專利名稱：一種從蠶砂中提取葉綠素并制備鐵葉綠酸鈉的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從中藥蠶砂中提取葉綠素及制備鐵葉綠酸鈉的方法，屬于中藥領 域。
背景技術：
葉綠素是我國和大多數(shù)國家允許使用的天然色素，其衍生物在醫(yī)藥上具有促進傷 口愈合、抗?jié)?、抗腫瘤、抗微生物、防癌、保肝、抗貧血等多方面的生物活性。葉綠素的基本 結構與人類及大多數(shù)動物血液中的血紅素結構極其相似，都是四吡咯金屬化合物，主要區(qū) 別在于葉綠素的中心原子是鎂，而血紅素的中心原子是鐵。以亞鐵離子置換葉綠素的鎂離 子制成鐵葉綠酸鈉(也稱為葉綠酸鐵鈉、葉綠素鐵鈉鹽等)后，其結構與血液中的血紅蛋白 極其相似，是治療缺鐵性貧血的良劑，有報道顯示鐵葉綠酸鈉中有機鐵的作用相當于硫酸 亞鐵的12. 5倍。雖然葉綠素在植物體內大量分布，但含量是比較低的，不適合大規(guī)模提取。蠶砂是 蠶的糞便，蠶在攝取桑葉后，吸收了大部分營養(yǎng)成分，剩下的不能吸收和利用的成分排出體 外，形成蠶砂，其中富含葉綠素，因此，蠶砂歷來是提取葉綠素和制備葉綠素衍生物的一種 重要原料。雖然蠶砂中的葉綠素含量比桑葉提高了(一般為0. 8%-2. 0%)，但與含有蛋白質、 纖維素、果膠質、木質素和脂肪質等組分相比仍然低得多，其一般組成為水分12%，粗蛋白 質15. 4%，粗脂質2. 6%，粗纖維19. 6%，可溶性非氮物36. 2%，此外尚含構成細胞壁與粗纖維 結合的果膠質和木質素等?，F(xiàn)有技術從蠶砂中提取葉綠素進而制備鐵葉綠酸鈉的方法，目前主要為有機溶劑 加熱回流法。為保證提取充分，此類方法一般需浸潤過夜，再回流提取數(shù)小時，速度慢，耗時 長，提取的葉綠素純度低，且后期提取液的純化過程有機溶劑消耗量大；同時，由于葉綠素 的熱敏性，在80°C以上極容易被破壞，因此加熱回流提取時，尤其以較高沸點的乙醇為溶劑 提取(考慮到經濟環(huán)保)時，葉綠素往往受到一定程度的破壞。在CN100390176C號專利授權 文件中，在蠶砂提取葉綠素前，增加了微波預處理的工藝，破壞組織細胞，減小葉綠素滲透 細胞溶解到有機溶劑的阻力，從而提高提取效率，但該技術一個明顯的不足之處在于，微波 處理物料的溫度極高，即使處理時間在30-90秒，高溫也會破壞部分葉綠素，從而大大降低 了提取率。向紀明等在《蠶砂中葉綠酸銅鈉、鐵葉綠酸鈉的提制及應用》(《安康師專學報》， 1999年9月，P40-42)中詳細記載了從蠶砂中提制鐵葉綠酸鈉的原理及提取工藝，提取工藝 包括萃取一阜化一純化一鐵化一堿化共五個步驟，上述生產工藝為目前蠶砂提取葉綠素并 制備鐵葉綠酸鈉的常規(guī)方法，在CN1451395A號專利申請公開文件中即使用了該技術?，F(xiàn)有 技術的葉綠素均是以有機溶劑直接提取而得，存在速度慢，耗時長，提取液雜質多，葉綠素 純度低，后期的處理過程有機溶劑耗量大，能耗高等諸多缺陷，不利于工業(yè)化生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的以蠶砂為原料提取葉綠素進而制備鐵葉綠酸鈉的方法，克服現(xiàn)有技術不足之處，提高鐵葉綠酸鈉的生產效率和產品純度。本發(fā)明以蠶砂為原料制備鐵葉綠酸鈉的方法包括以下步驟
A、提取葉綠素將蠶砂置于超微振動磨中，加入蠶砂重量0.5-1倍的70%-80%乙醇， 控制粉碎筒溫度45飛5°C，超微振動提取2-5分鐘，再加入蠶砂重量2-5倍的70%_80%乙 醇繼續(xù)在45飛5°C條件下超微振動提取5-15分鐘，出料，將料液以靜置、濾過或離心方式， 分得上清液和藥渣；將藥渣重置超微振動磨中，加入蠶砂重量2-5倍的70%-80%乙醇，在 45飛5°C條件下超微振動提取5-15分鐘，出料，料液以靜置、濾過或離心方式，分得上清液 和藥渣；將兩次所得上清液合并，回收乙醇，濾除水液，即得葉綠素粗提物；
