專利名稱：通過伯胺使病毒和/或蛋白質(zhì)與核酸分離的制作方法
通過伯胺使病毒和/或蛋白質(zhì)與核酸分離本申請(qǐng)要求于2010年4月20日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/325，卯4的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時(shí)申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過援引并入本文。
背景技術(shù)：
本文公開的實(shí)施方案涉及用伯胺使病毒和/或蛋白質(zhì)與核酸分離。強(qiáng)陰離子交換劑例如基于季銨離子的那些用于例如下游處理中，作為用于捕獲液體例如生物學(xué)液體特別是制造生物治療藥物的溶液中存在的帶負(fù)電荷大雜質(zhì)的精制 (polishing)介質(zhì)，所述雜質(zhì)例如內(nèi)毒素、病毒、核酸和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)。通常，陰離子交換劑已以珠形式提供且使用，例如可從GE Healthcare Bio-Sciences AB獲得的Q kpharose 。然而，基于珠的系統(tǒng)的通過量局限性可以需要大體積柱以有效捕獲雜質(zhì)?；谀さ膶游鱿到y(tǒng)(也稱為膜吸著劑(sorber))具有與對(duì)流膜孔直接附著的配體， 從而消除了內(nèi)部孔擴(kuò)散對(duì)大量轉(zhuǎn)運(yùn)(mass transport)的作用。此外，具有與有效流動(dòng)分配器偶聯(lián)的緊密膜孔徑分布的微孔膜基底的使用可以使軸分散降到最低，且提供所有活性位點(diǎn)的均勻利用。因此，膜吸著劑介質(zhì)的大量轉(zhuǎn)移速率可以比基于珠的標(biāo)準(zhǔn)層析介質(zhì)的那種大一個(gè)數(shù)量級(jí)，允許高效率和高通量分離。因?yàn)榕c用基于珠的介質(zhì)填充的柱比較，單個(gè)或甚至疊加膜是非常薄的，所以沿著層析床發(fā)現(xiàn)減少壓降，從而允許流速和生產(chǎn)率增加。所需結(jié)合容量通過使用足夠內(nèi)部表面積的膜達(dá)到，產(chǎn)生具有極大徑高比(d/h )的裝置配置。適當(dāng)設(shè)計(jì)的膜吸著劑具有為基于珠的標(biāo)準(zhǔn)制備型樹脂10 - 100倍好的層析效率。 因此，為了在膜吸著劑上達(dá)到相同水平的分離，可以利用10倍小的床高。1-5 mm的床高對(duì)于膜吸著劑是標(biāo)準(zhǔn)的，與用于基于珠的系統(tǒng)的10-30 cm床高比較。由于大體積膜吸著劑所需的極端柱長寬比，裝置設(shè)計(jì)是關(guān)鍵的。為了維持與膜吸著劑有關(guān)的固有性能優(yōu)點(diǎn)，需要適當(dāng)?shù)娜肟诤统隹诜峙淦饕杂行腋咝Ю每捎玫哪んw積。膜吸著劑技術(shù)理想地適合于本申請(qǐng)。膜吸著劑是高度多孔、互聯(lián)的介質(zhì)，當(dāng)溶液流過其孔時(shí)，其具有去除(吸附和/或吸收)溶液的某些組分的能力。膜吸著劑的性質(zhì)及其在所需應(yīng)用中表現(xiàn)良好的能力依賴于介質(zhì)(骨架)的多孔結(jié)構(gòu)以及暴露于溶液的表面性質(zhì)。一般地，首先由聚合物形成多孔介質(zhì)， 所述聚合物在水中不溶解或膨脹并且具有可接受的機(jī)械性質(zhì)。多孔介質(zhì)優(yōu)選是通過本領(lǐng)域眾所周知的相分離法制備的多孔膜片。參見例如，Zeman LJ, Zydney AL, Microfiltration and Ultrafiltration Principles and Applications, New York :Marcel Dekker,19960 中空纖維和管狀膜也是可接受的骨架。