專利名稱：登革病毒亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥高技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種登革病毒亞單位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
登革病毒(dengue virus,DV)是黃病毒屬(Flaviviridae)有包膜的單股正鏈RNA 病毒，有四個血清型(DV1-4)，以蚊蟲為媒介，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。DV感染所致的人類登革熱(classical dengue fever，DF)和登革出血熱/登革休克綜合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)嚴(yán)重危害人類健康。全球有 25 30億人生活在流行區(qū)內(nèi)，每年有1億以上的人遭受感染，DHF病例約50萬，死亡率5 20 %， 如治療不及時可達(dá)50%。近年來，隨著全球氣候變暖、人口流動、生態(tài)環(huán)境惡化、蚊媒分布區(qū)域擴(kuò)展等諸多原因，登革熱流行的范圍和頻率不斷增加，WHO已將DHF/DSS、肝炎、瘧疾、結(jié)核列為全球流行最嚴(yán)重的傳染病(Murgue B. 2010)。我國海南、廣東、廣西、福建、浙江和臺灣等地區(qū)也都是重點(diǎn)流行區(qū)域，多次發(fā)生DF，DHF/DSS的爆發(fā)流行。但時至今日，對DV感染性疾病尚無特異的治療手段，也無安全有效的疫苗問世。因此，對DV的有效免疫分子展開深入研究，并從中發(fā)掘有效的治療策略和途徑是當(dāng)前登革熱控制的當(dāng)務(wù)之急(Mathew A. et al. 2008)。要認(rèn)識DV的有效免疫分子，首先得從DV的結(jié)構(gòu)入手。DV基因組(約111Λ)可編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C，基質(zhì)蛋白M和包膜糖蛋白E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2A， NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和 NSQ (Leyssen P，et al. 2000)。其中，糖蛋白 E 位于 DV 包膜上，是 DV吸附靶細(xì)胞的重要功能蛋白(Modis Y,et al. 2004)，由三個功能區(qū)構(gòu)成中心區(qū)(Domain I)，二聚體形成區(qū)(Domain II)和一個受體結(jié)合區(qū)(Domain III)。DV E蛋白DIII區(qū)是決定病毒與受體結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，由E蛋白的295 392位殘基構(gòu)成，沒有糖基化位點(diǎn)，但有一對二硫鍵(CyS302-CyS333)對維持其結(jié)構(gòu)很重要，殘基382-386形成一個受體結(jié)合Loop 環(huán)，是DV識別和結(jié)合靶細(xì)胞上病毒受體的重要功能位點(diǎn)，決定著DV感染的靶細(xì)胞種類和組織嗜性(Matsui K，et al. 2009)。雖然DV的受體尚未確定，但利用純化的DV E蛋白DIII 區(qū)(EDIII)及其抗血清可在體外阻斷DV的感染(Batra G，et al. 2010)，證實了 EDIII區(qū)是DV識別靶細(xì)胞上病毒受體的功能域，且有保護(hù)功能。古巴PCT/CU2006/000015公開了 E蛋白的表面的保守區(qū)域用于預(yù)防和/或治療由登革病毒1-4和其他黃病毒引起的感染，涉及嵌合蛋白質(zhì)，其用作疫苗或用于針對登革病毒的4種血清型和其他黃病毒的預(yù)防性或治療性治療。但因血清型別的差異，交叉保護(hù)作用弱。古巴PCT/⑶1998/000001公開了登革病毒的前M/M蛋白的表位、合成肽，涉及5種登革2型病毒前M/M蛋白的合成肽，能激發(fā)抗四種登革病毒血清型的中和抗體。但登革病毒的preM/M蛋白有很強(qiáng)的非中和表位(Dejnirattisai M, et al. kience，2010)，由此引發(fā)的抗體依賴的感染增強(qiáng)現(xiàn)象(ADE)不容忽視。
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古巴PCT/⑶97/00006公開了利用畢赤酵母屬甲基營養(yǎng)酵母表達(dá)編碼血清型2和 4登革病毒包膜蛋白的基因的方法。編碼病毒蛋白E的基因序列是血清2型登革病毒的起點(diǎn)，來自1981年古巴登革熱和出血登革熱流行期間分離的毒株A15。對于血清4型登革病毒，起點(diǎn)是編碼病毒蛋白E的基因序列，病毒來自1981年多米尼加共和國登革熱流行期間分離的毒株814669。使用的病毒株較為久遠(yuǎn)，對現(xiàn)行流行株的預(yù)防效果有待深入探討。陳宗濤等200810069545公開了一種抗登革病毒E蛋白的單克隆抗體，能特異性地結(jié)合登革病毒，可以應(yīng)用于制備新型有效的預(yù)防和治療登革病毒感染的藥物，并且還可以做成試劑盒，用于檢測登革病毒。