專利名稱：一種大豆ap1類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，具體涉及來源于大豆的與花期和花器官發(fā)育相關(guān)的APl類轉(zhuǎn)錄因子GmAPl及其編碼基因與其在改變植物花期和花器官改造中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生殖生長(zhǎng)是高等植物生活史中最重要的階段，是植物繁殖后代和種群擴(kuò)散的手段和基礎(chǔ)，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)獲得產(chǎn)品的關(guān)鍵時(shí)期?；ㄆ鞴偈巧尺^程中重要的功能器官，它的發(fā)育狀況直接影響到果實(shí)和種子的形成以及品質(zhì)?；ǖ陌l(fā)育是植物生殖生長(zhǎng)期開始的重要標(biāo)志。植物必須在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間開始花的發(fā)育，以利于受精和種子的形成，確保繁殖的最大成功?；ǖ陌l(fā)育，即成花過程，是一個(gè)復(fù)雜而有序的生理活動(dòng)。植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后， 營(yíng)養(yǎng)分生組織形成花序分生組織，花序分生組織逐步形成花分生組織，然后產(chǎn)生花器官原基，花器官原基最終分化成各種花器官，形成一朵完整的花。這一過程受到外界環(huán)境誘導(dǎo)和基因網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)格控制，伴隨著一些特異基因的差異性表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)許多基因家族與花發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)。其中，MADS-box基因是調(diào)控植物生殖生長(zhǎng)的重要因子，也是研究最為深入的一個(gè)基因家族。APl類基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，編碼的轉(zhuǎn)錄因子具有序列特異性。該類轉(zhuǎn)錄蛋白因子具有保守的MADS域、I域、K域和C域。APl屬于花分生組織特征基因，在擬南芥中控制花序分生組織向花分生組織轉(zhuǎn)變，調(diào)控開花時(shí)間。同時(shí)，APl又屬于花器官特征基因， 具有ABC型MADS-box基因的A類基因功能，參與萼片和花瓣的特化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明的另一目的是提供編碼該大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子的基因。本發(fā)明的又一目的是提供該轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子GmAPl，具有SEQ ID NO. 2所述氨基酸序列。編碼所述的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子GmAPl的基因GmAPl。
該基因的開放閱讀框具有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。含有所述大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl的表達(dá)載體。所述的表達(dá)載體優(yōu)選將SEQ ID NO. 1所示的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl 開放閱讀框利用gateway技術(shù)插入植物表達(dá)載體pMDC32得到的植物過量表達(dá)載體 pMDC32-GmAPl。使用GmAPl構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(GUS基因、GFP基因等)或者抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物、潮霉素標(biāo)記物等)的抗性基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以表型性狀篩選轉(zhuǎn)化植株。含有所述大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl的工程菌。所述的工程菌優(yōu)選將所述的GmAPl基因轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105所得。擴(kuò)增大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl開放閱讀框的引物，正向引物和反向引物序列如下正向引物序歹Ij:5，ATGGGAAGGGGTAGGGTT 3，(SEQ ID NO. 3)；反向引物序列5，TGTCAAATGCCATACCAAAGC3，(SEQ ID NO. 4)。所述的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子GmAPl在改變植物花期和/或花器官改造中的應(yīng)用。所述的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl在改變植物花期和/或花器官改造中的應(yīng)用。攜帶有本發(fā)明GmAPl的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植物， 也可以是煙草、大豆、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等雙子葉植物。有益效果本發(fā)明提供的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl在花中特異性表達(dá)。該轉(zhuǎn)錄因子可能參與大豆的花序分生組、花分生組織和花器官(萼片和花瓣)的發(fā)育調(diào)控。GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比，開花期顯著提前，并出現(xiàn)了花器官同源異型突變現(xiàn)象。這一結(jié)果說明GmAPl能夠影響植物的成花轉(zhuǎn)變過程，調(diào)控花期，控制花器官形成。過量表達(dá)該基因可促使植物的開花期提前，花器官改變。這不僅可以解決制種過程中的花期不遇的難題，也可以縮短世代，減少耕種時(shí)間，加快育種步伐，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也有助于合理安排茬口提高復(fù)種指數(shù)。本發(fā)明的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)Ω淖冎参锘ㄆ诤突ㄆ鞴俑脑?，特別是培育早花早熟大豆具有重要意義，在作物育種發(fā)面具有廣泛的應(yīng)用前景。利用植物過量表達(dá)載體pMDC32-GmAPl，將本發(fā)明的GmAPl導(dǎo)入植物體內(nèi)，可獲得提前開花的轉(zhuǎn)基因植株。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。圖1為GmAPl在大豆中的表達(dá)特性圖A. GmAPl在大豆不同器官中的表達(dá)分析，分別為根、莖、葉、花、莢皮、種子(開花后25天)；B. GmAPl在大豆四輪花器官中的表達(dá)分析，花器官分別為萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊。C. GmAPl在大豆花發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析，其中1-4表示的發(fā)育時(shí)期對(duì)應(yīng)于D圖中 1-4所示的從綠色的花芽到完全成熟開放的花所經(jīng)過的四個(gè)不同時(shí)期；D從綠色的花芽到完全成熟開放的花所經(jīng)過的四個(gè)不同時(shí)期，1-4與C圖相對(duì)應(yīng)。圖2為含有GmAPl的植物過量表達(dá)載體的部分結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定。
