專利名稱：一種融合蛋白tat-oct4及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白TAT-0CT4及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
0CT4與NANOG是參與胚胎干(ES)細(xì)胞多能性維持和自我更新的兩個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)也在體外誘導(dǎo)成體細(xì)胞向誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPS cell)重編程過程中起著關(guān)鍵作用。在早期的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)研究中，大都采用病毒轉(zhuǎn)染等基因修飾的方法，但此方法存在著很大安全隱患。在09年底有文獻(xiàn)報(bào)道，利用多精氨酸蛋白跨膜肽與誘導(dǎo)因子0CT4， S0X2，c-MYC，KLF4也可以成功的誘導(dǎo)出人類和小鼠的iPS細(xì)胞。但是目前關(guān)于單獨(dú)誘導(dǎo)因子在重編程中功能的研究很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白，命名為TAT-0CT4。本發(fā)明提供的融合蛋白，包括TAT跨膜肽以及結(jié)合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的細(xì)胞重編程相關(guān)因子；所述細(xì)胞重編程相關(guān)因子為0CT4轉(zhuǎn)錄因子、c-myc因子、klf4因子或S0X2因子； 所述0CT4轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如序列表中序列6所示。上述TAT跨膜肽是如下1)或2)所述的多肽1)序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的多肽；2)序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端和/或C末端加上1-10個(gè)任意氨基酸殘基且具有跨膜功能的由1)衍生的多肽；所述TAT跨膜肽2、是如下a)或b)或c)a)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的C末端加上序列表中序列4所示的 HA標(biāo)簽；b)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端加上His標(biāo)簽；c)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的C末端加上序列表中序列4所示的 HA標(biāo)簽并在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端加上His標(biāo)簽。進(jìn)一步，上述蛋白是如下I)或II)的蛋白質(zhì)I)其氨基酸序列如序列表中序列8的第22-403位所示；II)其氨基酸序列如序列表中序列8所示。上述的蛋白的編碼基因?qū)儆诒景l(fā)明的保護(hù)范圍。進(jìn)一步講，上述基因是如下1)或2)1)其核苷酸序列如序列表中序列7的第64-1212位；2)其核苷酸序列如序列表中序列7所示。含有上述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體地講，上述重組表達(dá)載體是將上述的基因插入載體pET18a的多克隆位點(diǎn)得到的載體。上述的蛋白或上述的基因在制備如下(1)-(4)中任一所述產(chǎn)品中的應(yīng)用(1)促進(jìn)細(xì)胞向誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的產(chǎn)品；(2)促進(jìn)細(xì)胞增殖的產(chǎn)品；(3)促進(jìn)細(xì)胞中內(nèi)源NANOG轉(zhuǎn)錄因子或0CT4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增強(qiáng)的產(chǎn)品；(4)促進(jìn)細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)量增強(qiáng)的產(chǎn)品。上述NANOG轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述NANOG轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因如序列表中序列9所示；所述細(xì)胞周期蛋白是CDC25A或CDK6。上述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞；優(yōu)選是是HAF細(xì)胞實(shí)施例5證明HAF細(xì)胞內(nèi)源性的0CT4和NANOG的轉(zhuǎn)錄均可被外源加入的 TAT-0CT4和TAT-NAN0G融合蛋白所激活。TAT跨膜肽輸送核轉(zhuǎn)錄因子蛋白可作為一個(gè)細(xì)胞重編程的方法，將在iPS細(xì)胞誘導(dǎo)和臨床上具有重要的應(yīng)用前景。可見，我們制備的導(dǎo)肽融合蛋白TAT-0CT4和TAT-NAN0G均可以激活成纖維細(xì)胞內(nèi)源的0CT4與NANOG表達(dá)，這也反應(yīng)了在iPS重編程過程中轉(zhuǎn)錄因子0CT4和NANOG的自我調(diào)控與相互調(diào)控。而且TAT-NAN0G 可以在體外顯著的提高細(xì)胞的增殖速度，這樣為細(xì)胞的體外擴(kuò)增及組織工程的臨床應(yīng)用提供了一種更加可控，更加安全的有效途徑。


圖1為目的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，及其表達(dá)純化的SDS-PAGE電泳檢測(cè)與western blot 鑒定；A，融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；B，目的蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳檢測(cè)1，Marker ；2，5， 空白對(duì)照的上清液和包涵體沉淀；3，6，TAT-0CT4表達(dá)菌株的上清液和包涵體沉淀；4，6， TAT-NAN0G表達(dá)菌株的上清液和包涵體沉淀；C，D，分別為TAT-NAN0G和TAT-0CT4的鎳柱純化及western blot鑒定。圖2為免疫熒光的方法對(duì)TAT融合蛋白的跨膜效率檢測(cè)。圖3為TAT-0CT4和TAT-NAN0G細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)。圖4為空白對(duì)照組，TAT-NAN0G組，TAT-0CT4組HAF細(xì)胞中0CT4的內(nèi)源表達(dá)。