該單克隆抗體的中和效能偏低，應(yīng)用受限。Zhang AS等(J Virol Methods, 2007)公開了一種用大腸桿菌表達(dá)2型登革病毒E 蛋白III區(qū)的方法，有一定保護(hù)效果，但產(chǎn)量為25mg/L，制備效率偏低，不利于規(guī)?；苽?。Wang J等(Dengue Bulletin. 2006)公開了一種大腸桿菌谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST) 融合的登革病毒E蛋白，但保護(hù)實驗表明該融合蛋白沒有保護(hù)功能，提示重組分子效能與其天然結(jié)構(gòu)的維持密切相關(guān)。印度^emad B等Q008)和我國學(xué)者Chen S等Q007)將4種血清型登革病毒E 蛋白的特定區(qū)域融合在一起，構(gòu)建成4價重組蛋白疫苗，在動物水平有一定保護(hù)作用，中和滴度為1 47-1 588，對各型DV的保護(hù)力差異較大，不利于推廣。新加坡Sim CAN等Q008)報到了一種表達(dá)登革病毒EDIII的重組乳鏈球菌制劑， 但對同種或不同種小鼠的保護(hù)能力差異很大，其中和效果和免疫途徑都有待深入進(jìn)行評估。綜上所述，本領(lǐng)域急切需求安全性好，免疫效價高的優(yōu)質(zhì)疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種安全、新型、免疫效果好、適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的疫苗。該疫苗融合了登革病毒保護(hù)性抗原組分，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可以用于預(yù)防登革病毒感染性疾病。本發(fā)明的技術(shù)方案是登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒中含有一個由下列元件組成融合編碼基因A)引導(dǎo)肽編碼序列；B)登革病毒包膜糖蛋白EDIII編碼區(qū)；C)編碼序列為SEQ ID NO 9所示的連續(xù)6個組氨酸編碼序列。所述表達(dá)質(zhì)粒是述表達(dá)質(zhì)粒是pETWb或pQE-31或pET 28a0所述的編碼基因是由插入元件按a-b-c的順序串聯(lián)串聯(lián)、優(yōu)化而成，相鄰兩個元件之間沒有終止密碼子。所述的引導(dǎo)肽編碼序列選自SEQ ID NO :1所示的胡蘿卜軟腐歐文(氏)菌果膠酶信號肽的核苷酸序列。所述的登革病毒包膜糖蛋白EDIII編碼區(qū)選自SEQ ID NO 5所示的2型登革病毒包膜糖蛋白EDIII的核苷酸序列；SEQ ID NO :7所示的1型登革病毒包膜糖蛋白EDIII 的核苷酸序列。
所述的登革病毒為登革病毒血清型1或2或3或4型。一種融合蛋白，由登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌后表達(dá)，所述融合蛋白不含任何核苷酸。所述的靶細(xì)菌包括BL21或Rosetta或觀33來源于大腸桿菌的宿主細(xì)菌。登革病毒亞單位疫苗，含有上述融合蛋白和藥學(xué)中可以接受的佐劑或載體。登革病毒亞單位疫苗在制備預(yù)防登革熱的藥物中的用途。登革病毒亞單位疫苗的制備方法，包括以下步驟1)將上述的含有登革病毒亞單位疫苗融合基因的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入靶細(xì)菌；2)當(dāng)所述的轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌培養(yǎng)至0D600值為0. 5時，加入0. 5mM的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，37°C下培養(yǎng)4小時，收集誘導(dǎo)細(xì)菌；3)超聲破壁，收集包涵體；4)溶解包涵體，用Ni-NTA層析柱進(jìn)行純化；5)收集含目的蛋白的洗脫峰，透析復(fù)性；6)用XK16陽離子交換柱進(jìn)行純化，收集含目標(biāo)蛋白的洗脫峰；7)透析脫鹽處理后得到所需的登革病毒亞單位疫苗蛋白。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明所述的重組登革病毒亞單位疫苗的各種組合物，包括藥用組合物，尤其是疫苗組合物。藥用組合物所述的藥用組合物可以包含實際使用時所選用的藥學(xué)上可以接受的緩沖劑，也包含用于預(yù)定用途的其它物質(zhì)。本領(lǐng)域已有多種緩沖劑適用于預(yù)定用途，本領(lǐng)域的技術(shù)人員都善于選擇的緩沖劑。在一些實例中，該藥用組合可以含有藥學(xué)上可接受的保濕劑，藥學(xué)上可接受的各種保濕劑在多種公開出版物都有敘述，包括如中華人民共和國藥典(2005版)。所述的藥用組合物可制備出各種劑型，如注射劑、片劑、丸劑、膠囊、噴霧劑等。適用于局部使用和口服的藥用級別的有機(jī)或無機(jī)載體或稀釋劑。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括水性介質(zhì)、植物性和動物性油脂。