專利名稱：抗體制備方法及所得抗體和抗體庫的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選和/或制備感興趣蛋白質(zhì)的特異性抗體的方法。本發(fā)明具體涉及一種高通量、低成本和高成功率的方法，其可用于在蛋白質(zhì)組規(guī)模預(yù)測感興趣蛋白質(zhì)的表位，制備其特異性抗體，以及篩選和檢測所產(chǎn)生的抗體。
背景技術(shù)：
基因組技術(shù)的發(fā)展，在基因的層面上為生物功能的研究、疾病的診斷和治療、以及藥物的開發(fā)等領(lǐng)域提供了大量的基礎(chǔ)信息。但是對于大多數(shù)的生物體系來說，單純的基因信息并不足以闡明其作用機制。此外，如果要利用這些信息以及作用機制來實現(xiàn)應(yīng)用的目的，如對病理狀況進行鑒定和分析、對藥物的作用機制及效果進行驗證和判斷，則需要更進一步地在蛋白質(zhì)的層面上獲取更多的信息，例如分析和研究各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、表達、定位、修飾、以及相互作用等性質(zhì)。對蛋白質(zhì)各種性質(zhì)的鑒定需要借助很多的技術(shù)手段，如質(zhì)譜、層析、電泳、芯片以及各種標(biāo)記技術(shù)等，這其中的很多技術(shù)手段都需要通過抗原抗體的相互作用來實現(xiàn)。此外，抗原抗體相互作用本身也是非常重要的技術(shù)手段，其可以廣泛地應(yīng)用于科研、醫(yī)療以及藥物開發(fā)等各個領(lǐng)域，例如治療性抗體藥物的開發(fā)等。隨著蛋白質(zhì)研究的深入進展，對各種抗體乃至抗體庫的需求也日益增加，例如需要針對某物種蛋白組中所有蛋白制備其特異性抗體庫，或者針對某一特定類別的蛋白如激酶、G蛋白受體等制備其特異性抗體等等。但是目前已知的僅僅是針對幾千種蛋白的有限抗體，而且其特異性也滿足不了很多技術(shù)手段的需要。因此，能夠針對任何感興趣蛋白快速、高效且大量地制備高度特異的抗體將具有十分重要的意義。目前常用的獲取抗體方法包括雜交瘤技術(shù)、重組抗體技術(shù)、各種分子展示技術(shù)，以及將上述這些技術(shù)與高通量的方法結(jié)合的技術(shù)等?？贵w的制備，通常主要是通過天然或重組蛋白或其片段來免疫動物，使動物體內(nèi)產(chǎn)生能夠特異地識別和結(jié)合所述蛋白的抗體。然后根據(jù)需要再使用各種技術(shù)手段從動物的細胞中獲取抗體，如單克隆抗體或者多克隆抗體等。單克隆抗體的獲取通常需要借助雜交瘤技術(shù)，該方法在免疫動物后，需要取動物細胞進行融合以獲得產(chǎn)生抗體的雜交瘤，再進行克隆建株以產(chǎn)生抗體，隨后再對抗體進行純化和鑒定。根據(jù)需要可以再進一步確定其抗原表位。這種產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)最早應(yīng)用于鼠模型(K6hler和Milstein，Nature vol. 256，1975)，如今已廣泛的應(yīng)用于各種動物模型，其詳細過程可參見各種教科書和操作手冊的介紹(如 Bazin,“Rat hybridomas andrat monoclonal antibodies”,CRCPress, 1990 ;Goding,“Monoclonal antibodies !principles and practice，，, 3rd edition,Academic Press,1996 ;Shepherd 和 Dean “Monoclonal antibodies，，Oxford UniversityPreSS，2000等)。此方法雖然目前仍廣泛應(yīng)用于抗體制備，但其也具有很多缺點，如制備周期很長、制備技術(shù)非常復(fù)雜、不能夠完全識別表位、以及成本高昂等缺點，而且這種方法也并不能應(yīng)用于所有的蛋白質(zhì)，例如對于很多免疫原性低或者具有毒性的抗原來說，這種方法就不適用(SinclairNR (et al，2004)B cel 1/antibody to lerance to our own antigens.Front Biosci 9 :3019-3028)。此外，為獲得具有特異性的單克隆抗體，目前常用的是將化學(xué)合成的肽片段偶聯(lián)至載體蛋白，然后免疫小鼠。此方法一次得到針對同一蛋白質(zhì)單一表位的抗體，而由于肽片段本身免疫原性的差異，這種策略的整體成功率不高。特別是對于同源性很高的蛋白，篩選出來的肽的免疫原性很差，很難刺激小鼠機體產(chǎn)生強免疫反應(yīng)。另一常用策略是采用全長蛋白質(zhì)或者蛋白 質(zhì)片段制備免疫原，部分解決了上述問題，但卻又存在蛋白表達整體成功率不高的缺陷(一般表達純化體系為30-70% ) (Thorsten Kohl, ChristianSchmidt,Stefan ffiemann, Annemarie Poustka and Ulrike Korf. Drew, 2003)。對于在所用動物中具有高同源性的蛋白質(zhì)片段，動物免疫應(yīng)答一般較弱，制備單克隆抗體的成功率較低(Sinclair NR et al, 2004, Automated productionof recombinant human proteins asresource for proteome research ProteomeScience 2008,6 :4 ;Sinclair NR(2004)Bcell/antibody tolerance to our ownantigens. Front Biosci 9:3019-3028)。重組抗體技術(shù)可以與各種分子展示技術(shù)相結(jié)合，從而針對多種抗原來產(chǎn)生對靶具有高度親和力的抗體，并且可以同步確定抗原表位，因而常用于藥物開發(fā)中(ChristineRothe,Stefanie Urlinger,Makiko Yamashita et al. TheHuman Combinatorial AntibodyLibrary HuCAL GOLD Combines Diversification of All Six CDRs According to theN atural Immune System witha Novel Display Method for Efficient Selection ofHigh-Affinity Antibodies. J. Mol. Biol. (2008) 376，1182—1200，2007)。但重組抗體技術(shù)的操作復(fù)雜，成本高昂，產(chǎn)量較低，而且還經(jīng)常存在非特異性結(jié)合，從而限制了其大規(guī)模的應(yīng)用 ° (Levitan, B. Stochastic modeling and optimization of phage display. J. Mol.Biol. 277,893-916 (1998). Bradbury et al，2004)為提高免疫和篩選效率，可以將上述技術(shù)與高通量的方法相結(jié)合，例如采用多種免疫原同時免疫并使用芯片技術(shù)進行篩選的高通量策略，如CN200510026873. 0所述。但這種免疫策略需要大量高免疫原性的免疫原，這對于難以進行表達和提純的蛋白質(zhì)或者對于免疫原性很低的蛋白質(zhì)來說，也是很難實現(xiàn)的。另外傳統(tǒng)的多免疫原同時免疫的方法只能在產(chǎn)生抗體后根據(jù)需要再通過特定技術(shù)如表位定位(epitope mapping)來被動地確定該抗體所針對的表位(參見GlennE. Morris,“Methods in Molecular Biology Epitope MappingProtocoIs^,Humana Press,1996)。