專利名稱：一種工業(yè)化分離純化紫杉醇的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及紫杉醇的分離純化方法，具體涉及一種工業(yè)化高效分離純化紫杉醇與三尖杉寧堿的方法，屬化合物分離純化領域。
背景技術：
紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離提取的一種具有紫杉烷二萜骨架的新型抗癌藥物，也是目前所了解的唯一一種可促進微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。它對大多數實體瘤有強力抑制作用，而對正常細胞基本無影響，尤其對晚期卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和卡波濟氏肉瘤的療效確切、副作用較小。隨著研究的進一步深入，紫杉醇類藥物的抗癌作用越來越得到更加廣泛的應用，現已成為一線抗癌藥物和廣譜的抗腫瘤藥物。作為紫杉醇主要來源的紅豆杉類植物屬于珍稀物種，在我國被列為國家一級保護植物。紅豆杉樹皮中紫杉醇含量極低，約占0.01%，遠遠不能滿足市場對紫杉醇的需求。近 20年來，紫杉醇的制備方法相繼有多學科，多角度地探索性報道。有紫杉醇細胞培養(yǎng)、真菌發(fā)酵、化學半合成與全合成方法。無論采取何方法制備紫杉醇，都需要將紫杉醇從紫杉醇類似物中分離并純化出來。常見的紫杉醇類似物主要有三尖杉寧堿、巴卡亭IIIUO-去乙?；仙即?、7-表-紫杉醇、紫杉醇C等。由于結構和性質比較相近，從而造成紫杉醇與其類似物的分離十分困難。此外，作為一種生物大分子物質，紫杉醇受溫度、有機溶劑、酸、堿等環(huán)境條件的影響，容易發(fā)生降解或異構而生成其他紫杉烷類物質。例如紫杉醇在強酸性或弱堿性條件下會降解為巴卡亭111或者發(fā)生異構生成7-表-紫杉醇；溫度較高時紫杉醇也會發(fā)生降解反應，生成相應的小分子物質。作為臨床使用中的藥品，紫杉醇在實際應用中其純度要求很高。紫杉醇資源珍貴、價格居高不下，分離的純度和收率成為制約藥用紫杉醇成本的關鍵因素。基于上述幾個方面，使得開發(fā)更加高效、廉價的工業(yè)化分離純化技術以及新型的生產分離純化工藝，成為紫杉醇研究中的焦點問題。目前常用的分離純化紫杉醇與紫杉醇類似物的方法主要有柱層析法、薄層色譜法、沉淀法、膠束動電色譜法、膜分離法、樹脂吸附分離法、化學反應法等。但是，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產的僅有柱層析法一種，其他方法都只局限于實驗室研究，柱層析法又分為正相柱法和反相柱兩種方法。有關紫杉醇分離純化的專利申請有多項如中國專利CN 1377882A “一種聯(lián)合制備高純度紫杉醇、三尖杉寧堿，10"脫乙?；涂ㄍII的方法”；中國專利CN 1611496A “一種利用高壓液相色譜制備高純度紫杉醇的方法”；中國專利CN 101391989A “一種制備多羥基紫杉烷及紫杉醇的方法”。現有紫杉醇分離純化方法的不足之處主要在于目前各種分離紫杉醇的方法尚不能夠有效地分離紫杉醇和三尖杉寧堿；就能夠大規(guī)模工業(yè)化分離純化紫杉醇與紫杉醇類似物的柱層析法而言，正相法和反相法又各自存在缺陷。正相柱層析法往往需要引入氧化反應，通過改變三尖杉寧堿的化學結構，以增加三尖杉寧堿與紫杉醇的分離度，這不僅改變了分離對象的化學結構，而且要多次過柱，多次重結晶進行純化。操作步驟的繁瑣不僅降低了目標紫杉醇的收率，增加生產成本，而且分離結果僅能得到紫杉醇一種產品，改變結構后的三尖杉寧堿只能被當做廢料丟棄，既浪費資源又污染環(huán)境。反相柱層析法雖然不用改變分離對象的化學結構，但實際應用中，該方法需要使用特制的反相柱硅膠，其市場價格高昂， 達50萬元/公斤。工業(yè)化生產中，每分離1公斤紫杉醇至少會用到50公斤的反相柱硅膠， 僅反相柱硅膠一項的成本就要2500萬元，大大增加了分離紫杉醇的生產成本，限制了其工業(yè)化大規(guī)模生產