還可用穩(wěn)定劑、乳化劑、維持PH的各種緩沖劑和皮膚滲透增強(qiáng)劑等作為輔助材料。當(dāng)本發(fā)明用作疫苗時，重組的登革病毒亞單位疫苗可采用多種方法進(jìn)行配制。通常情況下，按本領(lǐng)域熟知的各種方法，用藥學(xué)上可以接受的載體或運(yùn)載體配制本發(fā)明的疫苗。合適的藥用載體包括無菌生理鹽水，也可用其它無菌的水性和非水性的等滲注射液，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥學(xué)上可接受的載體。配制本發(fā)明的疫苗組合物時還可含有其它成分，如佐劑、穩(wěn)定劑、PH調(diào)節(jié)劑、防腐劑等。這些成分都是疫苗領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。佐劑包括(但不限于)鋁鹽佐劑、皂苷佐劑、Cerbu佐劑(Cerbu Biotechnik Gmbh, Gaiberg, Germany)等。穩(wěn)定劑包括(但不限于)精氨酸、乙基纖維素、多元醇、氨基酸、無機(jī)鹽、PEG等。給藥途徑與劑量當(dāng)用作疫苗時，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將本發(fā)明的登革病毒亞單位疫苗施用于個體。通常采用與常規(guī)疫苗相同的施用途徑施用這些疫苗。采用疫苗組合物的形式時，除含有重組的登革病毒亞單位疫苗蛋白外，還可包括藥學(xué)上可以接受的載體、佐劑、穩(wěn)定劑、PH調(diào)節(jié)劑等。
給藥常規(guī)與途徑包括肌肉注射、皮下注射、滴鼻、靜脈注射、經(jīng)口服等，如果需要也可采用組合給藥途徑。疫苗組合物的給用劑量可以單劑量，也可多劑量，且可給予加強(qiáng)劑量以維持被施用個體的免疫力。在所選用的給藥途徑中，應(yīng)以“有效劑量”給予登革病毒亞單位疫苗的量，足以引發(fā)被施用個體的免疫應(yīng)答，且能有效保護(hù)被施用個體，足以抵抗登革病毒的感染。所述的有效劑量，是指在疫苗組合物中所選用的登革病毒亞單位疫苗的量是按可引發(fā)個體免疫保護(hù)性應(yīng)答而無明顯的副作用的量確定。以疫苗組分中登革病毒亞單位疫苗蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)計算有效劑量，通常包括給予約l_500yg蛋白質(zhì)，較佳地為l-200yg，更加地10-100 μ g?？捎冒ㄓ^察對象中的抗體滴度和其它反應(yīng)來確定具體疫苗的最佳用量，通過檢測疫苗提供的免疫力水平來確定是否需要增強(qiáng)劑量，施用佐劑或免疫刺激劑可提高本發(fā)明登革病毒亞單位疫苗的免疫應(yīng)答，這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.保持了天然結(jié)構(gòu)，提高了免疫的有效性1)本方面提供的登革病毒亞單位疫苗既擁有登革病毒E蛋白的中和表位，能有效刺激機(jī)體的產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。2)提供的重組蛋白含有特定的引導(dǎo)肽序列，有利于疫苗中和表位的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，保持最佳的免疫原性，免疫宿主個體后可以產(chǎn)生對登革病毒的免疫活性，免疫效能上優(yōu)于同類疫苗制劑。3)所述的亞單位疫苗蛋白含有6XHis純化標(biāo)簽，便于制備過程中的純化，其純化途徑相對便捷。2.為成分單一的蛋白制劑，提高了疫苗的安全性。1)本發(fā)明的登革病毒亞單位疫苗為一種重組的蛋白質(zhì)制劑，不具有復(fù)制能力，也不會引起登革病毒導(dǎo)致的特異性細(xì)胞病變，可以最大程度地降低疫苗使用的風(fēng)險。2)在疫苗的設(shè)計上，采用了登革病毒E蛋白中重要的中和表位肽，摒棄了非中和表位，大大降低了疫苗使用后引發(fā)的抗體依賴的增強(qiáng)現(xiàn)象，即ADE現(xiàn)象，提高了使用安全性。3.生產(chǎn)成本低。1)本發(fā)明所述的登革病毒亞單位疫苗是采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的，其成本相對于酵母系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)低，利于成本的控制。2)在構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌并篩選穩(wěn)定的細(xì)菌克隆。在生產(chǎn)時，只需要培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)菌克隆、加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，即可產(chǎn)生大量的登革病毒亞單位疫苗，經(jīng)適當(dāng)?shù)募兓緩郊纯色@得登革病毒亞單位疫苗，縮短了疫苗生產(chǎn)流程，提高了疫苗的生產(chǎn)效率，產(chǎn)品生產(chǎn)成本降低。下面結(jié)合具體實施實例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，這些實施實例僅用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的適用范圍。以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如黃培堂等譯，分子克隆實驗指南(第三版，科學(xué)出版社，2002) 中所述的條件，或按試劑制造產(chǎn)家所建議的條件進(jìn)行。