所述表位有時也并非感興趣蛋白質(zhì)所特有的，通常也可在同物種的很多其它蛋白質(zhì)中出現(xiàn)，因而所產(chǎn)生的抗體的特異性較低。為解決上面提到的各種問題，需要新的抗體制備和篩選方法，從而能夠針對所有蛋白質(zhì)高效、快速、低成本的制備和篩選出高度特異的抗體。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種制備感興趣的蛋白質(zhì)的抗體的方法，該方法包括(a)預(yù)測和/或選擇位于感興趣的蛋白質(zhì)表面的肽片段；(b)合成或表達一或多個所述肽片段；(c)利用步驟(b)的產(chǎn)物免疫動物，任選組合佐劑進行免疫；(d)用來自步驟(C)的經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞來獲得抗體；(e)用步驟(a)的肽片段和/或天然構(gòu)象的所述感興趣的蛋白質(zhì)篩選步驟(d)中所獲得的抗體，得到所述感興趣的蛋白質(zhì)的抗體庫。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可通過如下方法預(yù)測或選擇所述步驟(a)中的肽片段(i)根據(jù)感興趣的蛋白質(zhì)的序列，通過計算如下參數(shù)來確定表面肽，所述參數(shù)選自溶劑可接近性、無序指數(shù)、蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域預(yù)測、或以上任意組合；(ii)將步驟(i)所確定的表面肽與感興趣的蛋白質(zhì)所來源物種的蛋白質(zhì)組進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質(zhì)的特異性肽片段；和(iii)將步驟(i)所確定的表面肽與其他物種的同源蛋白質(zhì)進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質(zhì)的保守序列。 在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(a)中所述肽片段是感興趣的蛋白質(zhì)的線性表面身份肽和/或構(gòu)象型表面身份結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述身份肽具有如下特點長度是6-12個氨基酸、高親水性、高抗原性、非信號肽、不位于跨膜區(qū)、而位于無序區(qū)域。在另一個實施方案中，所述身份結(jié)構(gòu)域是長度為100-500個氨基酸的、預(yù)期具有3維結(jié)構(gòu)的序列特異性蛋白質(zhì)片段。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(b)通過與增強免疫原性和/或增加拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)的融合蛋白的形式重組表達所述一或多個肽片段。在一個實施方案中，所述增強免疫原性和/或增加拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)是病毒樣顆粒蛋白質(zhì)載體。在一個實施方案中，所述病毒樣顆粒蛋白質(zhì)載體為乙肝病毒核衣殼(roc)蛋白。在一個實施方案中，所述一或多個肽片段插入到HBC蛋白的環(huán)、N端或C端，例如插入位點位于HBC蛋白的第77和第82位氨基酸殘基之間。在一個實施方案中，通過接頭連接的2-10個肽片段插入到HBC蛋白中。所述接頭可以是(GGGGS)n，其中n為任意整數(shù)，例如1、2、3或4。在一個實施方案中，本發(fā)明所述方法步驟(b)中一或多個肽片段進一步與免疫增強載體蛋白偶聯(lián)。在一個實施方案中，所述免疫增強載體蛋白為匙孔血藍蛋白(KLH)。在一個實施方案中，本發(fā)明所述方法步驟(b)中的一或多個肽片段是化學(xué)合成的。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(C)所述的免疫任選組合佐劑進行，例如佐劑選自弗氏完全佐劑、鋁、CpG、或其任意組合。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(C)的免疫在多位點進行，例如在選自以下位點的至少2個位點進行頸背部、尾根、后足掌、后側(cè)腹股溝、前腿腋窩、后腿肌肉。在一個實施方案中，進行多次免疫，時間間隔為2-14，例如3-4天。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(C)的免疫包含如下步驟(A).首次免疫，在頸背部、尾根、后足掌、后側(cè)腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及弗氏完全佐劑進行免疫；并在后腿肌肉使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；(B).第二次免疫，在頸背部、后側(cè)腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及弗氏完全佐劑進行免疫；并在后腿肌肉使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；(C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；和(D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫。在一個實施方案中，在第一天進行首次免疫，在第5天進行第二次免疫，在第8天進行第三次免疫，在第11天進行第四次免疫。
本發(fā)明方法步驟(d)可以通過至少一種選自如下方法來獲得抗體(1)將來自步驟(C)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞并表達從而獲得抗體；(2)從來自步驟(C)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞中分離出抗原特異性B細胞，再利用PCR來克隆和表達抗體基因從而獲得抗體；或者(3)從來自步驟(C)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞中分離出mRNA ，然后通過噬菌體展示、或核糖體展示、或酵母展示、或細菌展示、或桿狀病毒展示、或哺乳細胞展示、或mRNA展示來獲得抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法獲得主要包含單一 IgG亞型的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(e)的抗體庫是針對一個物種所有感興趣蛋白質(zhì)的抗體庫。在另一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(e)的抗體庫是包含了針對一種感興趣的蛋白質(zhì)的所有表位的抗體的抗體庫。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(e)通過親和力排序篩選步驟(d)中所獲得的抗體。本發(fā)明的方法還可以進一步包括篩選功能性抗體或檢測性抗體的步驟(f)。例如，所述檢測性抗體通過Western印跡、IP、IF、IHC、流式細胞計數(shù)、ELISA或其任意組合進行篩選；所述功能性抗體通過可阻斷或中和測定來進行篩選。在另一方面，本發(fā)明提供了確定感興趣的蛋白質(zhì)的表位的方法，所述方法包括用上述步驟(a)中所預(yù)測和/或篩選的肽片段構(gòu)建檢測抗原來對所產(chǎn)生的抗體進行篩選以確定表位的步驟。


