專利名稱：連接目標(biāo)序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是多重分子擴(kuò)增步驟，它能夠?qū)⑴c擴(kuò)增有關(guān)的目標(biāo)核苷酸序列連接起來，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(多重PCR)。該方法特別有利地用于產(chǎn)生來自免疫球蛋白、T 細(xì)胞受體或者B細(xì)胞受體可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)(cognate pair)文庫(kù)以及組合文庫(kù)。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物中存在的參與免疫應(yīng)答的抗原結(jié)合蛋白是表現(xiàn)出廣泛多樣結(jié)合特異性的多克隆大集合。這種多樣性是通過編碼這些結(jié)合蛋白可變區(qū)的基因序列的重排產(chǎn)生的。 這些可變區(qū)結(jié)合蛋白包括可溶性的和膜結(jié)合形式的B細(xì)胞受體(也稱為免疫球蛋白或者抗體)以及膜結(jié)合的T細(xì)胞受體(TcR)。就免疫球蛋白而言，在抗原通過B細(xì)胞抗原受體借助被稱為親和成熟的過程(該過程涉及了這些可變基因體細(xì)胞超變的循環(huán))被識(shí)別之后，免疫球蛋白的親和性增強(qiáng)。值得注意的是，已經(jīng)對(duì)免疫球蛋白或者其片段例如Fab片段、Fv片段和單鏈 Fv(SCFV)分子進(jìn)行克隆和重組表達(dá)。但是所有其他的可變區(qū)結(jié)合蛋白原則上也可以使用與對(duì)于抗體相同的概念進(jìn)行克隆和表達(dá)。具有所需結(jié)合特異性的抗體的已知分離方式經(jīng)常涉及來自被免疫宿主的雜交瘤的制備，接下來對(duì)特異克隆進(jìn)行篩選，或者涉及在大腸桿菌中制備由免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域組成的組合表達(dá)庫(kù)，接下來使用例如噬菌體展示的技術(shù)對(duì)組合表達(dá)庫(kù)進(jìn)行富集。用于制備治療性抗體的雜交瘤技術(shù)在使用中一個(gè)主要的限制是沒有適宜作為人B 淋巴細(xì)胞融合伴侶的人淋巴瘤。異源雜交瘤(即人B細(xì)胞與小鼠淋巴瘤的融合)極為不穩(wěn)定，因此幾乎不能產(chǎn)生用于生產(chǎn)目的的適宜細(xì)胞系。通過用EB病毒感染無限增殖化的人B 細(xì)胞表現(xiàn)出類似的不穩(wěn)定性。缺乏穩(wěn)定可靠的制備用于治療的人抗體的細(xì)胞學(xué)方法可以使用分子生物學(xué)中更為最近的進(jìn)展得到補(bǔ)償。使用組合文庫(kù)和噬菌體展示可以產(chǎn)生大的抗體克隆集合，可能的多樣性超過了 IO100從這個(gè)集合中可以就與特異靶標(biāo)結(jié)合進(jìn)行篩選，這樣產(chǎn)生亞文庫(kù)?？梢允褂迷搧單膸?kù)制備多克隆或者單克隆抗體?？梢詮牧馨图?xì)胞、漿細(xì)胞、雜交瘤或者任何其他表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞群中擴(kuò)增出構(gòu)成文庫(kù)的可變區(qū)編碼序列(例如免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列)。制備組合文庫(kù)的當(dāng)前技術(shù)包括從細(xì)胞群中分別分離可變區(qū)編碼序列。這樣，例如免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的編碼序列的原始配對(duì)就會(huì)丟失。但是在組合文庫(kù)中所述的序列隨機(jī)配對(duì)，且這些可變序列的原始組合僅僅會(huì)隨機(jī)出現(xiàn)。因此，為了分離負(fù)責(zé)所需結(jié)合特異性的可變區(qū)編碼序列，需要相當(dāng)大量的篩選。這通常與表達(dá)所需特異性的克隆的富集方法，例如核糖體展示或者噬菌體展示聯(lián)合進(jìn)行。即使是這樣，所獲得的多樣性對(duì)于分離產(chǎn)生與那些在原來細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的結(jié)合蛋白具有類似高度親和性的結(jié)合蛋白的可變區(qū)編碼序列對(duì)，可能仍然不夠大。而且，通常用于篩選組合文庫(kù)的富集步驟引入了很大的偏倚性(bias)，例如偏好大腸桿菌中非常低毒性的多肽、有效的折疊、緩慢的關(guān)閉速率(off-rate)或者其他系統(tǒng)依賴的參數(shù)，這進(jìn)一步降低了文庫(kù)的多樣性。此外，來源于這種組合文庫(kù)的克隆更易于產(chǎn)生出與自身抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的結(jié)合蛋白，因?yàn)榕c原始對(duì)(此后稱為關(guān)聯(lián)對(duì)(cognate pair))相反，他們從未經(jīng)歷過體內(nèi)針對(duì)自身抗原的負(fù)選擇，對(duì)于B和T 淋巴細(xì)胞受體發(fā)育過程中的特定階段就有負(fù)選擇出現(xiàn)。因此克隆可變區(qū)編碼序列的原始配對(duì)就是合意的方法。而且，在關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)中出現(xiàn)表達(dá)所需結(jié)合特異性的克隆的頻率要比在通常的組合文庫(kù)中出現(xiàn)所需特異性的頻率高很多，特別是如果起始材料細(xì)胞來自具有高頻率編碼特異結(jié)合對(duì)的細(xì)胞的供體，如具有免疫性或者免疫后的供體。由此，關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)不需要與組合文庫(kù)具有相同的大小具有IO4到IO5個(gè)克隆的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)或者具有IO2到IO3個(gè)克隆的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)(克隆來自具有正在發(fā)生的相關(guān)免疫應(yīng)答的供體)，對(duì)于獲得代表廣泛多樣所需結(jié)合特異性的結(jié)合蛋白可能已經(jīng)足夠了。為了產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)，需要來自相同細(xì)胞的可變區(qū)編碼序列的連接。目前已對(duì)兩種不同的獲得可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)配對(duì)的方法進(jìn)行了描述。細(xì)胞內(nèi)PCR方法將一群細(xì)胞固定并且使其通透化，之后來自免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列在細(xì)胞內(nèi)連接。這一連接可以通過重疊-延伸RT-PCR(WC) 93/03151)或者重組(Chapal, N. et al. 1997 BioTechniques 23,518-524)進(jìn)行。在這些出版物中描述的擴(kuò)增過程，是由下面三個(gè)或四個(gè)步驟組成的過程i)使用恒定區(qū)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生免疫球蛋白cDNA，ii)使用含有重疊-延伸設(shè)計(jì)或者重組位點(diǎn)的引物組對(duì)重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，iii)重組連接，如果選擇了該方法的話，iv)產(chǎn)物進(jìn)行嵌套PCR產(chǎn)生克隆用的限制性位點(diǎn)。由于細(xì)胞被通透化，所以擴(kuò)增產(chǎn)物很有可能漏到細(xì)胞之外，這樣會(huì)使重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列混雜，導(dǎo)致同源配對(duì)性的喪失。因此， 該步驟包含在每一次反應(yīng)之后的漂洗步驟，使得這個(gè)過程耗費(fèi)勞動(dòng)，降低了反應(yīng)的效率。更為一般地，細(xì)胞內(nèi)PCR的效率極為低下，導(dǎo)致低的敏感性。因此細(xì)胞內(nèi)PCR連接技術(shù)從未有過廣泛的使用，而且原始研究實(shí)際上從未以能夠被用于證實(shí)在細(xì)胞內(nèi)連接的確存在的方式被可靠地重復(fù)出來。但是這對(duì)于避免重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列的混雜以及由此引起的關(guān)聯(lián)對(duì)的破壞來講是至關(guān)重要的。在WO 01/92291中描述了不同的細(xì)胞內(nèi)方法。該方法基于RNA反式拼接，在細(xì)胞內(nèi)獲得Vh和\編碼mRNA的連接。該方法需要驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)反式拼接的DNA構(gòu)建體。單細(xì)胞PCR是一種獲得重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)配對(duì)的不同方法 (參見例如 Coronella，J. A. et al. 2000Nucleic Acids Res. 28,E85 ；Wang, X. , et al. 2000 J. Immunol. Methods 20, 217-225) 在這些出版物中，通過使細(xì)胞的密度稀釋至每個(gè)反應(yīng)1 個(gè)細(xì)胞，來分散一群表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞，從而避免了克隆過程中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列的混雜。基本上該過程被描述為由三到四個(gè)步驟組成的過程i)使用寡聚dT 引物、隨機(jī)六聚引物或者恒定區(qū)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，ii)將cDNA產(chǎn)物分級(jí)進(jìn)入幾個(gè)管，使用含有用于克隆的限制性位點(diǎn)的引物組對(duì)各自的可變鏈編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(在分開的管中)，iii)產(chǎn)物進(jìn)行嵌套PCR產(chǎn)生用于克隆的限制性位點(diǎn)(可選擇)以及iv)通過克隆到適宜的載體中將不同管中的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列連接起來，這本身是一個(gè)多步驟的過程。人類有兩種類型的輕鏈λ和K。這表明對(duì)于每個(gè)單一細(xì)胞產(chǎn)生的cDNA，必須進(jìn)行至少三個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，之后進(jìn)行分析并將適宜的片段克隆到單個(gè)載體中得到關(guān)聯(lián)配對(duì)。這樣所描述的單細(xì)胞PCR需要大量的操作以產(chǎn)生關(guān)聯(lián)配對(duì)文庫(kù)。盡管為了獲得代表所需廣泛多樣結(jié)合特異性的結(jié)合蛋白，關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)不需要與組合文庫(kù)具有相同的大小，但是用所描述的單細(xì)胞PCR方法制備一個(gè)具有如IO4到IO5個(gè)克隆的文庫(kù)還是一項(xiàng)耗費(fèi)勞動(dòng)的任務(wù)。而且大量的操作大大增加了污染和人為錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。為了獲得與在免疫應(yīng)答中通常觀察到的親和性相當(dāng)?shù)母叨扔H和的結(jié)合蛋白，可變區(qū)序列的關(guān)聯(lián)配對(duì)與它們的擴(kuò)增相聯(lián)合是非常有利的。為了制備具有大量多樣性的文庫(kù)， 需要有一種可以適合于進(jìn)行高通量形式的且污染和混雜的風(fēng)險(xiǎn)最小的克隆技術(shù)。同樣需要降低克隆的步驟，以制備適合于高通量的形式的組合文庫(kù)。成果公開本發(fā)明提供了使用多重分子擴(kuò)增步驟，例如多重重疊-延伸RT-PCR或者多重 RT-PCR之后通過連接方法或者重組方法連接，來連接兩個(gè)或者更多目標(biāo)核苷酸序列如可變區(qū)編碼序列的有效方法。該方法適用于在單一細(xì)胞上進(jìn)行，這樣使關(guān)聯(lián)對(duì)的克隆以高通量的方式進(jìn)行。附圖描述

圖1列舉了不同類型的重疊-延伸尾巴(tail)。粗線條對(duì)應(yīng)的是引物中基因特異的部分，常規(guī)的線條對(duì)應(yīng)的是重疊的尾巴。豎直線條表示了互補(bǔ)區(qū)域。引物有助于兩個(gè)目標(biāo)核苷酸序列的連接。圖I(I)顯示的是類型I的兩種重疊-延伸尾巴，其中只有延伸尾巴完全或者部分地重疊；圖I(II)顯示了類型II的重疊-延伸尾巴，其中第一個(gè)引物延伸尾巴的5'核苷酸與相鄰引物的基因特異部分互補(bǔ)；圖1 (III)顯示了類型III重疊-延伸尾巴，其中整個(gè)的重疊-延伸尾巴都與相鄰引物的基因特異區(qū)域互補(bǔ)。圖2是一幅示意圖，圖示了用于連接免疫球蛋白可變區(qū)編碼序列的多重重疊_延伸引物混合物的概況。用管狀結(jié)構(gòu)表示了待連接的編碼輕鏈(LC)和重鏈可變區(qū)(Vh)的 cDNA，并且表明了它們有義鏈的5'和3'端以及擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小。用于擴(kuò)增編碼序列的多重重疊-延伸引物組用箭頭指示。具有虛線5'凸出的彎曲的箭尾表示了克隆尾巴。 重疊-延伸尾巴用粗體表示。尾巴中的限制性位點(diǎn)與尾巴一同命名。多重重疊-延伸引物混合物中的引物總數(shù)是16，分布如下外引物包含一個(gè)Ck和一個(gè)Chi引物，重疊-延伸引物包含6個(gè)八和8個(gè)Vh引物。Cm弓丨物在重鏈恒定結(jié)構(gòu)域1的5'端退火。多重重疊-延伸RT-PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物預(yù)計(jì)大約1070bp，由整個(gè)κ輕鏈(由恒定區(qū)、連接基因和可變基因 (CK+JL+VL)構(gòu)成)和重鏈可變區(qū)(由可變基因、多樣性片段和連接基因(Vh+D+Jh)構(gòu)成)構(gòu)成。5'和3'表明了開放閱讀框的方向。只有一小部分的Cm區(qū)域編碼序列被這個(gè)多重重疊_延伸引物混合物擴(kuò)增，因?yàn)镃hi引物的退火位置靠近重鏈的J-區(qū)域。圖3是一系列的圖片，顯示了可獲得的產(chǎn)物的不同連接方向，取決于連接尾巴上裝配了何種引物。實(shí)心黑塊表示了重疊區(qū)域。5'和3'表明了開放閱讀框的方向。圖3A 表示了產(chǎn)物的頭對(duì)頭定向。圖3B表示了尾對(duì)尾的定向。圖3C表示了頭對(duì)尾的定向，前面是輕鏈編碼序列。圖3D表示了頭對(duì)尾的定向，前面是重鏈編碼序列。圖4示意了免疫球蛋白表達(dá)載體pLL113，其中編碼序列是頭對(duì)尾的定向。載體包含以下元件bla =使氨芐青霉素抗性基因表達(dá)的啟動(dòng)子；Amp =編碼氨芐青霉素抗性的基因；pUC ori = pUC復(fù)制起點(diǎn)；AdMLP =腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；Human IgGl =編碼免疫球蛋白同型Gl重鏈的序列；hGH pA =人生長(zhǎng)激素polyA信號(hào)序列；bGH polyA =牛生長(zhǎng)激素polyA序列。Human Kappa LC =編碼免疫球蛋白κ輕鏈的序列。FRT = Flp識(shí)別靶標(biāo)位點(diǎn)。Hygromycin =編碼潮霉素抗性的基因。SV40 polyA =猿猴病毒40 polyA信號(hào)序列。圖5A是一個(gè)電泳凝膠，顯示了兩步多重重疊-延伸RT-PCR之后進(jìn)行半嵌套PCR的結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物來自從單一 CHO Flp-In pLL113細(xì)胞中分離的cDNA。泳道1_12是樣品泳道，箭頭表明了 1076bp的正確的嵌套多重重疊-延伸RT-PCR產(chǎn)物；Ml是IOObp的梯度。W 是用作陰性對(duì)照模板的水。C是來自細(xì)胞系HB-8501的陽(yáng)性cDNA對(duì)照模板。在另一張圖中描繪了相同的泳道的W、C和IOObpDNA梯度，對(duì)比較小，目的是解析出單個(gè)的DNA片段。圖 5B是圖5A中凝膠的草圖，表明了凝膠上的相關(guān)片段。圖6是一系列的電泳凝膠的照片和圖片，表示了沒有額外PCR擴(kuò)增的單步多重重疊-延伸RT-PCR反應(yīng)結(jié)果。在每一幅圖中Ml是IOObp的梯度，M2是500bp的梯度。圖6A 是電泳凝膠，顯示了來自對(duì)應(yīng)于100、10、1或者0個(gè)細(xì)胞的裂解物的擴(kuò)增產(chǎn)物。箭頭指示重疊-延伸產(chǎn)物。圖6B是對(duì)圖6A中凝膠的草圖描繪。圖6C是電泳凝膠，證實(shí)了在圖6A的 100個(gè)和1個(gè)細(xì)胞的泳道中存在重疊-延伸產(chǎn)物。圖6D是電泳凝膠，顯示了使用NheI和 NcoI的限制性酶分別切割圖6C中1個(gè)細(xì)胞的泳道中的重疊-延伸產(chǎn)物。圖7是電泳凝膠，顯示了單步多重重疊-延伸RT-PCR之后進(jìn)行半嵌套PCR擴(kuò)增的結(jié)果。Ml是IOObp的梯度，M2是500bp的梯度。多重重疊-延伸引物混合物中含有Chi，Ch2， Ch3，Ch4或者Ch5作為多重重疊-延伸RT-PCR反應(yīng)中的外引物。使用對(duì)應(yīng)于100、10、1或者 0個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞裂解物進(jìn)行反應(yīng)。重疊-延伸產(chǎn)物的大小用箭頭表明。圖8是電泳凝膠，顯示了單步多重重疊-延伸RT-PCR之后進(jìn)行半嵌套PCR擴(kuò)增的結(jié)果，使用了富集的人B淋巴細(xì)胞作為模板。Ml是IOObp的梯度。泳道5和6顯示了重疊-延伸產(chǎn)物預(yù)期大小的條帶。圖9A是一幅示意圖，顯示了用于制備表達(dá)IgGl-的細(xì)胞系的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 (Em465/01P582/Em465/01P581)，其中編碼序列是頭對(duì)頭的定向。載體包含以下元件Amp =編碼氨芐青霉素抗性的基因；PUC ori = pUC復(fù)制起點(diǎn)；AdMLP =腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；EFP=延伸因子啟動(dòng)子；AP leader=堿性磷酸酶前導(dǎo)序列；VH =重鏈可變區(qū)編碼序列； IgGl HC =編碼免疫球蛋白同型Gl重鏈恒定區(qū)的序列；rBGpolyA =家兔β球蛋白polyA 信號(hào)序列；bGH polyA =牛生長(zhǎng)激素polyA序列；IgK leader =編碼小鼠κ前導(dǎo)序列的序列；IgL(lb或者lc)=編碼免疫球蛋白λ輕鏈家族Ib或者Ic的序列；FRT = Flp識(shí)別靶標(biāo)位點(diǎn)；Hygromycin =編碼潮霉素抗性的基因；SV40 polyA =猿猴病毒40 polyA信號(hào)序列。 圖9B和9C是溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠，分別使用來自細(xì)胞系CHO Flp-In/Em464/01P581 和CH0Flp-In/Em464/01P582的PCR產(chǎn)物上樣。泳道1到4對(duì)應(yīng)于分別使用總RNA模板濃度為50pg, 5pg，0. 5pg或者Opg進(jìn)行多重重疊-延伸RT-PCR反應(yīng)。M是IOObp的梯度(New England Biolabs，NewEngland，USA)。箭頭表示了重疊-延伸 PCR 產(chǎn)物。圖10是一個(gè)流程圖，表示了所用的步驟，目的是產(chǎn)生關(guān)聯(lián)抗體表達(dá)文庫(kù)，可以從該表達(dá)文庫(kù)中表達(dá)單克隆或者多克隆抗體。圖11是大腸桿菌載體JSK301的示意圖，該載體用于通過在載體上所示的NotI/ XhoI限制性位點(diǎn)處插入包含關(guān)聯(lián)可變區(qū)編碼序列的重疊-延伸片段，制備Fab載體文庫(kù)。 載體包含以下的元件Amp and Amp pro =氨芐青霉素抗性基因及其啟動(dòng)子；pUC19 Ori = 復(fù)制起點(diǎn)；Human CHl =編碼人免疫球蛋白 1重鏈結(jié)構(gòu)域1的序列；StufTer =無關(guān)的序列插入物，在重疊-延伸片段插入 后被切除。tac P and lac Z =細(xì)菌啟動(dòng)子，可以在NheI 和AscI限制性位點(diǎn)處被切除。圖12是一幅示意圖，顯示了關(guān)聯(lián)Fab表達(dá)載體文庫(kù)的制備。步驟I顯示了通過XhoI-NotI消化將可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)(VH1-VL1到VHx-VLx)插入大腸桿菌JSK301 載體中。步驟II顯示了通過AscI-NheI消化將細(xì)菌啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列盒(pelB前導(dǎo)序列-Ptac-啟動(dòng)子，引導(dǎo)VHx的表達(dá)，以及P Iac啟動(dòng)子-pelB前導(dǎo)序列，引導(dǎo)VLx的表達(dá)) 插入。圖13顯示了使用單步多重重疊_延伸RT-PCR以及之后的額外PCR擴(kuò)增使組成G 蛋白的α、β和Y亞基連接。給出了每個(gè)編碼區(qū)域以及連接產(chǎn)物的大小。在擴(kuò)增中通過引物尾巴引入的限制位點(diǎn)在終產(chǎn)物中予以表明。圖14顯示了對(duì)㈧從供體血液中純化的PBMC、⑶磁性分選的非標(biāo)記⑶19陰性細(xì)胞級(jí)分以及(C)磁性分選的CD19+細(xì)胞級(jí)分的分析性FACS染色的點(diǎn)狀圖。對(duì)于每一個(gè)級(jí)分顯示了一個(gè)散射(scatter)圖線、一個(gè)⑶19/⑶38圖線和一個(gè)⑶38/⑶45圖線。圖15顯示了圖9C的⑶19+級(jí)分，它曾經(jīng)儲(chǔ)存于液氮中，融化并且使用抗⑶19、抗 ⑶38和抗⑶45進(jìn)行染色。顯示了對(duì)應(yīng)于圖9C的點(diǎn)圖線。圖16顯示了用于分選⑶19+細(xì)胞級(jí)分的閾值(gate)。使用了基于⑶38和⑶45 的散射閾值和熒光閾值分離CD38high(CD38hi)和CD45intermediate (CD45in)細(xì)胞。圖17是電泳凝膠，顯示了對(duì)供體TT03進(jìn)行成功的多重重疊-延伸RT-PCR反應(yīng) (行A，8個(gè)96孔板上的孔1-12)。樣品已經(jīng)上樣于瓊脂糖凝膠的兩行(A和B)中，每一行 48個(gè)樣品。重疊-延伸片段的預(yù)期大小是大約1070bp。用箭頭標(biāo)記出推測(cè)的重疊-延伸片段。圖18顯示了來自平板G060的周質(zhì)提取物的ELISA分析。使用山羊(gt)抗人κ 包被ELISA板，被捕獲的Fab片段使用HRP偶聯(lián)的山羊抗人Fab特異的抗體進(jìn)行檢測(cè)。