專利名稱：一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌素提取工藝，具體地說，是一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取抗菌素的方法。
背景技術(shù)：
自1980年Boman首次在惜比古天蠶中分離出天蠶素以來，先后在許多昆蟲中發(fā)現(xiàn)抗菌肽或抗菌素。柞蠶抗菌素的基礎(chǔ)研究比較雄厚，應(yīng)用研究領(lǐng)域廣泛。發(fā)明人經(jīng)文獻(xiàn)檢索，查閱了相關(guān)資料表明，國內(nèi)外有關(guān)抗菌肽的研究報(bào)導(dǎo)較多。通常從動(dòng)物、植物、微生物中研究與開發(fā)天然食品防腐劑。在植物中，許多研究者發(fā)現(xiàn)，毛桃和杏核中的芳香精油成分、大蒜、洋蔥中的辛辣組分、白菜汁中的非辛辣組分以及綠茶、蘋果、腰果中的風(fēng)味成分均含有抗菌有效成分。王南舟等人分別研究了甘草制劑、 連翹制劑、藻類和大蒜汁的抑菌防腐作用，發(fā)現(xiàn)它們對多種常見食品腐敗菌具有廣泛的抑制作用。甘露聚糖是廣泛存在于自然界的一種多糖。據(jù)日本最近的研究發(fā)現(xiàn)，甘露聚糖是一種高效、經(jīng)濟(jì)的天然食品防腐劑，可以從魔芋、椰子、海藻等天然產(chǎn)物中提取，可用于水果、 蔬菜、豆制品、蛋類以及魚類等許多食品的防腐保鮮。如在豆制品中添加的甘露聚糖，在梅雨季節(jié)，保質(zhì)期可長達(dá)4天，而對照組僅放2天就發(fā)霉變臭。在動(dòng)物體內(nèi)也含有豐富的抗菌物質(zhì)。人們對柞蠶抗菌肽進(jìn)行抗菌譜研究，認(rèn)為它對食品防腐有作用。從蟹殼、蝦殼中提取的脫乙酰甲殼質(zhì)，又稱殼聚糖也有很強(qiáng)的抑真菌作用，當(dāng)濃度為0.4%時(shí)，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抗菌性，對革蘭氏陰性菌和陽性菌亦有抗菌作用。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)和制備天然食品防腐劑備受研究者的重視和關(guān)注，取得了令人矚目的成果。如由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的納他霉素，由白色鏈霉菌產(chǎn)生的聚賴氨酸，由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素等。但迄今為止，尚未見由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取抗菌素的方法提取高活性柞蠶抗菌素的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于以下構(gòu)思柞蠶抗菌素是以柞蠶蛹為原料提取的，尤其我國長白山脈有大面積自然生長的柞林是盛產(chǎn)柞蠶蛹的優(yōu)良基地，產(chǎn)地天然無污染，柞蠶蛹已被國家列為新資源食品。柞蠶蛹營養(yǎng)豐富、藥食兼用，可以為人們提供高蛋白、低脂肪、低膽固醇以及維生素和某些礦物質(zhì)。同時(shí)，昆蟲體內(nèi)往往含有特殊的活性成分，對人類的健康具有獨(dú)特的功能。是天然綠色的高級營養(yǎng)品。提取工藝過程無污染，不使用任何化學(xué)藥品。柞蠶抗菌素可直接開發(fā)保健食品，也可應(yīng)用于食品添加劑，即可防止食品腐敗，延長保質(zhì)期，人食用后可提高肌體的免疫力。柞蠶抗菌素具有廣譜的殺菌活性，人食用后易被體內(nèi)的蛋白酶水解消化，而無任何副作用。通過以上同類研究比較分析可以說明一、柞蠶抗菌素的提取工藝與同類研究類似，有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為提取柞蠶抗菌素在批量生產(chǎn)上存在活性低等、且設(shè)備要求嚴(yán)格，成本較高等，本項(xiàng)提取技術(shù)解決了上述存在問題，具有實(shí)用性。二、柞蠶抗菌素的應(yīng)用研究較多，但作為食品添加劑的研究，特別是在牛奶、冷卻肉等食品上的應(yīng)用尚未見系統(tǒng)報(bào)導(dǎo)，添補(bǔ)了本領(lǐng)域空白。具有先進(jìn)性。三、柞蠶抗菌素作為食品添加劑，是一種新型的生物防腐劑，防腐效果好、安全性高，應(yīng)用前景廣闊。四、各種不同的誘導(dǎo)源對柞蠶蛹的基因的誘導(dǎo)效應(yīng)不盡相同，而合成的抗菌物質(zhì)在數(shù)量上、活性上有一定的差異。由此看來柞蠶蛹體的抗菌物質(zhì)誘導(dǎo)應(yīng)答體系將是一種獨(dú)特的低級的免疫體系。