圖I :多克隆位點設(shè)計圖示與核苷酸序列。圖2 :人造HBc圖示。圖3 :H載體結(jié)構(gòu)圖。圖4 4A1抗體Western結(jié)果驗證。C2C12細胞以含蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA緩沖液(50mM Tris pH7. 4,150mM NaCl, 1% Triton-X-100，I %脫氧膽酸鈉 0. 1% SDS 裂解液)裂解，SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入I 5稀釋的單克隆抗體細胞株的培養(yǎng)上清，以 ECL Plus (Amersham)檢測。WB western 印跡。圖5 :4A1抗體IF驗證數(shù)據(jù)。5X IO3個BHK細胞接種到細胞載玻片上于37 °C培養(yǎng)過夜，冰甲醇(_20°C )固定15min，lXPBS洗滌2X3min，l% BSA室溫封閉Ih后，加入單克隆抗體細胞株培養(yǎng)上清I : I室溫孵育I小時，洗滌，加入二抗抗小鼠Dylight549 (Abcam) I 400和DAPI I 4000室溫孵育lh，洗滌，熒光顯微鏡(Olympus)鏡檢拍照。圖6 :針對GPRl 16蛋白獲得的抗體1A6的Western結(jié)果驗證。WB western印跡。圖7 :針對Aofl蛋白獲得的抗體2F1的Western結(jié)果驗證。WB western印跡。發(fā)明詳述除非另有說明，所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常見的含義。所有專利，專利申請，公開出版物，GenBank序列，網(wǎng)站以及其他公開材料均全文援引加入本文，除非另有說明。本發(fā)明提供了一種制備感興趣的蛋白質(zhì)的抗體的方法，其能夠高效、快速、低成本地制備所述蛋白質(zhì)的高度特異性抗體，進而建立覆蓋感興趣的蛋白質(zhì)表面表位的表位庫以及針對所有表位的抗體庫。本發(fā)明還提供了明確抗體所針對的特定表位的方法。本發(fā)明提供了一種制備感興趣的蛋白質(zhì)的抗體的方法，所述方法包括(a)預(yù)測和/或選擇位于感興趣的蛋白質(zhì)表面的肽片段；(b)合成或表達一或多個所述肽片段；(C)利用步驟(b)的產(chǎn)物免疫動物，任選組合佐劑進行免疫；(d)用來自步驟(C)的經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞來獲得抗體；(e)用步驟(a)的肽片段和/或天然構(gòu)象的所述感興趣的蛋白質(zhì)篩選步驟(d)中所獲得的抗體，得到針對所述感興趣的蛋白質(zhì)的抗體庫。如本文所用，術(shù)語“感興趣的蛋白質(zhì)”是指任意的天然蛋白質(zhì)，或者是經(jīng)可變剪接(alternative splicing)而得到的天然蛋白質(zhì)的同種型,或者是天然蛋白質(zhì)的突變型,或者上述各種蛋白質(zhì)的任意組合。本文所述“可變剪接”是指在同一個mRNA前體中，通過不同剪接方式(即通過不同剪接位點組合外顯子)而產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程。通過可變剪接所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物互為同種型，其可能會表現(xiàn)出不同功能和結(jié)構(gòu)特性，或者在相同細胞中由于表達水平不同而導(dǎo)致不同表型。本文所述“突變型”是指天然蛋白質(zhì)通過一或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加所獲得的突變蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語“肽片段”是指所述感興趣的蛋白質(zhì)中連續(xù)或者非連續(xù)的氨基酸序列，其可以是連續(xù)的線性多肽，也可以是構(gòu)成結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的非連續(xù)多肽的組合。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過如下方法預(yù)測或選擇所述步驟(a)中的肽片段(i)根據(jù)感興趣的蛋白質(zhì)的序列，通過計算如下參數(shù)來確定表面肽，所述參數(shù)選自 溶劑可接近性、無序指數(shù)、蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域預(yù)測、或以上任意組合；(ii)將步驟
(i)所確定的表面肽與感興趣的蛋白質(zhì)所來源物種的蛋白質(zhì)組進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質(zhì)的特異性肽片段；和(iii)將步驟(i)所確定的表面肽與其他物種的同源蛋白質(zhì)進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質(zhì)的保守序列。在一個實施方案中，步驟(a)中所述肽片段是感興趣的蛋白質(zhì)的線性表面身份肽和/或構(gòu)象型表面身份結(jié)構(gòu)域。本文所用術(shù)語“表面肽”是指位于天然蛋白質(zhì)表面的線性肽片段和/或位于蛋白質(zhì)表面構(gòu)成結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的非連續(xù)多肽的組合。本文所用術(shù)語“身份肽(signaturepeptide) ”是指與同物種蛋白質(zhì)組中的其它蛋白質(zhì)的序列相比較,感興趣的蛋白質(zhì)所獨有的線性連續(xù)肽序列。本文所用術(shù)語“身份結(jié)構(gòu)域(signature domain) ”是指與同物種蛋白質(zhì)組中的其它蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域相比較，感興趣的蛋白質(zhì)所獨有的結(jié)構(gòu)域。本文所用術(shù)語“表面身份肽”和“表面身份結(jié)構(gòu)域”分別是指位于蛋白質(zhì)天然構(gòu)象表面的“身份肽”和“身份結(jié)構(gòu)域”。本文所用術(shù)語“溶劑可接近性”是代表蛋白內(nèi)氨基酸暴露于構(gòu)像蛋白表面程度的一個指標(biāo)(參見 Bent Petersen, Thomas Nordahl Petersen, PernilleAndersen MortenNielsen and Claus Lundegaard. A generic method for assignment of reliabilityscores applied to solvent accessibility predictions. BMCStructuralBiology 2009，
9:51)0本文所用術(shù)語“無序指數(shù)”是代表氨基酸復(fù)雜程度的一個參數(shù)(參見PredragRadivoj ac，Lilia M. Iakoucheva, Christopher J. Oldfield, ZoranObradovic，VladimirN. Uversky, and A. Keith Dunker. Intrinsic Disorder andFunctional Proteomics.Biophysical Journal Volume 92，1439-1456(2007))。