圖19顯示了來自平板G060的周質(zhì)提取物的ELISA分析。使用10ug/ml卵清蛋白 (SigmaA-5503)包被ELISA板，被捕獲的Fab片段使用HRP偶聯(lián)的山羊抗人Fab特異的抗體進(jìn)行檢測(cè)。圖20顯示了來自平板G060的周質(zhì)提取物的ELISA分析。使用破傷風(fēng)類毒素包被 ELISA板，被捕獲的Fab片段使用HRP偶聯(lián)的山羊抗人Fab特異的抗體進(jìn)行檢測(cè)。圖21顯示了來自平板G060的周質(zhì)提取物的一步競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析。ELISA板使用破傷風(fēng)類毒素(TT)包被，在每一個(gè)孔中加入10_7M的可溶性TT，目的是與細(xì)菌上清中的Fab 片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固定化的TT。被捕獲的Fab片段用HRP偶聯(lián)的山羊抗人Fab特異的抗體進(jìn)行檢測(cè)。圖22顯示了來自G060板的TT抗原結(jié)合克隆的可變重鏈蛋白序列的序列比對(duì)。用不同的陰影代表不同程度的序列同源性100%、80%和60%被分別用黑色、灰色和淺灰色表示。⑶Rl位于比對(duì)位置的34到41。⑶R2位于比對(duì)位置的55到73。⑶R3位于比對(duì)位置的107到127。早熟終止密碼子用星號(hào)表示。比對(duì)分成8幅不同的圖(a_h)，從左至右排列成兩排。上面一排是圖22a到d，下面一排是圖22e到h。圖23顯示了來自G060平板的TT抗原結(jié)合克隆的可變輕鏈蛋白序列的序列比對(duì)。 用不同的陰影代表不同程度的序列同源性100%、80%和60%被分別用黑色、灰色和淺灰色表示。⑶Rl位于比對(duì)位置的沈到42。⑶R2位于比對(duì)位置的58到64。⑶R3位于比對(duì)位置的97到106。早熟終止密碼子用星號(hào)表示。比對(duì)分成8幅不同的圖(a-h)，從左至右排列成兩排。上面一排是圖23a到d，下面一排是圖23e到h。圖24顯示了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，測(cè)定了從平板G060中選出的克隆的表觀親和性。濃度從IOOnM到25pM的可溶性TT稀釋液(四倍稀釋)加入到Fab片段中，這樣與Fab片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固定化TT。在給定可溶性TT濃度下觀察到的結(jié)合與沒有向反應(yīng)中加入可溶性TT 時(shí)觀察到的結(jié)合之比作為反應(yīng)的程度。圖25顯示了雙系統(tǒng)發(fā)生點(diǎn)矩陣圖線，顯示了抗體重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列之間的基因內(nèi)和基因間的關(guān)系。V1^nt的系統(tǒng)發(fā)生樹在點(diǎn)矩陣中配對(duì)，以顯示特定V基因的實(shí)際配對(duì)。A)使用噬菌體展示從組合文庫(kù)中得到的TT結(jié)合克隆。B)使用本發(fā)明從關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)中得到的TT結(jié)合克隆。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供兩個(gè)或者更多不相鄰目標(biāo)核苷酸序列的擴(kuò)增和連接方法，使這種序列的克隆適合于高通量的模式。這主要通過降低擴(kuò)增和連接待克隆的序列所需要的步驟的數(shù)目來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的一個(gè)方面是連接多個(gè)不相鄰的核苷酸序列的方法，包含在多重分子擴(kuò)增步驟中，使用來自分離的單個(gè)細(xì)胞、等基因細(xì)胞群或者具有遺傳多樣性的細(xì)胞群的模板擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列并實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增出的序列的隨后連接。如果模板是分離的單個(gè)細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群，連接產(chǎn)生的核酸片段包含以關(guān)聯(lián)方式互相連接的目標(biāo)核苷酸序列。如果模板是具有遺傳多樣性的細(xì)胞群，連接產(chǎn)生了片段文庫(kù)，其中每一個(gè)片段包含隨機(jī)連接的目標(biāo)核酸序列。這也被稱為組合文庫(kù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這個(gè)多重分子擴(kuò)增步驟是多重PCR擴(kuò)增，優(yōu)選地先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和連接在單一步驟中進(jìn)行，使用多重重疊-延伸RT-PCR或者分成兩步進(jìn)行，使用多重RT-PCR，之后通過連接方法或者重組方法連接。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及的是包含連接的可變區(qū)編碼序列，特別是重鏈可變區(qū)和輕鏈的編碼序列或者T細(xì)胞受體(TcR) α鏈和β鏈編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的制備。該過程涉及從至少一個(gè)適宜的供體獲得含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分，可選地從這個(gè)級(jí)分中富集某一個(gè)淋巴細(xì)胞群，例如B淋巴細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞，這取決于是需要來自免疫球蛋白還是來自TcR的可變區(qū)編碼序列。含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分或者富集后的細(xì)胞級(jí)分分配到一系列容器中，每一個(gè)容器中一個(gè)細(xì)胞。對(duì)該一系列單細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟或者其它c(diǎn)DNA 制備步驟，使用來自單細(xì)胞群的核酸作為模板。RT步驟之后是多重分子擴(kuò)增步驟以及根據(jù)本發(fā)明的一種方法從每一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的可變區(qū)編碼序列對(duì)的連接。本發(fā)明公開的克隆技術(shù)省略了費(fèi)力和低效的克隆過程，而且降低了在多次克隆步驟中污染和多樣性丟失的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及的是通過多重分子擴(kuò)增以及連接過程產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)?？梢詫?duì)使用本發(fā)明的方法制備的關(guān)聯(lián)對(duì)的起始文庫(kù)(親本文庫(kù))進(jìn)行篩選，這樣產(chǎn)生了編碼靶標(biāo)特異性結(jié)合蛋白可變結(jié)構(gòu)域或者全長(zhǎng)結(jié)合蛋白的關(guān)聯(lián)對(duì)的亞文庫(kù)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的文庫(kù)和亞文庫(kù)可以在重組單克隆或者多克隆蛋白的表達(dá)中使用，其中存在于供體中的原始結(jié)合親和性和特異性被保留下來。定義術(shù)語“關(guān)聯(lián)對(duì)”描述的是包含在單個(gè)細(xì)胞中或者來自單個(gè)細(xì)胞的非相鄰目標(biāo)核酸的原始配對(duì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，關(guān)聯(lián)對(duì)包含兩個(gè)可變區(qū)編碼序列，這兩個(gè)序列共同編碼一個(gè)結(jié)合蛋白可變結(jié)構(gòu)域，所述基因序列來自同一個(gè)細(xì)胞。這樣，當(dāng)作為完整的結(jié)合蛋白或者作為其穩(wěn)定片段表達(dá)時(shí)，它們保持了原來從這個(gè)細(xì)胞表達(dá)的結(jié)合蛋白的結(jié)合親和性和特異性。關(guān)聯(lián)對(duì)可以例如包含抗體可變重鏈編碼序列與來自同一個(gè)細(xì)胞的可變輕鏈編碼序列，或者T細(xì)胞受體的α鏈編碼序列與來自同一個(gè)細(xì)胞的β鏈編碼序列。關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)是這種關(guān)聯(lián)對(duì)的集合。術(shù)語“熱起始聚合酶”描述的是在用于逆轉(zhuǎn)錄的溫度下無活性或者具有非常低活性的聚合酶。這種聚合酶需要通過高溫(90到95攝氏度)激活才能有功能。這對(duì)于單步 RT-PCR步驟而言是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@阻止了聚合酶對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的干擾。術(shù)語“等基因細(xì)胞群”描述的是遺傳上相同的細(xì)胞群。特別地，通過對(duì)分離的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)充得到的等基因細(xì)胞群是本發(fā)明感興趣的。術(shù)語“分離的單個(gè)細(xì)胞”描述的是已經(jīng)在物理上與細(xì)胞群分開的細(xì)胞，對(duì)應(yīng)于“單一容器中的單個(gè)細(xì)胞”。當(dāng)在多個(gè)容器中逐個(gè)分散一群細(xì)胞時(shí)，得到的就是一群分離的單個(gè)細(xì)胞。正如在標(biāo)題為“模板來源”部分中所說明的，容器與單個(gè)細(xì)胞的比例不一定要達(dá)到 100%才能稱之為單細(xì)胞群，來自與擴(kuò)增相關(guān)的“連接”的術(shù)語描述了擴(kuò)增后的編碼目標(biāo)核酸序列的核酸序列連接成單一片段的過程。與關(guān)聯(lián)對(duì)相關(guān)，片段包含來自相同細(xì)胞的編碼可變結(jié)構(gòu)域的核酸序列，例如抗體重鏈可變區(qū)與抗體輕鏈可變區(qū)的編碼序列。連接可以與擴(kuò)增一起進(jìn)行或者在擴(kuò)增之后立即進(jìn)行連接步驟。對(duì)于片段的形式或者功能性沒有要求，它可以是線性的、環(huán)形的、單鏈或者雙鏈的。連接也不一定是永久的，如果需要的話，可以從片段中分離出目標(biāo)核酸序列中的一個(gè)，例如可以從關(guān)聯(lián)對(duì)片段中分離出一個(gè)可變區(qū)編碼序列。但是只要組成關(guān)聯(lián)對(duì)的原始可變區(qū)沒有混雜有其他可變區(qū)，它們就仍然被當(dāng)做是關(guān)聯(lián)對(duì)，盡管它們沒有一起連接成為一個(gè)單一片段。連接優(yōu)選是核苷酸磷酸二酯鍵連接。但是也可以通過不同的化學(xué)交聯(lián)步驟得到連接。術(shù)語“多重分子擴(kuò)增”描述的是在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或者更多靶標(biāo)序列。適宜的擴(kuò)增方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) (U. S. 4，683，202)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)， (ffu and Wallace, 1989, Genomics 4，560-9)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)技術(shù)(Walker et al.， 1992，Nucl. Acids Res. 20，1691-6)，自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(Guatelli et al. , 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α.，87，1874-8)以及基于核酸的序列擴(kuò)增(NASBA) (Compton J.，1991， Nature 350，91_2)。后兩種擴(kuò)增方法涉及基于等溫轉(zhuǎn)錄的等溫反應(yīng)，產(chǎn)生單鏈RNA (ssRNA) 和雙鏈 DNA (dsDNA)。術(shù)語“多重PCR”描述了一種PCR的變體，其中兩個(gè)或者更多的靶標(biāo)序列通過在同一個(gè)反應(yīng)中包括一組以上的引物而被同時(shí)擴(kuò)增，例如一組引物適用于擴(kuò)增重鏈可變區(qū)而另一組引物適用于在同一個(gè)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增κ鏈可變區(qū)。此外還可以用適用于λ鏈可變區(qū)擴(kuò)增的引物組與這些引物組聯(lián)合。術(shù)語“多重RT-PCR”描述了多重PCR反應(yīng)，在這個(gè)反應(yīng)之前是逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟。
12多重RT-PCR可以用兩步過程進(jìn)行，在多重PCR之前有一個(gè)獨(dú)立的RT步驟，或者以一步過程進(jìn)行，其中用于RT和多重PCR的所有組分混和在一個(gè)試管中。術(shù)語“多重重疊-延伸PCR”以及“多重重疊-延伸RT-PCR”意味著使用多重重疊-延伸引物混合物進(jìn)行多重PCR或者多重RT-PCR以擴(kuò)增靶標(biāo)序列，這樣使靶標(biāo)序列的擴(kuò)增和連接同時(shí)進(jìn)行。術(shù)語“多個(gè)容器”描述了使單個(gè)細(xì)胞與細(xì)胞群物理分離的任何物體(或者物體的集合)。這可以是試管、多孔板(例如96孔、384孔、微量滴定板或者其他多孔板)、陣列、微陣列、微芯片、凝膠或者凝膠基質(zhì)。優(yōu)選地，所述物體適宜于PCR擴(kuò)增。如這里所使用的，術(shù)語“多克隆蛋白”或者“多克隆性”指的是蛋白質(zhì)組合物，包含不同的但是同源的蛋白質(zhì)分子，優(yōu)選地選自免疫球蛋白超家族。因此，每一個(gè)蛋白質(zhì)分子與組合物中的其他分子都是同源的，但是還含有一個(gè)或者更多的可變多肽序列片段，其特征為多克隆蛋白質(zhì)各成員之間氨基酸序列的差異。這種多克隆蛋白質(zhì)的已知示例包括抗體或者免疫球蛋白分子、T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體。多克隆蛋白質(zhì)可以由確定的蛋白質(zhì)分子亞組組成，其由共同的特征(例如對(duì)于所需的靶標(biāo)具有共同的結(jié)合活性)確定，例如對(duì)所需靶標(biāo)抗原表現(xiàn)出結(jié)合特異性的多克隆抗體。正如在這里所使用的，術(shù)語“遺傳多樣的細(xì)胞群”指的是細(xì)胞群，該細(xì)胞群中單個(gè)細(xì)胞在基因組水平上互不相同。這種遺傳多樣性的細(xì)胞群是例如來自供體的細(xì)胞群或者這種細(xì)胞的級(jí)分(例如含有B淋巴細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分)。術(shù)語“引物組”與術(shù)語“引物對(duì)”可以互換使用，它描述的是兩個(gè)或者更多引物，這些引物一起能夠起動(dòng)目標(biāo)核苷酸序列(即關(guān)聯(lián)對(duì)的一個(gè)成員)的擴(kuò)增。可以設(shè)計(jì)本發(fā)明的引物組使其起動(dòng)含有可變區(qū)編碼序列的核苷酸序列家族的擴(kuò)增。不同家族的示例有抗體κ 輕鏈、λ輕鏈、重鏈可變區(qū)以及α、β、Y或者δ T細(xì)胞受體可變區(qū)。用于含有可變區(qū)編碼序列的核苷酸序列家族擴(kuò)增的引物組通常包含多個(gè)引物，其中一些引物可以是簡(jiǎn)并引物。術(shù)語“序列一致性”表示為百分比，它表明了兩個(gè)序列中就最短序列的長(zhǎng)度而言核酸序列一致性的程度。它可以計(jì)算如下(Nref-Ndif) X 100/Nrrf，其中Nrrf是較短序列中的殘基數(shù)目，^lif是兩個(gè)序列之間按照Nref的長(zhǎng)度進(jìn)行最佳比對(duì)匹配后不相同殘基的總數(shù)。因此， DNA 序列 AGTCAGTC 和序列 TA A TCA A TCGG(Ndif = 2 且 Nref = 8)的序列一致性是 75 % (下劃線顯示了最佳的比對(duì)，斜體表示8個(gè)殘基中有兩個(gè)不相同的殘基)。在提到連接時(shí)，術(shù)語“隨機(jī)地”或者“隨機(jī)的，，指的是并非來自同一個(gè)細(xì)胞但是在遺傳多樣的細(xì)胞群中橫向連接的核苷酸序列的連接。如果目標(biāo)核苷酸序列是可變區(qū)編碼序列，這會(huì)產(chǎn)生連接序列的組合文庫(kù)。另一方面，如果目標(biāo)核苷酸序列編碼非多樣性雜聚蛋白，則隨機(jī)連接的序列看起來類似于來自單個(gè)細(xì)胞的連接的序列。就逆轉(zhuǎn)錄而言，術(shù)語“來自分離的單個(gè)細(xì)胞的模板”指的是這種分離的細(xì)胞內(nèi)的核酸。核酸可以例如是RNA、mRNA、DNA或者基因組DNA的形式。核酸可以從細(xì)胞中分離出來或者仍然與細(xì)胞的其他物質(zhì)在一起，細(xì)胞是完整無缺的形式或者是裂解的形式。擴(kuò)增和連接方法本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是使用了一種變異的PCR降低了擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列所需的試管的數(shù)目，在這種變異的PCR中，通過在同一個(gè)反應(yīng)中包含一組以上的引物(例如擴(kuò)增可變區(qū)域編碼序列所需的所有引物)，兩個(gè)或者更多的靶標(biāo)序列在同一個(gè)試管中被同時(shí)擴(kuò)增。一般地，這種方法被稱為多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(多重PCR)。 多重PCR擴(kuò)增以及逆轉(zhuǎn)錄和隨后的多重PCR(多重RT-PCR)是診斷領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，如用于DNA突變、刪除以及多態(tài)性分析，用于mRNA水平的定量測(cè)定以及鑒定病毒、 細(xì)菌和寄生蟲(綜述參見Markoulatos，P. et al. 2002. J. Clin. Lab. Anal. 16，47-51)。但是使用由四個(gè)以上的引物(包含Vk和/或乂；^引物組以及Vh引物組)組成的多重引物混合物在同一個(gè)容器中擴(kuò)增免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)編碼序列和免疫球蛋白重鏈可變區(qū)編碼序列，只有非常少的實(shí)例(Chapal, N. et al. 1997. BioTechniques 23,518-524. ；Liu, A. H. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89，7610—7614 ；Embleton, Μ. J. et al. 1992. Nucleic Acids Res. 20，3831-3837)。原因可能是適用于抗原結(jié)合蛋白可變結(jié)構(gòu)域編碼序列擴(kuò)增的引物對(duì)一般包含多個(gè)簡(jiǎn)并引物，目的是捕獲這些可變區(qū)編碼序列的多樣性。這樣，在對(duì)可變區(qū)編碼序列進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)的復(fù)雜性大大增加了。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是由多重PCR擴(kuò)增的兩個(gè)或者更多靶標(biāo)序列在擴(kuò)增過程后馬上連接。特別地，可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)由這個(gè)過程連接。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案利用了多重引物混合物可以設(shè)計(jì)成在重疊_延伸PCR步驟中起作用這個(gè)特點(diǎn)，使目標(biāo)核苷酸序列被同時(shí)擴(kuò)增和連接。這個(gè)多重重疊_延伸PCR技術(shù)降低了分離和連接目標(biāo)核苷酸序列，特別是已連接的可變區(qū)的關(guān)聯(lián)對(duì)，所需的反應(yīng)數(shù)目。本發(fā)明的其他實(shí)施方案通過連接方法或者重組方法得到連接，作為多重重疊-延伸PCR的一種替代連接方式。在這些步驟中，連接與多重PCR擴(kuò)增不是同時(shí)進(jìn)行的，而是作為擴(kuò)增之后立即進(jìn)行的一個(gè)步驟。但是連接仍然可以在進(jìn)行多重PCR的試管中進(jìn)行。為了進(jìn)行多重重疊_延伸PCR，需要有兩個(gè)或者更多的引物組(多重引物混合物)，其中每組中至少一個(gè)引物帶有重疊_延伸尾巴。重疊_延伸尾巴使擴(kuò)增過程中每個(gè)引物組產(chǎn)生的產(chǎn)物連接起來。這種引物混合物被稱為多重重疊-延伸引物混合物。多重重疊_延伸PCR與通常的重疊-延伸PCR不同之處在于待連接的序列在同一個(gè)試管中同時(shí)產(chǎn)生，這樣在擴(kuò)增過程中使靶標(biāo)序列立即連接，而沒有任何中間純化。而且，通常的重疊-延伸PCR需要用外引物或者嵌套引物進(jìn)行單獨(dú)的連接PCR反應(yīng)，目的是產(chǎn)生連接產(chǎn)物 (Horton,R. Μ. et al. 1989. Gene77，61-68)。這樣的額外擴(kuò)增步驟在本發(fā)明的多重重疊-延伸PCR中是可選擇的。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是多重PCR或者多重重疊-延伸PCR擴(kuò)增之前的逆轉(zhuǎn)錄(RT) 步驟，使用的模板來自分離的單個(gè)細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是使用來自分離的單個(gè)細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群的核苷酸序列作為模板用于多重PCR擴(kuò)增。優(yōu)選地，在多重PCR之前將來自單個(gè)細(xì)胞的RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。對(duì)于一些目標(biāo)核酸序列的擴(kuò)增，可以使用基因組DNA作為mRNA之外的另一種選擇。 通過使用分離的單個(gè)細(xì)胞或者來自分離的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)充后得到的等基因細(xì)胞群作為模板來源，就可以用來自細(xì)胞群中不同細(xì)胞的核苷酸序列避免編碼目標(biāo)雜聚蛋白的核苷酸序列的混雜。如果希望獲得目標(biāo)序列的原始組合，則這是非常重要的。特別是對(duì)于制備可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)而言，使用分離的單個(gè)細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群作為模板來源是一個(gè)重要的特征。