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種分離效率高、成本低廉、易于工業(yè)化操作的紫杉醇分離純化方法。為實現本發(fā)明目的，采用正相柱層析法，通過選用多元(四元或五元)體系混合溶劑作為流動相，對紫杉醇粗產品進行分離純化。流動相為C1-10烷烴類、氯化烴類、C1-4醇類、飽和烷烴酯類、烷烴酮類化合物中的任意三種或四種與胺類化合物的組合。所述胺類溶劑選自二乙胺或三乙胺；C1-10烷烴類溶劑選自正己烷、正戊烷或環(huán)己烷；氯化烴類溶劑選自二氯甲烷、三氯甲烷或四氯甲烷；所述C1-4醇類溶劑選自甲醇或乙醇；所述飽和烷烴酯類溶劑選自乙酸乙酯；所述烷烴酮類溶劑選自丙酮或異丙酮。胺類溶劑的用量占流動相體積的8% 16%。通常經一至兩次層析柱洗脫后純度93% 95%的紫杉醇占80% 90% ；經一至兩次層析柱洗脫后純度30% 90%的紫杉醇占5% 15% ；經一至兩次層析柱洗脫后純度低于 30%的紫杉醇占1% 3% ；樣品進行一次重結晶，得目標紫杉醇。實際應用中，原料紫杉醇的含量越高，所需層析柱的洗脫次數越少。采用本方法分離紫杉醇時，如原料紫杉醇含量高于70%，則僅需一次層析柱洗脫就可獲得理想的分離效果；如原料紫杉醇含量為50% 70%，兩次層析柱洗脫就可獲得理想的分離效果。本發(fā)明創(chuàng)新點在于多元(四元或五元)體系流動相的選擇，使得分離純化過程中省去了溴化法等化學反應步驟，避免了分離對象中化學結構的改變，減少了原料樣品的過柱次數，僅過一次層析柱便可將80%以上的紫杉醇分離出來。同時，分離結果得到高純度的紫杉醇和三尖杉寧堿兩種物質。三尖杉寧堿除了本身可作為高附加值的原料藥直接利用外 (15萬元/公斤)，還可被制成多烯紫杉醇或紫杉醇，獲得更多的經濟效益。本發(fā)明創(chuàng)新點在于流動相選用C1-10烷烴類、氯化烴類、C1-4醇類、飽和烷烴酯類、烷烴酮類化合物中的任意三種或四種與胺類化合物的組合；固定相為50元/Kg的普通 200目 300目正相柱硅膠。分離純化過程中所用材料均為簡單易得、成本低廉的材料，易于開展工業(yè)化生產及降低生產成本。與目前常用的反相柱分離紫杉醇方法相比，可有效分離紫杉醇與三尖杉寧堿，過柱次數少，分離效率高，生產成本低廉，可大規(guī)模開展工業(yè)化生產。本發(fā)明創(chuàng)新點在于胺類試劑的應用，調節(jié)了流動相的pH值，使分離過程在堿性條件下進行，此時被分離物質均以分子形式存在，減少了在硅膠上的吸附，且提高了難分離物質對紫杉醇和三尖杉寧堿的分離度，很好地解決了以往各種分離方法中不能有效分離紫杉醇和三尖杉寧堿的難題。本發(fā)明創(chuàng)新點在于層析柱的洗脫液中，含三尖杉寧堿的液體先流出，含紫杉醇的液體后流出。這與多元(四元或五元)體系流動相及胺類試劑的使用有關，堿性分離環(huán)境使得三尖杉寧堿先于紫杉醇流出。 采用本發(fā)明方法可有效分離紫杉醇與三尖杉寧堿，分離純化效果好，能很方便地將紫杉醇粗產品純度提高至98%以上，根據原料情況，僅一至兩次洗脫總收率就可高達 90%。與現有紫杉醇分離方法比，本方法過柱洗脫次數少，操作簡便，安全，分離效率高，成本低廉，上樣量大，易于工業(yè)化開展大規(guī)模生產。
具體實施例方式為對本發(fā)明進行更好地說明，具體實施方式
如下 實施例1
取紫杉醇含量70%的樣品為原料，原料與硅膠重量比為2:100。原料用二氯甲烷溶解后備用。四元體系流動相為正己烷二氯甲烷甲醇三乙胺體積比=3:6:2:2,200目 300 目硅膠作為固定相。采用濕法上柱，采用濕法上柱，上樣后，用二氯甲烷溶劑沖一個柱體積后再用配好的流動相進行分離。流動相沖1.4個柱體積后，開始有紫杉醇C流出，緊接著為三尖杉寧堿流出，經0. 3個柱體積后，為單一紫杉醇流出，再經2個柱體積后紫杉醇可被完全分離出來，一次洗脫后純度90%以上的紫杉醇占85%。合并純度30% 90%的紫杉醇流出液并進行二次洗脫。(分離過程可用TLC或HPLC進行監(jiān)測)合并兩次洗脫液中純度90%以上的紫杉醇流出液，在45°C下進行真空濃縮，濃縮物在室溫下(25°C)用丙酮正己烷=1: 6體積比進行重結晶，攪拌IOmin后有大量白色沉淀析出，攪拌20min后，紫杉醇可完全析出。進行抽濾和真空干燥后，得到純度達98. 6%的紫杉醇純品，紫杉醇總收率達97. 6%。實施例2
