專利名稱：玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米褪綠斑駁病毒屬是番茄叢矮病毒科下的一個(gè)屬，該屬只有玉米褪綠斑駁病毒一個(gè)種(Maize chlorotic mottle virus, NCBI登錄號(hào)碼為X14736)。玉米褪綠斑駁病毒的自然寄主是玉米，引起褪綠斑駁、壞死、矮化、穗發(fā)育差或無穗、過早死亡等癥狀。玉米褪綠斑駁病毒易通過機(jī)械接種傳播，也可以經(jīng)種子傳播，在阿根廷、墨西哥、秘魯、美國(guó)等地有報(bào)道。玉米褪綠斑駁病毒的相對(duì)分子質(zhì)量為6. 1 X IO6,標(biāo)準(zhǔn)沉降常數(shù)^ciw = 109S,在氯化銫中的浮力密度為1. 365g/cm3，病毒對(duì)乙醚、氯仿和非離子去垢劑不敏感，在體外可穩(wěn)定33 天以上，熱鈍化點(diǎn)在80-85°C，病毒在pH 6穩(wěn)定，可由二價(jià)陽(yáng)離子穩(wěn)定。玉米褪綠斑駁病毒的病毒粒子為等軸對(duì)稱二十面體(T = 3)，用磷鎢酸負(fù)染色直徑約30nm，用醋酸鈾負(fù)染色直徑約33nm，無包膜，粒子外形呈六邊形，有的被染色劑滲透， 有180個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)亞基。玉米褪綠斑駁病毒的外殼蛋白由一種多肽組成(由近3’端的0RF4 編碼)，分子質(zhì)量25. IkDa0玉米褪綠斑駁病毒的核酸為單分子線形正義ssRNA，長(zhǎng)4437nt， 核酸占病毒粒子重量的18%，有的病毒粒子還偶爾含有一個(gè)IlOOnt的亞基因組RNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2C6，已于2011年02月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 4579。分泌抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C6 CGMCC No. 4579簡(jiǎn)稱雜交瘤細(xì)胞株2C6。本發(fā)明提供的單克隆抗體，是由雜交瘤細(xì)胞株2C6 CGMCC No. 4579分泌產(chǎn)生的。所述單克隆抗體可應(yīng)用于如下(a)和/或(b)(a)制備輔助鑒定待測(cè)病毒是否為玉米褪綠斑駁病毒的試劑盒；(b)制備輔助檢測(cè)待測(cè)植物樣本中是否含有玉米褪綠斑駁病毒的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)包括所述單克隆抗體的試劑盒；所述試劑盒為如下(C)和/或(d)(c)輔助鑒定待測(cè)病毒是否為玉米褪綠斑駁病毒的試劑盒；(d)輔助檢測(cè)待測(cè)植物樣本中是否含有玉米褪綠斑駁病毒的試劑盒。所述試劑盒還可包括玉米褪綠斑駁病毒包被抗體(如購(gòu)自購(gòu)自Agdia公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為SRA17001的玉米褪綠斑駁病毒包被抗體)。所述試劑盒還可包括酶標(biāo)二抗(如購(gòu)自中山金橋公司的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的馬抗小鼠酶標(biāo)抗體)。所述單克隆抗體或所述試劑盒可用于輔助鑒定待測(cè)病毒是否為玉米褪綠斑駁病毒。所述待測(cè)病毒具體可為玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus)、麝香石竹環(huán)斑病毒(Carnation ringspot virus)或番前叢矮病毒(Toma to bushy stuntvirus)。所述單克隆抗體或所述的試劑盒可用于輔助檢測(cè)待測(cè)植物樣本中是否含有玉米褪綠斑駁病毒。所述待測(cè)植物樣本具體可為玉米(Zea mays L.)(如京科2 葉片、昆諾藜 (Chenopodium guinoa)葉片或曼陀羅(Datura stramonium)葉片。本發(fā)明提供了一種玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明提供的單克隆抗體可作為玉米褪綠斑駁病毒的血清學(xué)診斷試劑，避免了交叉反應(yīng)(特異性好)，大大提高了檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒的靈敏度(效價(jià)高)。應(yīng)用本發(fā)明提供的單克隆抗體鑒定待測(cè)病毒是否為玉米褪綠斑駁病毒，或檢測(cè)待測(cè)植物樣本中是否含有玉米褪綠斑駁病毒，具有簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、一次可處理多個(gè)樣品、特異性好、靈敏度高、 應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的單克隆抗體可用于研制玉米褪綠斑駁病毒的免疫學(xué)診斷試劑，如酶聯(lián)診斷試劑、膠體金免疫試紙條、抗體芯片、生物傳感器等。