多重重疊-延伸PCR是一項(xiàng)很少用的技術(shù)。WO 99/16904公開了在單一反應(yīng)中連接來自基因組序列的外顯子，這樣不需要使用逆轉(zhuǎn)錄就可產(chǎn)生cDNA。根據(jù)描述，對(duì)于要連接的每個(gè)外顯子這個(gè)方法使用一個(gè)引物組(包含兩個(gè)引物)，這樣形成了多重重疊-延伸引物混合物。每個(gè)單個(gè)引物組都能夠通過互補(bǔ)重疊-延伸尾巴與相鄰的引物組發(fā)生重疊。通過使用多重重疊-延伸引物混合物進(jìn)行重疊-延伸PCR反應(yīng)，之后進(jìn)行嵌套PCR(這被描述為一個(gè)必需的步驟)，從基因組DNA模板產(chǎn)生cDNA。如WO 99/16904中所描述的，由基因組DNA的外顯子制備cDNA是與雜聚蛋白編碼序列的克隆不相同的領(lǐng)域。首先，雜聚蛋白(heteromeric protein) 一般是從不同的基因表達(dá)的，而WO 99/16904中描述的外顯子連接涉及的是來自單一基因的外顯子的連接。此外， 本發(fā)明有助于連接后的目標(biāo)核酸序列文庫(kù)的制備，特別是組合文庫(kù)和可變區(qū)關(guān)聯(lián)對(duì)的文庫(kù)的制備，這是與連接來自單一基因的一系列外顯子產(chǎn)生單一非可變cDNA完全不同的情況。 而且，本發(fā)明使用了來自單個(gè)細(xì)胞的核酸，特別是RNA形式的核酸，不需要從其他細(xì)胞成分中分離出來就可以用作模板。幾乎沒有出版物中描述了關(guān)于可變區(qū)編碼序列連接的多重重疊-延伸RT-PCR。多重重疊-延伸RT-PCR最簡(jiǎn)單的形式是從雜交瘤細(xì)胞系中分離scFv編碼序列 (Thirion,S. et al. 1996. Eur. J. Cancer Prev. 5，507-511 以及Mullinax，R. L et al. 1992. BioTechniquesl2，864-869)。Thirion和Mullinax描述的方法用雜交瘤細(xì)胞系提取的總 RNA和寡聚dT引物進(jìn)行mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，之后進(jìn)行單獨(dú)的連接步驟。使用總計(jì)4個(gè)引物，包含兩個(gè)分別用于擴(kuò)增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的編碼序列的引物對(duì)，進(jìn)行連接步驟。\正向引物和Vh或者Ch反向引物含有互補(bǔ)的重疊-延伸尾巴，使重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列的擴(kuò)增和連接同時(shí)進(jìn)行。這些方法沒有使用嵌套PCR增加連接方法的敏感性。關(guān)于可變區(qū)編碼序列連接的另一個(gè)多重重疊-延伸RT-PCR的實(shí)例在前面提到的 WO 93/03151中予以描述，其提供了克隆來自相同細(xì)胞的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列的方法而不需要在克隆前分離單個(gè)細(xì)胞。WO 93/03151中描述的方法在RT步驟和多重重疊-延伸PCR步驟之間需要漂洗。而且，WO 93/03151的特殊目的之一是解決了需要分離單個(gè)細(xì)胞以獲得可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)的問題。這些已知的多重重疊-延伸RT-PCR技術(shù)中沒有一項(xiàng)可以在來自分離的單個(gè)細(xì)胞的模板上起作用。而且沒有一項(xiàng)方法能夠通過單一步驟RT-PCR反應(yīng)進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括了多個(gè)非相鄰的目標(biāo)核苷酸序列的連接。該方法包含在多重PCR或者多重RT-PCR擴(kuò)增步驟中使用來自分離的單個(gè)細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群的模板擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列并且實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列的連接。而且，該方法包含了對(duì)連接后的產(chǎn)物進(jìn)行一次額外擴(kuò)增的選擇性步驟。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括包含連接后的可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的制備。該方法包含從供體獲得含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分，從這個(gè)級(jí)分中可選地富集某一個(gè)淋巴細(xì)胞群。然后，通過在多個(gè)容器中分配來自含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分或者富集后的細(xì)胞級(jí)分的細(xì)胞，得到分離的單細(xì)胞群。分離的單細(xì)胞群中含有的可變區(qū)編碼序列進(jìn)行多重分子擴(kuò)增(多重RT-PCR擴(kuò)增)，實(shí)現(xiàn)可變區(qū)編碼序列對(duì)的連接(其中單個(gè)的對(duì)來自分離的單細(xì)胞群中的單個(gè)細(xì)胞)。而且，該技術(shù)包含兩個(gè)可選的步驟第一步將單細(xì)胞群中每個(gè)分離的單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)充為等基因細(xì)胞群，然后進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增。這樣得到具有多樣性等基因細(xì)胞群的多個(gè)容器(一個(gè)容器中一個(gè)等基因細(xì)胞群)。第二個(gè)選擇性步驟包括對(duì)連接后的可變區(qū)編碼序列進(jìn)行額外的擴(kuò)增。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的單個(gè)成員與來自同一個(gè)細(xì)胞的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)編碼序列相連，或者T細(xì)胞受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的單個(gè)成員由與α鏈可變區(qū)相連的β鏈可變區(qū)構(gòu)成或者由與δ鏈可變區(qū)相連的Y鏈可變區(qū)構(gòu)成，其中相連的可變區(qū)來自同一個(gè)細(xì)胞。本發(fā)明的多重RT-PCR擴(kuò)增可以作為兩個(gè)步驟的過程進(jìn)行，其中逆轉(zhuǎn)錄(RT)和多重PCR擴(kuò)增(或者是多重分子擴(kuò)增)分別進(jìn)行，或者作為單一步驟的過程進(jìn)行，其中RT和多重PCR擴(kuò)增步驟使用同樣的引物在一個(gè)試管中進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄(RT)使用含有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶進(jìn)行，從來自分離的單細(xì)胞的總RNA、 mRNA或者靶標(biāo)特異RNA產(chǎn)生cDNA?？梢杂糜谀孓D(zhuǎn)錄的引物有，例如寡聚dT引物、隨機(jī)六聚體引物、隨機(jī)十聚體引物、其他隨機(jī)引物或者對(duì)于目標(biāo)序列特異的引物。兩步多重RT-PCR擴(kuò)增步驟使RT步驟產(chǎn)生的cDNA被分配到一個(gè)以上的容器中，這樣在進(jìn)行擴(kuò)增之前儲(chǔ)存了模板級(jí)分。此外，cDNA向一個(gè)以上試管中的分配使得可以對(duì)來自同一個(gè)模板的核酸進(jìn)行一個(gè)以上的多重PCR擴(kuò)增。盡管這導(dǎo)致了獨(dú)立反應(yīng)數(shù)量的升高，但這打開了降低多重引物混合物復(fù)雜性的可能性，如果這是所期望的話。這個(gè)兩步的方法可以例如用于在一個(gè)試管中擴(kuò)增和連接重鏈可變區(qū)和κ輕鏈可變區(qū)編碼序列以及使用相同的模板在不同的試管中擴(kuò)增和連接重鏈可變區(qū)和λ輕鏈可變區(qū)編碼序列。單個(gè)細(xì)胞通常只表達(dá)一種輕鏈。但是同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)而不是在進(jìn)行另一個(gè)反應(yīng)之前等待一個(gè)反應(yīng)的結(jié)果通常是更為容易的。而且，κ和λ的擴(kuò)增作為內(nèi)部陰性對(duì)照，因?yàn)轭A(yù)計(jì)只有κ或者λ才能從單個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增。在單步多重RT-PCR步驟中，在同一個(gè)容器中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和多重PCR擴(kuò)增。所有在單步中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和多重PCR必需的組分在一開始就加入到容器中并且進(jìn)行反應(yīng)。一般地，一旦反應(yīng)開始，就無須加入額外的組分。單步多重RT-PCR擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)是它進(jìn)一步減少了產(chǎn)生本發(fā)明的連接的核苷酸序列所需的步驟數(shù)目。在需要在多個(gè)容器中進(jìn)行相同反應(yīng)以及在單細(xì)胞陣列上進(jìn)行多重RT-PCR時(shí)這是非常有用的。通過使用多重引物混合物中存在的反向引物進(jìn)行單步多重RT-PCR，該反向引物在多重PCR擴(kuò)增中需要作為逆轉(zhuǎn)錄的引物。 一般地，單步多重RT-PCR所需的組合物包含核酸模板、具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶、具有DNA聚合酶活性的酶、脫氧核苷三磷酸混合物(包含dATP，dCTP，dGTP和dTTP的dNTP混合物)以及多重引物混合物。核酸模板優(yōu)選是來自分離的單個(gè)細(xì)胞的總RNA或者mRNA，模板或者是純化的形式或者是細(xì)胞裂解物的形式或者仍然在完好無缺的細(xì)胞內(nèi)。一般地，反應(yīng)混合物的精確組成需要對(duì)每一個(gè)用于本發(fā)明的多重引物混合物進(jìn)行一些優(yōu)化。這適用于兩步和單步的多重RT-PCR步驟。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，使用基因組DNA而不是RNA作為模板可能是適宜的。在這些情況下省略了逆轉(zhuǎn)錄步驟，而本發(fā)明的其它步驟根據(jù)本申請(qǐng)全文所述的進(jìn)行。對(duì)于一些單步多重RT-PCR反應(yīng)而言，在反應(yīng)中加入額外的組分可能是有利的。例如，在RT步驟之后加入聚合酶。其他組分可以是例如dNTP混合物或者可能具有不同引物組成的多重引物混合物。然后這可以被認(rèn)為是單管(one-tube)多重RT-PCR，一般認(rèn)為它與單步多重RT-PCR具有相同的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗蚕拗屏藶楂@得所需的連接產(chǎn)物而必需的試管數(shù)目。多重RT-PCR擴(kuò)增出的目標(biāo)核苷酸序列可以通過使用不同的多重引物混合物用幾種方法互相連接，例如多重重疊_延伸RT-PCR、連接方法或者重組方法。優(yōu)選地，多重 RT-PCR擴(kuò)增和連接方法是單步或者兩步方法。但是連接過程可能還可以以多步驟的過程進(jìn)行，使用例如填充片段以PCR、連接方法或者重組方法連接目標(biāo)核酸序列。這種填充片段可能含有順式元件、啟動(dòng)子元件或者相關(guān)的編碼序列或者識(shí)別序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接過程與多重RT-PCR擴(kuò)增在同一個(gè)容器中進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，與多重PCR擴(kuò)增一起進(jìn)行多個(gè)非相鄰的目標(biāo)核苷酸序列的連接，使用多重重疊-延伸引物混合物。這使目標(biāo)序列被同時(shí)擴(kuò)增和連接。一般地， 多重重疊_延伸PCR所需的組合物包含核酸模板，具有DNA聚合酶活性的酶、脫氧核苷三磷酸混合物(包含dATP，dCTP，dGTP和dTTP的dNTP混合物)以及多重重疊-延伸引物混合物。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，通過多重重疊-延伸RT-PCR，使用來自分離的單個(gè)細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群的模板對(duì)多個(gè)非相鄰的目標(biāo)核苷酸序列進(jìn)行連接。而且，該方法包含對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行額外分子擴(kuò)增的選擇性步驟。優(yōu)選地，多重重疊_延伸RT-PCR以單步或者單管反應(yīng)進(jìn)行。本發(fā)明的多重重疊-延伸引物混合物包含至少兩個(gè)引物組，該引物組能夠起動(dòng)至少兩個(gè)可變區(qū)編碼序列的擴(kuò)增和連接，例如免疫球蛋白重鏈可變區(qū)家族序列與κ或者λ 輕鏈可變區(qū)家族序列的擴(kuò)增和連接，或者來自T細(xì)胞受體家族α、β、Y或者δ的序列的擴(kuò)增和連接。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過連接方法將多重RT-PCR擴(kuò)增出來的多個(gè)目標(biāo)核苷酸序列連接起來。為了達(dá)到這個(gè)目的，設(shè)計(jì)用于多重RT-PCR的多重引物混合物，使擴(kuò)增出來的靶標(biāo)序列能夠被適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈睿⑶铱梢酝ㄟ^DNA連接方法進(jìn)行共價(jià)連接(引物設(shè)計(jì)在“引物混合物和設(shè)計(jì)”部分中予以描述)。在使用這種多重引物混合物進(jìn)行多重RT-PCR之后，形成靶標(biāo)序列相容末端所需的限制性酶與連接酶一起加入到混合物中。 雖然可以進(jìn)行純化，但是在這個(gè)步驟之前不必要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。限制性切割和連接聯(lián)合進(jìn)行的反應(yīng)溫度大概在0到40攝氏度之間。但是如果來自多重PCR反應(yīng)的聚合酶仍然存在于混合物中，則孵育溫度優(yōu)選在室溫以下，最優(yōu)選的溫度在4到16攝氏度之間。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過重組方法將多重RT-PCR擴(kuò)增出來的多個(gè)目標(biāo)核苷酸序列連接起來。在這種方法中，擴(kuò)增出的靶標(biāo)序列可以使用相同的重組位點(diǎn)連接起來。然后加入促進(jìn)重組的重組酶進(jìn)行連接。一些適宜的重組酶系統(tǒng)有具有各種FRT位點(diǎn)的Flp重組酶系統(tǒng)、具有各種Iox位點(diǎn)的Cre重組酶、在attP位點(diǎn)和attB位點(diǎn)之間進(jìn)行重組的整合酶OC31、β-重組酶-六系統(tǒng)以及Gin-gix系統(tǒng)。已經(jīng)在兩個(gè)核苷酸序列 (Vh與Vl連接)上示例了通過重組進(jìn)行的連接(Chapal，N.et al. 1997 BioTechniques 23， 518-524)，在這里引用作為參考。在一個(gè)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)核苷酸序列包含可變區(qū)編碼序列，連接產(chǎn)生了可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)。除了可變區(qū)以外，這種關(guān)聯(lián)對(duì)可能還包含一個(gè)或者更多恒定區(qū)編碼序列。在本發(fā)明的一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，目標(biāo)核苷酸序列包含免疫球蛋白可變區(qū)編碼序列，連接產(chǎn)生了輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)。除了可變區(qū)以外，這種關(guān)聯(lián)對(duì)可能還包含一個(gè)或者更多恒定區(qū)編碼序列。而且，這種關(guān)聯(lián)對(duì)可以從來自由含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分(例如全血細(xì)胞、單核細(xì)胞或者白細(xì)胞)富集的B淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞的模板中分離出來。在本發(fā)明同樣優(yōu)選的實(shí)施方案中，目標(biāo)核苷酸序列包含TcR可變區(qū)編碼序列，連接產(chǎn)生了 α鏈可變區(qū)和β鏈可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)或者Y鏈可變區(qū)和δ鏈可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)。除了可變區(qū)以外，這種關(guān)聯(lián)對(duì)可能還包含一個(gè)或者更多恒定區(qū)編碼序列。 而且，這種關(guān)聯(lián)對(duì)可以從來自由含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分(例如全血細(xì)胞、單核細(xì)胞或者白細(xì)胞)富集的T淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞的模板中分離出來。本發(fā)明的另一方面是使用遺傳多樣性細(xì)胞群作為模板來源的多重RT-PCR。細(xì)胞與細(xì)胞之間主要的雜聚蛋白編碼序列沒有變化，結(jié)合蛋白的可變區(qū)編碼序列不是如此。因此在使用本發(fā)明克隆這種非可變雜聚蛋白編碼序列時(shí)，沒有必要進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的初步分離。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，多個(gè)非相鄰的目標(biāo)核苷酸序列通過以下的方法被隨機(jī)連接，該方法包含使用來自遺傳多樣細(xì)胞群的模板對(duì)目標(biāo)核苷酸序列進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增，然后連接擴(kuò)增后的目標(biāo)核苷酸序列。而且該方法包含對(duì)連接后的產(chǎn)物進(jìn)行額外擴(kuò)增的選擇性步驟。如同單細(xì)胞方法一樣，連接可以使用用于擴(kuò)增的多重重疊-延伸引物混合物進(jìn)行或者通過連接方法或重組方法進(jìn)行。優(yōu)選地來自細(xì)胞群的模板不嚴(yán)格局限于細(xì)胞內(nèi)部。細(xì)胞群可以例如被裂解。將隨機(jī)連接過程應(yīng)用于表達(dá)可變結(jié)合蛋白的細(xì)胞群，使可變區(qū)編碼序列組合文庫(kù)的制備簡(jiǎn)單化。優(yōu)選地，細(xì)胞群包含的細(xì)胞表達(dá)可變區(qū)結(jié)合蛋白，例如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、漿細(xì)胞或者這些細(xì)胞的混合物。以上提到的實(shí)施方案中的細(xì)胞群可以例如被通透化或者被裂解，不需要額外的純化，或者模板核酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)步驟從細(xì)胞中分離出來。優(yōu)選單步多重RT-PCR步驟。但是兩步方法也可以用于該實(shí)施方案中。本發(fā)明還提供了包含連接的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)編碼序列對(duì)的組合文庫(kù)。提高多重RT-PCR-連接過程特異性、敏感性和產(chǎn)量的有效方法是對(duì)多重RT-PCR得到的連接后的核苷酸序列進(jìn)行額外的分子擴(kuò)增，之后通過連接方法或者重組方法進(jìn)行連接或者使用多重重疊_延伸RT-PCR進(jìn)行連接。這個(gè)額外的擴(kuò)增優(yōu)選地使用PCR擴(kuò)增進(jìn)行，使用適用于擴(kuò)增連接的目標(biāo)核酸序列的弓I物混合物。使用的弓I物混合物可以是多重引物混合物或者多重重疊-延伸引物混合物的外引物，即與連接后的可變區(qū)編碼序列有義鏈最外面的5'端和3'端退火的引物，這樣使整個(gè)連接產(chǎn)物被擴(kuò)增。外引物還可以描述為多重重疊-延伸引物混合物中不含有重疊-延伸尾巴的引物。或者可以使用嵌套或者半嵌套引物組進(jìn)行連接的核苷酸序列的額外擴(kuò)增。這種嵌套PCR特別用于提高該方法的特異性以及提高連接產(chǎn)物的量。對(duì)于本發(fā)明，半嵌套式PCR(如在標(biāo)題為“引物混合物和設(shè)計(jì)”的部分中描述的)被認(rèn)為與嵌套式PCR同樣有用。因此，盡管對(duì)于本發(fā)明不是必須的，但是合意的是對(duì)多重重疊_延伸RT-PCR的連接產(chǎn)物或者由連接方法或者重組方法連接的產(chǎn)物進(jìn)行額外的PCR擴(kuò)增，優(yōu)選使用嵌套或者半嵌套PCR。額外的擴(kuò)增可以使用多重重疊-延伸RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物或者連接產(chǎn)物或者重組產(chǎn)物的一個(gè)級(jí)分或者全部，或者這些產(chǎn)物中任何一個(gè)的一個(gè)級(jí)分，或者使用來自這些反應(yīng)中任何一個(gè)的經(jīng)過部分純化(例如對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后將對(duì)應(yīng)于連接后的可變區(qū)編碼序列預(yù)期大小的片段切下來)的連接產(chǎn)物直接進(jìn)行。對(duì)于通過多重重疊-延伸 RT-PCR連接的產(chǎn)物，優(yōu)選地直接在多重重疊-延伸RT-PCR反應(yīng)的一個(gè)級(jí)分上進(jìn)行額外的擴(kuò)增，因?yàn)檫@會(huì)有助于在第一個(gè)反應(yīng)中沒有被連接的單個(gè)靶標(biāo)序列的連接。目標(biāo)序列本發(fā)明的目標(biāo)核苷酸序列可以選自編碼不同亞基或者結(jié)構(gòu)域的序列，這些亞基或者結(jié)構(gòu)域在表達(dá)后形成蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)的一部分。這些由至少兩個(gè)不同的亞基組成的蛋白質(zhì)被稱為雜聚蛋白。雜聚蛋白在所有的種中都是常見的。這些蛋白質(zhì)所屬的一些類型有例如酶、抑制劑、結(jié)構(gòu)蛋白、毒素、通道蛋白、G蛋白、受體蛋白、免疫球蛋白超家族蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等等。編碼這些雜聚蛋白的核苷酸序列是不相鄰的，意味著例如它們來自不同的基因或者不同的mRNA分子。