圖5為空白對(duì)照組，TAT-NAN0G組，TAT-0CT4組HAF細(xì)胞中NANOG的內(nèi)源表達(dá)。圖6為融合蛋白TAT-NAN0G進(jìn)入成纖維細(xì)胞后提高細(xì)胞的增殖速度。圖7為TAT-NAN0G處理后HAF細(xì)胞中CDC25A的表達(dá)相對(duì)于TAT-0CT4組和對(duì)照組顯著上調(diào)，而⑶K6的表達(dá)略有上調(diào)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、TAT跨膜肽核轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建利用TRIZOL試劑盒(購自hvitrogen公司)提取PA-1細(xì)胞(購自ATCC) 的總RNA，用Dnase 1(購自Invitrogen)消化后，用反轉(zhuǎn)錄酶Super Transcript III (Invitrogen)將上述PA-I細(xì)胞的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA為模板，分別設(shè)計(jì)0CT4 的上游引物 5，-GCGGAGCTCATGGCGGGACACCTGG-3，和下游引物 5，-ATAGCGGCCGCTTAT CAGTTTGAATGCA-3，，NANOG 的上游引物 5，-GAGCTCATGAGTGTGGATCCAGCTT-3，和下游引物 5，-GCGGCCGCTCACACGTCTTCAGGTT-3，，用Platinum Pfx DNA 聚合酶(購自 hvitrogen 公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)?；厥丈鲜鯬CR反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果分別獲得1090bp 的0CT4擴(kuò)增產(chǎn)物和918bp的NANOG擴(kuò)增產(chǎn)物，回收該條帶連入pMD18_T克隆載體中并進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明，獲得條帶與0CT4 GenBank Accession Number :NM_002701. 4和 NANOG GenBank Accession Number :NM_024865. 2 的序列一致。也即所述 1090bp 的 0CT4 擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，可編碼序列表中序列6所示的蛋白。然后我們又通過搭橋PCR的方法將跨膜肽TAT與標(biāo)簽HA分別構(gòu)建在轉(zhuǎn)錄因子 0CT4和NANOG的5’末端。跨膜肽TAT的編碼基因如序列表中序列1所示，可編碼序列表中序列2所示的蛋白。標(biāo)簽HA的編碼基因如序列表中序列3所示，可編碼序列表中序列4所示的蛋白。具體方法如下第一輪PCR反應(yīng)分別用0CT4內(nèi)部上游引物5’ CGCCGCT ATCCGTATGATGTGCCGGATGTGGCGGAGCTCATGGCGGGACACCTGG 3，，和 0CT4 下游引物 5，ataGCGGCCGCTTATCAGTTTGAATGCA 3，以上述所得正確的0CT4序列為模板得到擴(kuò)增產(chǎn)物 1，然后再以擴(kuò)增產(chǎn)物1為模板分別用0CT4外部上游引物5，ataCATATGTATGGCCGCAAAAAACG CCGCCAGCGCCGCCGCTATCCGTATG3，與 0CT4 下游引物 5，ataGCGGCCGCTTATCAGTTTGAATGCA 3， 進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到TAT-HA-0CT4的DNA序列。我們用同樣的方法得到了 TAT-HA-NAN0G的DNA序列，接著我們利用設(shè)計(jì)在引物上的NdeI (5，端)與NotI (3，端)酶切位點(diǎn)使用這兩種限制性內(nèi)切酶(Takara公司)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，然后連入原核表達(dá)載體pET28a中，然后進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示序列正確，將這兩種表達(dá)載體分別命名為PET-TAT-0CT4，PET-TAT-NAN0G。融合蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1 所示。測(cè)序表明表達(dá)載體PET-TAT-0CT4是將序列表中序列7的自5’端第64-1212位的 DNA片段插入pET28a中構(gòu)建而成的。其中序列表中序列7的自5，端第64-1212位的DNA 片段可編碼序列表中序列8的第22-403位所示的蛋白。實(shí)施例2、TAT跨膜肽核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)純化將表達(dá)載體PET-TAT-0CT4，PET-TAT-NAN0G和對(duì)照空載體pET28a轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli的BL21 Rostta-Gami (購自hvitrogen公司)菌株中，在37 °C的條件下用 ImMIPTG(購自Sigma公司)誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)后，離心收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，通過鎳柱(購自GE公司)利用HIS標(biāo)簽對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化，最后分別用0CT4的抗體(購自Santa Cruze公司)和NANOG的抗體對(duì)目的蛋白進(jìn)行了 western blot鑒定。表達(dá)純化及鑒定的結(jié)果如圖1所示。其中表達(dá)載體PET-TAT-0CT4表達(dá)出的融合蛋白(TAT-0CT4)的氨基酸序列如序列表中序列8所示。序列表中序列8的第1-21位是pET28a載體上自帶的基因所編碼的包括His標(biāo)簽在內(nèi)的蛋白。實(shí)施例3、TAT跨膜肽核轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測(cè)我們分別將終濃度為0. 2M的TAT-NAN0G和TAT-0CT4加入到HAF細(xì)胞的培養(yǎng)基中，2小時(shí)后我們通過免疫熒光的方法用HA的抗體(購自Sigma公司)對(duì)TAT融合蛋白的跨膜效率進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明TAT融合蛋白已穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)中，并且已有部分蛋白定位在細(xì)胞核中(圖2)。