通常需要分開的處理步驟，以修飾所形成的多孔結(jié)構(gòu)的外部或正面表面和內(nèi)部孔表面，以賦予所需吸附性質(zhì)。因?yàn)槟そY(jié)構(gòu)通常由疏水聚合物形成，所以表面修飾步驟的另一個(gè)目的也是使得表面親水或水可濕潤。存在修飾膜的外部或正面表面和內(nèi)部孔表面的許多方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到涉及吸附、等離子體氧化、原位自由基聚合、移植和包被的示例性方法。這些方法大多數(shù)導(dǎo)致在膜表面上形成單層樣結(jié)構(gòu)，這大部分時(shí)間達(dá)到使得其親水的目的，然而未能賦予可接受的吸附性質(zhì)，例如對(duì)于被吸附物的高容量。容量定義為由給定介質(zhì)體積可以保留的被吸附物的量(重量)。只要所有吸附在膜表面上發(fā)生，該容量就受膜表面積限制。通過其性質(zhì)，與層析珠比較，微孔膜具有較少表面積。增加表面積的一個(gè)方法是減少孔徑，這明顯導(dǎo)致流量中的顯著喪失。例如，在0.65 um聚乙烯膜(Entegris Corp，Billerica ΜΑ) 上的最大限度(單層)蛋白質(zhì)吸附是約20 mg/ml，與表面相互作用類型無關(guān)。這明顯小于例如具有約80 mg/ml的一般容量的瓊脂糖層析珠。驅(qū)動(dòng)吸附的表面相互作用類型由其中使用給定膜吸著劑產(chǎn)物的具體應(yīng)用限定。例如，共同未決的申請(qǐng)系列號(hào)12/221，496公開了高容量、高親和力吸著劑，其去除來自單克隆抗體(MABs)溶液的病毒、核酸、內(nèi)毒素和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCPs)。這些雜質(zhì)趨于具有比 MABs低的等電點(diǎn)，這意味著在特定pH下它們將是帶負(fù)電荷的，而MAB將是帶正電荷的。需要陰離子交換劑即具有正電荷且吸引陰離子的介質(zhì)，以去除這些雜質(zhì)。許多化學(xué)部分在水溶液中具有正電荷，包括伯、仲和叔胺，以及季銨鹽。胺在低于11的PH下是帶正電荷的，而銨鹽在所有PH下都具有正電荷，所以這些基團(tuán)通常分別被稱為弱和強(qiáng)陰離子交換劑。陰離子交換成員具有多個(gè)帶正電荷的結(jié)合位點(diǎn)，其吸引且容納各種雜質(zhì)和污染物?？梢詽撛谌コ碾s質(zhì)量是這些結(jié)合位點(diǎn)在膜上的濃度的函數(shù)，并且配體的化學(xué)性質(zhì)(以及這些配體的濃度)負(fù)責(zé)對(duì)于各種雜質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度。高結(jié)合強(qiáng)度是用于增加雜質(zhì)例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)去除的關(guān)鍵屬性。結(jié)合強(qiáng)度(SB)也涉及洗脫結(jié)合雜質(zhì)所需的溶液的離子強(qiáng)度。 如下測定膜吸著劑的SB (以電導(dǎo)率單位測量，mS/cm)。首先，使少量被吸附物溶液經(jīng)過膜吸著劑，使得被吸附物與膜吸著劑結(jié)合。其次，用增加梯度的無機(jī)鹽例如氯化鈉洗脫膜吸著劑。記錄洗脫掉被吸附物所需的洗脫溶液的最低限度電導(dǎo)率且定義為那種膜吸著劑的SB。 通過增加吸著劑的結(jié)合強(qiáng)度，可以使得帶負(fù)電荷的雜質(zhì)與膜吸著劑不可逆地結(jié)合，從而顯著增加去除效率。高結(jié)合強(qiáng)度轉(zhuǎn)變?yōu)樵跇O高鹽濃度下結(jié)合帶負(fù)電荷的雜質(zhì)例如病毒或DNA 的能力。在疫苗工業(yè)中，在疫苗中使用的病毒或蛋白質(zhì)盡可能純化是基本的，并且因此希望從雜質(zhì)例如核酸特別是DNA中純化病毒。為了使用層析以流過模式執(zhí)行此類純化，DNA 與膜結(jié)合而病毒/蛋白質(zhì)流過膜是必需的。為了使用陰離子交換層析完成這點(diǎn)，通常進(jìn)料的PH必須低于病毒或蛋白質(zhì)的pi (通常約5. 5或更少)，這可以導(dǎo)致這些生物分子的不穩(wěn)定性和滅活。因此，將希望提供用介質(zhì)使用包括此類介質(zhì)的流過型陰離子交換劑用于使病毒或蛋白質(zhì)與例如DNA有效且選擇性分離的方法。發(fā)明概述