本文所用術(shù)語“蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域預(yù)測”是指在蛋白與蛋白相互作用時，一些結(jié)構(gòu)域在相互作用中扮演關(guān)鍵作用，通過分析蛋白氨基酸組成，可以預(yù)測兩個蛋白以何種方式結(jié)合，較經(jīng)典的軟件如Autodock。(參見Bin Liu, Xiaolong Wang,Lei Lin, Buzhou Tang, Qiwen Dong and Xuanffang. Prediction of protein bindingsites in protein structures using hiddenMarkov support vector machine. BMCBioinformatics2009,10 :381)。
本文所用術(shù)語“蛋白質(zhì)組”是指由某物種的基因組、或者某種細胞或組織所表達的所有蛋白質(zhì)的集合。本發(fā)明所述的序列比對可通過本領(lǐng)域已知的各種方法進行，例如使用各種常用軟件或者在線服務(wù)來進行，例如由NCBI所提供的BLASP等。本發(fā)明所述的預(yù)測和/或選擇是指首先基于生物信息學(xué)的方法，針對特定的蛋白質(zhì)，通過二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、同基因組比較、同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測來定義出具有蛋白質(zhì)特異性且對該蛋白質(zhì)具有較高覆蓋范圍的身份肽和/或身份結(jié)構(gòu)域以作為潛在的表位。此類生物信息學(xué)的方法已廣泛的應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及相互作用的預(yù)測，如 Berglund L 等人(參見 Protein Science, 17 :606-613, 2008)介紹了針對整個人蛋白質(zhì)組進行蛋白組層面的特異性表位篩選的方法，其中基于8、10、12氨基酸殘基的滑動窗(sliding window)序列比對,用啟發(fā)式(heuristic)方法來針對整個人蛋白質(zhì)組預(yù)測每個人類蛋白質(zhì)的序列一致性，基于此方法可對90%的人蛋白質(zhì)找出至少一個特異性表位。Anderson HP 等人(參見 Protein Science, 15 :2558-2567, 2006)介紹了利用蛋白 3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來預(yù)測非連續(xù)表位的方法DiscoTope，這種方法基于抗原-抗體蛋白質(zhì)復(fù)合物的X-ray晶體結(jié)構(gòu)所確定的非連續(xù)性表位集合來評估氨基酸統(tǒng)計學(xué)、空間信息和表面可接近性。Yan CH等人(參見BMC Bioinformatics, 7 :262,2006)介紹了由氨基酸序列來預(yù)測潛在的DNA-結(jié)合位點的方法，其使用樸素貝葉斯分類器來預(yù)測特定的氨基酸序列是否為DNA結(jié)合位點。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的身份肽是長度為6-12個氨基酸、高親水性、高抗原性、非信號肽、非跨膜區(qū)以及位于無序區(qū)域的肽。在一個實施方案中，本發(fā)明所述的身份結(jié)構(gòu)域是長度為100-500個氨基酸、預(yù)期具有3維結(jié)構(gòu)的序列特異性蛋白質(zhì)片段。在一個實施方案中，本發(fā)明所述方法步驟(a)預(yù)測和/或選擇位于感興趣的蛋白質(zhì)表面的多個肽片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、直至位于感興趣的蛋白質(zhì)表面的所有可作為潛在表位的肽片段。在一個實施方案中，所述多個肽片段被設(shè)計為一個免疫抗原串聯(lián)多肽。例如，所述免疫抗原串聯(lián)多肽可以如下設(shè)計。對感興趣的蛋白質(zhì)的免疫參數(shù)如抗原性、親水性、可接近性、等電點、信號預(yù)測、跨膜預(yù)測、特異性等參數(shù)的設(shè)定規(guī)則可參見Kolaskar AS等FEBSLett.276(1-2) :172-4,1990 ；Parker JM 等 Biochemistry. 25(19) :5425-32,1986 ；EminiEA等J Virol. 55 (3) :836_9，1985。對于任意一個感興趣的蛋白質(zhì)，首先根據(jù)預(yù)測的等電點和信號肽結(jié)果排除蛋白質(zhì)中的這些區(qū)域。例如設(shè)置一個滑動窗，長度為5-20個氨基酸，在蛋白質(zhì)上順次移動一個氨基酸，將滑動窗的序列加入一個集合。例如，對于一個長度為n個氨基酸的蛋白質(zhì)(假設(shè)它沒有信號肽和跨膜區(qū))，總共會產(chǎn)生n-9條短肽序列(移動框長度為10個氨基酸)。對每一短肽，計算(可參見Kolaskar AS等FEBS Lett. 276(1-2) =172-4,1990 ；Parker JM 等 Biochemistry. 25(19) :5425-32,1986 ；Emini EA 等 J Virol. 55(3)836-9，1985)它的等電點、可接近性、免疫原性、親水性和根據(jù)BLAST方法的種屬內(nèi)特異性。在等電點大于3. 5時，計算每條短肽的上述參數(shù)的加權(quán)平均值(0. 2*免疫原性+0. I*可接近性+0. 2*親水性+0. 5*種屬內(nèi)特異性)。根據(jù)加權(quán)平均值對這些短肽進行排序，選出分數(shù)最大同時肽段間重疊(overlap) < 3的短肽,例如選擇7條短肽。本發(fā)明所述肽片段可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)獲得，例如重組表達或者化學(xué)合成，即本發(fā)明所述肽片段可以使用原核或真核表達系統(tǒng)用本領(lǐng)域已知的重組表達方法表達或者所述肽片段可以通過常規(guī)化學(xué)方法合成。
在一個實例中，例如對于難以進行表達及純化的蛋白質(zhì)或者具有很低免疫原性的蛋白質(zhì)，為了制備特異性抗體，利用高免疫原性表達載體、高成功率的可溶蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)輔助產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的潛在抗原。例如，可以提及的是病毒樣顆粒蛋白載體乙肝病毒核衣殼(HBC)蛋白。HBC蛋白質(zhì)是一種可攜帶各種來源的肽的非感染性類病毒顆粒載體，可用來結(jié)合靶肽以產(chǎn)生高效價抗體反應(yīng)，因而在疫苗制備中廣泛應(yīng)用。HBC蛋白質(zhì)可在特定位點如環(huán)、N端或C端等攜帶外源氨基酸，可將高達238個氨基酸的外源序列展示在蛋白質(zhì)表面以促進免疫反應(yīng)發(fā)生。關(guān)于HBC載體的詳細描述可參見Good MF等，Science，235 =1059-1063,1987 ;PumpensP 和 Grens E, Intervirology,44 :98-114,2001 ；Clarke BE 等，Nature330 381-384,1987 ；Francis MJ 等，Nature 330 :168-170,1987 ；ffhitacre DC 等 Expert Rev.Vaccines 8:111565-1573,2009。