專利名稱：一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種ELISA方法，尤其涉及一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心 ELISA方法，屬于醫(yī)藥生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管生長(zhǎng)素(Angiogenin，ANG)是存在于正常血漿及實(shí)體腫瘤組織中的一種分子量為14. lkD.pl 9. 5的蛋白質(zhì)，基因定位于染色體14qll。ANG是一種能有效促進(jìn)新生血管形成的刺激因子，具有很強(qiáng)的促血管生成作用，ANG被認(rèn)為是促血管生成最主要的細(xì)胞因子之一。ANG最初是于1985年從人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29的培養(yǎng)液中分離而得，隨后在人血漿和牛乳中檢測(cè)到它的存在，它屬于核糖核酸酶超家族成員，一級(jí)結(jié)構(gòu)與人胰核糖核酸酶有 35 %相同，具有微弱的核糖核酸酶活性。ANG是通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活胞內(nèi)的第二信使而發(fā)揮一系列生物學(xué)作用(如介導(dǎo)細(xì)胞粘連、誘導(dǎo)細(xì)胞入侵、組織新生管狀結(jié)構(gòu)的形成等)，從而達(dá)到促進(jìn)新生血管形成的作用。ANG促進(jìn)新生血管形成的研究意義主要體現(xiàn)在三個(gè)方面(1)改善局部微循環(huán)，特別是在血循環(huán)較差的半月板纖維軟骨的修復(fù)以及梗塞或創(chuàng)傷、燒傷等損傷組織中的重建側(cè)枝循環(huán)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。(2)實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)依賴于腫瘤內(nèi)部血管的快速生長(zhǎng)， 因此可以通過(guò)抑制ANG的生物學(xué)活性，阻止新生血管的形成從而達(dá)到治療腫瘤的目的。(3) 研究表明，胰腺癌、乳腺癌等患者的外周血血清中，ANG的水平明顯升高，血清ANG的水平與這些腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)。另外，研究還表明，胃癌、肺癌、大腸癌及乳腺癌患者血清中ANG水平較正常對(duì)照明顯增高，因此，可以通過(guò)檢測(cè)血清及腫瘤組織中ANG的水平來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展情況。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明公開一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法檢測(cè) ANG含量，用于腫瘤、自身免疫疾病等Angiogenin相關(guān)疾病的臨床輔助診斷。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法， 首先構(gòu)建ANG2基因制備ANG2蛋白，再表達(dá)并純化ANG2蛋白，以ANG2蛋白為抗原制備高效價(jià)和高特異性抗人ANG2單克隆抗體和ANG2多克隆抗體，以抗人ANG2多克隆抗體為捕獲抗體，以生物素標(biāo)記的抗人ANG2單克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)可溶性ANG2含量的雙抗夾心ELISA方法。上述的一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法，其中，所述的構(gòu)建ANG2 基因制備ANG2蛋白應(yīng)用RT-PCR技術(shù)釣取ANG2基因序列，構(gòu)建pET28a/ANG2重組表達(dá)質(zhì)粒， 并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21宿主菌株中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)His-ANG2融合蛋白，鎳柱親和層析純化 ANG2蛋白，采用SDS-PAGE分析表達(dá)。上述的一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法，其中，所述的ANG2單克隆抗體的制備工藝采用純化的His-ANG2融合蛋白作為抗原，免疫BALB/c小鼠和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，以HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽(yáng)性孔，將克隆后的雜交瘤細(xì)胞接種入小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，收集腹水并進(jìn)行純化。上述的一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法，其中，所述的ANG2多克隆抗體的制備工藝，其特征在于，采用純化的His-ANG2融合蛋白免疫家兔，制備并純化多克隆抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，為腫瘤及自身免疫疾病等 Angiogenin相關(guān)疾病的診斷、療效觀察及預(yù)后判斷提供了一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，為研究Angiogenin蛋白功能及在腫瘤篩查診斷等方面奠定基礎(chǔ)。說(shuō)明書附1為雙抗夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線；橫坐標(biāo)為不同稀釋濃度的ANG2抗原標(biāo)準(zhǔn)品，縱坐標(biāo)為相應(yīng)的0D450nm吸光值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。一、ANG2基因的構(gòu)建、表達(dá)及純化1 方法1. 