本發(fā)明為玉米褪綠斑駁病毒的血清學(xué)診斷試劑的研制奠定了基礎(chǔ)，將在玉米褪綠斑駁病毒的檢測(cè)和鑒定中發(fā)揮重要作用。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。ATCC即American type culture collection的縮寫，網(wǎng)址為atcc. org。玉米褪綠斑駁病毒兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ACD公司。堿性磷酸酯酶標(biāo)記的馬抗小鼠酶標(biāo)抗體購(gòu)自中山金橋公司。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 結(jié)果取平均值。實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)均采用購(gòu)自ATCC的DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)30-2002)作為 ■石出i首養(yǎng)■ ο玉米(Zea mays L.)品種京科25 購(gòu)自北京農(nóng)科院種植科技有限公司。昆諾藜(Chenopodium guinoa)公眾可以從中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得；參考文獻(xiàn)李桂芬，朱水芳、周群等，侵染紫松果菊的黃瓜花葉病毒分離物的鑒定，植物保護(hù)， 2007年第33卷，第1期，54-56頁(yè)。曼陀羅(Datura stramonium)公眾可以從中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院獲得；參考文獻(xiàn)李桂芬，朱水芳、周群等，侵染紫松果菊的黃瓜花葉病毒分離物的鑒定，植物保護(hù)， 2007年第33卷，第1期，54-56頁(yè)。玉米褪綠斑駁病毒(Maizechlorotic mottle virus ；縮寫為 MCMV)購(gòu)自 ATCC， ATCC 編號(hào)為 PV-262。麝香石竹環(huán)斑病毒(Carnation ringspot virus, CRSV)購(gòu)自 ATCC， ATCC 編號(hào)為 PV-21。番茄叢矮病毒(Tomato bushy stunt virus, TBSV)購(gòu)自 ATCC，ATCC 編號(hào)為PV-500。底物溶液二乙醇胺(C4H11NO2) 97mL,硝基苯磷酸二鈉lg，蒸餾水(H2O) 600mL，用鹽酸(HCl)調(diào)pH值至9. 8，然后用蒸餾水定容至IL ；4°C儲(chǔ)存。樣品抽提緩沖液(pH7. 4)將亞硫酸鈉1. 3g和聚乙烯基吡咯烷酮20g溶于PBST緩沖液中，用PBST緩沖液定容至1L。包被緩沖液(pH9. 6)將碳酸鈉1. 59g、碳酸氫鈉2. 93g和疊氮化鈉0. 20g溶于水，用水定容至1L。實(shí)施例1、雜交瘤細(xì)胞株的獲得一、病毒繁殖與純化(玉米褪綠斑駁病毒制劑的制備)將玉米褪綠斑駁病毒(毒源)接種在玉米上，19d采收病葉，病葉加4倍體積的0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(含0.5%巰基乙醇，pH7. 0)，勻漿，雙層紗布過濾，低速離心(6450Xg，IOmin)，取上清；加入 NaCl 至濃度為 0. 2mol/L、PEG(MV6000)至濃度 8%、 TritonX-IOO 至濃度 2%，4°C攪拌 3h ；離心(10100Xg，30min)，沉淀懸浮于 0. 02mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)中，4°C攪拌過夜；離心(15008Xg, IOmin)；取上清離心(160070Xg, 160min)，沉淀懸浮于0. 02mol/L磷酸鈉緩沖液中，4°C攪拌過夜；離心(6620 X g，lOmin)，取上清做10% 40%蔗糖梯度離心(160070 X g，150min)，吸取蔗糖梯度中的病毒帶，即為純化的玉米褪綠斑駁病毒制劑。二、小鼠免疫將純化的玉米褪綠斑駁病毒制劑在與其同體積的福氏完全佐劑中乳化，乳化后對(duì) 8周齡的BALB/c小鼠做腹腔注射，每只小鼠100 μ g純化病毒。2周后，將純化的玉米褪綠斑駁病毒制劑在與其同體積的福氏不完全佐劑中乳化作第二次腹腔注射，每只小鼠IOOyg 純化病毒。3周后第三次免疫小鼠(同第二次)。在進(jìn)行步驟三的融合前3天加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫是采用200 μ g純化的玉米褪綠斑駁病毒制劑直接注射小鼠腹腔。三、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，用純化的玉米褪綠斑駁病毒制劑4yg/ml的濃度包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA進(jìn)行測(cè)定。對(duì)陽(yáng)性孔的細(xì)胞用有限稀釋法克隆3次，使陽(yáng)性率達(dá)100%，陽(yáng)性克隆細(xì)胞及時(shí)凍存。