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(b)中的一或多個肽片段插入到HBC蛋白的環(huán)、N端或C端，例如插入到HBC蛋白的第77和第82位氨基酸殘基之間的位置。本發(fā)明的多個肽片段例如2-10個肽片段還可以通過接頭連接，然后插入到HBC蛋白中。所述接頭可以是本領(lǐng)域常規(guī)使用的任何街頭，例如(GGGGS)n，其中n為任意整數(shù)，例如n = 1、2、3或4。例如，在一個實例中，選擇N條免疫原性、特異性較高的肽片段(5彡N彡20)，其長度可以為M(5彡MS 20)個氨基酸。為了避免不同肽片段之間產(chǎn)生新的抗原表位，在不同肽片段之間插入一或多個弱免疫原性接頭GGGGS將所述肽片段串聯(lián)到一起。對于不同的蛋白質(zhì)長度，可以選擇不同的肽片段長度(5 < M < 20)，插入的片段數(shù)目可在5-20之間，肽片段的長度例如是6-12氨基酸，片段數(shù)目例如是小于10。在本發(fā)明的實施方案中，上述步驟(b)中表達的一或多個肽片段還可以進一步與免疫增強載體蛋白偶聯(lián)，所述免疫增強載體蛋白例如是匙孔血藍蛋白(KLH)。KLH蛋白是一種源于巨型匙孔帽貝(Megathura crenulata)的攜氧金屬蛋白，其常被用作產(chǎn)生抗體的載體蛋白。其所具有的多個表位以及其與哺乳動物的來源蛋白的差異性使得其成為了良好的用于產(chǎn)生抗體的載體蛋白。關(guān)于KLH蛋白的使用可參見Harris JR等，Micron. 30 (6):597-623,1999 以及 WO 2001/047552。本發(fā)明步驟(C)所述免疫動物可以通過本領(lǐng)域任何已知方法進行。本發(fā)明用來進行免疫的動物可以是本領(lǐng)域常用的動物，例如小鼠、大鼠、兔、棉羊、山羊、馬、牛等。在一個實施方案中，可以使用適當(dāng)佐劑，從而快速高效地獲得高效價且亞型較單一的抗體。在一個的實施方案中，通過本發(fā)明的方法可以獲得主要包含單一 IgG亞型的抗體。本發(fā)明所使用的佐劑可選自弗氏完全佐劑、鋁、CpG、或其任意組合。
在一個實施方案中，本發(fā)明方法包括對動物進行多位點免疫。利用多位點免疫策略快速產(chǎn)生高親和性抗體的具體方案例如參見Kilpatrick KE等人(Hybridoma 16:
(4)381-389，1997)。通過佐劑來調(diào)節(jié)抗體的親和性以及亞型的方案例如參見Karagouni L等 Scand. J. Tmmuno1. 31 :745-754,1990 以及 Petty RE 等 Immunology 32 :49-55,1977。本發(fā)明所述在多位點對動物進行免疫可以在選自以下位點的至少2個位點進行頸背部、尾根、后足掌、后側(cè)腹股溝、前腿腋窩、后腿肌肉。在本發(fā)明的一個實施方案中，對動物進行多次免疫。多次免疫之間的時間間隔可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)知識確定，例如2-14天，如3或4天。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(C)所述免疫包含如下步驟(A).首次免疫，在頸背部、尾根、后足掌、后側(cè)腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及弗氏完全佐劑進行免疫；并在后腿肌肉使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；(B).第二次免疫，在頸背部、后側(cè)腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及弗氏完全佐劑進行免疫；并在后腿肌肉使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；(C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；和(D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫。在更具體的實施方案中，本發(fā)明方法步驟(C)的免疫包含如下步驟(A).首次免疫，在頸背部、尾根、后足掌、后側(cè)腹股溝以及前腿腋窩使用在250 Ul緩沖液中的20 U g步驟(b)表達產(chǎn)物以及250 U I弗氏完全佐劑進行免疫；并在后腿肌肉使用在500 u I緩沖液中的20 ii g步驟(b)表達產(chǎn)物以及25 ill鋁+10 ii g CpG的佐劑進行免疫；(B).第二次免疫，在頸背部、后側(cè)腹股溝以及前腿腋窩使用在250 Ul緩沖液中的
10U g步驟(b)表達產(chǎn)物以及250 U I弗氏完全佐劑進行免疫；并在后腿肌肉使用在500 U I緩沖液中的10 y g步驟(b)表達產(chǎn)物以及25 ill鋁+10 ii g CpG的佐劑進行免疫；(C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用在500 Ul緩沖液中的IOu g步驟(b)表達產(chǎn)物以及25 ill鋁+10 ii g CpG的佐劑進行免疫；和(D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用在500 Ul緩沖液中的IOu g步驟(b)表達產(chǎn)物以及25 ill鋁+10 ii g CpG的佐劑進行免疫。在一個實施方案中，在第I天進行首次免疫，在第5天進行第二次免疫，在第8天進行第三次免疫，在第11天進行第四次免疫，第14天融合，得到的抗體絕大多數(shù)為親和力成熟的IgG亞型，IgG亞型抗體相對于IgM具有親和力高、穩(wěn)定性好以及易于純化的優(yōu)勢。本發(fā)明方法步驟(d)所述用來 自經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞獲得抗體可以本領(lǐng)域已知的任何方法進行。本文所用術(shù)語“淋巴細胞”是指淋巴器官的細胞或者由淋巴器官所產(chǎn)生的細胞，所述淋巴器官包括中樞淋巴器官(又稱作初級淋巴器官)和周圍淋巴器官(又稱作次級淋巴器官)。前者包括胸腺、腔上囊或其相當(dāng)器官(如哺乳動物的骨髓)，后者包括脾、淋巴結(jié)等。
在一個實施方案中，所述抗體通過至少一種選自如下的方法獲得(1)將來自步驟(C)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞并表達從而獲得抗體；(2)從來自步驟(c)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞中分離出抗原特異性B細胞，再利用PCR來克隆和表達抗體基因從而獲得抗體；或者(3)從來自步驟(c)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞中分離出mRNA，然后通過噬菌體展示、或核糖體展示、或酵母展示、或細菌展示、或桿狀病毒展示、或哺乳細胞展示、或mRNA展示來獲得抗體。雜交瘤技術(shù)的詳細介紹可參見Bazin, “Rat hybridomas and ratmonoclonalantibodies，，，CRC Press, 1990 ;Goding, “Monoclonal antibodies !principles andpractice”，3rd edition, Academic Press,1996 ；Shepherd 和 Dean “Monoclonalantibodies” Oxford University Press, 2000 等文獻。