取紫杉醇含量60%的樣品為原料，原料與硅膠重量比為1.5:100。原料用二氯甲烷溶解后備用。五元體系流動相為正己烷二氯甲烷丙酮三乙胺乙酸乙酯體積比=6 :3 :1 : 1 1. 5,200目 300目硅膠作為固定相。采用濕法上柱，上樣后，用二氯甲烷溶劑沖一個柱體積后再用配好的流動相進行分離。流動相沖1. 7個柱體積后，開始有紫杉醇C流出，緊接著為三尖杉寧堿流出，經0. 5個柱體積后，為單一紫杉醇流出，再經2個柱體積后紫杉醇可被完全分離出來，一次洗脫后純度90%以上的紫杉醇占75%。合并純度30% 90%的紫杉醇流出液并進行二次洗脫。(分離過程可用TLC或HPLC進行監(jiān)測)合并兩次洗脫液中純度 90%以上的紫杉醇流出液，(分離過程可用TLC或HPLC進行監(jiān)測)含紫杉醇的流出液在45°C 下進行真空濃縮，濃縮物在室溫下(25°C)用丙酮正己烷=1: 6體積比進行重結晶，攪拌 IOmin后有大量白色沉淀析出，攪拌20min后，紫杉醇可完全析出。進行抽濾和真空干燥后， 得到純度達98. 5%的紫杉醇純品，紫杉醇總收率達94. 6%。實施例3
取紫杉醇含量50%的樣品為原料，原料與硅膠重量比為2:100。原料用三氯甲烷溶解后備用。五元體系流動相為正己烷三氯甲烷丙酮二乙胺乙酸乙酯體積比=431 1 1. 5,200目 300目硅膠作為固定相。采用濕法上柱，上樣后，用三氯甲烷溶劑沖2個柱體積后再用配好的流動相進行分離。流動相沖2個柱體積后，開始有紫杉醇C流出，緊接著為三尖杉寧堿流出，經0. 5個柱體積后，為單一紫杉醇流出，再經2. 5個柱體積后紫杉醇可被完全分離出來，一次洗脫后純度90%以上的紫杉醇占66. 7%。合并純度30% 90%的紫杉醇流出液并進行二次洗脫。(分離過程可用TLC或HPLC進行監(jiān)測)含紫杉醇的流出液在 45°C下進行真空濃縮，濃縮物在室溫下(25°C)用丙酮正己烷=1 :6體積比進行重結晶，攪拌IOmin后有大量白色沉淀析出，攪拌20min后，紫杉醇可完全析出，進行抽濾和真空干燥后，得到純度達98. 3%的紫 杉醇純品，紫杉醇總收率達90. 7%。
權利要求
1.一種工業(yè)化分離純化紫杉醇的方法，采用正相柱層析法分離紫杉醇，其特征在于，流動相為Cl-IO烷烴類、氯化烴類、C1-4醇類、飽和烷烴酯類、烷烴酮類化合物中的任意三種或四種與胺類化合物的組合。
2.如權利要求1所述的分離純化紫杉醇方法中，其特征在于，胺類化合物選自二乙胺或三乙胺；C1-10烷烴類化合物選自正己烷、正戊烷或環(huán)己烷；氯化烴類化合物選自二氯甲烷、三氯甲烷或四氯甲烷；C1-4醇類化合物選自甲醇或乙醇；飽和烷烴酯類化合物選自乙酸乙酯；烷烴酮類化合物選自丙酮或異丙酮。
3.如權利要求1或2所述的分離純化紫杉醇方法中，其特征在于，胺類化合物的用量占流動相體積的8% 16%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種工業(yè)化高效分離純化紫杉醇的方法，屬化合物分離純化領域。該方法采用柱層析法分離紫杉醇，以C1-10烷烴類、氯化烴類、C1-4醇類、飽和烷烴酯類、烷烴酮類化合物中的任意三種或四種與胺類化合物的組合作為流動相，普通200目～300目硅膠作為固定相，以正相柱層析法對紫杉醇進行分離純化。該多元體系混合溶劑流動相增大了難分離物質對的分離度，解決了以往分離方法中不能有效分離紫杉醇與三尖杉寧堿的現象。經柱層析法分離及純化后，原料紫杉醇粗品的純度可提高至98%以上，根據原料情況，僅一至兩次洗脫總收率可高達90%。該方法使用常見溶劑及硅膠，成本低廉，操作簡便，上樣量大，易于工業(yè)化生產。
文檔編號C07D305/14GK102219764SQ201110121650
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權日2011年5月12日
發(fā)明者丁奎嶺, 曹繼紅, 李文鋒, 樊燕鴿, 薛寶玉, 趙俊宏 申請人:河南省科學院化學研究所有限公司