B、精制葉綠素將步驟A所得葉綠素粗提物用去離子水洗滌1-3次，每次去離子水的用 量為葉綠素粗提物重量的1-5倍，濾過，所得濾渣即為葉綠素精提物；
C、皂化除雜將葉綠素精提物用120號汽油溶解，加入足量的NaOH溶液，攪拌，使其完 全皂化，靜置，分層，分取下層皂化液，以120號汽油洗滌至汽油層色淡(即顯現(xiàn)汽油本身具 有的淡黃色)，分取皂化液；
D、鐵化將除雜后的皂化液以酸溶液調節(jié)pH值至2-4，析出的沉淀以丙酮溶解，再加入 沉淀重量0. 12-0. 18倍的FeCl2 · 4H20，加熱保持微沸至溶液呈深綠色為止，回收丙酮，得鐵 代產物；
E、堿化取鐵代產物以去離子水洗至無游離鐵離子，溶解于丙酮或95%乙醇中，再加入 足量NaOH乙醇溶液，至不再有沉淀產生為止，濾過，所得沉淀即為鐵葉綠酸鈉。本發(fā)明方法亦可首先將蠶砂置于超微振動磨中進行超微粉碎，再將提取溶劑加入 超微振動磨中與蠶砂粉共同超微振動提取。優(yōu)選的以蠶砂為原料制備鐵葉綠酸鈉的方法包括以下步驟
A、提取葉綠素將蠶砂置于超微振動磨中，加入蠶砂重量1倍的75%乙醇，控制粉碎筒 溫度50°C，超微振動提取3分鐘，再加入蠶砂重量3倍的75%乙醇，在50°C條件下超微振動 提取10分鐘，出料，料液離心分離，得上清液和藥渣；上清液備用，藥渣重置超微振動磨中， 加入蠶砂重量3倍的75%乙醇，在50°C條件下超微振動提取10分鐘，出料，料液離心分離， 得上清液和藥渣；將兩次所得上清液合并，回收乙醇，濾除水液，得葉綠素粗提物；
B、精制葉綠素將步驟A所得葉綠素粗提物用去離子水洗滌2次，每次去離子水的用量 為葉綠素粗提物重量的1倍，濾過，所得濾渣即為葉綠素精提物；
C、皂化除雜將葉綠素精提物用5倍重量的120號汽油溶解，再加入葉綠素精提物0.3 倍量30%Na0H溶液，攪拌，使其完全皂化，靜置，分層；分取下層皂化液，以120號汽油洗至汽 油層色淡，分取皂化液；
D、鐵化將除雜后的皂化液以酸溶液調節(jié)pH值至2-4，析出的沉淀以丙酮溶解，再加入 沉淀重量0. 16倍的FeCl2 · 4H20，加熱保持微沸至溶液呈深綠色為止，回收丙酮，得鐵代產 物；
E、堿化取鐵代產物以去離子水洗至無游離鐵離子，溶解于丙酮或95%乙醇中，再加入 足量NaOH乙醇溶液，至不再有沉淀產生為止，濾過，所得沉淀即為鐵葉綠酸鈉。上述步驟D中的FeCl2 ·4Η20也可以用其他亞鐵離子鹽代替，如含有同量亞鐵離子 WFeSO40本發(fā)明為解決葉綠素提取率和純度較低的問題，采用了完全不同的思路以中等濃度 乙醇配合超微振動提取。超微粉碎技術是目前中藥粉碎技術領域的熱點，本發(fā)明人在改善葉綠素提取率的 研究過程中也曾嘗試過超微粉碎技術，即按照常規(guī)方法將蠶砂進行超微粉碎，然后將粉碎 物用95%乙醇或丙酮進行提取，結果發(fā)現(xiàn)提取出的雜質非常多，葉綠素的分離成本極高。發(fā) 明人進行了反復的試驗，以期找到更好的分離手段，但一直不理想；此后在對蠶砂各成分進 行層析分析時，發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)，葉綠素在中等濃度乙醇中依然有較好的溶解度，并且雜質 較容易洗脫掉，于是發(fā)明人摒棄低極性溶劑提取的常規(guī)思路，又經多次試驗后終于確定以 75%的乙醇作為葉綠素的最佳提取溶劑。在接下來的生產實踐中，發(fā)明人又遇到了超微粉碎普遍存在的難題，S卩(1)在藥 材粉碎過程中，隨著顆粒粒徑的減小，進一步粉碎時需要的能量不斷增大，當顆粒粒徑達到 一定程度后，粉碎效率明顯降低(2)既便在粉碎完成后，由于粒徑表面能增加，從而使顆 粒處于不穩(wěn)定狀態(tài)，表現(xiàn)為流動性差、易聚集形成假大顆粒，可濕性增加、易吸潮，吸附性增 加，易吸附空氣中的雜質等。