現(xiàn)有技術(shù)的問題已通過本發(fā)明克服，本發(fā)明提供了使用包括膜的陰離子交換劑 (exchanger)使生物分子例如病毒和其他蛋白質(zhì)與核酸特別是宿主細(xì)胞DNA分離，所述膜具有具有在其上形成的聚合物例如伯或仲胺配體，例如聚烯丙胺的表面。描述的是調(diào)節(jié)微孔膜的結(jié)合容量的方法，從而使得在高于病毒或蛋白質(zhì)Pl的PH下，它們選擇性保留對(duì)于高電荷物質(zhì)例如DNA的顯著和有效鍵合容量，同時(shí)喪失其對(duì)于荷電物質(zhì)例如病毒或蛋白質(zhì)的基本上所有結(jié)合容量。結(jié)果是通過建立這樣的條件使生物分子例如病毒/蛋白質(zhì)與DNA有效分離，從而使得生物分子在高于生物分子Pl的PH下流過裝置，同時(shí)仍保留顯著的DNA結(jié)合。在特定實(shí)施方案中，整個(gè)外部和內(nèi)部孔表面由松散交聯(lián)的水凝膠形成。這種水凝膠的濕(膨脹)厚度是約50-100 nm。用含有單獨(dú)或與單價(jià)鹽組合的一種或更多種離子改性劑或由其組成的緩沖液調(diào)節(jié)聚合伯胺和仲胺的結(jié)合容量，優(yōu)選具有與聚合物主鏈共價(jià)附著的伯胺，更優(yōu)選具有通過至少一個(gè)脂肪族基團(tuán)優(yōu)選亞甲基與聚合物主鏈共價(jià)附著的伯胺的脂肪族聚合物。離子改性劑定義為這樣的分子，其具有超過一個(gè)可電離基團(tuán)，并且可以與膜上的伯胺基團(tuán)強(qiáng)相互作用和/或與生物分子強(qiáng)相互作用，防止其與膜表面結(jié)合，和/或可以在2 個(gè)或更多個(gè)相似荷電離子基團(tuán)或分子之間形成弱或強(qiáng)橋。這些分子包括但不限于多價(jià)離子或鹽例如磷酸鹽、硫酸鹽或硼酸鹽，和多離子分子例如檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸、聚丙烯酸等。這些分子可以以其酸、堿或鹽形式使用。單價(jià)鹽是具有單電離的鹽，例如氯化鈉、溴化鈉、碘化鈉等。附圖簡述


圖1是依照特定實(shí)施方案在吸附劑的流過流中的FlU-A滴度和DNA濃度圖； 圖2是依照特定實(shí)施方案在吸附劑的流過流中的Flu-A滴度濃度圖；和圖3是依照特定實(shí)施方案在吸附劑的流過流中的DNA濃度圖。具體實(shí)施方案詳述
本文公開的實(shí)施方案涉及純化方法，所述純化方法涉及具有在多孔、自支持基底上形成的多孔聚合物的多孔層析或吸著介質(zhì)。該介質(zhì)特別適合于在以各種濃度的一種或更多種離子改性劑的存在下從病毒中有力去除物質(zhì)例如DNA，所述離子改性劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸(EDTA)、琥珀酸鹽、硫酸銨、硫酸鈉、哌嗪-N，N’ -雙(2-乙磺酸)、谷氨酸鹽、三-聚磷酸鹽、聚電解質(zhì)例如聚丙烯酸、苯乙烯磺酸鈉、表面活性劑例如月桂基醚硫酸鈉(單獨(dú)或作為其他緩沖液中的添加劑使用)。多孔基底具有與基底的幾何或物理結(jié)構(gòu)相關(guān)的2個(gè)表面。片將具有頂和底面，或第一個(gè)和第二個(gè)表面。這些通常被稱為“側(cè)面”。在使用中，液體將從一個(gè)側(cè)面(表面)通過基底流動(dòng)到且流過另一個(gè)側(cè)面(表面)。對(duì)于中空纖維和管狀膜，存在內(nèi)和外表面。流動(dòng)從內(nèi)部進(jìn)行到外部，或反之亦然，依賴于設(shè)計(jì)和用途。