M為DNA分子量DL2000 (Takara) ； 1_10為不同的轉(zhuǎn)基因株系；WT為野生型煙草 (陰性對(duì)照)。圖4為轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR鑒定。1-8為不同的株系；P :pMDC32-GmAPl質(zhì)粒DNA (陽(yáng)性對(duì)照)；WT為野生型煙草(陰性對(duì)照)；M為DNA分子量DL2000 (Takara)。圖5為!35S: GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交鑒定。M為Marker ；WT為野生型煙草；2、6、17、30、23表示不同的35S: GmAPl轉(zhuǎn)基因株
系；箭頭表示雜交帶位置。圖6為35S: GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)花器官變異。A和G，野生型煙草正常發(fā)育的花，花瓣、萼片均為5枚。B-C，35S::GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草的花瓣和雄蕊發(fā)育異常，出現(xiàn)同源異型突變現(xiàn)象。D-F，轉(zhuǎn)基因煙草的花瓣、萼片突變?yōu)? 枚。圖7為35S::GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的開花期時(shí)間比較。35S: :GmAPl轉(zhuǎn)基因植株平均開花期要明顯早于野生型煙草，存在0.01水平顯著差異。圖8為35S: :GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草的株高比較。35S: GmAPl轉(zhuǎn)基因植株在開花期時(shí)平均株高要明顯低于野生型煙草，存在0. 01 水平顯著差異。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1大豆GmAPl及其編碼基因的克隆與鑒定實(shí)驗(yàn)材料為栽培大豆品種Jackson，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心種質(zhì)資源研究室提供。參照擬南芥APl基因(GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為Z16421)的序列信息和大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行大豆APl類基因的克隆， 基因命名為GmAPl。具體方法如下取大豆的花，置于液氮中研碎，采用植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN DP404)進(jìn)行總RNA提取。取5 μ g總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Τ0Υ0Β0公司)按試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 以得到的cDNA片段為模板，利用SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的擴(kuò)增GmAPl開放閱讀框的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。50 μ 1 PCR反應(yīng)體系為2 μ 1 cDNA(0. 05 μ g)、上、下游引物各 2μ 1(10μΜ)、5μ 1 10 X PCR 緩沖液、1 μ 1 dNTP (IOmM)禾口 2U Taq DNA 聚合酶，用超純水補(bǔ)足50 μ 1。反應(yīng)在Bio-RAD PTC200型PCR儀上進(jìn)行，其程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性 50s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，共32個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、測(cè)序后，進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明該GmAPl的開放閱讀框具有序列表中SEQ ID NO. 1 的核苷酸序列，全長(zhǎng)為7 Ilbp，編碼SEQ ID N0. 2所示的236個(gè)氨基酸。
實(shí)施例2 GmAPl在大豆不同器官和不同發(fā)育時(shí)期的花中的表達(dá)特征利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)GmAPl在大豆各個(gè)器官和不同發(fā)育時(shí)期的花中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。大豆實(shí)驗(yàn)材料于六月初播種于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室，田間管理同常規(guī)。 第三片復(fù)葉展開時(shí)取根、莖、葉；初花期取花芽，盛花期取花苞和盛花；取開花后25天的種子。盛花取下后在無菌條件下迅速分離各輪花器官花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，分別液氮速凍后-80°C保存?zhèn)溆谩？俁NA的提取同實(shí)施例1。以大豆組成型表達(dá)基因Tubulin(GenBank登陸號(hào)為 AY907703)為內(nèi)參基因，其擴(kuò)增引物為Tubulin正向引物序列5，GGAGTTCACAGAGGCAGAG 3，(SEQ IDN0. 7) ,Tubulin 反向引物序列5，CACTTACGCATCACATAGCA 3，(SEQ ID NO. 8)。以來自大豆不同組織或器官的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。GmAPl的擴(kuò)增引物為GmAPΙ-qPCR 正向引物序列5，ATGATTCCGAGTCACAGGGAA 3，(SEQ ID NO. 5), GmAPl-qPCR 反向引物序列5，TGTCAAATGCCATACCAAAGC 3，(SEQ ID NO. 6)。結(jié)果(圖1)分析表明，GmAPl在花中特異性表達(dá)，在根、莖、葉和種子中均不表達(dá)。 在四輪花器官中，GmAPl只在花瓣和萼片中表達(dá)，萼片中表達(dá)量較高。隨著花的成熟、開放， GmAPl的表達(dá)量總體趨勢(shì)是逐漸上升，在花瓣快速生長(zhǎng)的花苞期表達(dá)量最高。實(shí)施例3 GmAPl轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定禾I」M Invitrogen & 司的 Gateway Technology with Clonase I I i式齊[Ji， GmAPl 重組到植物表達(dá)載體pMDC32 (Curtis et al, 2003,Plant Physiology. 