圖1為實施實例1中登革病毒亞單位疫苗分子重組表達(dá)質(zhì)粒制備的過程示意圖。圖2為實施實例3中革病毒亞單位疫苗分子Wfertern blot鑒定示意圖。圖3為實施實例4中革病毒亞單位疫苗分子純化結(jié)果的SDS-PAGE示意圖。圖4顯示了實施實例6中革病毒亞單位疫苗分子免疫小鼠血清中和病毒感染細(xì)胞的示意圖
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，以2型登革病毒主要保護(hù)性抗原功能區(qū)為核心，建立了登革病毒亞單位疫苗制備技術(shù)，并成功構(gòu)建了安全性好、免疫效價高的登革病毒亞單位疫苗，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。經(jīng)過大量實驗，證實本文所述的登革病毒亞單位疫苗分子的構(gòu)建必須滿足下列條件1)必須有合適的引導(dǎo)肽序列。胡蘿卜軟腐歐文(氏)菌果膠酶信號肽為一種多功能引導(dǎo)肽，能在大腸桿菌中將所攜帶的重組蛋白引導(dǎo)至細(xì)菌的周間隙，增加蛋白的溶解性， 對外源蛋白天然結(jié)構(gòu)的維持有重要作用，本發(fā)明選用該引導(dǎo)肽，實驗證實其缺失或移碼突變，重組蛋白的免疫保護(hù)效果會顯著下降。2)刪除登革病毒E蛋白的前294個氨基酸和后99個氨基酸，保留的編碼序列是登革病毒E蛋白的中后部318個核苷酸，因為這段序列以前的編碼序列所編碼的氨基酸含有更多的非中和表位，有2個糖基化位點(diǎn)，不宜在原核細(xì)胞中表達(dá)；這段序列以后的編碼序列所編碼的氨基酸中含有一個包膜錨定區(qū)(氨基酸452-491)和一個莖環(huán)區(qū)(氨基酸 395-450)，能使表達(dá)的E蛋白滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，降低了分泌。3)添加必要的純化標(biāo)簽，如適用于本發(fā)明的6XHis標(biāo)簽，便于登革病毒亞單位疫苗蛋白的純化?？捎糜诒景l(fā)明的登革病毒是血清亞型中的任何一種，4種亞型的基因組序列登錄號如下I 型U88536II 型U87411III 型AY099336IV 型AF326825在制備本發(fā)明的登革病毒亞單位疫苗蛋白時，通常按以下步驟進(jìn)行(以2型登革病毒為例)1.構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒這可通過PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化技術(shù)實現(xiàn)(見實施例1)，制備重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切和核苷酸測序鑒定。2.篩選并鑒定重組細(xì)菌克隆(見實施例2)在獲得重組表達(dá)質(zhì)粒連接產(chǎn)物后，一種常規(guī)的方法是將其引入靶細(xì)菌，一種優(yōu)選的方法是采用質(zhì)粒攜帶的抗性基因所對應(yīng)的抗生素(如氨芐青霉素)篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌，獲得有穩(wěn)定抗性的細(xì)菌克隆，擴(kuò)增所需克隆，用誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，利用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)條帶，確定表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)菌克隆。
3.登革病毒亞單位疫苗蛋白的表達(dá)(見實施例3)培養(yǎng)2中篩選出的克隆，加入0. 5mM的誘導(dǎo)劑IPTG，30°C誘導(dǎo)4小時，離心收集菌體，超聲破碎，制備重組蛋白包涵體。4.登革病毒亞單位疫苗蛋白的純化(見實施例4)將包涵體溶解于8M尿素中，離心收集上清，分別用Ni-NTA親和層析柱和陽離子交換株進(jìn)行純化，收集洗脫峰，透析至保存液中備用。本發(fā)明所用的常規(guī)試劑采用市售的分析純試劑。實施例1登革病毒亞單位疫苗重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程1.弓丨導(dǎo)肽(pelB片段)序列的PCR擴(kuò)增(1)所述的引導(dǎo)肽為胡蘿卜軟腐歐文(氏)菌果膠酶信號肽。根據(jù)SEQ NO 1所示的信號肽序列(Lei SP，et al，J Bacteriol. 1987 ； 169 (9) :4379-4383)設(shè)計一對寡核苷酸片段P1 7]47]4CCATGGGCAAATACCTGCTGCCGACCGCT(黑體為 NcoI 位點(diǎn))(SEQ ID No 3), P2 TATACATATG GGCCATCGCGGTGGGC(黑體為 NdeI 位點(diǎn))(SEQ ID No 4)，由深圳華大基因公司DNA合成部合成。(2)胡蘿卜軟腐歐文(氏)菌基因組DNA的制備基因組提取試劑盒為!Iomega產(chǎn)品，操作按公司說明書進(jìn)行。(3)PCR擴(kuò)增以O(shè))中提取的DNA為模板，用P1-P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)如下