但是如本發(fā)明中所使用的，不相鄰還可以表示編碼同一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，其中結(jié)構(gòu)域被非目標(biāo)核苷酸序列分割開。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)核苷酸序列含有來自免疫球蛋白超家族例如免疫球蛋白(抗體)、B細(xì)胞受體和T細(xì)胞受體(TcR' s)的可變區(qū)編碼序列。來自免疫球蛋白的可變區(qū)編碼序列是特別感興趣。這種可變區(qū)編碼序列包含全長(zhǎng)的抗體以及Fab' S、 Fv' S,scFv' s以及可變區(qū)編碼序列片段的組合，例如互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R' S)、連接基因或者V基因或者這些的組合。一般地本發(fā)明可以應(yīng)用于任意組合的可變區(qū)編碼序列及其片段。本申請(qǐng)例示了整個(gè)輕鏈與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的連接。但是本發(fā)明還允許只有重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域的連接，產(chǎn)生Fv或者scFv編碼序列，或者整個(gè)輕鏈與重鏈可變區(qū)+恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域Chi+部分的鉸鏈區(qū)連接，產(chǎn)生Fab、Fab'或者F(ab)2。而且，可以向可變重鏈中添加重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的任何區(qū)域，產(chǎn)生截短的抗體編碼序列或者全長(zhǎng)的抗體編碼序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可變區(qū)編碼序列包含一種類型的免疫球蛋白輕鏈 (κ或者λ)編碼序列以及一個(gè)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)編碼序列。來自T細(xì)胞受體(TcR' s)的可變區(qū)編碼序列也是感興趣的。這些TcR編碼序列包含全長(zhǎng)的α和β鏈或者Y和δ鏈以及可溶性TcR的編碼序列或者只有這些結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域或者它們的單鏈融合蛋白(例如單鏈α β或者單鏈的Y δ)的編碼序列。模板來源本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是將來自分離的單個(gè)細(xì)胞、等基因細(xì)胞群或者沒有被分開到單個(gè)容器中的遺傳多樣細(xì)胞群的核苷酸序列連接起來的能力。本發(fā)明中使用的細(xì)胞可以是例如細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者這些細(xì)胞的級(jí)分。來自哺乳動(dòng)物的血液細(xì)胞是可以用于本發(fā)明的細(xì)胞級(jí)分的一個(gè)實(shí)例。本發(fā)明的優(yōu)選特點(diǎn)是使用分離的單個(gè)細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群作為模板來源，原因是目標(biāo)核酸序列的混雜特別是可變區(qū)編碼序列的混雜被避免了。如果希望獲得原始的配對(duì)例如可變區(qū)編碼序列的原始配對(duì)，則這一點(diǎn)是非常重要的。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的特點(diǎn)是從包含淋巴細(xì)胞例如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和/或各種不同發(fā)育階段的這些細(xì)胞譜系的細(xì)胞級(jí)分中獲得單個(gè)細(xì)胞或者單細(xì)胞群。其他表達(dá)來自免疫球蛋白超家族的結(jié)合蛋白的細(xì)胞群也可以被用于獲得單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞系例如雜交瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞譜系或者病毒無限增殖化細(xì)胞系或者來自供體的參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞也可以用于本發(fā)明。來自供體的含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分可以從富含這些細(xì)胞的天然組織或者液體例如血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟組織、扁桃體組織或者腫瘤內(nèi)和周圍的浸潤(rùn)或者炎癥組織浸潤(rùn)獲得。用于本發(fā)明的適宜的細(xì)胞供體可以選自完全含有獲得性免疫系統(tǒng)的脊椎動(dòng)物。供體可以是從未接受免疫接種的或者對(duì)所需的靶標(biāo)是過度免疫的。分離對(duì)所需靶標(biāo)具有結(jié)合特異性的抗原結(jié)合蛋白時(shí)，優(yōu)選具有過度免疫性的供體。這些具有過度免疫性的供體可以是使用靶標(biāo)或者靶標(biāo)的片段進(jìn)行了免疫接種的供體，或者可以是恢復(fù)期的患者、或者是未處于健康狀態(tài)、對(duì)靶標(biāo)具有天然免疫應(yīng)答的個(gè)體，例如自體免疫患者、癌癥患者、具有感染性疾病的患者如HIV患者、甲、乙或丙型肝炎患者、SARS患者等等或者具有慢性疾病的患者。在使用重組蛋白用于治療時(shí)，它們優(yōu)選地來自與將要被治療的個(gè)體屬于相同物種的序列(例如人類的序列用于人類的治療)。首先，因?yàn)閬碜酝庠葱蛄?即非人類)的重組蛋白會(huì)被免疫系統(tǒng)識(shí)別，導(dǎo)致牽涉多克隆抗蛋白質(zhì)抗體的免疫應(yīng)答。這些抗蛋白質(zhì)抗體可以通過占據(jù)活性位點(diǎn)阻斷藥物的作用，它們會(huì)加速藥物的清除，有可能誘導(dǎo)不良反應(yīng)，如重復(fù)接觸后的超敏反應(yīng)。但是在重組蛋白來自具有物種特性的序列時(shí)也可以看到免疫原性。這種免疫原性可以例如被與體內(nèi)觀察到的那些修飾不同的翻譯后修飾所誘導(dǎo)?？勺儏^(qū)編碼序列組合文庫(kù)也可能產(chǎn)生免疫原性，原因是它們由體外產(chǎn)生的可變區(qū)編碼序列的隨機(jī)對(duì)組成?？刂企w內(nèi)抗體重鏈和輕鏈編碼序列對(duì)(或者T細(xì)胞受體)形成的規(guī)律還沒有被完全理解。因此，即使組成對(duì)的兩個(gè)序列都完全是人類序列，一些體外形成的對(duì)仍可能被免疫系統(tǒng)識(shí)別為外源的。另一方面，從關(guān)聯(lián)文庫(kù)得到的結(jié)合蛋白不會(huì)產(chǎn)生所述的異常組合，因此與來自組合文庫(kù)的結(jié)合蛋白相比，它們具有較低的潛在免疫原性。這并不意味著來自組合文庫(kù)的產(chǎn)物不適宜用于治療，只是需要對(duì)以上提及的它們的副反應(yīng)進(jìn)行更大程度的監(jiān)控。對(duì)于本發(fā)明中的使用，細(xì)胞供體應(yīng)當(dāng)優(yōu)選與將要用從本發(fā)明的連接核苷酸序列得到的產(chǎn)物進(jìn)行治療的物種屬于同一物種。優(yōu)選地，細(xì)胞供體是家養(yǎng)動(dòng)物、寵物、人或者轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。攜帶人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在美國(guó)專利No. 6，111，166和Kuroiwa， Y.等人Nature Biotechnology ；2002 ；20 :889_893中有所描述。這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠產(chǎn)生人免疫球蛋白。這樣，對(duì)這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行通常的免疫接種技術(shù)，可以產(chǎn)生針對(duì)特定靶標(biāo)的完全人抗體。這使編碼結(jié)合蛋白(這些結(jié)合蛋白對(duì)更為困難的靶標(biāo)例如某些人抗原具有特異性，對(duì)于所述某些人抗原沒有或者只存在有限的天然人抗體應(yīng)答)的文庫(kù)的制備成為可能。這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物同樣可以開發(fā)產(chǎn)生人T細(xì)胞受體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分由從供體獲得的全血、 骨髓、單核細(xì)胞或者白細(xì)胞組成。單核細(xì)胞可以從血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟、癌癥細(xì)胞周圍的浸潤(rùn)物以及炎性浸潤(rùn)物中分離。單核細(xì)胞可以通過密度離心技術(shù)如Ficoll梯度進(jìn)行分離。如果單核細(xì)胞從包含組織的樣品中分離，在進(jìn)行梯度離心之前將組織打碎?？梢允褂美鐧C(jī)械方法如研磨、電穿孔和/或化學(xué)方法如酶處理等進(jìn)行組織打碎?？梢允褂冒准?xì)胞提取法直接從供體進(jìn)行白細(xì)胞的分離。例如含有淋巴細(xì)胞的骨髓或者組織的粗制備物也可以用于本發(fā)明。這些制備物需要進(jìn)行打碎，例如根據(jù)以上的描述進(jìn)行打碎，以促進(jìn)單細(xì)胞的分配。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是就某種淋巴細(xì)胞群例如來自B淋巴細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞而言，對(duì)含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分如全血、單核細(xì)胞、白細(xì)胞或者骨髓進(jìn)行富集。 可以通過例如使用磁珠細(xì)胞分選或者熒光激發(fā)細(xì)胞分選(FACS)進(jìn)行B淋巴細(xì)胞的富集，利用了譜系特異的細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白如CD19或者其他B細(xì)胞譜系特異標(biāo)記。可以通過例如使用細(xì)胞表面標(biāo)記如CD3或者其他T細(xì)胞譜系特異的標(biāo)記進(jìn)行T淋巴細(xì)胞的富集。本發(fā)明的優(yōu)選特點(diǎn)是對(duì)富集后的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分選，目的是在向多個(gè)容器中分配單個(gè)細(xì)胞之前獲得漿細(xì)胞。一般通過FACS分選分離漿細(xì)胞，使用表面標(biāo)記例如CD38，可能與CD45聯(lián)合使用。也可以使用其他漿細(xì)胞特異的表面標(biāo)記或者其組合，例如 ⑶138，⑶20，⑶21，⑶40，⑶9，HLA-DR或者⑶62L，對(duì)于標(biāo)記的精確選擇取決于漿細(xì)胞的來源，如扁桃體、血液或者骨髓。漿細(xì)胞還可以從來自任何以上來源的、未富集的含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞群中獲得。從血液中分離的漿細(xì)胞有時(shí)被稱為早期漿細(xì)胞或者成漿細(xì)胞。在本發(fā)明中這些細(xì)胞也被稱為漿細(xì)胞，盡管它們與骨髓內(nèi)的漿細(xì)胞相比是CD19陽(yáng)性的。對(duì)免疫球蛋白編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)的分離，使用漿細(xì)胞是較好的，因?yàn)檫@些細(xì)胞中有更高比例的細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異抗體(這些抗體反映了對(duì)所需抗原的獲得性免疫)，且大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生了體細(xì)胞高變，因此編碼高親和性的抗體。而且與其他B淋巴細(xì)胞群相比，漿細(xì)胞中的mRNA水平升高，這樣在使用單個(gè)漿細(xì)胞時(shí)逆轉(zhuǎn)錄步驟更為有效。作為漿細(xì)胞分離的代替，也可以使用細(xì)胞表面標(biāo)記如CD22，從含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分中分離記憶B細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是在向多個(gè)容器中分配細(xì)胞之前，根據(jù)抗原特異性選擇被富集的B淋巴細(xì)胞。通過富集的B淋巴細(xì)胞與所需的抗原接觸使抗原結(jié)合在暴露于表面的免疫球蛋白上，之后分離結(jié)合物，從而分離抗原特異的B淋巴細(xì)胞。這可以通過例如使用所需的抗原包被磁珠之后進(jìn)行磁珠細(xì)胞分選、通過FACS、通過使用抗原包被層析柱之后進(jìn)行親和層析、通過濾膜篩選或者本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方法進(jìn)行。如果需要的話，可以根據(jù)抗原特異性對(duì)漿細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞、未富集的單核細(xì)胞、白細(xì)胞、全血、骨髓或者組織制備物進(jìn)行分離。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是使用表面標(biāo)記⑶45R0和/或⑶27分選富集的T淋巴細(xì)胞(例如⑶3陽(yáng)性細(xì)胞)，獲得記憶T細(xì)胞級(jí)分。也可以使用MHC-肽復(fù)合體篩選T淋巴細(xì)胞的 MHC-抗原特異性(例如 Callan，M. F. et al. 1998. J. Exp. Med. 187,1395-1402 ；Novak, Ε. J. et al. 1999. J. Clin. Invest 104，R63-R67)。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是以上描述的任何分離的細(xì)胞級(jí)分(例如B淋巴細(xì)胞、 漿細(xì)胞、記憶細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞)的無限增殖化?？梢栽诩?xì)胞分配之前使用EB病毒 (Traggiai, E.，et al.，2004. Nat Med 10,871-875)進(jìn)行無限增殖化?；蛘呖梢栽谀孓D(zhuǎn)錄之前對(duì)分離的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行無限增殖化和擴(kuò)充。Traggiai等人，Nat Med. 2004Aug ； 10 (8) 871-5。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是所需細(xì)胞(例如雜交瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞系、全血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、單核細(xì)胞、白細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、抗原特異的B淋巴細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、抗原/MHC特異的T淋巴細(xì)胞或者記憶T細(xì)胞)群的細(xì)胞向多個(gè)容器中進(jìn)行逐一分配，目的是獲得分離的單細(xì)胞群。這種單細(xì)胞的分離指的是細(xì)胞從細(xì)胞群中進(jìn)行物理分離，使單個(gè)容器中含有單個(gè)細(xì)胞，或者對(duì)微陣列、芯片或者凝膠基質(zhì)進(jìn)行荷載使其產(chǎn)生單個(gè)細(xì)胞。這些細(xì)胞可以通過有限稀釋直接分配到大量的容器(例如單個(gè)容器的陣列)中。本發(fā)明中使用的單個(gè)容器優(yōu)選是適用于PCR的容器(例如PCR管以及 96孔或者384孔的PCR平板或者更大的容器陣列)。但是也可以使用其他的容器。當(dāng)向大量的單個(gè)容器(例如384孔的平板)中分配單個(gè)細(xì)胞時(shí)，得到的是單個(gè)細(xì)胞群。這種分配可以通過例如將某一體積分配到單個(gè)容器中，該體積中平均包含的細(xì)胞濃度為1、0. 5或者 0. 3個(gè)細(xì)胞，這樣得到平均含有單個(gè)細(xì)胞或者更少細(xì)胞的容器。由于通過有限稀釋對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分配是一個(gè)統(tǒng)計(jì)事件，一部分容器將會(huì)是空的，大部分的容器會(huì)含有一個(gè)細(xì)胞，少部分的容器會(huì)含有兩個(gè)或者更多的細(xì)胞。當(dāng)兩個(gè)或者更多的細(xì)胞存在于一個(gè)容器中，則可能在該容器的細(xì)胞中出現(xiàn)一些可變區(qū)編碼序列的混雜。但是由于這種混雜是次要事件，所以它不會(huì)影響本發(fā)明的整體有用性。而且，不具有所需結(jié)合親和性和特異性的可變區(qū)編碼序列的組合在篩選過程中很有可能不被選中因此被除去。因此，混雜的次要事件不會(huì)顯著影響本發(fā)明的最終文庫(kù)。通過有限稀釋進(jìn)行細(xì)胞分配的替代方法使用例如細(xì)胞分選儀如FACS儀器或者能夠設(shè)定程序準(zhǔn)確地將單個(gè)細(xì)胞分配到單個(gè)容器中的自動(dòng)儀器。這些替代方法是優(yōu)選的，原因是它們消耗更少的勞動(dòng)，對(duì)于均一地將單個(gè)細(xì)胞分配到單個(gè)容器中更為有效。以上描述的富集、分選和分離步驟的實(shí)施使得大部分細(xì)胞保持完好無損。在富集和分選過程中細(xì)胞的破裂可能導(dǎo)致可變區(qū)編碼序列的混雜。但是預(yù)計(jì)這不是問題，因?yàn)槠屏训念l率預(yù)計(jì)很低。在向單個(gè)容器中分配之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行漂洗和可能的RNA酶處理會(huì)除去任何在該過程中已經(jīng)泄露的RNA。而且，在考慮以上對(duì)如何分配細(xì)胞以獲得單個(gè)容器群中的單細(xì)胞群的描述時(shí)，每一個(gè)容器中必需含有單個(gè)細(xì)胞并不被認(rèn)為是絕對(duì)必需的特征。相反，它表明大多數(shù)容器中含有單個(gè)細(xì)胞，例如含有兩個(gè)或者更多細(xì)胞的容器的數(shù)目占所分配細(xì)胞總數(shù)的25%以下， 或者更好地在10%以下。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是逆轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，使用的模板來自在多個(gè)容器中被分配為單一細(xì)胞的細(xì)胞。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄(RT)，根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為將要作為RT模板來源的單細(xì)胞內(nèi)的核酸來自單個(gè)細(xì)胞，盡管沒有必要將它們從該單個(gè)細(xì)胞的其他成分中分離出來。當(dāng)對(duì)單個(gè)細(xì)胞向單個(gè)容器中進(jìn)行了最終分配后，可以在逆轉(zhuǎn)之前對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行增殖以獲得等基因細(xì)胞群。這個(gè)過程產(chǎn)生了更多的可以被用作模板的mRNA，如果要擴(kuò)增和連接的是稀有的靶標(biāo)，則這一點(diǎn)可能就很重要。但是就靶標(biāo)基因而言，在增殖過程中細(xì)胞應(yīng)當(dāng)保持遺傳一致性。只要用于逆轉(zhuǎn)錄的模板沒有降解，分離的細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群可以保存完好或者裂解。優(yōu)選對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，目的是使接下來的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增變得容易。在本發(fā)明的一個(gè)不同的實(shí)施方案中，公開的多重重疊-延伸RT-PCR方法或者多重 RT-PCR之后通過連結(jié)方法或者重組方法進(jìn)行連接，還可以用于來自沒有被分配到單一容器中的遺傳多樣細(xì)胞群的模板，所述細(xì)胞群在一起作為一個(gè)細(xì)胞庫(kù)。該方法可以用于產(chǎn)生組合文庫(kù)。這種方法不需要單個(gè)細(xì)胞的分配。但是，可以在這一方法中使用的細(xì)胞與在單細(xì)胞方法中描述的那些細(xì)胞是相同的，例如一群分選后的B淋巴細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞。在對(duì)這樣的細(xì)胞群進(jìn)行單步多重重疊-延伸RT-PCR或者單步多重RT-PCR之后通過連接方法或者重組方法進(jìn)行連接時(shí)，優(yōu)選地在反應(yīng)之前裂解細(xì)胞，如果需要的話可以從裂解物中分離總RNA或者mRNA。本發(fā)明中單步多重重疊-延伸RT-PCR的敏感性允許使用非常小量的模板。如實(shí)施例2和3所示，可以用對(duì)應(yīng)于單個(gè)細(xì)胞裂解物的模板量進(jìn)行單步多重重疊-延伸RT-PCR。引物混合物和設(shè)計(jì)