133，462-469) 中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化液涂布于含50mg/L潮霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒，得到pMDC32-GmAPl植物過量表達(dá)載體(圖幻，用凍融法將 pMDC32-GmAPl 轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株 EHA105 (Biovector Co. , LTD)中。將 pMDC32_GmAPl 通過農(nóng)桿菌株EHA105的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，在含有50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初步篩選得到具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植株。提取初步篩選得到具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA，使用基因特異性引物GmAPl-BF SEQ ID N0. 9，和GmAPl-BR :SEQ ID NO. 10進(jìn)行PCR鑒定。能夠擴(kuò)增出約為 SOObp大小條帶的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草，擴(kuò)增不出約為SOObp大小條帶的為陰性植株(圖3)。 選擇 PCR 鑒定為陽(yáng)性的植株，以 GmAPl-BF (SEQ ID N0. 9)和 GmAPl-BR(SEQ ID NO. 10)為引物，進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果表明GmAPl可在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)(圖4)。將PCR、RT-PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株命名為35S: GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草。大量提取35S: GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草的基因組總DNA，用EcoR I充分酶切后與DIG標(biāo)記的GmAPl探針進(jìn)行Southern雜交。GmAPl 探針序列為GmAPl開放閱讀框全長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)野生型煙草的基因組DNA作為陰性對(duì)照，操作按照DIG HighPrime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche)試劑盒的說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因植株顯示特征條帶，陰性對(duì)照沒有帶(圖幻。這表明GmAPl基因的開放閱讀框區(qū)域已經(jīng)整合到35S: GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA中，且均以多個(gè)拷貝方式插入。對(duì)35S::GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行表型觀察。在25°C、長(zhǎng)日照的生長(zhǎng)條件下，與野生型煙草相比，35S: GmAPl轉(zhuǎn)基因煙草出現(xiàn)了花瓣?duì)钚廴?、雄蕊狀花瓣的花器官同源異型突變性狀，萼片和花瓣?shù)目突變?yōu)?枚(圖6)，說明GmAPl的異源表達(dá)能夠影響花器官的正常發(fā)育。統(tǒng)計(jì)開花期的結(jié)果顯示，煙草中過量表達(dá)GmAPl能夠促使植株提早開花，且差異極顯著(圖7)。由于開花提前，轉(zhuǎn)基因煙草過早地結(jié)束營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)
6致植株矮化。對(duì)比處于開花期的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的株高，結(jié)果顯示35S: =GmAPlR 基因煙草株高平均值明顯低于野生型煙草，差異極顯著(圖8)。
權(quán)利要求
1.一種大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子GmAPl，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所述氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子GmAPl的基因GmAPl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子GmAPl的基因GmAPl，其特征在于該基因的開放閱讀框具有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體是將SEQID NO. 1 所示的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl開放閱讀框利用gateway技術(shù)插入植物表達(dá)載體 PMDC32得到的植物過量表達(dá)載體pMDC32-GmAPl。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的工程菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的工程菌，其特征在于所述的工程菌是將所述的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105所得。
8.擴(kuò)增大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl開放閱讀框的引物，其特征是正向引物序列為 SEQ IDN0. 3，反向引物序列為SEQ ID NO. 4。
9.權(quán)利要求1所述的APl類轉(zhuǎn)錄因子GmAPl在改變植物花期和/或花器官改造中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2或3所述的大豆APl類轉(zhuǎn)錄因子基因GmAPl在改變植物花期和/或花器官改造中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種大豆AP1類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。該大豆AP1類轉(zhuǎn)錄因子，命名為GmAP1，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)。其編碼基因GmAP1具有SEQ ID NO.1所示序列。本發(fā)明大豆AP1轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因可用于改變植物花期，培育早花植物品種，進(jìn)行花器官改造等方面。GmAP1為花器官特異性表達(dá)基因，其表達(dá)模式與組織以及植株的發(fā)育階段相關(guān)。與野生型煙草相比，過量表達(dá)GmAP1的轉(zhuǎn)基因煙草開花期提前，并出現(xiàn)了花器官同源異型突變性狀。說明GmAP1能控制植物的成花轉(zhuǎn)變，影響植物的花期，決定四輪花器官的特化和發(fā)育。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102206262SQ201110089240
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者喻德躍, 遲英俊, 黃方 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)