2個(gè)表面之間的厚度尺度是多孔的。這個(gè)多孔設(shè)計(jì)具有與孔相關(guān)的表面積。為了防止與術(shù)語“表面”或“表面積”或相似用法相關(guān)的混淆，本發(fā)明人將幾何表面稱為外部或正面表面或側(cè)面。與孔有關(guān)的表面積將被稱為內(nèi)部或多孔表面積。多孔材料包含其為空間隙的孔和構(gòu)成材料的物理體現(xiàn)的固體基質(zhì)或骨架。例如， 在非編織網(wǎng)中，隨機(jī)定向的纖維構(gòu)成基質(zhì)并且給予網(wǎng)其形式。在聚合物微孔膜中，相分離的聚合物提供基質(zhì)。此處，本發(fā)明人討論包被或覆蓋介質(zhì)的表面。本發(fā)明人通過這意指如此包被內(nèi)和外表面，以便不完全阻斷孔，即保留顯著比例的結(jié)構(gòu)用于對(duì)流流動(dòng)。特別地，對(duì)于內(nèi)表面積，包被或覆蓋意指包被或覆蓋基質(zhì)，留下顯著比例的孔開放。吸收(absorption)指通過滲透到吸收材料體內(nèi)吸收物質(zhì)。吸附(adsorption)指分子從本體相移動(dòng)到吸附介質(zhì)表面上。吸著(sorption)是包括吸附和吸收的一般術(shù)語。類似地，在本文中指示為吸著劑的吸著材料或吸著裝置，指吸附和吸收的材料或裝置。多孔基底充當(dāng)用于吸附水凝膠的支持骨架。基底應(yīng)順應(yīng)處理和制造成堅(jiān)固和完整的裝置?？捉Y(jié)構(gòu)應(yīng)提供均勻流動(dòng)分布、高流量和高表面積?；卓梢允抢w維、片例如編織物、 非織物、墊、氈或膜、或一種或更多種珠。優(yōu)選地，基底是由編織或非編織物或膜形成的片。纖維可以具有任何長度、直徑并且可以是中空或?qū)嵭牡?。它們不鍵合在一起作為基底(盡管它們?cè)趹?yīng)用包衣后可能形成單一結(jié)構(gòu))，而是個(gè)別不連續(xù)實(shí)體。它們可以以連續(xù)長度的形式例如不確定長度的線或單絲，或它們可以形成較短的個(gè)別纖維，通過切割纖維材料例如非編織或編織物、將連續(xù)長度纖維切成個(gè)別小片制成，通過結(jié)晶生長法形成等。非編織物是通過使纖維或纖絲熱或化學(xué)纏繞由鍵合在一起的分開纖維直接制成的扁平、多孔片。一般地，非編織物制造商供應(yīng)具有1 - 500微米平均流動(dòng)孔(MFP)等級(jí)的介質(zhì)。對(duì)于非編織物，多孔結(jié)構(gòu)是纏繞纖維，并且多孔性指纖維之間和纖維中的彎曲間隙。多孔性對(duì)于縮絨織物具有相似含義。優(yōu)選非織物通過Freudenberg Nonwovens NA of Lowell, Mass.，并且是類型F02463。編織物通過使經(jīng)線纖維和緯線纖維以有規(guī)則模式或編織樣式在一定預(yù)定角度彼此交錯(cuò)產(chǎn)生。一般地，緯線處于與經(jīng)線約90度的角度。其他常用角度包括但不限于30、45、 60和75度?？椢锏耐暾酝ㄟ^由編織過程引起的纖維機(jī)械互鎖得到維持?？椢锏鸟薨?織物符合復(fù)雜表面的能力)、表面平滑和穩(wěn)定性主要受編織樣式控制，例如平紋、斜紋、緞紋、 方平組織、紗羅等。在這種情況下，基底多孔性是纖維之間的間隙，并且具有較少的彎曲性質(zhì)?；走€可以由各種材料形成，所述材料包括玻璃、塑料、陶瓷和金屬。硼硅玻璃是合適玻璃的一個(gè)例子。它可以作為纖維或玻璃墊形成。可以使用基于更常規(guī)的硅酸鹽化學(xué)或更奇特的化學(xué)例如釓、鋯、鈦等及其摻和物的各種陶瓷。它們可以形成纖維、墊、氈、單塊或膜。金屬例如不銹鋼、鎳、銅、鐵或其他磁性金屬和合金、鈀、鎢、鉬等可以制成各種形式包括纖維、燒結(jié)片和結(jié)構(gòu)，例如燒結(jié)不銹鋼或鎳濾器、編織篩和非編織墊、織物和氈例如不銹鋼絨。優(yōu)選基底由合成或天然聚合材料制成。熱塑塑料是用于這個(gè)用途的有用類別的聚合物。