因此，在選擇誘導(dǎo)源時(shí)，選擇誘導(dǎo)抗菌活性高、菌物易于培養(yǎng)、成本低、蠶蛹腐敗少的誘導(dǎo)源，對提高分離提取抗菌素的效率是重要一環(huán)。本發(fā)明的目的是，對現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行實(shí)質(zhì)性改進(jìn)，提供一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取抗菌素的方法，其方法的步驟選取科學(xué)合理，誘導(dǎo)的抗菌素活性值高，柞蠶蛹腐敗少、蛹血保持清澈透明，抗菌素收率高，成本低，易于工廠化生產(chǎn)。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步驟(1)柞蠶繭在0 3°C條件下保存，試驗(yàn)前置于室溫18 22°C、60 70%相對濕度條件下保存12 Mh ；(2)去除繭殼取出滯育蛹，選擇去除滯育蛹中的死蛹、發(fā)育蛹；(3)柞蠶蛹用清水洗凈，用65 75%酒精進(jìn)行體表消毒；(4)微生物誘導(dǎo)源，用大腸桿菌E. COliK12A1菌苗作誘導(dǎo)源，其LB培養(yǎng)基配方為 IL溶液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，培養(yǎng)Mh，用同樣培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接，在培養(yǎng)的菌液中加入36%甲醛溶液使之成為3%福爾馬林溶液，在4°C放置M 168h，離心2500rpm， 15min，棄去上清液，沉淀的菌體用0. 9%氯化鈉溶液洗滌、2500rpm，15min反復(fù)離心3次，所得菌體在大腸桿菌E. ColiK12D31固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)Mh，確認(rèn)無菌落生長，證明是死菌后，貯于冰箱中備用，用時(shí)將菌苗濃度調(diào)至IO8 105cellS/ml ；(5)誘導(dǎo)，經(jīng)液體培養(yǎng)的大腸桿菌E. ColiK12D31菌苗用昆蟲生理鹽水稀釋成每ml 含IO8 105cells，濃度每頭蛹注射40 60μ 1，用微量注射器自蛹體背部節(jié)間膜處注入， 處理后的蠶蛹置于22 25°C、相對濕度60 80%條件下保護(hù)72 120h ；(6)柞蠶抗菌素的提取，將誘導(dǎo)72 120h的柞蠶蛹，提取蛹血漿、離心15000rpm， 4 10°C，20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再離心12000rpm，4 6°C，5min,除去可溶性固形物，再在溫度70 90°C，3 IOmin加熱去除蛋白質(zhì)，離心4000rpm，IOmin得上清液即為柞蠶抗菌素水溶液成品。本發(fā)明的一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法，其方法簡單，步驟選取科學(xué)合理，容易實(shí)施，誘導(dǎo)的抗菌素活性值高，蠶蛹腐敗少、蛹血保持清澈透明，抗菌素收率高，成本低，易于工廠化生產(chǎn)。提取的柞蠶抗菌素作為一種新型的天然防腐劑可應(yīng)用于食品，具有殺菌譜廣、食用后易被體內(nèi)蛋白酶水解消化、無任何毒副作用的特點(diǎn)，根據(jù)柞蠶抗菌素的性質(zhì)將其添加到飲料、豆制品、奶制品中，可以延長保質(zhì)期，還可以抑制腸道有害細(xì)菌的繁殖，增強(qiáng)人體免疫力。
具體實(shí)施例方式下面利用實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1 一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步驟
(1)柞蠶繭在0 3°C條件下保存，試驗(yàn)前置于室溫18°C、60%相對濕度條件下保存 24h ；(2)去除繭殼取出滯育蛹，選擇去除滯育蛹中的死蛹、發(fā)育蛹；(3)柞蠶蛹用清水洗凈，用65 75%酒精進(jìn)行體表消毒；(4)微生物誘導(dǎo)源，用大腸桿菌E. COliK12A1菌苗作誘導(dǎo)源，其LB培養(yǎng)基配方為 IL溶液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，培養(yǎng)Mh，用同樣培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接，在培養(yǎng)的菌液中加入36%甲醛溶液使之成為3%福爾馬林溶液，在4°C放置Mh，離心2500rpm，15min，棄去上清液，沉淀的菌體用0. 