實(shí)施例4、TAT跨膜肽核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)對(duì)進(jìn)入細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子TAT-0CT4和TAT-NAN0G，我們分別利用帶有0CT4和 NANOG特異結(jié)合序列的報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析，來對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了檢測(cè)。與陰性對(duì)照相比，TAT-0CT4和TAT-NAN0G組均有顯著上調(diào)(圖3)。 實(shí)施例5、內(nèi)源性的0CT4和NANOG的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)0CT4, NANOG和S0X2是調(diào)控ES細(xì)胞多能型維持以自我更新的核心因子，文獻(xiàn)報(bào)道它們可以通過自調(diào)控和互調(diào)控的方式來維持在細(xì)胞內(nèi)的平衡。因此我們使用 STORGreen (購自Applied Biosystems公司)通過定量PCR方法來檢測(cè)用跨膜肽融合蛋白刺激后HAF細(xì)胞內(nèi)源相關(guān)基因的表達(dá)變化。處理組與對(duì)照組的cDNA制備與實(shí)施例1中方法相同。檢測(cè)序列表中序列5所示的0CT4基因和序列表中序列9所示的NANOG基因的所用引物如表2所示。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，HAF細(xì)胞內(nèi)源性的0CT4和NANOG的轉(zhuǎn)錄均可被外源加入的TAT-0CT4和TAT-NAN0G融合蛋白所激活(圖4，圖5)。表 權(quán)利要求
1.一種蛋白，包括TAT跨膜肽以及結(jié)合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的細(xì)胞重編程相關(guān)因子；所述細(xì)胞重編程相關(guān)因子為0CT4轉(zhuǎn)錄因子、c-myc因子、klf4因子或S0X2因子；所述 0CT4轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于所述TAT跨膜肽是如下1)或2)所述的多肽1)序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的多肽；2)序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端和/或C末端加上1-10個(gè)任意氨基酸殘基且具有跨膜功能的由1)衍生的多肽；所述TAT跨膜肽2、是如下a)或b)或c)a)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的C末端加上序列表中序列4所示的HA 標(biāo)簽；b)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端加上His標(biāo)簽；c)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的C末端加上序列表中序列4所示的HA 標(biāo)簽并在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端加上His標(biāo)簽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的蛋白，其特征在于所述蛋白是如下I)或II)的蛋白質(zhì)I)其氨基酸序列如序列表中序列8的第22-403位所示；II)其氨基酸序列如序列表中序列8所示。
4.權(quán)利要求1-3中任一所述的蛋白的編碼基因。
5.如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)1)其核苷酸序列如序列表中序列7的第64-1212位；2)其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
6.含有權(quán)利要求4或5所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將權(quán)利要求4 或5所述的基因插入載體pET-28a的多克隆位點(diǎn)得到的載體。
8.權(quán)利要求1-3中任一所述的蛋白或權(quán)利要求4或5所述的基因在制備如下(1)-(4) 中任一所述產(chǎn)品中的應(yīng)用(1)促進(jìn)細(xì)胞向誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變的產(chǎn)品；(2)促進(jìn)細(xì)胞增殖的產(chǎn)品；(3)促進(jìn)細(xì)胞中內(nèi)源NANOG轉(zhuǎn)錄因子或0CT4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量增強(qiáng)的產(chǎn)品；(4)促進(jìn)細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)量增強(qiáng)的產(chǎn)品。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述NANOG轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述NANOG轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因如序列表中序列9所示；所述細(xì)胞周期蛋白是CDC25A或CDK6。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞；優(yōu)選是是HAF 細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合蛋白TAT-OCT4及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的融合蛋白，TAT跨膜肽以及結(jié)合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的細(xì)胞重編程相關(guān)因子。將本發(fā)明的融合蛋白TAT-OCT4處理HAF細(xì)胞后，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)量增強(qiáng)。TAT跨膜肽輸送核轉(zhuǎn)錄因子蛋白可作為一個(gè)細(xì)胞重編程的方法，將在細(xì)胞誘導(dǎo)和臨床上具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102190735SQ201110084049
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者戴建武, 曹佳妮, 肖志峰, 陳冰 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所