熱塑塑料包括但不限于聚烯烴例如聚乙烯，包括超高分子量聚乙烯、聚丙烯、護(hù)套聚乙烯/聚丙烯纖維、PVDF、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、聚苯砜、聚氯乙烯、聚酯例如聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯等、聚酰胺、丙烯酸酯例如聚甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯聚合物和上述的混合物。其他合成材料包括纖維素、環(huán)氧化物、氨基甲酸乙酯等。合適基底包括微孔濾膜，即具有約0. 1 -約10 μ m孔徑的那些?；撞牧峡梢允怯H水或疏水。親水基底材料的例子包括但不限于多糖和聚酰胺，以及表面處理的親水多孔膜， 例如 Durapore (Millipore Corporation, Billerica ΜΑ)。疏水材料的例子包括但不限于聚烯烴、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚砜、聚碳酸酯、聚酯、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯。 多孔結(jié)構(gòu)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法由基底材料制備，所述方法例如溶液倒相、 溫度誘導(dǎo)的相分離、空氣鑄造、徑跡蝕刻、拉伸、燒結(jié)、激光鉆孔等。因?yàn)楸景l(fā)明的通用性質(zhì)， 制備多孔結(jié)構(gòu)的基本上任何可用方法都適合于制造支持骨架用于膜吸著劑。由于其機(jī)械性質(zhì)、化學(xué)、腐蝕和Y穩(wěn)定性的組合，已發(fā)現(xiàn)由超高分子量聚乙烯制成的基底材料是有用的。聚合物形成吸附水凝膠且具有負(fù)責(zé)吸引且容納希望捕獲的實(shí)體的化學(xué)基團(tuán)(結(jié)合基團(tuán))?？商娲?，聚合物具有可容易修飾以摻入結(jié)合基團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)。包衣或覆蓋是可滲透的，從而使得雜質(zhì)可以捕獲到包衣或覆蓋深處，增加吸附容量。優(yōu)選聚合物是聚合伯胺。 合適聚合伯胺的例子包括聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚丁烯胺、聚賴氨酸、其與彼此和其他聚合物的共聚物，以及其分別的質(zhì)子化形式。合適共聚物包括乙烯醇共乙烯胺、丙烯酰胺共烯丙胺、乙二醇共烯丙胺、和烯丙胺共N-異丙基丙烯酰胺。已發(fā)現(xiàn)由聚烯丙胺(和/或其質(zhì)子化形式例如聚烯丙胺鹽酸鹽(PAH))制備的包衣或覆蓋是特別有用的。PAA以許多分子量商購可得(Nitto Boseki )，通常在1，000-150, 000范圍中，并且所有這些可以用于產(chǎn)生膜吸著劑。PAA和PAH在水中容易溶解。PAA水溶液的pH是約10-12，而PAH的那種是3-5。PAA 和PAH可以互換使用，然而，必須監(jiān)控最終溶液的pH，并且需要時(shí)調(diào)整至超過10的值，從而使得非質(zhì)子化氨基可用于與交聯(lián)劑反應(yīng)。包衣或覆蓋一般構(gòu)成包被或覆蓋基底的至少約3%總體積，優(yōu)選約基底的5% -約 10%總體積。在特定實(shí)施方案中，包衣或覆蓋以基本上均勻的厚度覆蓋基底。干包衣的合適厚度范圍為約10 nm-約50 nm。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解聚合物可以通過任何合適方法固定在基底上，所述方法例如包被、移植、交聯(lián)等，并且如本文使用的，術(shù)語“包被基底”在廣義上意欲包含具有在其上形成的聚合物的任何基底。交聯(lián)劑可以與聚合物反應(yīng)，以使得聚合物在水中不可溶，并且因此保留在支持骨架的表面上。