1ANG2基因的釣取ANG2 基因 cDNA 序列1 ATGTGGCAGA TTGTTTTCTT TACTCTGAGC TGTGATCTTG TCTTGGCCGCAGCCTATAAC AACTTTCGGA AGAGCATGGA CAGCATAGGA AAGAAGCAAT101 ATCAGGTCCA GCATGGGTCC TGCAGCTACA CTTTCCTCCT GCCAGAGATGGACAACTGCC GCTCTTCCTC CAGCCCCTAC GTGTCCAATG CTGTGCAGAG201 GGACGCGCCG CTCGAATACG ATGACTCGGT GCAGAGGCTG CAAGTGCTGGAGAACATCAT GGAAAACAAC ACTCAGTGGC TAATGAAGCT TGAGAATTAT301 ATCCAGGACA ACATGAAGAA AGAAATGGTA GAGATACAGC AGAATGCAGTAGAACCAG ACGGCTGTGA TGATAGAAAT AGGGACAAAC CTGTTGAACC401 AAACAGCGGA GCAAACGCGG AAGTTAACTG ATGTGGAAGC CCAAGTATTAAATCAGACCA CGAGACTTGA ACTTCAGCTC TTGGAACACT CCCTCTCGAC501 AAACAAATTG GAAAAACAGA TTTTGGACCA GACCAGTGAA ATAAACAAATTGCAAGATAA GAACAGTTTC CTAGAAAAGA AGGTGCTAGC TATGGAAGAC601 AAGCACATCA TCCAACTACA GTCAATAAAA GAAGAGAAAG ATCAGCTACAGGTGTTAGTA TCCAAGCAAA ATTCCATCAT TGAAGAACTA GAAAAAAAAA701 TAGTGACTGC CACGGTGAAT AATTCAGTTC TTCAGAAGCA GCAACATGATCTCATGGAGA CAGTTAATAA CTTACTGACT ATGATGTCCA CATCAAACTC801 AGCTAAGGAC CCCACTGTTG CTAAAGAAGA ACAAATCAGC TTCAGAGACTGTGCTGAAGT ATTCAAATCA GGACACACCA CGAATGGCAT CTACACGTTA901 ACATTCCCTA ATTCTACAGA AGAGATCAAG GCCTACTGTG ACATGGAAGCTGGAGGAGGC GGGTGGACAA TTATTCAGCG ACGTGAGGAT GGCAGCGTTG
1001 ATTTTCAGAG GACTTGGAAA GAATATAAAG TGGGATTTGG TAACCCTTCAGGAGAATATT GGCTGGGAAA TGAGTTTGTT TCGCAACTGA CTAATCAGCA1101 ACGCTATGTG CTTAAAATAC ACCTTAAAGA CTGGGAAGGG AATGAGGCTTACTCATTGTA TGAACATTTC TATCTCTCAA GTGAAGAACT CAATTATAGG1201 ATTCACCTTA AAGGACTTAC AGGGACAGCC GGCAAAATAA GCAGCATCAGCCAACCAGGA AATGATTTTA GCACAAAGGA TGGAGACAAC GACAAATGTA1301 TTTGCAAATG TTCACAAATG CTAACAGGAG GCTGGTGGTT TGATGCATGTGGTCCTTCCA ACTTGAACGG AATGTACTAT CCACAGAGGC AGAACACAAA1401 TAAGTTCAAC GGCATTAAAT GGTACTACTG GAAAGGCTCA GGCTATTCGCTCAAGGCCAC AACCATGATG ATCCGACCAG CAGATTTCTA A根據(jù)Genebank中所提供的人ANG2mRNA序列(Genebank登錄號(hào)NM001147)，設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的特異性引物，引物序列如下ANG2-F :5，-gcTCTAGAGAATTCatgtggcagattgttttcttac-3，(帶有 EcoR I 酶切位占)ANG2-R :5，-tccCCCGGGAAGCTTgaaatctgctggtcggatca-3，(帶有 Hind III 酶切位占)PCR反應(yīng)程序94"C 4min ICycle
權(quán)利要求
1.一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法，其特征在于，首先構(gòu)建ANG2基因制備ANG2蛋白，再表達(dá)并純化ANG2蛋白，以ANG2蛋白為抗原制備高效價(jià)和高特異性抗人ANG2單克隆抗體和ANG2多克隆抗體，以抗人ANG2多克隆抗體為捕獲抗體，以生物素標(biāo)記的抗人ANG2單克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)可溶性ANG2含量的雙抗夾心ELISA方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法，其特征在于，所述的構(gòu)建ANG2基因制備ANG2蛋白應(yīng)用RT-PCR技術(shù)釣取ANG2基因序列，構(gòu)建pET28a/ ANG2重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21宿主菌株中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)His_ANG2融合蛋白， 鎳柱親和層析純化ANG2蛋白，采用SDS-PAGE分析表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法，其特征在于，所述的ANG2單克隆抗體的制備工藝采用純化的His-ANG2融合蛋白作為抗原，免疫 BALB/c小鼠和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，以HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽(yáng)性孔，將克隆后的雜交瘤細(xì)胞接種入小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，收集腹水并進(jìn)行純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法，其特征在于，所述的ANG2多克隆抗體的制備工藝，其特征在于，采用純化的His-ANG2融合蛋白免疫家兔，制備并純化多克隆抗體。
全文摘要
一種基于Angiogenin檢測(cè)的雙抗夾心ELISA方法，旨在提供一種方法簡(jiǎn)單，靈敏度高的檢測(cè)ANG2含量的方法；其技術(shù)要點(diǎn)是首先構(gòu)建ANG2基因制備ANG2蛋白，再表達(dá)并純化ANG2蛋白，以ANG2蛋白為抗原制備高效價(jià)和高特異性抗人ANG2單克隆抗體和ANG2多克隆抗體，以抗人ANG2多克隆抗體為捕獲抗體，以生物素標(biāo)記的抗人ANG2單克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)可溶性ANG2含量的雙抗夾心ELISA方法；本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域；可用于腫瘤及自身免疫疾病等Angiogenin相關(guān)疾病的診斷、療效觀察及預(yù)后判斷，為研究Angiogenin蛋白功能及在腫瘤篩查診斷等方面奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/515GK102221615SQ20111008108
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者孫奮勇, 康賢通, 馬紀(jì) 申請(qǐng)人:廣州華燦醫(yī)藥科技有限公司