DNA 模板(20|Lig/ml)Ιμ 5xPCR buffer (TaKaRa)ΙΟμΙMgCl2(25mM) (TaKaRa)5μ1dNTP(25mM/each) (TaKaRa)Ιμ 引物 ΜΙ(ΙΟμΜ)Ιμ 引物 Μ2(10μΜ)Ιμ PrimerStar (lOU/μΙ)Ιμ dH2030μ1total50 μ 混勻后，置PCR擴(kuò)增儀(Biofcid)上按94°C 30秒，52°C 30秒，72 V 30秒擴(kuò)增25 個循環(huán)，1.5%的瓊脂糖(上海生工)凝膠電泳，按TakaRa膠回收試劑盒說明書回收目的片段；2.酶切與連接回收的pelB片段經(jīng)NcoI (TaKaRa)/NdeI (TaKaRa)雙酶切，插入原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-16b (Novagen)的 Ncol/Ndel 位點(diǎn)。
8pelB 片段(45ng/|Lil)10 μ
IOxbuffer B(TakaRa)5 μ
NcoI (5υ/μ1)2 μ 酶切反應(yīng)，、
NdeI (5υ/μ1)2 μ
dH2031μ1
total50 μ 混勻后置37°C水浴反應(yīng)4小時，1. 5%的瓊脂糖(上海生工)凝膠電泳，按TakaRa 膠回收試劑盒說明書回收雙酶切后的PelB片段；pET-16b (Novagen)質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)體系同上，回收質(zhì)粒；
IOxligation buffer (Promega)1.5μ1連接反應(yīng)pET-16b(NcoI/NdeI酶切，25 ng/μ )Ιμ
pelB 片段(Ncol/Ndel 酶切，60ng/|iil)5μ1
Τ4 ligase (Promega,10U/pl)Ιμ
dH206.5μ1
total15μ1混勻后置16°C水浴反應(yīng)16小時，750C 5min滅活連接酶；3.轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5ci感受態(tài)的制備參見分子克隆實驗指南(第三版，科學(xué)出版社，200 ，取4μ 1連接產(chǎn)物于100 μ 1 DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴中30min，42°C休克90秒，置冰浴中2min，將混合物加入900 μ 1 LB培養(yǎng)基CTakaRa)中，37°C振蕩培養(yǎng)1小時，涂布AMP (100 μ g/ml，西南制藥三廠)瓊脂平板，37°C培養(yǎng)18小時，挑選AMP抗性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取與鑒定，序列正確者命名為pET-pelB。4.登革病毒2型E蛋白中和表位編碼序列(EDIII)的PCR擴(kuò)增(1)所述的登革病毒2型為U87411登錄號的病毒株，用SV Total RNA Isolation 試劑盒(Promega)，按試劑盒說明書提取登革病毒RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增EDIII蛋白(SEQ ID No 6)編碼序列(E 片段)(SEQ ID No :5)，所用 DNA 引物如下E1，TATACATATG ATGTGCACAGGAAAGTTTAAAG(黑體為 NdeI 位點(diǎn))(SEQ ID No 11)禾口 E2，GGG GGATCC7T4 CACCATCATCACCATCACTTGACCG ATAG AACTTCCTTT (黑體為 BamHI 位點(diǎn)，斜體為終止密碼，下劃線為6XHis標(biāo)簽)(SEQ ID No :12)，引物由深圳華大基因公司合成；(2)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒為Promega產(chǎn)品，以病毒RNA為模板，以試劑盒攜帶的隨機(jī)引物(6mer)進(jìn)行RT得到cDNA第一鏈，RT反應(yīng)如下
9IOxRTbuffer4μ1MgCl2(25mM)2μ1dNTP(25mM/each)Ιμ 隨機(jī)引物(10μΜ)Ιμ RNasin(40pg/ml)Ιμ 逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV,10U/|li1)Ιμ TotalRNA(0.6“g/pl)ΙΟμΙRNase free H2O20μ1混勻后42°C水浴1小時，然后75°C 10分鐘，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。(3). EDIII片段的PCR擴(kuò)增以cDNA第一鏈為模板，以E1/E2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