經(jīng)間接ELISA法篩選，3次亞克隆化獲得了 1株能穩(wěn)定分泌抗MCMV的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞株命名為2C6，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為No. 4579。分泌抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C6 CGMCC No. 4579簡(jiǎn)稱雜交瘤細(xì)胞株2C6。實(shí)施例2、單克隆抗體的制備、Ig類型的鑒定和效價(jià)測(cè)定一、病毒繁殖與純化1、將玉米褪綠斑駁病毒(毒源)接種在玉米葉片上，19天后采收病葉(玉米葉片出現(xiàn)系統(tǒng)褪綠斑癥狀)。2、步驟1的病葉加4倍體積的pH7. 0-0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(含0. 5%體積百分含量的巰基乙醇)，勻漿，雙層紗布過濾，低速離心(6450 X g，lOmin)，取上清。3、步驟2的上清中加入NaCl至濃度為0. 2mol/L、PEG(MV6000)至終濃度為8% (質(zhì)量百分含量)、TritonX-IOO至終濃度2% (體積百分含量)，4°C攪拌汕，離心(10100 X g， 30min)收集沉淀。4、步驟3的沉淀懸浮于pH7. 0-0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，4°C攪拌過夜，離心 (15008Xg，IOmin)，取上清。5、步驟4的上清離心(160070Xg，160min)，取沉淀。6、步驟5的沉淀懸浮于pH7. 0-0. 02mol/L磷酸鈉緩沖液中，4°C攪拌過夜，離心(6620 X g，IOmin)，取上清。7、步驟6的上清進(jìn)行蔗糖10% 40% (質(zhì)量百分含量)連續(xù)梯度離心 (160070Xg，150min)，吸取蔗糖梯度中的病毒帶(蔗糖-35%梯度)，得到病毒液(含有病毒的蔗糖溶液)。8、檢測(cè)步驟7得到的病毒液中的病毒含量。測(cè)定病毒溶液的OD26tlnm值，按照公式“病毒濃度=病毒溶液的OD26tlnm值/病毒的吸光常數(shù)”計(jì)算病毒含量，玉米褪綠斑駁病毒的溶液的OD26tlnm值為77. 655，吸光常數(shù)為6. 46， 病毒濃度為12. 02mg/ml。二、單克隆抗體1、將雜交瘤細(xì)胞株2C6置于細(xì)胞培養(yǎng)基(含體積百分含量為20%的胎牛血清) 中，在37°C條件培養(yǎng)72小時(shí)08-96小時(shí)均可)，得到培養(yǎng)上清。2、效價(jià)測(cè)定將步驟1得到的培養(yǎng)上清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。采用步驟一的7得到的病毒液包被酶標(biāo)板(玉米褪綠斑駁病毒的使用濃度為4 μ g/ml)。二抗為堿性磷酸酯酶標(biāo)記的馬抗小鼠酶標(biāo)抗體。培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)為1 105。3、單克隆抗體的制備用G蛋白柱(G蛋白柱購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-0404-01)對(duì)步驟1的培養(yǎng)上清進(jìn)行純化(完全按照G蛋白柱的使用說明進(jìn)行操作)，得到單克隆抗體(濃度為0. 46mg/ ml)，-20°C保存。三、單克隆抗體Ig類型的鑒定單克隆抗體Ig類型的鑒定采用Sigma公司單抗分型試劑按說明書進(jìn)行。2C6單克隆抗體為IgGl亞類。實(shí)施例3、單克隆抗體的特異性測(cè)定和檢測(cè)應(yīng)用采用TAS-ELISA方法，檢測(cè)實(shí)施例2的步驟二制備的單克隆抗體分別與玉米褪綠斑駁病毒同科病毒-麝香石竹環(huán)斑病毒、番茄叢矮病毒有無交叉反應(yīng)。一、實(shí)驗(yàn)樣本的制備將玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)接種玉米品種京科25的葉片；取病葉(發(fā)生明顯褪綠斑的葉片；命名為病葉甲)分別進(jìn)行步驟二和步驟三。將沒有接種該病毒且沒有上述發(fā)病表征的健康葉片(命名為對(duì)照葉甲)分別進(jìn)行步驟二和步驟三。將麝香石竹環(huán)斑病毒(CRSV)接種昆諾藜(Chenopodium guinoa)的葉片；取病葉 (出現(xiàn)枯斑的病葉；命名為病葉乙)分別進(jìn)行步驟二和步驟三。將沒有接種該病毒且沒有上述發(fā)病表征的健康葉片(命名為對(duì)照葉乙)分別進(jìn)行步驟二和步驟三。將番茄叢矮病毒(TBSV)接種曼陀羅(Datura stramonium)的葉片；取病葉(出現(xiàn)褪綠斑的病葉；命名為病葉丙)分別進(jìn)行步驟二和步驟三。將沒有接種該病毒且沒有上述發(fā)病表征的健康葉片(命名為對(duì)照葉丙)分別步驟二和步驟三。