本發(fā)明方法步驟(d)也可通過噬菌體展示、或核糖體展示、或酵母展示、或細菌展示、或桿狀病毒展示、或哺乳細胞展示、或mRNA展示來獲得抗體。這些方法均為本領(lǐng)域常用技術(shù)，其具體的操作可參考相應(yīng)的教科書和操作手冊。例如可參見Mondon P等Front.Biosci. 13 :1117-1129, 2008。以噬菌體展示技術(shù)為例，其是通過將分離的抗體基因插入到噬菌體DNA中，從而抗體分子上能與抗原結(jié)合的可變區(qū)域被連接到噬菌體衣殼蛋白上。當(dāng)噬菌體感染大腸桿菌后，單鏈DNA在大腸桿菌內(nèi)進行復(fù)制，而噬菌體則重新組裝并分泌到培養(yǎng)基中，同時并不裂解大腸桿菌。曬菌體與祀抗原共同溫育，結(jié)合的曬菌體分離后，再進行擴增和純化從而能夠篩選出大量克隆。關(guān)于噬菌體展示技術(shù)可參見劉佳等細胞與分子免疫學(xué)雜志(Chin. J. CellMol. Immunol.) 2004 :20 (6) 773-775、CN03131796. O、WO2009/109572 以及 WO 2009/085462。本發(fā)明方法所產(chǎn)生的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用本發(fā)明方法篩選和制備的針對一個物種所有感興趣蛋白質(zhì)的抗體庫。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用本發(fā)明方法篩選和制備的包含了針對一種感興趣的蛋白質(zhì)的所有表位的抗體的抗體庫。本發(fā)明中所用的術(shù)語“抗體”、“單克隆抗體”、“多克隆抗體”、“表位”等是本領(lǐng)域所常用的術(shù)語，其含義符合本領(lǐng)域技術(shù)人員一般的理解，也可以參考常用的教科書和手冊對其的定義。本發(fā)明所用的術(shù)語“抗體庫”是指包含了多種不同的抗體的一種抗體集合，其可以包含針對多種不同蛋白的抗體，也可以包含針對同一蛋白不同表位的抗體。本發(fā)明方法步驟(e)中所述“篩選”是用步驟(a)的肽片段和/或天然構(gòu)象的感興趣的蛋白質(zhì)來篩選步驟(d)獲得的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明方法步驟(e)通過親和力排序篩選步驟(d)中所獲得的抗體。對抗體進行親和性鑒定的方法可參見Griswold WR等 Immunology letters,1984 :229-232 ；Van Heyningen V 等 Journal of ImmunologicalMethods, 62 :147-153,1983 ；以及 Rath S 等 Journal of Immunological Methods,106 245-249，1988。在一個實施方案中，本發(fā)明方法還進一步包括篩選功能性抗體或檢測性抗體的步驟(f)。例如，所述檢測性抗體可以通過Western印跡、IP、IF、IHC、流式細胞計數(shù)、ELISA或其任意組合進行篩選，或所述功能性抗體通過可阻斷或中和測定來進行篩選。本文所述檢測性抗體是指可以與抗原反應(yīng)并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)手段例如Western印跡、IP、IF、IHC、流式細胞計數(shù)或ELISA等檢測的抗體。本文所述功能性抗體是指可以與抗原反應(yīng)并且對抗原的生物學(xué)功能產(chǎn)生作用例如阻斷或中和等的抗體。例如，通 過如下方法篩選針對所述感興趣的蛋白質(zhì)的抗體將所述感興趣的蛋白質(zhì)或其片段生物素化，在真核細胞例如293細胞中過表達，將所述過表達的生物素化蛋白質(zhì)或其片段加入鏈霉抗生物素包被的平板中，之后加入本發(fā)明方法步驟(e)所獲得的抗體進行ELISA測定，獲得反應(yīng)陽性的抗體。本發(fā)明獲得的一種單克隆抗體4A1是由雜交瘤細胞株4A1產(chǎn)生的，所述雜交瘤細胞株4A1于2011年I月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCC201107。本發(fā)明獲得的另一種單克隆抗體1A6是由雜交瘤細胞株1A6產(chǎn)生的，所述雜交瘤細胞株1A6于2011年I月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C201108。本發(fā)明獲得的一種單克隆抗體2F1是由雜交瘤細胞株2F1產(chǎn)生的，所述雜交瘤細胞株2F1于2011年I月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C201109。在另一個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明方法獲得的抗體庫。在一個實施方案中，所述抗體庫包含針對所有感興趣蛋白質(zhì)的抗體。在一個實施方案中，所述抗體庫包含針對位于一種感興趣蛋白質(zhì)的表面上的所有表位的抗體。在一個實施方案中，所述抗體庫中的抗體是單克隆抗體。在另一個方面，本發(fā)明還提供了確定產(chǎn)生的抗體所針對的表位的方法，包括用上述步驟(a)中所預(yù)測和/或篩選的肽片段構(gòu)建檢測抗原來對本發(fā)明所產(chǎn)生的抗體進行篩選以確定表位的步驟。本文所用術(shù)語“檢測抗原”是指利用上述步驟中所預(yù)測和/或篩選的肽片段所構(gòu)建的融合蛋白，該檢測抗原可用于針對多個蛋白進行篩選，其中針對每個所要篩選的蛋白均含有一個表位。在一個實施方案中，本發(fā)明所采用的篩選策略是可以針對N個蛋白質(zhì)的篩選策略，每個蛋白質(zhì)設(shè)計的表位數(shù)和蛋白質(zhì)數(shù)均可以是N個(5 < NS 20)，前提條件是對每種蛋白質(zhì)所選擇的表位數(shù)目一致。例如針對5種蛋白質(zhì)，每個蛋白質(zhì)在免疫抗原設(shè)計的時候確定了 5個抗原表位，分別以A、B、C、D，E表示(見表I)，例如免疫抗原I的表位分別是Al、BI、Cl、Dl和El。此處表位數(shù)和蛋白數(shù)均可以是N個(5 < NS 20)。5個蛋白質(zhì)的檢測抗原采用I列內(nèi)的五個多肽表位做為一個新的蛋白序列(見表I，例如檢測抗原A包含Al、A2、A3、A4和A5)。在篩選的過程中，每個融合后的陽性克隆孔(采用免疫抗原篩選得到)，分別采用5個檢測抗原篩選，通過典型的ELISA篩選，從而明確每個陽性克隆針對哪個多肽表位。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上，優(yōu)先挑取針對每個表位的陽性細胞進行建株和后續(xù)鑒定，從而避免在未知表位的情況下，陽性克隆只是針對某個最優(yōu)勢表位的細胞株最多，造成得到的細胞株的同質(zhì)性。表I免疫抗原設(shè)計方法
I檢測抗原A I檢測抗原B I檢測抗原C I檢測抗原D I檢測抗原E免疫抗原 I|aiIbiIciIdiIei
免疫抗原 2A2B2一 C2一 D2E2—
免疫抗原 3A3B3一 C3一 D3E3—
免疫抗原 4A4B4一 C4一 D4E4—