本發(fā)明的引物混合物包含至少四個(gè)引物，它們兩兩成對(duì)形成引物組，能夠擴(kuò)增至少兩個(gè)不同的目標(biāo)靶標(biāo)序列。兩個(gè)或者更多的這種引物組組成了多重引物混合物。優(yōu)選地，多重引物混合物包含至少 3,4, 5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19 或者 20， 30，40，50，60，70，80，90100，110，120，130，140 或者 150 個(gè)引物組(引物對(duì))。特別對(duì)于可變區(qū)編碼序列的擴(kuò)增，多重引物混合物中的單個(gè)引物組可以由多于兩個(gè)的引物組成。優(yōu)選地，一個(gè)引物組包含至少 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，45，50，60，70， 80,90,100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，220，240，260，280 或者 300 個(gè)引物。優(yōu)選地，在多重引物混合物中引物的總數(shù)至少是5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，20， 25,30,35,45,50,60,70,80,90,100，125，150 或者 200，最多是 225，250，275，300，325，350， 375或者400個(gè)引物。本發(fā)明的所有引物包含基因特異的區(qū)域，優(yōu)選地所有的引物還在引物5'末端帶有引物尾巴，即與基因特異引物部分的3'端融合的5'非編碼序列。這樣的引物尾巴大約有6-50核苷酸長(zhǎng)，但是如果需要的話也可以更長(zhǎng)一些。擴(kuò)增以后，引物尾巴(primer tail) 被加在靶標(biāo)序列上。本發(fā)明的引物尾巴是例如，克隆尾巴和連接尾巴，如適用于通過連接方法進(jìn)行連接的尾巴，適用于通過重組方法進(jìn)行連接的尾巴或者重疊_延伸尾巴?？寺∥舶涂梢詾?到20個(gè)核苷酸長(zhǎng)或者更長(zhǎng)并且包含限制位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)， 它們對(duì)連接產(chǎn)物向適當(dāng)載體中的插入是有用的。為了通過連接方法進(jìn)行連接，對(duì)多重引物混合物的引物組進(jìn)行設(shè)計(jì)使第一引物組的一部分(正向或者反向引物)裝配有含有限制位點(diǎn)的連接尾巴，該限制位點(diǎn)在切割后會(huì)與位于第二引物組一部分的連接尾巴中的限制位點(diǎn)相容。為了連接多于兩個(gè)的靶標(biāo)序列， 第二引物組的第二部分裝配有限制位點(diǎn)，該限制位點(diǎn)切割后能與第三引物組的一部分中的限制位點(diǎn)相容。位于第二引物組中的所述第二限制位點(diǎn)應(yīng)該與第一引物組中的限制位點(diǎn)不相容。可以通過這樣設(shè)計(jì)引物來連接相當(dāng)多的靶標(biāo)序列。應(yīng)該選擇在靶標(biāo)序列中出現(xiàn)頻率低或者不出現(xiàn)的限制位點(diǎn)。而且，相容性限制位點(diǎn)優(yōu)選地應(yīng)該是不同的，使得連接位點(diǎn)不能被所使用的特定限制酶切割。這使得反應(yīng)向靶標(biāo)序列1與靶標(biāo)序列2的連接方向進(jìn)行，原因是相同靶標(biāo)序列之間的連接可以被限制性酶切割。適宜的限制位點(diǎn)對(duì)有，例如SpeI和 XbaI (或者NheI或AvrII可以代替這兩個(gè)中的一個(gè)或者全部)、NcoI和BspHI、EcoRI和 MfeI或者PstI和NsiI0對(duì)于連接，SpeI可以例如位于靶標(biāo)序列1中，XbaI可以位于靶標(biāo)序列2中，NcoI可以位于靶標(biāo)序列的另一端，BspHI位于靶標(biāo)序列3中，依此類推。為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化這個(gè)過程，如果限制酶在相同的緩沖液中都起作用則是一個(gè)優(yōu)勢(shì)。為了通過重組方法進(jìn)行連接，多重引物混合物的引物組可以例如按照 Chapal (1997 BioTechniques 23，518-524)的文章中所示例的進(jìn)行設(shè)計(jì)，該文章在這里被引用作為參考。為了使目標(biāo)核苷酸序列的連接與多重PCR擴(kuò)增在同一個(gè)步驟中進(jìn)行、向多重引物混合物的每一個(gè)引物組的至少一個(gè)引物中加入適合于重疊_延伸PCR的尾巴，這樣產(chǎn)生多重重疊-延伸引物混合物。重疊-延伸尾巴通常更長(zhǎng)，長(zhǎng)度從8到75個(gè)核苷酸，可能含有限制位點(diǎn)或者重組位點(diǎn)，使得接下來可以插入調(diào)控元件如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止序列或者連接體序列(如scFv中的連接體序列)。如果需要終止密碼子的話，重疊-延伸尾巴還可以含有終止密碼子。一般地有三種類型的重疊-延伸尾巴，如圖1中所示。在類型I中，兩個(gè)引物組中只有重疊-延伸尾巴互相重疊。兩個(gè)重疊-延伸尾巴中不必所有的核苷酸都互相互補(bǔ)。 在本發(fā)明的一方面中，互補(bǔ)的核苷酸占據(jù)了重疊-延伸尾巴的60到85%。在類型II的重疊-延伸尾巴中，5'核苷酸中的4到6個(gè)核苷酸與相鄰靶標(biāo)序列的基因特異區(qū)域互補(bǔ)。在類型III的重疊-延伸尾巴中，整個(gè)的重疊區(qū)與相鄰的靶標(biāo)序列互補(bǔ)。如果以后要在連接的靶標(biāo)序列之間插入調(diào)控元件等，則優(yōu)選類型I和類型II的重疊-延伸尾巴。如果要通過確定的連接體(如scFv中的)連接靶標(biāo)序列，則優(yōu)選類型II的重疊-延伸尾巴。如果靶標(biāo)序列要按照閱讀框進(jìn)行連接，則優(yōu)選類型III的重疊-延伸尾巴。重疊-延伸尾巴的設(shè)計(jì)取決于序列的特性，如長(zhǎng)度、相對(duì)GC含量(GC% )、是否存在限制位點(diǎn)、回文序列、熔解溫度、它們所要連接的基因特異的部分等等。重疊-延伸尾巴的長(zhǎng)度應(yīng)該在8到75個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選地長(zhǎng)度在15到40個(gè)核苷酸之間。更為優(yōu)選在22 到觀個(gè)核苷酸之間。使用非常長(zhǎng)的重疊-延伸尾巴(50到75個(gè)核苷酸)可能對(duì)由每個(gè)引物組產(chǎn)生的產(chǎn)物的連接有利。但是在使用非常長(zhǎng)的重疊-延伸尾巴時(shí)，重疊-延伸尾巴的長(zhǎng)度和基因特異區(qū)的長(zhǎng)度的比例很可能需要進(jìn)行調(diào)整。GC%的偏好取決于重疊-延伸尾巴的長(zhǎng)度。因?yàn)檩^短的尾巴具有較短的互補(bǔ)區(qū)域，所以它們需要比更長(zhǎng)的尾巴具有更高的GC% 以加強(qiáng)相互作用。應(yīng)當(dāng)同樣遵守引物設(shè)計(jì)的其他原則，例如應(yīng)當(dāng)盡可能減少使引物二聚體化和發(fā)夾的形成。引物也不能引發(fā)錯(cuò)誤的反應(yīng)。而且，已知Taq DNA聚合酶通常在新合成的DNA鏈的3'端加上腺嘌呤(A)，通過使重疊-延伸尾巴容納3'非模板的A添加，使其適合于重疊-延伸尾巴的設(shè)計(jì)。攜帶連接尾巴(例如重疊-延伸尾巴、適合于通過連接方法進(jìn)行連接的尾巴或者適合于通過重組方法進(jìn)行連接的尾巴)的引物的選擇確定了靶標(biāo)序列連接的順序和方向。 是引物組中的正向引物還是反向引物還是很可能正向和反向引物都配備有連接尾巴，這對(duì)于本發(fā)明不是重要的。但是，還是必須對(duì)此給予一些考慮，因?yàn)樵谧罱K產(chǎn)物中靶標(biāo)序列的順序和方向可能對(duì)于例如調(diào)控元件(如啟動(dòng)子和終止序列)的插入或者對(duì)于靶標(biāo)序列按照閱讀框的連接是重要的。為了連接兩個(gè)目標(biāo)核苷酸序列，可以在用于每一個(gè)靶標(biāo)序列PCR擴(kuò)增的每一引物組的反向或者正向引物上加上連接尾巴。本發(fā)明示例了向每組引物的Vh和\正向引物中添加重疊-延伸尾巴和適于通過連接方法進(jìn)行連接的尾巴(例如分別如圖2和實(shí)施例9所示)。這使得產(chǎn)物的連接方向是5'到5'(頭對(duì)頭和雙向)。但是連接尾巴也可以加在每個(gè)引物組的反向引物(例如在第一組的Ck和/或。或者在第二組中的Ch或者Jh)上。 這使得產(chǎn)物的連接方向是3'到3'(尾對(duì)尾和雙向)。第三種選擇是在第一個(gè)引物組的反向引物(例如C κ和/或。引物)和第二引物組的正向引物(例如Vh引物)上加上連接尾巴，反之亦然。這產(chǎn)生了 3'到5'的定向(頭對(duì)尾和單向)。圖3示意了可以產(chǎn)生的可能方向，這取決于每個(gè)引物組中哪個(gè)引物裝備有連接尾巴。在連接兩個(gè)以上的目標(biāo)核苷酸序列時(shí)，一些引物組需要在正向和反向引物上都具有連接尾巴，這樣使一個(gè)尾巴與前一個(gè)引物組的一個(gè)尾巴互補(bǔ)，另一個(gè)尾巴與接下來的引物組中的一個(gè)尾巴互補(bǔ)。這個(gè)原則適于所有擴(kuò)增靶標(biāo)序列(將要在兩個(gè)其他靶標(biāo)序列之間被連接)的引物組。
基因特異引物部分的設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)遵守已知的引物設(shè)計(jì)原則，例如使引物的二聚體化、發(fā)夾形成以及非特異退火最小。而且，在可能的情況下應(yīng)當(dāng)避免3'的堿基出現(xiàn)多個(gè)G 或者C核苷酸。引物組中基因特異區(qū)域的熔解溫度(Tm)優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)互相相等，相差正負(fù)5 攝氏度。在本發(fā)明中，合意的Tm值在45攝氏度到75攝氏度之間，對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，大約60 攝氏度是最佳的。有利的是，可以在根據(jù)本任務(wù)而設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序的輔助下進(jìn)行初始的引物設(shè)計(jì)。但是引物設(shè)計(jì)一般需要實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)和常規(guī)的優(yōu)化。這可以通過例如對(duì)使用該引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和測(cè)序進(jìn)行分析而進(jìn)行。引物中簡(jiǎn)并位置的使用在擴(kuò)增具有可變區(qū)域的序列或者在尋找屬于特定蛋白質(zhì)類型的新的家族成員時(shí)是有用的方法。簡(jiǎn)并位置的數(shù)目可能也需要進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明包含改進(jìn)的引物組，它們可以一起用于高度多重化的形式中。de HaarcKde Haard, H. J. et al. 1999. J. Biol. Chem. 274，18218-18230)描述的引物組作為起始點(diǎn)使用， 通過修整引物的3'端降低非特異相互作用以及添加重疊-延伸尾巴或者適合于通過連接方法進(jìn)行連接的尾巴，對(duì)引物組進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是引物混合物由至少兩個(gè)引物組組成，該引物組能夠引起至少兩個(gè)目標(biāo)核苷酸序列的擴(kuò)增，促進(jìn)它們的連接。本發(fā)明的引物混合物能夠引起至少兩個(gè)來自雜聚蛋白質(zhì)(例如屬于酶、抑制劑、結(jié)構(gòu)蛋白、毒素、通道蛋白、G-蛋白、受體蛋白、免疫球蛋白超家族蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等等)的亞單位或者結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是包含引物組的重疊-延伸引物混合物，其中每個(gè)引物組的至少一個(gè)引物組成員包含一個(gè)能夠與第二個(gè)引物組的一個(gè)引物組成員的重疊-延伸尾巴發(fā)生雜交的重疊-延伸尾巴。重疊-延伸尾巴通過使每一個(gè)產(chǎn)生自引物組的產(chǎn)物裝備上與相鄰產(chǎn)物互補(bǔ)的尾巴，使得在多重重疊-延伸PCR擴(kuò)增中目標(biāo)核苷酸的即刻連接成為可能。但是這并不意味著連接必須在這個(gè)第一輪PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)。根據(jù)反應(yīng)的設(shè)置，可以在使用第一輪PCR(多重 PCR擴(kuò)增)的外引物進(jìn)行的額外擴(kuò)增中進(jìn)行大部分的實(shí)際連接。本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是引物組，該引物組被設(shè)計(jì)為擴(kuò)增含有可變區(qū)編碼序列的核苷酸序列家族。這些家族的實(shí)例有κ輕鏈(如在人中的VKI-VI)，λ輕鏈(如在人中的 VL1-10)以及來自免疫球蛋白的可變重鏈(例如人中的VH1-7和小鼠中的VH1-15)，以及 α，β，γ或者δ TcR可變區(qū)。用于擴(kuò)增含有可變區(qū)編碼序列的核苷酸序列家族的引物組通常包含多個(gè)引物，其中一些引物可以是簡(jiǎn)并引物。例如使用引物組〔包含與κ鏈(V"引物)或者κ前導(dǎo)序列引物)和/或λ鏈(yLX引物)或者λ前導(dǎo)序列引物) (正向引物)以及恒定區(qū)κ (Ck引物)和/或λ引物(Ca引物)(反向引物)或者大量這種引物的5'端互補(bǔ)的大量引物〕對(duì)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)編碼序列家族進(jìn)行擴(kuò)增?；蛘呖梢允褂幂p鏈連接區(qū)引物(Ju和/或Ju引物)作為反向引物而不使用恒定區(qū)引物?；蛘哒蛞锱c在可變輕鏈前導(dǎo)序列之前的UTR區(qū)域退火。同樣，可以使用一個(gè)引物組(使用各種不同的引物組合)擴(kuò)增免疫球蛋白重鏈可變區(qū)編碼序列家族。例如與重鏈可變區(qū)5' 端互補(bǔ)的引物(Vh引物)或者與該區(qū)前導(dǎo)序列互補(bǔ)的引物(Vm引物)(正向引物)以及大量重鏈連接區(qū)引物(Jh引物)或者重鏈恒定區(qū)引物(反向引物)。Ch引物可以是同型特異的并且原則上可以使用任何的Ch引物(例如Chi，Ch2，Ch3，或Ch4)，以及可以產(chǎn)生全長(zhǎng)重鏈的 Ch引物?；蛘哒蛞锱c在可變重鏈前導(dǎo)序列之前的UTR區(qū)域退火。
如果對(duì)于可變區(qū)引物觀察到交叉雜交，則使用與前導(dǎo)序列而不是與可變區(qū)5'端退火的正向引物是特別有用的。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在細(xì)胞內(nèi)加工的過程中前導(dǎo)序列可以被切掉， 所以可以從最終的蛋白質(zhì)中除去由于交叉雜交造成的突變。實(shí)施例9描述了抗體可變重鏈和κ輕鏈前導(dǎo)序列引物的設(shè)計(jì)。起動(dòng)的位點(diǎn)在前導(dǎo)編碼序列3'端(C末端)內(nèi)使引物比以前的抗體前導(dǎo)序列引物有優(yōu)勢(shì)，原因是這導(dǎo)致擴(kuò)增后的序列在細(xì)菌和真核表達(dá)載體之間的穿梭，使前導(dǎo)序列在兩個(gè)系統(tǒng)中都起作用。實(shí)施例9中描述的設(shè)計(jì)系統(tǒng)可以很容易地用于抗體λ輕鏈，TcRa、β、γ或者δ鏈。本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是與可變區(qū)編碼序列之前的前導(dǎo)編碼序列的3'端退火的引物及其在可變區(qū)編碼序列擴(kuò)增中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)選特點(diǎn)是使用與SEQ ID NO 86到92的基因特異區(qū)具有至少90%序列一致性(優(yōu)選至少95%的一致性)的引物，它們對(duì)應(yīng)于在重鏈前導(dǎo)編碼序列的C端退火的引物(Vm引物)。這些SEQ ID NO中基因特異的序列對(duì)應(yīng)于所述序列的第18號(hào)堿基到3' 末端(還請(qǐng)參見表11)。本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的特點(diǎn)是使用與SEQ ID NO 93到98的基因特異區(qū)具有至少 90%序列一致性(優(yōu)選至少95%的一致性)的引物，他們對(duì)應(yīng)于在κ輕鏈前導(dǎo)編碼序列的 C端退火的引物(八u引物)。這些SEQ ID NO中基因特異的序列對(duì)應(yīng)于所述序列的第25 號(hào)堿基到3'末端(還請(qǐng)參見表11)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于多重重疊-延伸PCR以及也可能用于逆轉(zhuǎn)錄步驟的多重重疊-延伸引物混合物包含a)至少一個(gè)與免疫球蛋白輕鏈區(qū)編碼序列有義鏈互補(bǔ)的Q或者叉引物；b)至少一個(gè)與免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)編碼序列反義鏈互補(bǔ)的，并且能夠與a)中的引物形成引物組的\ 5'引物或者&前導(dǎo)序列引物；c)至少一個(gè)與免疫球蛋白恒定重鏈結(jié)構(gòu)域編碼序列的有義鏈互補(bǔ)或者與重鏈連接區(qū)有義鏈互補(bǔ)的Ch或者Jh引物， 以及d)至少一個(gè)與免疫球蛋白重鏈可變區(qū)編碼序列反義鏈互補(bǔ)的，并且能夠與c)中的引物形成引物組的Vh 5'引物或者Vh前導(dǎo)序列引物。本發(fā)明的引物組可以是例如Vlk +C κ，Vla +Ca，Vlk +Jlk，Vla +Jla，Vlk l+C κ， VlaL+CA，Vlkl+Jlk，Vlal+Jla，VH+JH, VH+CH，VHL+JH 或者 Vm+CH 或者這些引物組的組合，它們能夠擴(kuò)增編碼可變區(qū)的靶標(biāo)序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，引物和VJVj引物適合于擴(kuò)增包含κ輕鏈可變區(qū)或者λ輕鏈可變區(qū)的序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，CJjJ引物和VJVJ引物適合于擴(kuò)增κ輕鏈可變區(qū)和λ輕鏈可變區(qū)的編碼序列。在本發(fā)明的一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于輕鏈擴(kuò)增的正向引物Va引物與SEQ ID 93到98的基因特異區(qū)域具有至少90%的序列一致性(優(yōu)選至少95%的一致性)，用于重鏈擴(kuò)增的正向引物Vm引物與SEQ ID 86到92的基因特異區(qū)域具有至少90%的序列一致性(優(yōu)選至少95%的一致性)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，攜帶免疫球蛋白W引物連接尾巴，優(yōu)選是互補(bǔ)重疊-延伸尾巴的形式。這產(chǎn)生了以頭-頭方式連接的可變區(qū)編碼序列。對(duì)于以頭-尾方式連接的可變區(qū)編碼序列，Q/叉和VhAV弓丨物含有連接尾巴或者和Ch/Jh弓丨物含有連接尾巴，優(yōu)選是互補(bǔ)重疊-延伸尾巴的形式。對(duì)于以尾-尾方式連接的可變區(qū)編碼序列，CL/JL和CH/JH引物含有連接尾巴，優(yōu)選是互補(bǔ)重疊_延伸尾巴的形式(圖3)。優(yōu)選地，本發(fā)明的多重引物混合物，包括多重重疊-延伸引物混合物包含兩個(gè)引物組。這樣，一個(gè)多重引物混合物包含至少四個(gè)不同的引物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，多重引物混合物包含四個(gè)以上的不同引物。本發(fā)明的多重引物混合物用于在單一容器中靶標(biāo)序列的擴(kuò)增。例如在同一個(gè)容器中κ、λ和重鏈可變區(qū)都被擴(kuò)增。本發(fā)明的一個(gè)多重引物混合物包含16個(gè)不同的簡(jiǎn)并引物，分布如下八個(gè)Vh引物、一個(gè)Cm引物，六個(gè)引物和一個(gè)C κ引物(圖2)。另一個(gè)引物組包含19個(gè)簡(jiǎn)并引物，分布如下八個(gè)Vh引物、四個(gè)Jh 引物，六個(gè)Vu引物和一個(gè)CK引物。第三個(gè)引物組包含22個(gè)簡(jiǎn)并引物，分布如下八個(gè)Vh 引物、一個(gè)Chi引物，11個(gè)V。引物和兩個(gè)Ca引物。第四個(gè)引物組包含27個(gè)簡(jiǎn)并引物，分布如下八個(gè)Vh引物、一個(gè)Chi弓丨物，六個(gè)V"引物，一個(gè)C κ引物，11個(gè)V。引物和兩個(gè)Ca 引物。本發(fā)明還包含引物，該引物用于對(duì)由多重RT-PCR以及此后通過連接方法或者重組方法連接或者多重重疊-延伸RT-PCR得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行額外PCR。這個(gè)額外PCR擴(kuò)增可以使用適用于擴(kuò)增連接的靶標(biāo)序列的引物混合物。這樣的引物混合物可能包含多重引物混合物或者多重重疊_延伸引物混合物的外引物，即與連接的核苷酸序列有義鏈的最外側(cè) 5'端和3'端退火的引物，這樣使整個(gè)連接的產(chǎn)物被擴(kuò)增?？梢杂米鞅景l(fā)明中外引物的引物的實(shí)例是(^/夂和/或。/^引物，其與Jh或者Ch引物形成引物組。這個(gè)過程一般用于增加從多重RT-PCR以及此后通過連接方法或者重組方法得到或者多重重疊-延伸RT-PCR 得到的連接產(chǎn)物的量?；蛘?，與初次多重RT-PCR或者多重重疊_延伸RT-PCR反應(yīng)中使用的外引物相比為嵌套的引物組可以用于對(duì)連接后的核苷酸序列進(jìn)行額外的擴(kuò)增。在本發(fā)明中，這種引物組被稱為嵌套引物組。嵌套引物的設(shè)計(jì)一般遵守的規(guī)則與前面描述的基因特異引物的引物設(shè)計(jì)規(guī)則相同，所不同的是它們從多重RT-PCR或者多重重疊-延伸RT-PCR中使用的外引物的退火位置的3'端引發(fā)。所以由嵌套PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物比從多重RT-PCR以及此后通過連接方法或者重組方法或者多重重疊_延伸RT-PCR得到的連接產(chǎn)物要短。除了增加連接產(chǎn)物的量，嵌套PCR還增加了整體特異性，特別是提高多重重疊_延伸RT-PCR技術(shù)的特異性。 但是應(yīng)當(dāng)注意在進(jìn)行額外擴(kuò)增時(shí)不是所有的前面描述的多重引物混合物/多重重疊_延伸引物混合物都適于與嵌套引物組合在一起。在這種情況下多重引物混合物/多重重疊_延伸引物混合物中的外引物可以用于額外擴(kuò)增或者可以進(jìn)行半嵌套PCR，后面將對(duì)此進(jìn)行描述。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，叉和Jh引物的混合物用作嵌套引物，用于連接后的免疫球蛋白可變區(qū)編碼序列的額外擴(kuò)增。本發(fā)明的嵌套引物還可以包含來自第一個(gè)多重引物混合物/多重重疊-延伸引物混合物的反向(或者正向)外引物以及另一個(gè)在第一個(gè)多重引物混合物/多重重疊-延伸引物混合物的正向(或者反向)退火位置外引物3'側(cè)引發(fā)的嵌套引物。使用這種引物組進(jìn)行額外的PCR擴(kuò)增，這一般被稱為半嵌套PCR。如果在一個(gè)特異區(qū)域(例如對(duì)于可變區(qū)序列)中設(shè)計(jì)嵌套引物(V和J引物)很困難(因?yàn)檫@樣的引物會(huì)在互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)中退火)，則可以例如使用半嵌套PCR。而且，在需要保持連接序列的一端不發(fā)生變化(例如用于克隆目的)時(shí)，可以使用半嵌套PCR。