合適的交聯(lián)劑是雙功能或多功能分子，其與包被聚合物反應(yīng)且在所選擇溶劑中是可溶的，所述溶劑優(yōu)選是水。廣泛多樣的化學(xué)部分與伯胺反應(yīng)，最值得注意的是環(huán)氧化物，氯、溴和碘代烷，羧酸酐和鹵化物，醛，α，β-不飽和酯，腈，酰胺和酮。優(yōu)選交聯(lián)劑是聚乙二醇二縮水甘油醚(PEG-DGE)。它在水中容易溶解，提供快速和有效的交聯(lián)，并且是親水、中性、無毒和容易獲得的。在包被溶液中使用的交聯(lián)劑的量基于在聚合物和交聯(lián)劑上的反應(yīng)基團(tuán)摩爾比。優(yōu)選比在約10-約1，000范圍中，更優(yōu)選約20-約200，最優(yōu)選約30-約 100。較多的交聯(lián)劑將阻礙水凝膠膨脹的能力并且將因此減少吸著容量，而較少的交聯(lián)劑可能導(dǎo)致不完全交聯(lián)，即留下某些聚合物分子完全溶解。表面活性劑可以用于幫助聚合物溶液在支持結(jié)構(gòu)的整個(gè)表面上均勻擴(kuò)展。優(yōu)選表面活性劑是非離子、水溶性和堿穩(wěn)定的。熒光表面活性劑具有降低水表面張力的顯著能力。 這些表面活性劑在商品名Zonyl下由Ε. I. du Pont de Nemours and Company銷售，并且是特別合適的，例如hnylFSH0另一個(gè)可接受類別的表面活性劑是辛基酚乙氧基化物，在商品名Triton X下由Dow Chemical Company銷售。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解還可以使用其他表面活性劑。在包被溶液中使用的表面活性劑濃度通常是降低溶液表面張力所需的最低限度量以避免反濕潤。反濕潤定義為在最初擴(kuò)展后液體在表面上的自發(fā)珠狀化(beading up)。反濕潤是膜吸著劑形成過程中高度不希望的事件，因?yàn)樗鼘?dǎo)致基底的非均勻包被和暴露，這有時(shí)導(dǎo)致無法濕潤的產(chǎn)物和減少的吸著容量。通過測量一滴溶液與由與多孔骨架相同的材料制成的平面形成的接觸角，可以方便地測定所需表面活性劑的量。動(dòng)態(tài)前進(jìn)和后退接觸角是特別有益的，這分別在液體加入或退出溶液滴時(shí)測量。如果溶液配制為具有后退接觸角0°，那么可以避免反濕潤。容易吸附在疏水表面上的少量親水聚合物任選可以加入溶液中作為擴(kuò)展助劑。聚乙烯醇是優(yōu)選聚合物，并且可以使用范圍約0. 05重量％ -約5重量％總?cè)芤后w積的濃度。當(dāng)支持多孔結(jié)構(gòu)無法用聚合物溶液容易地濕潤時(shí)，例如在疏水微孔膜的情況下， 濕潤助劑可以加入溶液中。濕潤助劑可以是與包被聚合物溶液相容的任何有機(jī)溶劑，其不會(huì)負(fù)面影響交聯(lián)反應(yīng)。一般地，溶劑是低級(jí)脂肪醇之一，但也可以使用丙酮、四氫呋喃、乙腈和其他水可混合溶劑。加入的有機(jī)溶劑的量是實(shí)現(xiàn)多孔基底由包被溶液的瞬時(shí)濕潤性所需的最低限度。示例性濕潤助劑包括甲醇、乙醇和異丙醇。包被方法可以改善網(wǎng)由包被溶液的濕潤。包被溶液可以以控制方式迫使進(jìn)入網(wǎng)內(nèi)，以便均勻地飽和網(wǎng)且不留下疏水點(diǎn)或區(qū)域。這可以例如通過使溶液擠壓經(jīng)過針對(duì)網(wǎng)壓迫的槽，或與網(wǎng)緊密接近來完成，以便通過應(yīng)用的擠壓力迫使溶液進(jìn)入網(wǎng)內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠測定產(chǎn)生均勻包被所需的壓力、速度和槽幾何形狀的條件。用于形成包被基底的優(yōu)選過程包含步驟1)制備溶液；2)將溶液應(yīng)用在膜上；從基底的外表面中去除過量液體3)使膜干燥；4)使膜固化；5)膜的清洗和干燥；6)最終膜的任選退火；和7)膜的任選酸處理。更具體而言，制備含有合適聚合物和交聯(lián)劑的溶液。