免疫抗原 5|A5|B5|C5|D5|e5 綜上所述，本發(fā)明的方法通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測和/或選擇位于感興趣的蛋白質(zhì)表面的肽片段作為潛在表位。本發(fā)明方法可以高效、快速、低成本地獲得針對感興趣的蛋白質(zhì)的抗體，而且本發(fā)明方法可以獲得針對位于感興趣的蛋白質(zhì)天然構(gòu)象表面的表位的所有抗體。另外，本發(fā)明方法還可以通過組合篩選來確定位于感興趣的蛋白質(zhì)天然構(gòu)象表面的表位，鑒定抗體所識別的特定表位，以及進一步對所產(chǎn)生的抗體進行檢測和篩選。對于抗體應(yīng)用成功的幾個關(guān)鍵因素，包括抗體的識別位點(表位)，親和力以及特異性。對于單克隆抗體，在不知道表位的情況下，得到的抗體往往集中于某個免疫原性優(yōu)勢表位，表位的單一性，會導(dǎo)致抗體應(yīng)用不成功，主要與該表位的位置有關(guān)。明確知道抗體識別的表位，優(yōu)先得到多個表位的抗體，會降低表位位置不正確的影響，大大提供細胞株應(yīng)用的成功率。本發(fā)明的優(yōu)勢在于對于大樣本抗體制備，本方法具有成功率高(> 90%以上蛋白能夠得到Western應(yīng)用成功抗體)，成本低的特點。對于高同源性蛋白質(zhì)，受體蛋白結(jié)構(gòu)域以及小鼠本身蛋白質(zhì)均具有很高的成功率。對于小鼠自身蛋白抗體制備的意義在于，從中篩選得到的功能性抗體，可以用于小鼠動物模型的抗體治療試驗，對于臨床前研究具有重要意義。對于膜受體蛋白，采用功能性結(jié)構(gòu)域制備抗體，更有利獲得具有阻斷功能抗體，有利于抗體藥物開發(fā)，采用本發(fā)明方法構(gòu)建的抗體文庫，可以用進一步開發(fā)功能性抗體。同時高通量的表位篩選策略，保證得到的每個細胞株明確知道對應(yīng)的識別表位信息，對于研究抗體與蛋白的相互作用，以及采用多個表位抗體共同確定某種蛋白表達信息，均具有很重要意義。以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的闡述。下述實施例僅用于說明本發(fā)明，無意對本發(fā)明做出任何限制。在不脫離本發(fā)明的精神和實質(zhì)的情況下，本領(lǐng)域人員可以對本發(fā)明做出多種改動和變化，這些改動和變化同樣在本申請權(quán)利要求要求保護的范圍內(nèi)。
實施例實施例I :載體改造A、HBC載體改造的設(shè)計首先用一段設(shè)計好的多克隆位點(MCSGGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCTTCCATATGGAATTC(SEQ ID NO :1))來替換乙肝病毒核衣殼蛋白(HBc) cDNA 的 c/el 環(huán)，即編碼HBc蛋白第76-82位氨基酸的核苷酸。所述MCS的示意圖與序列詳見圖I。然后，將所述MCS的兩端連接編碼L-N和L-C兩個接頭的核苷酸序列并替換編碼HBc蛋白第76-82位氨基酸的核苷酸，其中L-N和L-C兩個接頭兩端的E代表谷氨酸，G代表甘氨酸，S代表絲氨酸。隨后，將編碼6XHis標(biāo)簽(HHHHHH)、P-gal (MTMITDSL)、接頭(EFH)等序列元件的核苷酸序列添加到此cDNA之前，改造后的HBc核苷酸序列如圖2所示。B、全基因合成用 DNA Works 軟件(得自 http: //helixweb. nih. gov/dnaworks/)通過密碼子優(yōu)化設(shè)計HBc核苷酸序列，如下所示CCATGGGCAGCAGCCACCATCATCACCACCACATGACCATGATCACCGATAGCCTGGAGTTCCATATCGATCCGTACAAGGAATTTGGCGCGACCGTGGAACTGCTGAGCTTCCTGCCGAGCGACTTTTTTCCAAGCGTGCGTGACCTGCTGGATACGGCGAGCGCACTGTATCGTGAAGCGCTGGAAAGCCCGGAACATTGCAGCCCGCATCATACCGCGCTGCGTCAGGCGATTCTGTGCTGGGGCGAACTGATGACCCTGGCGACCTGGGTGGGCGGCAATGAAGAAGGTGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCTTCCATATGGAATTCGGTGGCGGCGGCAGCGGCGGTGGTGGCAGCGAAGAAGACCTGGTTGTGAGCTATGTGAACACCAATATGGGCCTGAAGTTTCGTCAGCTGCTGTGGTTTCATATTAGCTGCCTGACCTTTGGCCGCGAAACCGTGATTGAATACCTGGTGAGCTTTGGCGTGTGGATTCGTACCCCACCGGCGTATCGTCCGCCGAATGCGCCAATTCTGAGCACCCTGCCGGAAACGACCGTTTAAGAGCTCCG TCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAG(SEQ ID NO 2)優(yōu)化的HBC核苷酸序列利用下表2所示的引物序列合成，所示引物序列由賽百盛(中國上海)公司合成。表2全基因合成引物序列
權(quán)利要求
1.一種制備針對感興趣的蛋白質(zhì)的抗體的方法，包括 (a)預(yù)測和/或選擇位于感興趣的蛋白質(zhì)表面的肽片段； (b)合成或表達一或多個所述肽片段； (C)利用步驟(b)的產(chǎn)物免疫動物，任選組合佐劑進行免疫； (d)用來自步驟(C)的經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞來獲得抗體； (e)用步驟(a)的肽片段和/或天然構(gòu)象的所述感興趣的蛋白質(zhì)來篩選步驟(d)中所獲得的抗體，得到針對所述感興趣的蛋白質(zhì)的抗體庫。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述感興趣的蛋白質(zhì)是天然蛋白質(zhì)、和/或其選擇性剪接的同種型、和/或其突變型。
3.權(quán)利要求2的方法，其中步驟(a)中所述肽片段是感興趣的蛋白質(zhì)的線性表面身份肽和/或構(gòu)象型表面身份結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述步驟(a)的肽片段是通過如下方法預(yù)測或選擇的 (i)根據(jù)感興趣的蛋白質(zhì)的序列，通過計算如下參數(shù)來確定表面肽，所述參數(shù)選自 溶劑可接近性、無序指數(shù)、蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域預(yù)測、或以上任意組合； ( )將步驟(a)所確定的表面肽與感興趣的蛋白質(zhì)來源物種的蛋白質(zhì)組進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質(zhì)的特異性肽片段； (iii)將步驟(a)所確定的表面肽與其他物種的同源蛋白質(zhì)進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質(zhì)的保守序列。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述身份肽是長度為5-20個氨基酸、高親水性、高抗原性、非信號肽、非跨膜區(qū)以及位于無序區(qū)域的肽。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述身份結(jié)構(gòu)域是長度為100-500個氨基酸、預(yù)期具有3維結(jié)構(gòu)的序列特異性蛋白質(zhì)片段。
7.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其針對一個物種所有的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生抗體庫。