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本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是在額外擴(kuò)增反應(yīng)中使恒定區(qū)輕鏈編碼序列保持完好。與初次反應(yīng)(多重RT-PCR或者多重重疊-延伸RT-PCR反應(yīng))中使用的外引物相比，額外擴(kuò)增中使用的CJ反向)引物只有輕微修飾。修飾包含在用于初次擴(kuò)增的Q引物的3'端添加幾個(gè)堿基。另外，可以在嵌套的Q引物上加上不同的克隆尾巴。與在初次反應(yīng)中使用的恒定區(qū)重鏈特異的外引物相比，在額外擴(kuò)增中使用的正向引物是完全嵌套的。在額外擴(kuò)增中， 初次反應(yīng)中的外引物和輕微修飾的嵌套Q引物組合以及完全嵌套的正向引物，使特異性增加，這與使用完全嵌套的引物組進(jìn)行的嵌套PCR可以得到的特異性相當(dāng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用Jh引物和修飾的Q引物進(jìn)行嵌套PCR，其中與多重引物混合物/多重重疊-延伸引物混合物中的第一個(gè)Q引物相比，在3'端加上了兩個(gè)到十個(gè)基因特異的堿基對(duì)。多重重疊-延伸PCR的優(yōu)化可以使用幾個(gè)參數(shù)對(duì)兩步和單步的多重重疊-延伸PCR步驟的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化 (參見例如 Henegariu，0. et al. 1997. BioTechniques 23，504—511 ；Markoulatos, P. et al. 2002. J. Clin. Lab. Anal. 16，47-51)。一般地，相同的優(yōu)化參數(shù)可以應(yīng)用于多重RT-PCR， 盡管對(duì)于這種反應(yīng)而言外引物和內(nèi)引物之間的比例不很重要。a.引物濃度攜帶重疊-延伸尾巴的引物(例如V1^P八引物)的濃度優(yōu)選地低于沒有重疊-延伸尾巴的外引物(例如Jh和κ引物)的濃度。如果靶標(biāo)序列中一個(gè)序列的擴(kuò)增效率低于其他序列，例如由于更高GC%導(dǎo)致的低效率，則有可能均衡擴(kuò)增效率。對(duì)于低效率擴(kuò)增的引物組，可以使用更高的濃度，或者降低另一個(gè)引物組的濃度，從而可以實(shí)現(xiàn)上述擴(kuò)增效率的均衡。例如，編碼重鏈可變區(qū)的序列一般具有更高的GC%，所以比輕鏈可變區(qū)的擴(kuò)增效率低。這促進(jìn)使用比Vh引物濃度更低的\ 引物。另外在使用大量引物時(shí)，引物的總濃度可能是一個(gè)問題。通過滴定實(shí)驗(yàn)確定上限。 對(duì)于來自Applied Biosystems的"AmpliTaq Gold" PCR系統(tǒng)，上限是1. IuM總寡核苷酸濃度。而對(duì)于其他的系統(tǒng)，總寡核苷酸濃度可以高達(dá)2. 4uM。這樣的寡核苷酸總濃度上限影響了單個(gè)引物的最高濃度。如果單個(gè)引物濃度過低，有可能導(dǎo)致弱的PCR敏感性。還發(fā)現(xiàn)寡核苷酸引物的質(zhì)量對(duì)于多重重疊-延伸PCR很重要。HPLC純化的寡核苷酸引物產(chǎn)生最好的結(jié)果。b. PCR循環(huán)條件優(yōu)選地，循環(huán)條件如下變性10-30秒94攝氏度退火30-60秒50-70攝氏度，比引物的Tm大約低5攝氏度延伸1分鐘χ EPL 65-72攝氏度，EPL是1Λ表示的預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度.循環(huán)數(shù)30-80最終延伸10分鐘65-72攝氏度對(duì)于單步多重重疊-延伸RT-PCR，在以上概述的擴(kuò)增循環(huán)之前，在循環(huán)程序中加入以下的步驟逆轉(zhuǎn)錄42-60攝氏度30分鐘。在逆轉(zhuǎn)錄單獨(dú)進(jìn)行時(shí)也使用這些條件。
聚合酶激活95攝氏度10-15分鐘。在單步RT-PCR中最好使用熱起始聚合酶。根據(jù)生產(chǎn)商進(jìn)行激活?？梢詫?duì)所有這些參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。特別是退火溫度很重要。因此，開始時(shí)要分別檢測(cè)組成最終引物混合物的每一個(gè)引物組，目的是找到最佳的退火溫度和時(shí)間以及延伸和變性時(shí)間。這會(huì)為這些參數(shù)可以對(duì)多重重疊_延伸引物混合物進(jìn)行優(yōu)化的范圍提供一個(gè)很好的概念。PCR靈敏度差的問題，例如由于低的引物濃度或者低的模板濃度所造成的低PCR 靈敏度可以通過使用大量熱循環(huán)數(shù)目解決。大量熱循環(huán)數(shù)目由35到80個(gè)循環(huán)組成，優(yōu)選大約40個(gè)循環(huán)。另外，更長(zhǎng)的延伸時(shí)間可以改善多重重疊-延伸PCR過程。與一般的1分鐘延伸時(shí)間相比，長(zhǎng)的延伸時(shí)間由1. 5到4分鐘XEPL組成。c.輔助物的使用多重PCR反應(yīng)可以通過使用PCR添加劑例如DMS0、甘油、甲酰胺或者甜菜堿而顯著改善，添加劑使DNA松弛，使模板變性更容易。d. dNTP和氯化鎂脫氧核苷三磷酸(dNTP)的質(zhì)量和濃度對(duì)于多重重疊-延伸PCR來說是重要的。最佳的dNTP濃度是每一種dNTP (dATP, dCTP, dGTP和dTTP) 200到400uM之間，在此濃度以上擴(kuò)增被迅速抑制。更低的dNTP濃度(每種dNTP IOOuM)足以使PCR擴(kuò)增進(jìn)行。dNTP儲(chǔ)液對(duì)融解/凍結(jié)循環(huán)敏感。三到五次這種循環(huán)后多重PCR經(jīng)常進(jìn)行得不好。為了避免這種問題，可以將dNTP分裝成小份在-20攝氏度保存。對(duì)Mg2+的濃度進(jìn)行優(yōu)化是至關(guān)重要的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)DNA聚合酶是依賴于鎂的酶。 除了 DNA聚合酶之外，模板DNA、引物和dNTP也與Mg2+結(jié)合。因此，最佳的Mg2+濃度取決于 dNTP的濃度，模板DNA和樣品緩沖液的組成。如果引物和/或模板DNA緩沖液含有螯合劑例如EDTA或者EGTA，表觀的Mg2+最佳濃度會(huì)被改變。過量的Mg2+濃度使DNA雙鏈穩(wěn)定，防止DNA完全變性，這會(huì)降低產(chǎn)量。過量的Mg2+也可以穩(wěn)定引物與不正確模板位點(diǎn)之間形成的虛假退火，這樣降低了特異性。另一方面，不足量的Mg2+濃度降低了產(chǎn)物的量。dNTP和氯化鎂之間的良好平衡是200-400uM dNTP (每一種)與1. 5_3mM的氯化鎂。e PCR緩沖液的濃度一般地基于氯化鉀的緩沖液對(duì)于多重重疊-延伸PCR足夠；但是基于其他組分例如硫酸銨、硫酸鎂、Tris-HCl或者這些物質(zhì)組合的緩沖液也可以進(jìn)行優(yōu)化用于多重重疊-延伸PCR。參與較長(zhǎng)產(chǎn)物擴(kuò)增的引物對(duì)在低鹽濃度(例如20到50mM氯化鉀)下作用更好，而參與較短產(chǎn)物擴(kuò)增的引物對(duì)在高鹽濃度(例如80到IOOmM氯化鉀)下作用更好。 將緩沖液濃度提高到2X而不是IX，可以提高多重反應(yīng)的效率。f DNA 聚合酶本發(fā)明使用Taq聚合酶作為示例。除此以外也可以使用其他類型的耐熱DNA聚合酶，包括例如Pfu，Phusion，Pwo，Tgo，Tth，Vent，De印-vent。具有或者沒有3'到5'外切核酸酶活性的聚合酶可以單獨(dú)使用或者相互聯(lián)合使用。載體和文庫(kù)
根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)核苷酸序列的連接產(chǎn)生包含連接后的目標(biāo)核苷酸序列的核苷酸片段。另外，這種連接后的目標(biāo)核酸序列文庫(kù)通過本發(fā)明的方法制備，特別是可變區(qū)編碼序列的文庫(kù)。本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是通過本發(fā)明方法制備的、含有連接后的目標(biāo)核苷酸序列的片段或者連接后的目標(biāo)核苷酸序列文庫(kù)向適宜載體中的插入。文庫(kù)可以是組合文庫(kù)或者可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)。由外引物、嵌套引物或者半嵌套引物產(chǎn)生的限制位點(diǎn)優(yōu)選地設(shè)計(jì)為與所選擇的載體的適當(dāng)限制位點(diǎn)相匹配。如果半嵌套、嵌套引物或者外異物中的一個(gè)配備有適宜的重組位點(diǎn)且所選擇的載體也含有一個(gè)重組位點(diǎn)，則連接后的目標(biāo)核酸序列也可以通過重組插入到載體中。原則上對(duì)于可以用作通過本發(fā)明的一種多重RT-PCR-連接方法產(chǎn)生的產(chǎn)物的載體沒有限制。所選擇的載體可以是適宜在細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)的適宜載體，包括例如細(xì)菌、酵母、其他真菌、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些載體可以用于促進(jìn)進(jìn)一步的克隆步驟、載體系統(tǒng)之間的穿梭、插入到載體中的產(chǎn)物的展示、插入產(chǎn)物的表達(dá)和/或向宿主基因組中的整合。克隆和穿梭載體優(yōu)選是細(xì)菌載體。但是，在克隆和穿梭步驟中也可以應(yīng)用其他類型的載體。展示載體可以是例如來自fd、M13或者f 1絲狀噬菌體的噬菌體載體或者噬菌粒載體。這些載體能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)在絲狀噬菌體表面的展示，所述蛋白質(zhì)包括例如結(jié)合蛋白質(zhì)或者其片段。適宜在核糖體、DNA、酵母細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示的展示載體也是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。這些包含例如病毒載體或者編碼嵌合蛋白的載體。對(duì)于所有提到的物種都有表達(dá)載體，要選擇的載體完全決定于要表達(dá)的蛋白質(zhì)。 一些表達(dá)載體還能夠通過隨機(jī)整合或者利用適當(dāng)?shù)闹亟M位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)特異整合，整合到宿主的基因組中。當(dāng)引入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中時(shí)，可以設(shè)計(jì)表達(dá)載體使其提供額外的編碼序列，當(dāng)連接產(chǎn)物按照閱讀框插入到這些序列中時(shí)，這些編碼序列能夠使更大的蛋白，例如全長(zhǎng)的單克隆抗體表達(dá)。按照閱讀框的這種插入還可以促進(jìn)嵌合蛋白的表達(dá)，所述嵌合蛋白促進(jìn)在絲狀噬菌體或者細(xì)胞表面的展示。在噬菌體展示系統(tǒng)中，連接的目標(biāo)核苷酸序列可以按照閱讀框插入到編碼外殼蛋白，例如PlII或者pVIII(Barl3as，C.F. et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88，7978-7982 ；Kang, Α. S. et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 4363-4366)的序列中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)的目標(biāo)核苷酸序列連接片段包含與輕鏈可變區(qū)編碼序列相連的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)編碼序列。優(yōu)選地，這些連接后的序列插入到含有編碼一個(gè)或者更多免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的序列的載體中。對(duì)插入進(jìn)行工程化，使連接后的重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)編碼序列按照閱讀框插入到恒定區(qū)編碼序列中。這樣的插入可以例如產(chǎn)生Fab表達(dá)載體，全長(zhǎng)的抗體表達(dá)載體或者編碼全長(zhǎng)抗體的片段的表達(dá)載體。優(yōu)選地這樣的載體是適宜用于篩選的表達(dá)載體(例如大腸桿菌、噬菌?；蛘卟溉閯?dòng)物載體)，并且恒定區(qū)重鏈編碼序列選自人免疫球蛋白類型IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgM, IgAl, IgA2，IgD，或者IgE，這樣使Fab或者全長(zhǎng)的重組抗體表達(dá)。除了恒定重鏈編碼序列以外，載體可能還含有選自人λ或者κ鏈的恒定輕鏈編碼序列。當(dāng)連接的核苷酸序列只編碼免疫球蛋白可變區(qū)編碼序列(Fv)時(shí)，這是合適的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，單個(gè)的連接核苷酸序列片段包含與β鏈可變區(qū)編碼序列相連的TcR α鏈可變區(qū)編碼序列或者包含與δ鏈可變區(qū)編碼序列相連的γ鏈可變區(qū)編碼序列。優(yōu)選地，這些連接的序列插入到含有一個(gè)或者更多TcR恒定結(jié)構(gòu)域編碼序列的載體中。對(duì)插入進(jìn)行工程化，使插入的連接后的可變區(qū)編碼序列與相應(yīng)的TcR恒定區(qū)編碼序列按閱讀框融合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的載體是包含編碼亮氨酸拉鏈(與 TcR恒定區(qū)按閱讀框融合)序列的嵌合表達(dá)載體。已經(jīng)證明這種構(gòu)建體提高了可溶性TcR 的穩(wěn)定性(ffillcox, B. Ε. et al. 1999. Protein Sci 8,2418-2423) 可以通過兩種不同的方法將本發(fā)明的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)引入到載體中。在第一種方法中，將單一的關(guān)聯(lián)對(duì)逐個(gè)插入到適宜的載體中。這樣的載體文庫(kù)可以分別保存或者匯集在一起。在第二種方法中，在載體插入之前，匯集所有的關(guān)聯(lián)對(duì)，之后批量地插入到適宜的載體中，產(chǎn)生載體的匯集文庫(kù)(在圖12中予以闡明)。這種載體文庫(kù)包含多種多樣的可變區(qū)編碼序列對(duì)。本發(fā)明的一方面是連接后的可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)。優(yōu)選地，文庫(kù)中的單個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)包含與重鏈可變區(qū)編碼序列相連的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)編碼序列。另一個(gè)優(yōu)選的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)包含連接的TcR區(qū)編碼序列，其中每一個(gè)TcR區(qū)編碼序列包含與β鏈可變區(qū)編碼序列相連的α鏈可變區(qū)編碼序列和/或與δ鏈可變區(qū)編碼序列相連的TcR Y鏈可變區(qū)編碼序列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是連接后的可變區(qū)編碼序列(編碼針對(duì)某一靶標(biāo)的所需結(jié)合特異性)關(guān)聯(lián)對(duì)的亞文庫(kù)。優(yōu)選地這些關(guān)聯(lián)對(duì)包含連接后的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)編碼序列、TcR的α鏈可變區(qū)和β鏈可變區(qū)編碼序列和/或TcR γ鏈可變區(qū)和δ鏈可變區(qū)編碼序列。另一個(gè)實(shí)施方案是亞文庫(kù)，選自如整個(gè)發(fā)明中描述的可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)的親本文庫(kù)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是編碼全長(zhǎng)免疫球蛋白(選自人免疫球蛋白類型IgAl、 IgA2、IgD、IgE、IgGU IgG2、IgG3、IgG4、或者IgM)關(guān)聯(lián)對(duì)的文庫(kù)或者亞文庫(kù)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選特點(diǎn)是文庫(kù)或者亞文庫(kù)，編碼可溶和穩(wěn)定的TcR關(guān)聯(lián)對(duì)。本發(fā)明的特點(diǎn)是所述文庫(kù)的多樣性，所述文庫(kù)包含至少5，10，20，50，100，1000， 104, 105或者IO6個(gè)不同的關(guān)聯(lián)對(duì)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的連接后的可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)可以通過包含這里描述的步驟的方法得到。該文庫(kù)還被稱為親本文庫(kù)。篩選和選擇使用本發(fā)明的一種方法從供體中分離連接后的可變區(qū)編碼序列對(duì)的親本文庫(kù)，其預(yù)計(jì)代表了結(jié)合蛋白的多樣性，其中的一些蛋白是無關(guān)的，即不與所需的靶標(biāo)結(jié)合，特別是對(duì)于組合文庫(kù)而言。因此，本發(fā)明包含了對(duì)針對(duì)某一個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合多樣性亞組的編碼亞文庫(kù)進(jìn)行富集和篩選。對(duì)于關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)，文庫(kù)的多樣性預(yù)計(jì)代表了供體物質(zhì)中存在的多樣性，只有少數(shù)的隨機(jī)連接可變區(qū)。因此在篩選由關(guān)聯(lián)對(duì)組成的文庫(kù)中靶標(biāo)特異的結(jié)合親和性之前，不一定需要富集步驟。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生連接后的可變區(qū)編碼序列對(duì)的文庫(kù)的方法還包含了通過選擇連接后可變區(qū)序列對(duì)亞組(所述亞組編碼具有所需靶標(biāo)特異性的結(jié)合蛋白)建立亞文庫(kù)。這種對(duì)連接的可變區(qū)編碼序列的選擇也被稱為靶標(biāo)特異關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可變區(qū)編碼序列的靶標(biāo)特異關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)被轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體上。免疫學(xué)檢測(cè)法一般適宜對(duì)靶標(biāo)特異的免疫球蛋白可變區(qū)編碼序列進(jìn)行選擇。這些檢測(cè)法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，包括例如ELISPOTS，ELISA、膜檢測(cè)法(例如Wfestern印跡)、膜上的陣列或者FACS。檢測(cè)法可以使用產(chǎn)生自免疫球蛋白可變區(qū)編碼序列的多肽直接進(jìn)行。或者免疫檢測(cè)法可以與富集方法聯(lián)合進(jìn)行或在其后進(jìn)行，例如噬菌體展示、核糖體展示、細(xì)菌表面展示、酵母展示、真核病毒展示、RNA展示或者共價(jià)展示(在FitZGerald，K.， 2000. Drug Discov. Today 5，253-258中有綜述)。如圖10中所闡明的，可以對(duì)關(guān)聯(lián)Fab表達(dá)文庫(kù)和關(guān)聯(lián)全長(zhǎng)抗體表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，這樣產(chǎn)生陽(yáng)性克隆的亞文庫(kù)。這種篩選檢測(cè)和富集步驟也適于Fv或者scFv片段或者連接的可變區(qū)的組合文庫(kù)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用高通量的篩選檢測(cè)法進(jìn)行可變區(qū)編碼序列的靶標(biāo)特異關(guān)聯(lián)對(duì)或者組合對(duì)的亞文庫(kù)的選擇。高通量的篩選檢測(cè)法可以是，但是不止限于，使用半自動(dòng)化或者全自動(dòng)化儀器進(jìn)行的ELISA檢測(cè)。它還可以是膜檢測(cè)，其中細(xì)菌被機(jī)械地挑取并用格柵法印到瓊脂平板上面的適當(dāng)?shù)哪ど?，產(chǎn)生表達(dá)抗原結(jié)合分子的菌落陣列。分子通過膜分泌到下方的另一個(gè)抗原包被的膜上，抗原包被的膜可以獨(dú)立制備， 用于鑒定分泌針對(duì)所需靶標(biāo)的抗原結(jié)合分子的克隆(de ffildt, R.M.，et al. 2000. Nat. Biotechnol. 18，989-994)。在通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)選擇了抗原結(jié)合克隆的關(guān)聯(lián)對(duì)或者組合對(duì)亞文庫(kù)后，就可能通過對(duì)連接的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)編碼序列進(jìn)行DNA測(cè)序，進(jìn)行進(jìn)一步的分析。首先這種DNA測(cè)序可以提供關(guān)于文庫(kù)多樣性的信息，例如胚系來源、家族分布以及CDR 區(qū)內(nèi)部的成熟。這種分析可以對(duì)代表廣泛多樣性的克隆進(jìn)行選擇，去掉重復(fù)的克隆。第二， DNA測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)在分離過程中弓丨入的突變。在分析可變區(qū)編碼序列時(shí)，在評(píng)價(jià)一個(gè)突變是否可以接受時(shí)需要考慮三種類型的突變i)最常見類型的突變來自家族內(nèi)的交叉引發(fā)(cross-priming)，其中V基因的引物在一個(gè)特定的V基因家族中引發(fā)了錯(cuò)誤的亞組。這種被引入的改變主要是在一個(gè)特定位置天然存在的密碼子被替代。由于在V基因家族內(nèi)部的高度序列同源性，這些改變通?？梢员划?dāng)做保守和可以接受的改變；ii)較不常見的突變是通過家族間的交叉引發(fā)誘導(dǎo)的(例如VH3家族的引物引發(fā)VHl家族的編碼序列)并且誘導(dǎo)更為顯著的結(jié)構(gòu)改變，有時(shí)沒有天然的對(duì)應(yīng)物。這種改變有可能通過產(chǎn)生新的表位影響可變區(qū)的免疫原性。使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)可以容易地鑒定出這種改變并且對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，或者可以將該克隆從文庫(kù)中清除；iii)由Taq DNA聚合酶產(chǎn)生的錯(cuò)誤在恒定區(qū)編碼序列中很容易發(fā)現(xiàn)并且可以容易地去除。但是，由Taq引入的突變當(dāng)然也會(huì)在可變區(qū)編碼序列中存在，在那里它們與天然存在的體細(xì)胞突變無法區(qū)分，因?yàn)轶w細(xì)胞突變也是由于可變區(qū)編碼序列中的隨機(jī)突變?cè)斐傻??？紤]到這些突變是非系統(tǒng)突變并且僅僅以獨(dú)特的方式影響特定的對(duì)，所以對(duì)這些突變不予理睬是合理的?？梢允褂眠M(jìn)一步的序列分析確定關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的混雜程度性，如表20中對(duì)VH群H4 所示例的。