擴(kuò)增條件如下
5xPCR buffer (TaKaRa)ΙΟμΙ
MgCl2(25mM) (TaKaRa)5μ1
cDNA 第一鏈(ImM)Ιμ
dNTP(25mM/each) (TaKaRa) 2μ1 引物 ΕΙ(ΙΟμΜ)Ιμ
引物 Ε2(10μΜ)Ιμ
PrimerStar (lOU/μΙ)Ιμ
dH2027μ1
total50 μ 混勻后，置PCR擴(kuò)增儀(Biofcid)上按94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 2分鐘擴(kuò)增25 個循環(huán)，1.2%的瓊脂糖(上海生工)凝膠電泳，按TakaRa膠回收試劑盒說明書回收EDIII 片段；5. EDIII 片段的克隆回收的 EDIII 片段經(jīng) NheI (TaKaRa) /BamHI (TaKaRa)雙酶切， 克隆入3中構(gòu)建的pET-pelB之中
EDIII 片段(45ng/|Lil) ΙΟμΙ
IOxbuffer B(TakaRa)5 μ
NdeI (5υ/μ1)2 μ 酶切反應(yīng)κ 、，
BamHI (5υ/μ1)2 μ
dH2031μ1
total50 μ 混勻后置37°C水浴反應(yīng)4小時，1. 2%的瓊脂糖(上海生工)凝膠電泳，按TakaRa 膠回收試劑盒說明書回收雙酶切后的EDIII片段；
pET-pelB(3中構(gòu)建)質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)體系同上，回收質(zhì)粒；
IOxligation buffer (Promega)1.5μ1
pET-pelB(NdeI/Bamffl 酶切，25 ng/μ )Ιμ
SME 片段(Ndel/Bamffl 酶切，68ng/|iil)5μ1連接反應(yīng)
Τ4 ligase (Promega,10U/pl)Ιμ
dH206.5μ1
total15μ1混勻后置16°C水浴反應(yīng)16小時，75°C 5min滅活連接酶；轉(zhuǎn)化實驗大腸埃希菌DH5 α感受態(tài)的制備參見分子克隆實驗指南(第三版，科學(xué)出版社，2002)，取4μ 1連接產(chǎn)物于ΙΟΟμΙ DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴中30min，42°C 休克90秒，置冰浴中2min，將混合物加入900 μ 1 LB培養(yǎng)基CTakaRa)中，37°C振蕩培養(yǎng)1 小時，涂布AMP (100 μ g/ml，西南制藥)瓊脂平板，37°C培養(yǎng)18小時，挑選AMP抗性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取與鑒定。附圖1顯示了登革病毒亞單位疫苗重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程，含正確編碼序列的重組子命名為pET-pelB-EDIII-His。實施例2篩選并鑒定重組細(xì)菌克隆1.將實施例1所述的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pelB-EDIII-His按分子克隆實驗指南 (第三版，科學(xué)出版社，200 的方法轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)，具體參見實施例1中步驟 5中描述的方法進(jìn)行。2.挑取10個氨芐青抗性克隆，用Iml LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，等0D600值約為 0. 3-0. 5時，加入0. 5mM IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)1小時，14000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集菌體。3.參照分子克隆實驗指南的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的凝膠用考馬斯蘭染色，觀察，與未誘導(dǎo)的菌株相比，有明確表達(dá)條帶的克隆為表達(dá)陽性克隆，命名為 pET-pelB-EDIII-His/BL21 工程菌。4.登革病毒亞單位疫苗蛋白的純化(見實施例4)將包涵體溶解于8M尿素中，離心收集上清，分別用Ni-NTA親和層析柱和陽離子交換株進(jìn)行純化，收集洗脫峰，透析至保存液中備用。實施例3登革病毒亞單位疫苗蛋白的表達(dá)與鑒定1.復(fù)蘇實施例2中獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pET-pelB-EDIII-HiS/BL21工程菌，擴(kuò)大培養(yǎng)至2000ml，待0D600值約為0. 5時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0. 