發(fā)明人在解決粉碎難題的過程中，再次提出創(chuàng)造性技術方案， 即將提取溶劑加入到粉碎機中，邊粉碎邊提取。經實驗證實，在整個提取過程中，蠶砂的破 壁粉碎與成分的提取同時進行，超微粉碎可將細胞壁打破，其中的有效成分充分暴露出來， 蠶砂粉的表面積大大增加，振動磨的高速振動所產生的高能量使有效成分迅速溶解，從而 提高了成分的溶出速度，大大縮短了提取時間，數(shù)分鐘即可達到較高的提取效率。發(fā)明人同 時還發(fā)現(xiàn)，將粉碎提取容器的溫度通過外加恒溫裝置控制在50°C左右，超微提取的效果最 佳。綜合上述技術效果可見，控溫條件下的超微振動提取方法配合中等濃度乙醇溶劑 對葉綠素提取率較常規(guī)提取方法有明顯的提高；此外，采用70%-80%乙醇提取，與傳統(tǒng)的非 極性溶劑相比，不僅廉價、環(huán)保，且蠶砂中的粗纖維、蛋白質、粘液質等高分子雜質不易被提 取出來，有利于更好的提取和精制；最后的水洗程序，除去了提取物中含有的可溶性非氮 物、水溶性蛋白、多糖、單糖等雜質，使得提取的葉綠素不僅收率高，而且純度較高。高純度 的葉綠素提取物，含有較少的雜技和有機溶劑，也為下一步制備出高品質的鐵葉綠酸鈉創(chuàng) 造了有利條件，整個工藝過程安全簡單、成本低廉，利于工業(yè)化生產。為驗證本發(fā)明的效果，發(fā)明人將本發(fā)明技術與現(xiàn)有技術進行了對比研究。一、鐵葉綠酸鈉提取物的制備從取同一批次的蠶砂中均勻取出三份，每份^^， 分別按如下三種方法制備鐵葉綠酸鈉提取物，稱定重量。方法一(本發(fā)明方法)將蠶砂置于超微振動磨中，加入^ig的75%乙醇，控制粉碎 筒溫度50°C，超微振動提取3分鐘，再加入15Kg的75%乙醇，繼續(xù)在50°C條件下超微振動 提取10分鐘，出料，料液離心分離，得上清液和藥渣；上清液備用，藥渣重置超微振動磨中， 另加入15Kg的75%乙醇，在50°C條件下再超微振動提取10分鐘，出料，料液離心分離，得 上清液和藥渣；將兩次所得上清液合并，回收乙醇，濾除水液，得葉綠素粗提物；將此粗提 物用同樣重量的去離子水洗滌2次，濾過，得到葉綠素精提物；將葉綠素精提物用5倍重量 的120號汽油溶解，再加入葉綠素精提物0. 3倍量30%Na0H溶液，攪拌，使其完全皂化，靜 置，分層；分取下層皂化液，以120號汽油洗至汽油層色淡(汽油本色)，分取皂化液，以稀鹽 酸溶液調節(jié)PH值至4，析出的沉淀以丙酮溶解，再加入沉淀重量0. 16倍的FeCl2 · 4H20，加熱保持微沸至溶液呈深綠色為止，回收丙酮，得鐵代產物，再以去離子水洗至無游離鐵離子 (用鄰氮二菲試劑檢測洗滌液)，溶解于95%乙醇中，再加入NaOH乙醇溶液至不再有沉淀產 生為止，濾過，得到鐵葉綠酸鈉提取物，干燥稱重，記錄數(shù)據(jù)。方法二 (參照CN1451395A文獻)用適量清水灑在蠶砂上，翻動均勻后，放置6小 時軟化，再置于抽提罐中，加入蠶砂重量2倍的95%丙酮水溶液，常溫下浸提2小時，連續(xù)3 次；浸提完成后去渣，取丙酮提取液蒸餾回收丙酮，將得到的墨綠色膏狀物用其4倍重量的 汽油溶解，輕微攪拌，再加入其0. 