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如實(shí)施例9中所描述的，使用可以在可變區(qū)編碼序列前導(dǎo)序列中退火的引物，而不是在可變區(qū)5'區(qū)退火的引物，可以在表達(dá)文庫(kù)中避免i)和ii)中所描述的突變。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異的亞文庫(kù)和可能進(jìn)行了序列分析的連接免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)編碼序列對(duì)被轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。這種轉(zhuǎn)移可以向前面部分中描述的任何載體中進(jìn)行，使全長(zhǎng)的重組抗體被表達(dá)。如果使用哺乳動(dòng)物關(guān)聯(lián)全長(zhǎng)抗體表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，可能就不需要這樣的轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，從富集了 T淋巴細(xì)胞的含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分產(chǎn)生親本文庫(kù)?？梢詫?duì)組成親本文庫(kù)的連接后的可變區(qū)編碼序列對(duì)進(jìn)行選擇，從中選出編碼連接后可變區(qū)序列(由編碼具有所需靶標(biāo)特異性的結(jié)合蛋白的α及β和/或Y及δ鏈組成)對(duì)亞組的序列，產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對(duì)或者組合對(duì)的亞文庫(kù)。接下來可以使用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)例如使用四聚體MHC-肽復(fù)合體染色的方法(例如Callan，M.F. et al. 1998. J. Exp. Med. 187， 1395-1402 ；Novak, Ε. J. et al. 1999. J. Clin. Invest 104，R63-R67)，通過測(cè)量以 IL-2 釋放形式的細(xì)胞應(yīng)答或者通過更為精密復(fù)雜的方法如酵母或者逆轉(zhuǎn)錄病毒展示技術(shù)，從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的混合物中鑒定出抗原特異的T細(xì)胞受體。宿主細(xì)胞和表達(dá)本發(fā)明的文庫(kù)可以轉(zhuǎn)移到適于表達(dá)和生產(chǎn)蛋白質(zhì)的載體中，所述蛋白質(zhì)由連接的目標(biāo)核酸序列編碼，特別是由含有結(jié)合蛋白或者其片段的可變區(qū)編碼。這些載體在“載體和文庫(kù)”部分中有所描述，提供了例如屬于所選種的全長(zhǎng)抗體、Fab片段、Fv片段、scFv、膜結(jié)合或者可溶性tcR或者TcR片段的表達(dá)。本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)是連接后可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)的載體文庫(kù)或者亞文庫(kù)或者編碼連接后可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)的單個(gè)克隆引入到宿主細(xì)胞中，用于擴(kuò)增和/或表達(dá)。 宿主細(xì)胞可以選自細(xì)菌、酵母、其他真菌、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。對(duì)于表達(dá)的目的，優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞 (例如Sp2/0細(xì)胞，NSO) ,NIH 3T3、成纖維細(xì)胞或者無限增殖人細(xì)胞例如HeLa細(xì)胞、HEK293 細(xì)胞或者PER. C6。載體向宿主細(xì)胞的引入可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染方法完成，包括磷酸鈣沉淀、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體融合、紅細(xì)胞外殼融合(RBC ghost fusion)、原生質(zhì)體融合、病毒感染等等。單克隆全長(zhǎng)抗體、Fab片段、Fv片段和scFv片段的制備是眾所周知的。用于治療的重組多克隆抗體的制備是相當(dāng)新的領(lǐng)域。在PCT申請(qǐng)WO 2004/061104 中已經(jīng)描述了重組多克隆生產(chǎn)技術(shù)。簡(jiǎn)而言之，該技術(shù)涉及的是適于作為生產(chǎn)細(xì)胞系的細(xì)胞庫(kù)的制備。對(duì)于該技術(shù)接下來的描述是針對(duì)關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的，但是也同樣適于組合文庫(kù)。在細(xì)胞庫(kù)中的單個(gè)細(xì)胞能夠例如從關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)中表達(dá)重組多克隆結(jié)合蛋白的不同成員。為了保證單個(gè)細(xì)胞表達(dá)多克隆結(jié)合蛋白的單一關(guān)聯(lián)對(duì)而不是幾個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)，編碼關(guān)聯(lián)對(duì)的核酸序列引入到每個(gè)單個(gè)細(xì)胞基因組中的單個(gè)位點(diǎn)特異性位點(diǎn)。這是細(xì)胞庫(kù)的一個(gè)重要特點(diǎn)，因?yàn)檫@防止了從每一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的重鏈和輕鏈的混雜，但是還因?yàn)樗a(chǎn)生的細(xì)胞互相之間除了單個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)的可變區(qū)中有小的差異以外基本上都是相同的。這個(gè)特點(diǎn)可以使細(xì)胞庫(kù)在生產(chǎn)所需的時(shí)間段中進(jìn)行無偏倚的生長(zhǎng)。為了保證單一位點(diǎn)特異的整合，應(yīng)該使用只有一個(gè)整合位點(diǎn)的宿主細(xì)胞系，這些通常是商業(yè)化的，例如含有單一 FRT位點(diǎn)的^witrogen的CHO Flp-^i細(xì)胞。該細(xì)胞系的適當(dāng)載體含有一個(gè)對(duì)應(yīng)的FRT位點(diǎn)并且通過Flp重組酶引入到基因組中。還有一些其他已知的可以與它們的對(duì)應(yīng)重組位點(diǎn)聯(lián)合使用的重組酶，例如 Cre, β重組酶、Gin、Pin、PinB、PinD、R/RS、λ整合酶或者噬菌體(DC31整合酶。另外，適當(dāng)?shù)妮d體含有選擇標(biāo)記，可以對(duì)位點(diǎn)特異的整合子進(jìn)行選擇?？梢酝ㄟ^幾個(gè)不同的轉(zhuǎn)染和生產(chǎn)策略實(shí)現(xiàn)多克隆生產(chǎn)細(xì)胞系的制備以及來自這樣的細(xì)胞系的重組多克隆蛋白質(zhì)的制備。一種方式是使用混和成為單一組合物的載體文庫(kù)，用于轉(zhuǎn)染每個(gè)細(xì)胞具有單一整合位點(diǎn)的宿主細(xì)胞系。該方法被稱為批量轉(zhuǎn)染(bulk transfection)或者成批轉(zhuǎn)染。一般地，前面描述的載體和宿主細(xì)胞設(shè)計(jì)可以保證在正確選擇時(shí)可以得到能夠進(jìn)行無偏倚生長(zhǎng)的多克隆細(xì)胞系。在開始重組多克隆蛋白生產(chǎn)之前可以制備冷凍的多克隆細(xì)胞系的儲(chǔ)備物。另一種方式是將一個(gè)載體文庫(kù)分成幾個(gè)級(jí)分，使一個(gè)組合物中含有大致5到50 個(gè)該文庫(kù)的單個(gè)載體，用于轉(zhuǎn)染。優(yōu)選地，文庫(kù)的一個(gè)級(jí)分由10到20個(gè)單個(gè)載體組成。 然后將每個(gè)組合物轉(zhuǎn)染到一等份的宿主細(xì)胞中。該方法被稱為半批量轉(zhuǎn)染(semi-bulk transfection) 0轉(zhuǎn)染的份數(shù)取決于文庫(kù)的大小和每一個(gè)級(jí)分中單個(gè)載體的數(shù)目。如果文庫(kù)例如由100個(gè)不同的關(guān)聯(lián)對(duì)組成，分成含有20個(gè)不同成員的級(jí)分，則需要用組合物文庫(kù) (由原始文庫(kù)的不同級(jí)分組成)轉(zhuǎn)染5份宿主細(xì)胞。對(duì)每份宿主細(xì)胞篩選位點(diǎn)特異的整合。 優(yōu)選地，每份分別進(jìn)行選擇。但是也可以在選擇之前匯集小份?？梢詫?duì)等份的克隆多樣性進(jìn)行分析，只有那些具有足夠多樣性的等份才會(huì)被用于制備多克隆關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)儲(chǔ)備物。為了獲得所需的多克隆細(xì)胞系用于生產(chǎn)，在制備凍存儲(chǔ)備物之前可以在從儲(chǔ)備物中取出小份后或者在短期的增殖和適應(yīng)時(shí)間之后立即將小份混和?？梢赃x擇將細(xì)胞小份在整個(gè)制備過程中分開保存，將每一個(gè)小份的產(chǎn)物組合在一起得到多克隆蛋白質(zhì)組合物，而不是在制備之前匯集細(xì)胞的小份。第三種方式是高通量的方法，使用組成關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的單個(gè)載體分別轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。該方法被稱為單獨(dú)轉(zhuǎn)染(individual transfection)。優(yōu)選地，對(duì)單獨(dú)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞分別選擇位點(diǎn)特異的整合。選擇后產(chǎn)生的單個(gè)細(xì)胞克隆可以分析其增殖時(shí)間，優(yōu)選地具有相似生長(zhǎng)速率的克隆被用于制備多克隆關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)儲(chǔ)備物。在制備儲(chǔ)備物之前可以在從儲(chǔ)備物中取出小份后或者在短期的增殖和適應(yīng)時(shí)間之后立即將單個(gè)細(xì)胞克隆混和，得到所需的多克隆細(xì)胞系。該方法可以除去在轉(zhuǎn)染、整合和篩選中任何可能的殘留序列偏倚?；蛘咴谶M(jìn)行選擇之前混合單個(gè)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，這可以控制由于轉(zhuǎn)染造成的序列偏倚。在以上概述的生產(chǎn)策略中共同的特點(diǎn)是所有組成重組多克隆蛋白的單個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)可以在一個(gè)或者有限數(shù)目的生物反應(yīng)器中制備，唯一的區(qū)別在于選擇在什么階段制備由多克隆生產(chǎn)細(xì)胞系組成的細(xì)胞庫(kù)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是包含可變區(qū)編碼序列連接對(duì)關(guān)聯(lián)文庫(kù)或者亞文庫(kù)的宿主細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞群包含從分離的單細(xì)胞群(由淋巴細(xì)胞組成)得到的文庫(kù)，使用本發(fā)明的多重RT-PCR擴(kuò)增之后通過連接方法或者重組方法進(jìn)行連接或者本發(fā)明的多重重疊-延伸RT-PCR技術(shù)，以連接關(guān)聯(lián)對(duì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含可變區(qū)編碼序列連結(jié)對(duì)的組合文庫(kù)或者亞文庫(kù)的宿主細(xì)胞群。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞群包含對(duì)應(yīng)于文庫(kù)多樣性的多樣性細(xì)胞群(細(xì)胞已經(jīng)被所述的文庫(kù)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染)。優(yōu)選地，細(xì)胞群的每一個(gè)細(xì)胞只由整個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的一個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)組成，沒有一個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的單個(gè)成員超過表達(dá)自宿主細(xì)胞群的個(gè)體成員總數(shù)的50%、更為優(yōu)選25 %，或者最優(yōu)選10 %。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞群是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。如上描述的宿主細(xì)胞群可以用于表達(dá)重組多克隆結(jié)合蛋白，因?yàn)榧?xì)胞群的單個(gè)細(xì)胞由具有各種多樣性的可變區(qū)編碼序列組成。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是表達(dá)自包含載體文庫(kù)的宿主細(xì)胞的重組多克隆蛋白，所述載體編碼連接后的可變區(qū)編碼序列多樣性關(guān)聯(lián)對(duì)，其中這樣的文庫(kù)可以通過本發(fā)明的方法獲得。通常本發(fā)明的重組多克隆蛋白包含至少2，5，10，20，50，100，1000，IO4, IO5或者IO6 個(gè)由不同關(guān)聯(lián)對(duì)組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是表達(dá)自宿主細(xì)胞群的重組多克隆免疫球蛋白，該宿主細(xì)胞群包含編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列多樣性關(guān)聯(lián)對(duì)的載體文庫(kù)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是表達(dá)自包含載體文庫(kù)的宿主細(xì)胞群的重組多克隆TcR，這些載體編碼與β鏈可變區(qū)編碼序列相連的TcR α鏈可變區(qū)和/或與δ鏈可變區(qū)編碼序列相連的TcRY鏈可變區(qū)序列的多樣性關(guān)聯(lián)對(duì)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是適于進(jìn)行單克隆蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。特別地，單克隆抗體包含輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)形成的關(guān)聯(lián)對(duì)或者是包含α可變區(qū)與β可變區(qū)或者δ可變區(qū)與Υ可變區(qū)形成的關(guān)聯(lián)對(duì)的單克隆TcR。優(yōu)選地，這樣的單克隆生產(chǎn)細(xì)胞系不是雜交瘤細(xì)胞系。這種單克隆抗體或者TcR可以通過在連接多個(gè)非相鄰目標(biāo)核苷酸序列的方法中加入以下的步驟而產(chǎn)生a)向載體中插入所述的連接后的核苷酸序列；b)將所述的載體引入宿主細(xì)胞中；c)在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；以及d)獲得表達(dá)自插入所述宿主細(xì)胞的載體的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。優(yōu)選地，引入宿主細(xì)胞的載體編碼可變區(qū)編碼序列的單個(gè)關(guān)聯(lián)對(duì)。本發(fā)明的應(yīng)用本發(fā)明的一項(xiàng)主要應(yīng)用是可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)通過高通量方法的連接，特別是免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列或者TcRci和β鏈或者Y和δ鏈可變區(qū)編碼序列的連接，用于制備關(guān)聯(lián)對(duì)的文庫(kù)。除了產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)之外，也可以使用本發(fā)明的多重 RT-PCR以及隨后通過連接方法或者重組方法或者多重重疊-延伸RT-PCR技術(shù)的連接，在遺傳多樣性細(xì)胞群、來自這種細(xì)胞群的細(xì)胞裂解物或者從這種細(xì)胞群中純化的RNA上進(jìn)行上述的技術(shù)，制備組合文庫(kù)。文庫(kù)、亞文庫(kù)或者來自這些文庫(kù)中一個(gè)文庫(kù)的單一克隆有助于多克隆或者單克隆蛋白質(zhì)的表達(dá)。特別地可以從本發(fā)明的文庫(kù)中獲得單克隆或者多克隆抗體。重組單克隆抗體在診斷、治療和預(yù)防中的使用是眾所周知的。通過本發(fā)明制備的重組單克隆和多克隆抗體與通過現(xiàn)有技術(shù)制備的抗體產(chǎn)物具有相同的應(yīng)用。特別地，可以通過本發(fā)明的方法制備包含與至少一種藥物上可以接受的賦形劑聯(lián)合的多克隆重組免疫球蛋白作為活性成分的藥物組合物。更為優(yōu)選的是藥物組合物，其中多克隆重組免疫球蛋白包含可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)。這些多克隆重組免疫球蛋白藥物組合物可以用作藥物。 組合物中的多克隆重組免疫球蛋白對(duì)于事先確定的疾病靶標(biāo)可以是特異的，或者與該靶標(biāo)具有反應(yīng)性，這樣組合物可以用于治療、緩解或者阻止哺乳動(dòng)物例如人、家養(yǎng)動(dòng)物或者寵物中的疾病例如癌癥、感染、炎性疾病、過敏、哮喘和其他呼吸疾病、自體免疫疾病、免疫機(jī)能失常、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝和內(nèi)分泌疾病、移植排斥或者不需要的妊娠。本發(fā)明的另一項(xiàng)應(yīng)用不能使用常規(guī)的單克隆組合抗體技術(shù)獲得。在保護(hù)性抗原表征得很少或者是完全未知的情況下，例如在剛剛出現(xiàn)的感染性疾病中，不可能篩選能夠提供針對(duì)該疾病保護(hù)的單克隆抗體。但是，有可能使用本發(fā)明從已經(jīng)具有確立的保護(hù)性抗體應(yīng)答的供體例如恢復(fù)期患者中獲得表達(dá)抗體的細(xì)胞，并且使用來自這些個(gè)體的起始材料制備免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)。在例如病毒是已知的但是保護(hù)性抗原未知的情況下，可以制備針對(duì)病毒上的抗原結(jié)構(gòu)具有寬泛反應(yīng)性的關(guān)聯(lián)抗體基因?qū)Φ膩單膸?kù)。如果從這種亞文庫(kù)中制備重組多克隆抗體，則抗體可能含有保護(hù)性抗體。在抗原完全未知的情況下，產(chǎn)生自關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)(來自例如恢復(fù)期患者)的重組多克隆抗體，可以與當(dāng)今正在使用的超敏免疫球蛋白以相同的方式使用。這樣做的原因是關(guān)聯(lián)對(duì)保證產(chǎn)生的重組多克隆抗體與恢復(fù)期患者的抗體免疫應(yīng)答非常相似。本發(fā)明中描述的用于連接可變區(qū)關(guān)聯(lián)對(duì)的技術(shù)的另一項(xiàng)應(yīng)用是用于診斷和分析的目的。當(dāng)向患者給服藥物時(shí)，針對(duì)該藥物的免疫應(yīng)答的可能性總是存在。這種免疫原性可以通過常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行分析，例如使用來自用藥物處理的個(gè)體的血清或者血漿進(jìn)行的藥物特異的結(jié)合分析?；蛘撸景l(fā)明的方法可以用于通過分離可變重鏈和輕鏈編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)，反映給服藥物后不久患者的免疫應(yīng)答。然后可以篩選表達(dá)自這種文庫(kù)的抗體對(duì)于藥物或者藥物組分的反應(yīng)性。如果在血漿或者血清中存在的藥物干擾常規(guī)方法，則這種方法是非常有用的。這些藥物可以是例如抗體。使用常規(guī)的方法，對(duì)于與使用抗體治療有關(guān)的抗藥物免疫應(yīng)答(例如抗獨(dú)特型、抗構(gòu)架區(qū)或者抗Fc免疫應(yīng)答)的確定在用于治療的抗體從血液中被完全清除之前是不能進(jìn)行的。使用本發(fā)明，可以在治療幾周之后從使用該藥物進(jìn)行治療的個(gè)體中分離出編碼這種抗藥物的抗體的序列并且進(jìn)行分析。因此，這是一個(gè)用于一般評(píng)價(jià)藥物是否(特別是基于抗體的藥物)都具有免疫原性的替代方法。本發(fā)明的另一項(xiàng)應(yīng)用是疫苗和免疫程序的驗(yàn)證和比較。在疫苗的開發(fā)過程中這是非常有用的，因?yàn)槌爽F(xiàn)在進(jìn)行的對(duì)抗體結(jié)合特異性和血清滴度的比較之外，有可能對(duì)響應(yīng)新型候選疫苗而產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的序列多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較。另外，本發(fā)明可以在疫苗在人群中的效力監(jiān)測(cè)中用于分析、監(jiān)測(cè)和比較抗體應(yīng)答。本發(fā)明還在含有可變區(qū)的結(jié)合蛋白領(lǐng)域以外找到了應(yīng)用。對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)技術(shù)人員而言調(diào)整本發(fā)明中公開的技術(shù)，用于連接兩個(gè)或者更多編碼非結(jié)合蛋白的雜聚蛋白的轉(zhuǎn)錄核苷酸序列，僅僅是一個(gè)優(yōu)化的問題。這種編碼來自雜聚蛋白的結(jié)構(gòu)域或者亞基的序列的連接在分離這些蛋白編碼序列時(shí)可能是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@會(huì)顯著降低步驟的數(shù)目。 而且，有可能通過僅僅使用一個(gè)多重引物混合物/多重重疊-延伸引物混合物分離例如這些蛋白的拼接變異體、突變或者新家族的成員。編碼單一蛋白中不同結(jié)構(gòu)域的序列的連接也是一種可能性。這種技術(shù)會(huì)使與多結(jié)
36構(gòu)域蛋白質(zhì)中某些結(jié)構(gòu)域重要性相關(guān)的研究變得簡(jiǎn)單，原因是這會(huì)使中間結(jié)構(gòu)域的刪除變得簡(jiǎn)單。嵌合蛋白或者偶聯(lián)蛋白的制備也是本發(fā)明可以應(yīng)用的一個(gè)領(lǐng)域。即使要連接的蛋白質(zhì)具有不同的來源，例如人和小鼠蛋白質(zhì)的嵌合體，也可以通過在逆轉(zhuǎn)錄之前混和細(xì)胞來應(yīng)用本發(fā)明。這種細(xì)胞混合物可以由來自每一個(gè)物種的細(xì)胞群組成或者由來自每一個(gè)物種的單一細(xì)胞組成。