這 2種組分的濃度決定沉積包衣的厚度和膨脹度，這轉(zhuǎn)而限定通過膜的流量及其吸著容量。使聚合物和交聯(lián)劑溶解于合適溶劑優(yōu)選水中。溶液可以任選含有其他成分，例如濕潤助劑、 擴(kuò)展助劑和PH調(diào)節(jié)劑。如果使用疏水基底，那么溶液的表面張力將必須足夠低，以便使其濕潤。聚合物的水溶液一般不濕潤疏水微孔膜，因此有機(jī)溶劑(濕潤助劑)將必須加入溶液中。為了幫助包衣在疏水膜表面上均勻擴(kuò)展，表面活性劑可以加入溶液中。最后，依賴于交聯(lián)劑的化學(xué)性質(zhì)，PH可能需要升高以便實(shí)現(xiàn)交聯(lián)反應(yīng)。溶液組分和一般濃度范圍在表1中列出
權(quán)利要求
1.一種純化包含至少一種生物分子和DNA的樣品的方法，所述方法包含通過在任選與一種或更多種一價(jià)鹽組合的一種或更多種離子改性劑的存在下，在包含具有在其上形成的一種或更多種聚合伯胺或其共聚物的多孔基底的陰離子交換劑中，引入所述樣品來純化所述樣品；且收集含有不含DNA的所述生物分子的進(jìn)一步純化樣品。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或更多種離子改性劑包含緩沖液。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或更多種離子改性劑包含磷酸鹽離子。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或更多種離子改性劑包含檸檬酸鹽離子。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或更多種離子改性劑包含乙二胺四乙酸離子。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或更多種一價(jià)鹽包含氯化鈉。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底包含微孔膜。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述膜包含聚烯烴。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述聚烯烴是聚乙烯。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述基底是超高分子量聚乙烯膜。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物包含聚烯丙胺或質(zhì)子化聚烯丙胺。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物包含含有聚烯丙胺或質(zhì)子化聚烯丙胺的共聚物或嵌段共聚物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物是交聯(lián)的。
全文摘要
通過伯胺使病毒和/或蛋白質(zhì)與核酸分離的方法，特別地，用含膜的陰離子交換劑純化生物分子的方法，所述膜具有具有在其上形成的聚合物例如伯或仲胺配體，例如聚烯丙胺的表面。在單獨(dú)或與一價(jià)鹽組合的一種或更多種離子改性劑的存在下，將原料引入交換劑。離子改性劑改變伯胺的結(jié)合能力，從而使得在高于病毒或蛋白質(zhì)pI的pH下，它們保留對(duì)于高荷電物質(zhì)例如DNA的顯著結(jié)合容量，但喪失其對(duì)于荷電較少物質(zhì)例如病毒或蛋白質(zhì)的部分或幾乎所有結(jié)合容量。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102234311SQ201110097829
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者艾爾 G., 克羅斯 S., 拉馬斯瓦米 S. 申請(qǐng)人:米利波爾有限公司