2倍重量的20%氫氧化鈉水溶液，在40°C下，攪拌20分鐘 使之皂化；分離出皂化液上層的汽油層，再加入墨綠色膏狀物之4倍重量的汽油攪拌20分 鐘，保溫于40°C，靜置20分鐘使分層，分離出上層汽油層，如此重復4次，至汽油層色淡為 止；在除雜后的皂化液中緩緩加入4mol/L鹽酸溶液，同時適當攪拌，控制攪拌速度為60轉 /min左右，鹽酸加量以混合液PH = 2為度，靜置20分鐘，抽濾，分離出沉淀物；沉淀物用汽 油在常溫下洗滌3次，過濾得沉淀物；將此沉淀物用丙酮溶解，在pH = 4條件下，加入反應 理論量2倍的氯化亞鐵，于60°C反應2小時，回收丙酮，得到含鐵濃縮物，繼續(xù)用水和汽油 洗滌除雜至中性且無游離鐵離子存在；將該含鐵濃縮物加水溶解，再加入其2倍重量的30% 氫氧化鈉水溶液，生成鈉鹽溶于反應后液體中，過濾，濾液蒸干，殘渣干燥、稱重，記錄數(shù)據(jù)。方法三(對照CN100390176C文獻):將蠶砂碾碎，加入60%乙醇溶液2500ml作為細 胞破壁助劑，攪拌均勻軟化5分鐘，鋪成薄層，放進微波提取器內輻射70秒；將微波處理過 的物料加入95%乙醇40L，在33 的溫度下浸取45分鐘，過濾；將濾液減壓回收乙醇，濃縮 至15L，加入300g的NaOH，在350K溫度下皂化45分鐘，然后用丙酮萃取分離雜質；分取下 層水液，加入5mol/L的鹽酸溶液調節(jié)pH值2. 6，在35 的溫度下加入含i^eS0410%的溶液 500ml，鐵代40分鐘，濾過，洗滌，將得到的葉綠酸鐵溶液于400ml丙酮中，向溶液中加入5% 的氫氧化鈉乙醇溶液1L，在溫度下反應60分鐘，過濾、干燥、稱重，記錄數(shù)據(jù)。二、純度測定將上面三組得到的產物再按照以下含量測定方法檢測鐵葉綠酸鈉 和葉綠素衍生物的含量。1、鐵葉綠酸鈉含量測定方法
對照品溶液的制備精密稱取經130°C干燥至恒重的光譜純的三氧化二鐵0. 143g，置 燒杯中，加鹽酸溶液(1 — 2)5ml使溶解，移至IOOml量瓶中，加鹽酸溶液(1 — 2)4ml，加水至 刻度，搖勻，精密量取10ml，置IOOml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得每Iml約含 ^ΙΟΟμ g 的溶液。分別精密量取上述溶液0、0. 2,0. 4,0. 6、0. 8及1. 0ml，置IOml量瓶中，加硝酸溶液 (1 — 500)至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備取樣品適量，研細，精密稱取10mg，置50ml燒杯中，加硝酸 1. 5ml，高氯酸3滴，蓋上表面皿，15(Tl60°C加熱至近干后，加硝酸(1 — 2)&ι1，蓋上表面皿， 繼續(xù)加熱至近干，取出燒杯，放冷，加硝酸溶液(1 — 500)適量使溶解，移至25ml量瓶中，加 硝酸溶液(1 — 500)至刻度，搖勻，即得。測定法取對照品溶液及供試品溶液，照原子吸收分光光度法(中國藥典2005年 版一部附錄V D含量測定第一法)，在MSnm波長處測定，計算鐵的百分含量，乘以12. 32，即 得干燥品含鐵葉綠酸鈉(b) (C34H28O6N4FeNa2)的百分含量。2、葉綠素衍生物的含量測定方法
取樣品細粉約0. 18g，精密稱定，加稀鹽酸10ml、超聲處理15分鐘，減壓抽濾，棄去酸水，用水洗滌殘渣至水洗液呈中性(甲基紅指示液顯黃色，溴麝香草酚藍指示液顯黃綠 色)，將殘渣連同濾紙剪碎后，轉移至燒杯中，精密加入氫氧化鈉滴定液(0. lmol/L)20ml, 蓋上表面皿，熱水浴中加熱15分鐘，冷卻至室溫，加水5ml，搖勻，同法制備空白溶液。照 電位滴定法(中國藥典2005年版一部附錄V III A)用鹽酸滴定液(0. lmol/L)滴定，并將滴 定的結果用空白試驗校正，計算，即得干燥品含葉綠素衍生物的百分含量，以鐵葉綠酸(b) (C34H30O6N4Fe)計算。
權利要求