實(shí)施例實(shí)施例1 兩步多重重疊-延伸RT-PCR在該實(shí)施例中，使用來自分離的單個(gè)細(xì)胞的模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)，產(chǎn)生的cDNA用作一次以上的多重重疊-延伸PCR的模板。a.細(xì)胞使用Flp-In 技術(shù)(Invitrogen, Carls bad, CA, USA)制備表達(dá) IgGl-κ 的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。以FlpHn表達(dá)載體pcDNA5/FRT為基礎(chǔ)構(gòu)建IgG- κ哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒載體 pLL113(圖 4)。使用 Lipofectamin2000 (Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用含有抗體編碼基因的PLL113和可提供Flp重組酶瞬時(shí)表達(dá)的pOG44對(duì)CHO-Flp-In 細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。通過免疫檢測(cè)，根據(jù)IgG-κ的產(chǎn)生對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選和證實(shí)。選擇出的細(xì)胞系命名為CHO Flp-In pLL113，并且在添加了 2mM L-谷氨酰胺、10% FCS和900潮霉素 B的Ham' s F-12培養(yǎng)基(維持培養(yǎng)基)中維持。使用胰蛋白酶收獲CHO Flp-In pLLl 13細(xì)胞，用維持培養(yǎng)基漂洗三次。在最后一次漂洗后，細(xì)胞重懸于原來體積的維持培養(yǎng)基中。使用Casy-I System( Scharfe System GmbH,Reutlingen,Germany)測(cè)定細(xì)胞濃度，用維持培養(yǎng)基稀釋至1個(gè)細(xì)胞/5微升的濃度。b.逆轉(zhuǎn)錄將平均含有一個(gè)細(xì)胞的CHO Flp-In pLL113細(xì)胞懸液，分配到96孔PCR平板 (Thermo-Fast 96，圍邊的(skirted)AB-0800, ABgene, Epsom, Surrey, UK)的單一孑L中。通過使用Qiagen One-Step RT-PCR 實(shí)驗(yàn)方案 ^jiagen OneStep RT-PCR Kit, Cat# ；210210, Hilden, Germany)中的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)步驟從分配的細(xì)胞中合成cDNA。每一個(gè)孔含有以下的試劑，總體積是20微升IXOne Step RT-PCR 緩沖液，每種dNTP終濃度是ImM，5pmol Oligo poly-dT(18),26U RNA 酶抑制劑(RNasin，Promega, Madison USA, cat. No N2111)，2微升One Step RT-PCR酶混合物，和5 微升 CHO Flp-In pLL113 細(xì)胞懸液。在55攝氏度孵育反應(yīng)混合物30分鐘以進(jìn)行RT反應(yīng)。接下來在94攝氏度孵育反應(yīng)混合物10分鐘以使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。c.多重重疊-延伸PCR使用步驟b)產(chǎn)生的cDNA產(chǎn)物的一個(gè)級(jí)分作為模板用于多重重疊-延伸PCR。反
37應(yīng)在96孔平板中進(jìn)行。每一個(gè)孔含有以下的試劑，總體積是40微升IXOne Step RT-PCR 緩沖液，每種dNTP終濃度是500 μ Μ,多重重疊-延伸引物混合物濃度如表1中所示，26U RNA 酶抑制劑(RNasin，Promega, Madison USA, cat. No N2111)，2微升One Step RT-PCR酶混合物，和1微升cDNA模板(來源于單一細(xì)胞(步驟b))。所使用的多重重疊-延伸引物混合物包含表1中所示的引物。表 權(quán)利要求
1.連接多個(gè)非相鄰目標(biāo)核苷酸序列的方法，所述的方法包含a)在多重分子擴(kuò)增步驟中使用來自分離的單個(gè)細(xì)胞或者等基因細(xì)胞群的模板，擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列；以及b)實(shí)現(xiàn)步驟a)中擴(kuò)增出的目標(biāo)核苷酸序列的連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)核苷酸序列包含可變區(qū)編碼序列，且連接產(chǎn)生可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，其中目標(biāo)核苷酸序列包含免疫球蛋白可變區(qū)編碼序列，且連接產(chǎn)生了輕鏈可變區(qū)編碼序列與重鏈可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，其中目標(biāo)核苷酸序列包含T細(xì)胞受體可變區(qū)編碼序列，且連接產(chǎn)生了由α鏈可變區(qū)編碼序列與β鏈可變區(qū)編碼序列組成的關(guān)聯(lián)對(duì)或者由Y 鏈可變區(qū)編碼序列與S鏈可變區(qū)編碼序列組成的關(guān)聯(lián)對(duì)。
5.隨機(jī)連接多個(gè)非相鄰目標(biāo)核苷酸序列的方法，所述的方法包含a)在多重分子擴(kuò)增步驟中使用來自遺傳多樣性細(xì)胞群的模板，擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列；以及b)實(shí)現(xiàn)步驟a)中擴(kuò)增出的目標(biāo)核苷酸序列的連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，所述的細(xì)胞群是被裂解的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或者6的方法，其中所述的目標(biāo)核苷酸序列包含可變區(qū)編碼序列，且連接產(chǎn)生可變區(qū)編碼序列對(duì)的組合文庫(kù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的目標(biāo)核苷酸序列包含免疫球蛋白可變區(qū)編碼序列，且連接產(chǎn)生了輕鏈可變區(qū)編碼序列與重鏈可變區(qū)編碼序列對(duì)的組合文庫(kù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的目標(biāo)核苷酸序列包含T細(xì)胞受體可變區(qū)編碼序列，且連接產(chǎn)生α鏈可變區(qū)與β鏈可變區(qū)編碼序列對(duì)的組合文庫(kù)。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的多重分子擴(kuò)增步驟是多重 RT-PCR 擴(kuò)增。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的多重RT-PCR擴(kuò)增是兩步過程，包括在多重 PCR擴(kuò)增之前的獨(dú)立的逆轉(zhuǎn)錄(RT)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述的多重RT-PCR擴(kuò)增以單一步驟進(jìn)行，包含最初將進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)和多重PCR擴(kuò)增所需的所有組分加入到單個(gè)容器中。
13.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的目標(biāo)核苷酸序列的連接與多重分子擴(kuò)增在同一個(gè)容器中進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求10到13中任何一項(xiàng)的方法，其中使用多重重疊-延伸引物混合物， 所述的目標(biāo)核苷酸序列的連接與多重PCR擴(kuò)增被一同實(shí)現(xiàn)。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述的目標(biāo)核苷酸序列的連接通過連接方法實(shí)現(xiàn)。
16.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中使用適用于擴(kuò)增連接后目標(biāo)核酸序列的弓I物混合物進(jìn)行額外的分子擴(kuò)增。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中的多重重疊-延伸引物混合物包含了引物組，其中每個(gè)引物組中的至少一個(gè)引物組成員包含能夠與第二引物組中的引物組成員的重疊-延伸尾巴雜交的重疊-延伸尾巴。
18.根據(jù)權(quán)利要求14或者17的方法，其中的多重重疊-延伸引物混合物包含a)至少一個(gè)與免疫球蛋白輕鏈區(qū)編碼序列有義鏈互補(bǔ)的Q或者1引物；b)至少一個(gè)與免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)編碼序列反義鏈或者輕鏈可變區(qū)前導(dǎo)序列反義鏈互補(bǔ)并且能夠與步驟a)中的引物形成引物組的\ 5'引物或者Va引物；c)至少一個(gè)與免疫球蛋白恒定重鏈結(jié)構(gòu)域編碼序列的有義鏈互補(bǔ)或者與重鏈連接區(qū)編碼序列有義鏈互補(bǔ)的Ch或者Jh引物，以及d) 至少一個(gè)與免疫球蛋白重鏈可變區(qū)編碼序列反義鏈或者重鏈可變區(qū)前導(dǎo)序列反義鏈互補(bǔ)并且能夠與步驟c)中的引物形成引物組的Vh 5'引物或者Vm引物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中步驟b)的引物是I引物，與SEQID 93到98的基因特異區(qū)域有至少90%的序列一致性，步驟d)的引物是乂^引物，與SEQ ID 86到92的基因特異區(qū)域有至少90%的序列一致性。
20.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中從含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分獲得所述單個(gè)細(xì)胞、等基因細(xì)胞群或者遺傳上不同的細(xì)胞群。
21.產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的方法，所述關(guān)聯(lián)對(duì)包含連接的可變區(qū)編碼序列，所述的方法包含 a)提供來自供體的含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分；b)可選地從所述細(xì)胞級(jí)分中富集某個(gè)淋巴細(xì)胞群；c)獲得分離的單細(xì)胞群體，包含將細(xì)胞從所述的細(xì)胞級(jí)分中逐個(gè)分配到多個(gè)容器中；以及d)根據(jù)權(quán)利要求1到4或者10到20中任何一項(xiàng)的方法，擴(kuò)增所述的分離的單細(xì)胞群體中含有的可變區(qū)編碼序列以及實(shí)現(xiàn)其連接，這些取決于權(quán)利要求1到4中的任何一項(xiàng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中在進(jìn)行擴(kuò)增和連接(步驟d)以前，單細(xì)胞群體中的單個(gè)分離的單細(xì)胞被擴(kuò)充為等基因細(xì)胞群。
23.根據(jù)權(quán)利要求20到22任何一項(xiàng)的方法，其中含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分組成全血、 骨髓、單核細(xì)胞或者白細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求20到23任何一項(xiàng)的方法，其中含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分富集了B淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求20到24任何一項(xiàng)的方法，其中含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分或者B淋巴細(xì)胞譜系富集了漿細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求20到25任何一項(xiàng)的方法，其中來自含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分、B淋巴細(xì)胞譜系或者漿細(xì)胞的細(xì)胞對(duì)抗原特異性進(jìn)行富集。
27.根據(jù)權(quán)利要求20到23任何一項(xiàng)的方法，其中含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分對(duì)T淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞進(jìn)行富集。
28.根據(jù)權(quán)利要求20到23任何一項(xiàng)的方法，其中抗原特異的T細(xì)胞通過刺激含有淋巴細(xì)胞的細(xì)胞級(jí)分產(chǎn)生。
29.根據(jù)前面權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，還包含將連接后的核苷酸序列或者關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)插入到載體中。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述的載體選自克隆載體、穿梭載體、展示載體或者表達(dá)載體。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或者30的方法，其中連接后的核苷酸序列或者關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的單個(gè)成員包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)編碼序列與輕鏈可變區(qū)編碼序列，且所述的序列按照閱讀框插入到載體中，所述載體中已經(jīng)含有編碼一個(gè)或者更多免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域或者其片段的序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求29或者30的方法，其中連接后的核苷酸序列或者關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)的單個(gè)成員包含T細(xì)胞受體α鏈可變區(qū)編碼序列與β鏈可變區(qū)編碼序列，且所述的序列按照閱讀框插入到載體中，所述載體中已經(jīng)含有編碼一個(gè)或者更多T細(xì)胞受體恒定結(jié)構(gòu)域或者其片段的序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求21到32中任何一項(xiàng)的方法，還包含通過選擇連接后的編碼具有所需靶標(biāo)特異性的結(jié)合蛋白的可變區(qū)序列的關(guān)聯(lián)對(duì)的亞組建立亞文庫(kù)，產(chǎn)生可變區(qū)編碼序列的靶標(biāo)特異性關(guān)聯(lián)對(duì)的文庫(kù)。
34.根據(jù)權(quán)利要求31到33中任何一項(xiàng)的方法，還包含將所述的關(guān)聯(lián)對(duì)或者可變區(qū)編碼序列的靶標(biāo)特異性關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體編碼一個(gè)或者更多恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，所述恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域選自人類免疫球蛋白類型IgAl，IgA2，IgD, IgE, IgGl, IgG2，IgG3， IgG4，IgM, κ輕鏈或者λ輕鏈或者選自人T細(xì)胞受體α，β，δ和/或Υ鏈。
36.根據(jù)權(quán)利要求29到35中任一項(xiàng)的方法，還包含以下的步驟a)將編碼連接后的核苷酸序列片段的載體引入宿主細(xì)胞中；b)在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；以及 c)獲得插入到所述宿主細(xì)胞的載體表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是包含輕鏈可變區(qū)連接重鏈可變區(qū)的關(guān)聯(lián)對(duì)的單克隆抗體。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述的多肽產(chǎn)物是單克隆T細(xì)胞受體，所述的單克隆 T細(xì)胞受體包含α鏈可變區(qū)連接β鏈可變區(qū)的關(guān)聯(lián)對(duì)。
39.由連接的可變區(qū)編碼序列組成的關(guān)聯(lián)對(duì)的文庫(kù)。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的文庫(kù)，其中通過根據(jù)權(quán)利要求21或者任何其從屬權(quán)利要求的方法獲得所述的可變區(qū)編碼序列關(guān)聯(lián)對(duì)。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或者40的文庫(kù)，其中所述的關(guān)聯(lián)對(duì)的單個(gè)成員包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)編碼序列與重鏈可變區(qū)編碼序列。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的文庫(kù)，其中所述的單個(gè)成員編碼全長(zhǎng)的抗體，所述抗體選自人免疫球蛋白類型 IgAl，IgA2，IgD, IgE, IgGl，IgG2，IgG3，IgG4 或者 IgM0
43.根據(jù)權(quán)利要求39或者40的文庫(kù)，其中所述的關(guān)聯(lián)對(duì)的單個(gè)成員包含TcRα鏈可變區(qū)編碼序列與β鏈可變區(qū)編碼序列或者Y鏈可變區(qū)編碼序列與δ鏈可變區(qū)編碼序列。
44.根據(jù)權(quán)利要求40的文庫(kù)，其中所述的單個(gè)成員編碼全長(zhǎng)的TcR。
45.可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)的亞文庫(kù)，所述編碼序列編碼表現(xiàn)出針對(duì)某個(gè)靶標(biāo)的所需結(jié)合特異性的蛋白。
46.亞文庫(kù)，其編碼表現(xiàn)出針對(duì)某個(gè)靶標(biāo)的所需結(jié)合特異性的蛋白，該亞文庫(kù)選自根據(jù)權(quán)利要求39到44中任一項(xiàng)的文庫(kù)。
47.連接的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼序列的關(guān)聯(lián)對(duì)的亞文庫(kù)，其中可以從所述文庫(kù)表達(dá)的免疫球蛋白能夠與破傷風(fēng)毒素反應(yīng)或者與其結(jié)合。
48.包含根據(jù)權(quán)利要求39到47中任何一項(xiàng)的文庫(kù)或者亞文庫(kù)的宿主細(xì)胞群。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的宿主細(xì)胞群，其中的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
50.表達(dá)自根據(jù)權(quán)利要求48或者49的宿主細(xì)胞的重組多克隆蛋白。
51.能夠與破傷風(fēng)毒素反應(yīng)或者與其結(jié)合的重組多克隆免疫球蛋白或者其片段。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的重組多克隆免疫球蛋白，其中的單個(gè)成員是關(guān)聯(lián)對(duì)。
53.根據(jù)權(quán)利要求51或者52的重組多克隆免疫球蛋白，包含至少兩個(gè)單個(gè)的關(guān)聯(lián)對(duì)，所述關(guān)聯(lián)對(duì)包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)編碼序列，所述關(guān)聯(lián)對(duì)與選自以下SEQ ID對(duì)的單個(gè)SEQ ID對(duì)具有至少90%的序列一致性:229 276，262 309，240 287， 245:292，267:314，246:293，258:305，242:289，231:278，263:310，232:279，237:284， 255:302，260:307，251:298，233:280，228:275，244:291，250:297，252:299，264:311， 272:319,235:282 或者 238:285。
54.能夠與破傷風(fēng)毒素反應(yīng)或者與其結(jié)合的重組多克隆免疫球蛋白或者其片段，其中的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R1，⑶R2和⑶R3)來自一個(gè)或者更多的權(quán)利要求53中的SEQ ID對(duì)。
55.包含根據(jù)權(quán)利要求50的多克隆重組免疫球蛋白作為活性成分的藥物組合物，還含有至少一種藥物上可以接受的賦形劑。
56.包含能夠與破傷風(fēng)毒素反應(yīng)或者與其結(jié)合的重組多克隆抗體作為活性成分的藥物組合物，可選地還含有藥物上可以接受的賦形劑。
57.根據(jù)權(quán)利要求55或者56的藥物組合物，用作藥物。
58.預(yù)防或者治療處于破傷風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)的患者的方法，向有此需要的患者給服包含能夠與破傷風(fēng)毒素反應(yīng)或者與其結(jié)合的重組多克隆抗體的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及連續(xù)目標(biāo)序列的方法。多重重疊-延伸RT-PCR提供了在單一反應(yīng)中連接兩個(gè)或者更多雜聚蛋白結(jié)構(gòu)域或者亞基編碼核苷酸序列的有效方法。特別地，來自例如免疫球蛋白、T細(xì)胞受體或者B細(xì)胞受體的可變區(qū)編碼序列的連接通過使用本發(fā)明的方法而被簡(jiǎn)化。這產(chǎn)生了更為有效的制備可變區(qū)編碼序列文庫(kù)的方法。使用來自分離的單一細(xì)胞的模板進(jìn)行多重重疊-延伸RT-PCR的能力使得能夠以高通量形式產(chǎn)生關(guān)聯(lián)對(duì)文庫(kù)。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102199593SQ201110059890
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者L·S·尼爾森, M·B·奧列克西維奇, M·H·漢森, P·S·安德森 申請(qǐng)人:西福根有限公司