8.權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中步驟(e)所產(chǎn)生的抗體庫包含針對感興趣的蛋白質(zhì)的所有表位的抗體。
9.權(quán)利要求1-8任一項的方法，其中步驟(d)通過至少一種選自如下的方法而獲得抗體 (1)將來自步驟(c)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞并表達從而獲得抗體； (2)從來自步驟(c)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞中分離出抗原特異性B細胞，再利用PCR來克隆和表達抗體基因從而獲得抗體； (3)從來自步驟(c)經(jīng)免疫的動物的淋巴細胞中分離出mRNA，然后通過噬菌體展示、或者核糖體展示、或者酵母展示、或者細菌展示、或者桿狀病毒展示、或者不如細胞展示、或者mRNA展示來獲得抗體。
10.權(quán)利要求I至9任一項的方法，其中所述步驟(b)的一或多個肽片段以與增強免疫原性和/或增加拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)的融合蛋白的形式重組表達。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述增強免疫原性和/或增加拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)為病毒樣顆粒蛋白載體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述增強免疫原性和/或增加拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)為乙肝病毒核衣殼(HBC)蛋白。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述ー或多個肽片段插入到HBC蛋白的環(huán)、N端或C端。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述ー或多個肽片段插入到HBC蛋白的位置位于HBC蛋白的第77和第82位氨基酸殘基之間。
15.權(quán)利要求12-14任ー項的方法，其中通過接頭連接的2-10個肽片段插入在HBC蛋白中。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述接頭是(GGGGS)n，其中η= 1、2、3或4。
17.權(quán)利要求16的方法，其中η= I或2。
18.權(quán)利要求I至9任ー項的方法，其中所述步驟(b)表達的ー或多個肽片段進ー步與免疫增強載體蛋白偶聯(lián)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述免疫增強載體蛋白為匙孔血藍蛋白(KLH)。
20.權(quán)利要求I至9任ー項的方法，其中所述步驟(b)的一或多個肽片段是化學(xué)合成的。
21.權(quán)利要求I至20任ー項的方法，其中所使用的佐劑選自弗氏完全佐劑、鋁、CpG,或其任意組合。
22.權(quán)利要求I至21任ー項的方法，其中所述步驟(c)在多個位點免疫動物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述多位點免疫在選自以下位點的至少2個位點進行頸背部、尾根、后足掌、后側(cè)腹股溝、前腿腋窩、后腿肌肉。
24.權(quán)利要求22或23的方法，其中進行多次免疫，時間間隔為2-14天，例如3_4天。
25.權(quán)利要求24的方法，其中步驟(c)中的免疫方案包含如下步驟 (A).首次免疫，在頸背部、尾根、后足掌、后側(cè)腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及弗氏完全佐劑進行免疫；并在后腿肌肉使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫； (B).第二次免疫，在頸背部、后側(cè)腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及弗氏完全佐劑進行免疫；并在后腿肌肉使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫； (C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫； (D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產(chǎn)物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫。
26.權(quán)利要求25的方法，其中在第一天進行首次免疫，在第5天進行第二次免疫，在第8天進行第三次免疫，在第11天進行第四次免疫。
27.權(quán)利要求1-27任ー項的方法，其中所產(chǎn)生的抗體為單ー的IgG亞型。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所產(chǎn)生的抗體為單克隆抗體。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所產(chǎn)生的抗體為多克隆抗體。
30.權(quán)利要求1-29任ー項的方法，其中所述步驟(e)通過親和力排序篩選步驟(d)中所獲得的抗體。
31.權(quán)利要求1-30任ー項的方法，進ー步包括篩選功能性抗體或檢測性抗體的步驟(f)。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述檢測性抗體通過Western印跡、IP、IF、IHC、流式細胞計數(shù)、ELISA或其任意組合進行篩選。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述功能性抗體通過阻斷或中和測定來篩選。
34.權(quán)利要求1-33任一項的方法，其中所述方法可以針對90%以上的感興趣的蛋白質(zhì)產(chǎn)生檢測性抗體和/或功能性抗體。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求1-34任一項的方法獲得的抗體庫。
36.權(quán)利要求35的抗體庫，其包含針對一個物種所有感興趣蛋白質(zhì)的抗體。
37.權(quán)利要求35的抗體庫，其包含針對位于一種感興趣蛋白質(zhì)的表面上的所有表位的抗體。
38.權(quán)利要求35-37任一項的抗體庫，其中所述抗體是單克隆抗體。
39.權(quán)利要求35的抗體庫，其中所述庫包括用于在Western印跡、IP、ELISA、IHC、IF或流式細胞術(shù)中檢測感興趣的蛋白質(zhì)的抗體，和/或用于中和和/或阻斷感興趣的蛋白質(zhì)的功能的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種針對感興趣的蛋白質(zhì)制備其抗體的方法，其能夠針對所有蛋白質(zhì)高效、快速、低成本地制備具有高度特異性的抗體，并且能夠明確抗體所針對的表位，進而建立起覆蓋感興趣的蛋白質(zhì)表面的表位庫以及針對所有表位的抗體庫。這些抗體證明能夠用于檢測，蛋白功能研究和抗體制藥。
文檔編號C07K16/00GK102618940SQ201110034648
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者孟遜, 汪國興, 王小清, 陳澤庸 申請人:艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司