5mM，誘導(dǎo)4小時，收集培養(yǎng)物離心(Sigma 3T3離心機(jī))，留存細(xì)菌沉淀。2.稱取細(xì)菌濕重，用 TBS300 buffer (IOOmM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,300mM NaCl，lM Urea)重懸，制成10% (w/v)細(xì)菌懸液。3.在細(xì)菌懸液中加入終濃度為20μ g/ml的溶菌酶(Sigma公司)和ImM的 PMSF (蛋白酶抑制劑，Sigma公司)，37°C孵育30分鐘，超聲處理，間隙10秒，工作11秒，處理2個循環(huán)(寧波東芝超聲儀)。4.超聲物經(jīng)15000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘(日立21G離心機(jī))，沉淀用含TritonX-100 (上海生工)洗滌2次后，加入8M尿素溶液(IOOmM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH8. 0， 300mM NaCl，8M Urea, 5mm imidazole, Imm β-ME)，4°C溶解過夜。5.疫苗蛋白的鑒定取溶解的蛋白溶液10 μ 1，加入2 X loading buffer，參見分子克隆實驗指南的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用小鼠抗His的抗血清(中山公司)作一抗，辣根過氧化物酶(HR)標(biāo)記的兔抗小鼠(中山公司)作二抗進(jìn)行免疫印跡(Western blot)鑒定。附圖2顯示了重組表達(dá)登革病毒亞單位疫苗的Western blot鑒定結(jié)果，泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為表達(dá)菌制備包涵體，泳道3為純化的目標(biāo)蛋白，箭頭所示的特異性抗原印跡條帶即為所需的目標(biāo)蛋白。實施例4登革病毒亞單位疫苗蛋白的純化1.樣品處理將實施例3中8M尿素溶液(Buffer Α)溶解物用15000轉(zhuǎn)/分鐘離心 30分鐘(日立21G離心機(jī))，收集上清，用0. 22 μ m的濾器(Millipore公司)過濾，收集過濾液作為純化樣品。2. Ni-NTA柱純化將樣品以0. 5ml/min上樣于預(yù)先經(jīng)Buffer A平衡好的Ni-NTA層析柱(Bio-Rad)，用buffer A平衡至基線，再用Buffer B[Buffer A+20mM咪唑(上海生工產(chǎn)品)]進(jìn)行沖洗，最后用Buffer C[Buffer A+150mM咪唑(上海生工產(chǎn)品)]沖洗，收集洗脫峰，經(jīng)12 % SDS-PAGE電泳分析目標(biāo)蛋白的純度。3.目標(biāo)蛋白透析復(fù)性因在8M尿素中的蛋白分子處于變性狀態(tài)，需要將其復(fù)性方可具有生物學(xué)活性，復(fù)性采用透析方法。即將含目標(biāo)蛋白的洗脫峰依次用buffer DdOOmM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,300mM NaCl，4M Urea, Imm β -ME), buffer E(100mM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,300mM NaCl,2MUrea,0. ImM EDTA，0.01 % TritonX-100,10 % Glycerol)，和 buffer F(100mMNa2P04, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,150mM NaCl,0. ImM EDTA, 0.01% TritonX-100,10% Glycerol)進(jìn)行透析處理，4°C透析4h后換液，最后15000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，上清用0. 22 μ m的濾器(Millipore公司)過濾，收集過濾液。4.離子交換純化Ni-NTA柱純化并復(fù)性的樣品仍含有少量雜質(zhì)，對透析后的樣品用GE Healthcare的XK16陽離子交換柱進(jìn)行離子交換純化。層析柱先用buffer I (IOmM磷酸鹽緩沖液，PH 8. 0)平衡，上樣后再用buffer I沖洗，用0 IMNaCl的梯度液進(jìn)行洗脫， 收集洗脫峰，SDS-PAGE電泳分析目標(biāo)蛋白純度，用buffer F (見；3)透析4h，再用buffer GdOOmM Na2PO4, IOmM Tris-Cl, pH 8. 0,150mM NaCl,0. ImM EDTA,0. 01% Triton X-100, 50% Glycerol)透析，保存于_20°C備用。附圖4顯示了重組表達(dá)登革病毒亞單位疫苗蛋白的純化物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果，泳道1為含重組質(zhì)粒的工程菌未加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，泳道 2為加了 0. 5mM誘導(dǎo)劑培養(yǎng)4h后的工程菌，泳道3為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道4為Ni-NTA親和柱純化的洗脫峰，泳道5為離子交換洗脫峰，箭頭所示的為目標(biāo)蛋白。實施例5登革病毒亞單位疫苗的動物免疫1.動物免疫為證實登革病毒亞單位疫苗的免疫效能，我們檢測了登革病毒亞單位疫苗對BALB/c小鼠免疫后的抗體產(chǎn)生效價。登革病毒亞單位疫苗的免疫方案10只4周齡BALB/c小鼠，分對照組和免疫組進(jìn)行實驗。正常對照疫苗免疫組
