體。優(yōu)選地，將一種P2X7受體抗體結(jié)合到不相關(guān)的受體蛋白上的程度小于如所測量(例如通過放射免疫測定(RIA))的該抗體結(jié)合到？2\受體上的約10%。在某些實施方案中，結(jié)合到？2&受體上的抗體具有的解離常數(shù)(Kd)是< ΙμΜ、< ΙΟΟηΜ, < 10ηΜ、< 1恤、或< O. InM。抗非功能性P2X7受體抗體通常是具有一些或所有這些血清學(xué)特征并且結(jié)合到非功能性P2X7受體上而不是功能性P2X7受體上的抗體。一種“親和力成熟的”抗體是在其一個或多個HVR中具有一個或多個改變的抗體，這種改變與不具有一個或多個那種改變的母源抗體相比導(dǎo)致了抗體對于抗原的親和力的 改進。優(yōu)選的親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾的對于靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體是通過本領(lǐng)域已知的程序生產(chǎn)的?！耙种菩浴笨贵w或“拮抗劑”抗體是抑制或降低了該抗體結(jié)合的抗原的生物活性的抗體。優(yōu)選的抑制性抗體或拮抗劑抗體基本上或完全抑制了該抗原的生物活性。如在此使用的“激動劑抗體”是一種模擬感興趣的多肽的功能性活性中的至少一種的抗體?！敖Y(jié)合親和力”通常是指在一個分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點與其結(jié)合配偶體(例如，抗原)之間的總的非共價相互作用的強度。通常“結(jié)合親和力”是指反應(yīng)結(jié)合對(例如，抗體和抗原)的成員之間的I : I相互作用的固有結(jié)合親和力。分子X對于其配偶體Y的親和力通?？梢酝ㄟ^解離常數(shù)(Kd)表示?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法測量親和力，包括在此描述的那些。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合到抗原上并且傾向于很容易地解離，而高親和力抗體通常更快地結(jié)合到抗原上并且傾向于保持結(jié)合比較久。許多種測量結(jié)合親和力的方法是本領(lǐng)域已知的，其中任何方法可以用于本發(fā)明的目的。如在此使用的，在以下表中定義了氨基酸的特性
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)合到？2&受體上的抗原結(jié)合位點，該抗原結(jié)合位點由以下通式I定義FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中 FR1、FR2、FR3和FR4各自是框架區(qū)； ⑶R1、⑶R2和⑶R3各自是互補決定區(qū)； 其中 CDR3具有一個氨基酸序列(帶電荷的/極性的/芳香族的)(帶電荷的/芳香族的)XXXY(芳香族的/脂肪族的)(帶電荷的/中性的)(中性的/脂肪族的)。
并且其中X代表任何氨基酸。
2.如權(quán)利要求I所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列N(Y/F)XXXY(Y/F)EX。
3.如權(quán)利要求2所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列N(Y/F)(中性的)(帶電荷的)(中性的)Y(Y/F)E(中性的)。
4.如權(quán)利要求3所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列NFLESYFEA。
5.如權(quán)利要求2所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列N(Y/F)(帶電荷的)(中性的)(帶電荷的)Y(Y/F)E(中性的)。
6.如權(quán)利要求5所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列NYRGDYYET。
7.如權(quán)利要求I所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列H(芳香族的)XXXYYNI。
8.如權(quán)利要求7所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列H(Y/F))(中性的)(帶電荷的(帶電荷的)YYNI。
9.如權(quán)利要求7所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列H(Y/F)(中性的)(帶電荷的(中性的)YYNI。
10.如權(quán)利要求8所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列HYSKEYYNI。
11.如權(quán)利要求9所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列HFQRGYYNI。
12.如權(quán)利要求I所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)XXXYY(帶電荷的(中性的)。
13.如權(quán)利要求12所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYDV。
14.如權(quán)利要求12所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列(Y/N)(芳香族的)(中性的)(中性的)(中性的)YYEV。
15.如權(quán)利要求13所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列YFPLVYYDV。
16.如權(quán)利要求14所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列NYLPMYYEV。
17.如權(quán)利要求I所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列Y(帶電荷的)XXXY(中性的)(中性的)(中性的)。
18.如權(quán)利要求I所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列YHVIQYLGP。
19.如權(quán)利要求I所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列以下序列中的任一項HYSSRFFDV、NFKLMYYNV、NYRGDYYET、HFSRGYYDV、NFLESYFEA、NYL PMYYEV,HYIKVYYEA, HYSSRFFEV、NFRVMFFKA、HFQRGYYNI、HYSSRFFEV、YHVIQYLGP, HYSKEYYNI、YFPLVYYDV、DFTVPFYNA、NYDKKYFDV、YFPLVYYDV。
20.如權(quán)利要求I所述的抗原結(jié)合位點，其中CDR3具有以下氨基酸序列HFSRGYYDV或NYDKKYFDVο
21.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的抗原結(jié)合位點用于制造一種治療癌癥或與非功能性P2X7受體表達有關(guān)的病癥或疾病的藥物的用途。
22.根據(jù)以上權(quán)利要求的任一項所述的抗原結(jié)合位點，用于治療癌癥或與非功能性P2X7受體表達有關(guān)的病癥或疾病。
23.一種用于診斷癌癥或與非功能性P2X7受體表達有關(guān)的病癥或疾病的方法，包括以 下步驟將有待確定癌癥的存在或缺乏的組織或細胞與一種試劑接觸，該試劑處于根據(jù)以 上權(quán)利要求的任一項所述的一種抗原結(jié)合位點的形式；然后檢測該試劑與組織或細胞的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及嘌呤受體、其抗體以及相關(guān)的用于結(jié)合到所述受體上的片段，涉及所述抗體以及片段的生產(chǎn)，并且涉及所述抗體和片段用于癌癥檢測和治療的用途。具體地，所描述的抗體特異性地結(jié)合到由活細胞表達的非功能性P2X7受體上。
文檔編號C07K16/28GK102762595SQ201080063868
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者安格斯·基得利-拜爾德, 朱利安·亞歷山大·巴登 申請人:生物權(quán)威國際有限公司