1.一種以蠶砂為原料制備鐵葉綠酸鈉的方法，其特征在于包括以下步驟A、提取葉綠素將蠶砂置于超微振動磨中，加入蠶砂重量0.5-1倍的70%-80%乙醇， 控制粉碎筒溫度45飛5°C，超微振動提取2-5分鐘，再加入蠶砂重量2-5倍的70%_80%乙 醇繼續(xù)在45飛5°C條件下超微振動提取5-15分鐘，出料，將料液以靜置、濾過或離心方式， 分得上清液和藥渣；將藥渣重置超微振動磨中，加入蠶砂重量2-5倍的70%-80%乙醇，在 45飛5°C條件下超微振動提取5-15分鐘，出料，料液以靜置、濾過或離心方式，分得上清液 和藥渣；將兩次所得上清液合并，回收乙醇，濾除水液，即得葉綠素粗提物；B、精制葉綠素將步驟A所得葉綠素粗提物用去離子水洗滌1-3次，每次去離子水的用 量為葉綠素粗提物重量的1-5倍，濾過，所得濾渣即為葉綠素精提物；C、皂化除雜將葉綠素精提物用120號汽油溶解，加入足量的NaOH溶液，攪拌，使其完 全皂化，靜置，分層，分取下層皂化液，以120號汽油洗滌至汽油層色淡，分取皂化液；D、鐵化將除雜后的皂化液以酸溶液調節(jié)pH值至2-4，析出的沉淀以丙酮溶解，再加入 沉淀重量0. 12-0. 18倍的FeCl2 · 4H20，加熱保持微沸至溶液呈深綠色為止，回收丙酮，得鐵 代產物；E、堿化取鐵代產物以去離子水洗至無游離鐵離子，溶解于丙酮或95%乙醇中，再加入 足量NaOH乙醇溶液，至不再有沉淀產生為止，濾過，所得沉淀即為鐵葉綠酸鈉。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備鐵葉綠酸鈉的方法，其特征在于包括以下步驟A、提取葉綠素將蠶砂置于超微振動磨中，加入蠶砂重量1倍的75%乙醇，控制粉碎筒 溫度50°C，超微振動提取3分鐘，再加入蠶砂重量3倍的75%乙醇，在50°C條件下超微振動 提取10分鐘，出料，料液離心分離，得上清液和藥渣；上清液備用，藥渣重置超微振動磨中， 加入蠶砂重量3倍的75%乙醇，在50°C條件下超微振動提取10分鐘，出料，料液離心分離， 得上清液和藥渣；將兩次所得上清液合并，回收乙醇，濾除水液，得葉綠素粗提物；B、精制葉綠素將步驟A所得葉綠素粗提物用去離子水洗滌2次，每次去離子水的用量 為葉綠素粗提物重量的1倍，濾過，所得濾渣即為葉綠素精提物；C、皂化除雜將葉綠素精提物用5倍重量的120號汽油溶解，再加入葉綠素精提物0.3 倍量30%Na0H溶液，攪拌，使其完全皂化，靜置，分層；分取下層皂化液，以120號汽油洗至汽 油層色淡，分取皂化液；D、鐵化將除雜后的皂化液以酸溶液調節(jié)pH值至2-4，析出的沉淀以丙酮溶解，再加入 沉淀重量0. 16倍的FeCl2 · 4H20，加熱保持微沸至溶液呈深綠色為止，回收丙酮，得鐵代產 物；E、堿化取鐵代產物以去離子水洗至無游離鐵離子，溶解于丙酮或95%乙醇中，再加入 足量NaOH乙醇溶液，至不再有沉淀產生為止，濾過，所得沉淀即為鐵葉綠酸鈉。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的制備鐵葉綠酸鈉的方法，其特征在于步驟D中的 FeCl2 · 4H20用含有同量亞鐵離子的!^SO4代替。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從蠶砂中提取葉綠素并制備鐵葉綠酸鈉的方法，屬于中藥領域。該方法利用超微粉碎提取技術，在中等濃度乙醇和溫控條件下，按照萃取—皂化—純化—鐵化—堿化的工藝步驟，從蠶砂中制得較高純度的鐵葉綠酸鈉和葉綠素衍生物，提高了生產效率，其效果明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術。
文檔編號C07D487/22GK102093369SQ20111003102
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權日2011年1月28日
發(fā)明者劉朝勝 申請人:武漢聯(lián)合藥業(yè)有限責任公司