9%氯化鈉溶液洗滌、反復(fù)離心3次2500rpm，5min，所得菌體在大腸桿菌固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)Mh，確認(rèn)無菌落生長，證明是死菌后，貯于冰箱中備用，用時(shí)將菌苗濃度調(diào)至IO8 105cells/ml ；(5)誘導(dǎo)，經(jīng)液體培養(yǎng)的大腸桿菌E. ColiK12D31菌苗用昆蟲生理鹽水稀釋成每ml 含IO8 IO5ceIls,濃度每頭蛹注射40 μ 1，用微量注射器自蛹體背部節(jié)間膜處注入，處理后的蠶蛹置于22°C、相對濕度60%條件下保護(hù)72h ；(6)柞蠶抗菌素的提取，將誘導(dǎo)7 的柞蠶蛹，提取蛹血漿、離心15000rpm，4°C， 20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再離心12000rpm，4°C，5min,除去可溶性固形物，再在溫度70°C，3min加熱去除蛋白質(zhì)，離心4000rpm，lOmin，得上清液即為柞蠶抗菌素水溶液成 實(shí)施例2 —種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步驟(1)柞蠶繭在O 3°C條件下保存，試驗(yàn)前置于室溫20°C、65%相對濕度條件下保存 18h ；(2)去除繭殼取出滯育蛹，選擇去除滯育蛹中的死蛹、發(fā)育蛹；(3)柞蠶蛹用清水洗凈，用65 75%酒精進(jìn)行體表消毒；(4)微生物誘導(dǎo)源，用大腸桿菌E. COliK12A1菌苗作誘導(dǎo)源，其LB培養(yǎng)基配方為 IL溶液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，培養(yǎng)Mh，用同樣培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接，在培養(yǎng)的菌液中加入36%甲醛溶液使之成為3%福爾馬林溶液，在4°C放置96h，離心2500rpm，15min，棄去上清液，沉淀的菌體用0.9%氯化鈉溶液洗滌、反復(fù)離心3次2500rpm lOmin，所得菌體在大腸桿菌E. ColiK12D31固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)Mh，確認(rèn)無菌落生長，證明是死菌后，貯于冰箱中備用，用時(shí)將菌苗濃度調(diào)至IO8 105cellS/ml ；(5)誘導(dǎo)，經(jīng)液體培養(yǎng)的大腸桿菌E. ColiK12D31菌苗用昆蟲生理鹽水稀釋成每ml 含IO8 105cells，濃度每頭蛹注射50 μ 1，用微量注射器自蛹體背部節(jié)間膜處注入，處理后的蠶蛹置于23. 5°C、相對濕度70%條件下保護(hù)96h ；(6)柞蠶抗菌素的提取，將誘導(dǎo)的柞蠶蛹，提取蛹血漿、離心15000rpm，7°C， 20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再離心12000rpm，5°C，5min,除去可溶性固形物，再在溫度80°C，6min加熱去除蛋白質(zhì)，離心4000rpm IOmin得上清液即為柞蠶抗菌素水溶液成 實(shí)施例3 —種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步驟(1)柞蠶繭在O 3°C條件下保存，試驗(yàn)前置于室溫22°C、70%相對濕度條件下保存 12h ；(2)去除繭殼取出滯育蛹，選擇去除滯育蛹中的死蛹、發(fā)育蛹；(3)柞蠶蛹用清水洗凈，用65 75%酒精進(jìn)行體表消毒；(4)微生物誘導(dǎo)源，用大腸桿菌E. COliK12A1菌苗作誘導(dǎo)源，其LB培養(yǎng)基配方為 IL溶液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，培養(yǎng)Mh，用同樣培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接，在培養(yǎng)的菌液中加入36%甲醛溶液使之成為3%福爾馬林溶液，在4°C放置168h，離心2500rpm，15min,棄去上清液，沉淀的菌體用0.9%氯化鈉溶液洗滌、反復(fù)離心3次2500rpm lOmin，所得菌體在大腸桿菌E. ColiK12D31固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)Mh，確認(rèn)無菌落生長，證明是死菌后，貯于冰箱中備用，用時(shí)將菌苗濃度調(diào)至IO8 105cellS/ml ；(5)誘導(dǎo)，經(jīng)液體培養(yǎng)的大腸桿菌E. ColiK12D31菌苗用昆蟲生理鹽水稀釋成每ml 含IO8 105cells，濃度每頭蛹注射60 μ 1，用微量注射器自蛹體背部節(jié)間膜處注入，處理后的蠶蛹置于25°C、相對濕度60 80%條件下保護(hù)120h ；(6)柞蠶抗菌素的提取，將誘導(dǎo)120h的柞蠶蛹，提取蛹血漿、離心15000rpm，10°C, 20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再離心12000rpm，6°C，5min,除去可溶性固形物，再在溫度90°C，IOmin加熱去除蛋白質(zhì)，離心2500rpm IOmin,得上清液即為柞蠶抗菌素水溶液成品。柞蠶抗菌素水溶液成品可以直接用于食品添加劑，也可以按常規(guī)方法制成口服液或進(jìn)一步采用通用的冷凍干燥制成干粉供使用。本發(fā)明的一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法的具體實(shí)施方式
并非窮舉，本領(lǐng)域技術(shù)人員不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)的任何變換均屬于本發(fā)明權(quán)利要求所保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法，其特征是，它包含以下步驟(1)柞蠶繭在0 3°C條件下保存，試驗(yàn)前置于室溫18 22°C、60 70%相對濕度條件下保存12 Mh ；(2)去除繭殼取出滯育蛹，選擇去除滯育蛹中的死蛹、發(fā)育蛹；(3)柞蠶蛹用清水洗凈，用65 75%酒精進(jìn)行體表消毒；(4)微生物誘導(dǎo)源，用大腸桿菌E.ColiK12D31菌苗作誘導(dǎo)源，其LB培養(yǎng)基配方為1L培養(yǎng)液中，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，培養(yǎng)Mh，用同樣培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接，在培養(yǎng)的菌液中加入36%甲醛溶液使之成為3%福爾馬林溶液，在4°C放置M 168h，離心2500rpm，15min, 棄去上清液，沉淀的菌體用0. 9%氯化鈉溶液洗滌、2500rpm，15min條件下反復(fù)離心3次，所得菌體在大腸桿菌E. ColiK12D31固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)Mh，確認(rèn)無菌落生長，證明是死菌后，貯于冰箱中備用，用時(shí)將菌苗濃度調(diào)至IO8 105cellS/ml ；(5)誘導(dǎo)，經(jīng)液體培養(yǎng)的大腸桿菌E.ColiK12D3I菌苗用昆蟲生理鹽水稀釋成每ml含 IO8 105cells，濃度每頭柞蠶蛹注射40 60 μ 1，用微量注射器自蛹體背部節(jié)間膜處注入， 處理后的柞蠶蛹置于22 25°C、相對濕度60 80%條件下保護(hù)72 120h ；(6)柞蠶抗菌素的提取，將誘導(dǎo)72 120h的柞蠶蛹，提取蛹血漿、離心15000rpm，4 IO0C，20min,去除血球和脂肪球，取上清液，再離心12000rpm，4 6°C，5min,除去可溶性固形物，再在溫度70 90°C，3 IOmin加熱去除蛋白質(zhì)，離心2500 4000rpm lOmin，得上清液即為柞蠶抗菌素水溶液成品。
全文摘要
本發(fā)明是一種由活體柞蠶蛹誘導(dǎo)與提取蠶抗菌素的方法，其特點(diǎn)是，它包含有柞蠶繭保存，去除繭殼選擇滯育蛹，柞蠶蛹清洗、體表消毒，大腸桿菌E.coliK12D31菌苗的培養(yǎng)，誘導(dǎo)，提取柞蠶抗菌素等步驟，其方法的步驟選取科學(xué)合理，誘導(dǎo)的抗菌素活性值高，蠶蛹腐敗少、蛹血保持清澈透明，抗菌素收率高，成本低，易于工廠化生產(chǎn)。提取的柞蠶抗菌素作為一種新型的天然防腐劑可應(yīng)用于食品，具有殺菌譜廣、食用后易被體內(nèi)蛋白酶水解消化、無任何毒副作用的特點(diǎn)，根據(jù)柞蠶抗菌素的性質(zhì)將其添加到飲料、豆制品、奶制品中，可以延長保質(zhì)期，還可以抑制腸道有害細(xì)菌的繁殖，增強(qiáng)人體免疫力。
文檔編號C07K14/435GK102206263SQ20111007769
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者劉雋彥, 李金志 申請人:吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院