二、單克隆抗體的特異性測(cè)定分別將步驟一的各種葉片進(jìn)行10倍體積的稀釋(稀釋液為樣品抽提緩沖液)研磨，得到各種汁液。病葉甲得到的汁液為汁液甲，對(duì)照葉甲得到的汁液為對(duì)照液甲。病葉乙得到的汁液為汁液乙，對(duì)照葉乙得到的汁液為對(duì)照液乙。病葉丙得到的汁液為汁液丙，對(duì)照葉丙得到的汁液為對(duì)照液丙。通過酶聯(lián)免疫法檢測(cè)單克隆抗體的特異性，待測(cè)樣本為汁液甲、對(duì)照液甲、汁液乙、對(duì)照液乙、汁液丙或?qū)φ找罕?，具體步驟如下1、將玉米褪綠斑駁病毒包被抗體(購(gòu)自Agdia公司；產(chǎn)品目錄號(hào)SRA17001)按照說明書指明的使用濃度包被酶標(biāo)板，37 °C孵育池，洗酶標(biāo)板。2、加入待測(cè)樣本(100 μ 1/孔)，4°C冰箱過夜，洗酶標(biāo)板。3、將實(shí)施例2的步驟二制備的單克隆抗體與堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠混勻后一起加入到酶標(biāo)板中(總體積為100μ 1/孔，堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠的使用濃度為說明書建議的工作濃度，單克隆抗體的使用濃度為ι μ g/ml)，37°C孵育4h，洗酶標(biāo)板。4、加入底物溶液，37°C避光放置40分鐘后檢測(cè)OD4tl5nm值。結(jié)果見表1。表1單克隆抗體的特異性
權(quán)利要求
1.分泌抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C6，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4579。
2.一種單克隆抗體，是由分泌抗玉米褪綠斑駁病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2C6 CGMCC No. 4579分泌產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在如下(a)和/或(b)中的應(yīng)用(a)制備輔助鑒定待測(cè)病毒是否為玉米褪綠斑駁病毒的試劑盒；(b)制備輔助檢測(cè)待測(cè)植物樣本中是否含有玉米褪綠斑駁病毒的試劑盒。
4.包括權(quán)利要求2所述單克隆抗體的試劑盒；所述試劑盒為如下(c)和/或(d)(c)輔助鑒定待測(cè)病毒是否為玉米褪綠斑駁病毒的試劑盒；(d)輔助檢測(cè)待測(cè)植物樣本中是否含有玉米褪綠斑駁病毒的試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括玉米褪綠斑駁病毒包被抗體。
6.如權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括酶標(biāo)二抗。
7.權(quán)利要求2所述單克隆抗體或權(quán)利要求4至6中任一所述的試劑盒在輔助鑒定待測(cè)病毒是否為玉米褪綠斑駁病毒中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述待測(cè)病毒為玉米褪綠斑駁病毒(Maize chlorotic mottle virus)、廣香石竹環(huán)斑病毒(Carnation ringspot virus)或番叢矮病毒(Tomato bushy stunt virus)。
9.權(quán)利要求2所述單克隆抗體或權(quán)利要求4至6中任一所述的試劑盒輔助檢測(cè)待測(cè)植物樣本中是否含有玉米褪綠斑駁病毒中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述待測(cè)植物樣本為玉米(ZeamaysL.)葉片、昆諾薬(Chenopodium guinoa)卩十片或曼陀羅(Datura stramonium)卩十片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的單克隆抗體可作為玉米褪綠斑駁病毒的血清學(xué)診斷試劑，特異性好，靈敏度高。應(yīng)用本發(fā)明提供的單克隆抗體鑒定待測(cè)病毒是否為玉米褪綠斑駁病毒，或檢測(cè)待測(cè)植物樣本中是否含有玉米褪綠斑駁病毒，具有簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、一次可處理多個(gè)樣品、特異性好、靈敏度高、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為玉米褪綠斑駁病毒血清學(xué)診斷試劑的研制奠定了基礎(chǔ)，將在玉米褪綠斑駁病毒的檢測(cè)和鑒定中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C07K16/10GK102199575SQ20111006312
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者張永江, 朱水芳, 李桂芬, 馬潔 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院