第一天皮下和腹腔注射
PBS ΙΟΟμΙ
40叩疫苗蛋白+福氏完全佐劑
(Sigma )
注射后28天皮下和腹腔追加注射
PBS ΙΟΟμΙ
40叩疫苗蛋白
注射后35天皮
下和腹腔加強(qiáng)
注射
取血
取血
權(quán)利要求
1.一種登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒中含有一個由下列元件組成的融合編碼基因A)引導(dǎo)肽編碼序列；B)登革病毒包膜糖蛋白EDIII編碼區(qū)；C)編碼序列為SEQID NO 9所示的連續(xù)6個組氨酸編碼序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于所述表達(dá)質(zhì)粒是 pET16b 或 pQE-31 或 pET 28a。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于所述的編碼基因是由插入元件按a-b-c的順序串聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于所述的引導(dǎo)肽編碼序列選自SEQ ID NO :1所示的胡蘿卜軟腐歐文(氏)菌果膠酶信號肽的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于所述的登革病毒包膜糖蛋白EDIII編碼區(qū)選自SEQ ID NO :5所示的2型登革病毒包膜糖蛋白 EDIII的核苷酸序列；SEQ ID NO 7所示的1型登革病毒包膜糖蛋白EDIII的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于所述的登革病毒為登革病毒血清型1或2或3或4型。
7.一種融合蛋白，其特征在于由權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌后表達(dá)， 所述融合蛋白不含任何核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的登革病毒亞單位疫苗，其特征在于，所述的靶細(xì)菌包括BL21 或Rosetta或觀33等來源于大腸桿菌的宿主細(xì)菌。
9.一種登革病毒亞單位疫苗，其特征在于含有權(quán)利要求6所述的融合蛋白，和藥學(xué)中可以接受的佐劑或載體。
10.權(quán)利要求9所述的登革病毒亞單位疫苗在制備預(yù)防登革熱的藥物中的用途。
11.一種登革病毒亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)將權(quán)利要求1所述的登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入靶細(xì)菌；2)當(dāng)所述的轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌培養(yǎng)至0D600值為0.5時，加入0. 5mM的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，37°C下培養(yǎng)4小時，收集誘導(dǎo)細(xì)菌；3)超聲破壁，收集包涵體；4)溶解包涵體，用Ni-NTA層析柱進(jìn)行純化；5)收集含目的蛋白的洗脫峰，透析復(fù)性；6)用XK16陽離子交換柱進(jìn)行純化，收集含目標(biāo)蛋白的洗脫峰；7)透析脫鹽處理后得到所需的登革病毒亞單位疫苗蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種登革病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒中含有一個由下列元件組成的融合編碼基因A)引導(dǎo)肽編碼序列；B)登革病毒包膜糖蛋白EDIII編碼區(qū)；C)編碼序列為SEQ ID NO9所示的連續(xù)6個組氨酸編碼序列。所述疫苗安全、新型、免疫效果好、適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。該疫苗融合了登革病毒保護(hù)性抗原組分，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可以用于預(yù)防登革病毒感染性疾病。
文檔編號C07K1/36GK102199617SQ201110112898
公開日2011年9月28日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者尚偉龍, 張俊磊, 方昕, 楊杰, 胡珍, 饒賢才 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)