專利名稱：一種齊考諾肽的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種齊考諾肽的固相合成方法。
背景技術(shù)：
齊考諾肽(ziconotide)，商品名為Prialt，開發(fā)與上市廠商是美國Elan公司， 2005年1月首次在美國上市，2005年2月獲歐盟許可。適應(yīng)癥主要有對嚙齒類動物急、 慢性和神經(jīng)病性疼痛模型具有強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用，可安全有效的緩解惡性和非惡性疼痛病人的疼痛，包括鴉片類藥物治療無效的病人，且耐受性良好，還用于部分其他鎮(zhèn)痛治療療效差的嚴(yán)重慢性疼痛患者。藥效優(yōu)于其他鎮(zhèn)痛產(chǎn)品，鞘內(nèi)注射時其鎮(zhèn)痛功效比嗎啡強(qiáng)1000倍，且不會出現(xiàn)使用嗎啡時的副反應(yīng)，如呼吸抑制和產(chǎn)生耐藥性。其特點(diǎn)是需要鞘內(nèi)給藥，可通過血腦屏障而發(fā)揮藥效。藥理作用表現(xiàn)為結(jié)合并阻斷脊髓背角淺層內(nèi)的初級傷害感受性傳入神經(jīng)上的N-型鈣通道，從而阻止初級傳入神經(jīng)末梢興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，對抗傷害感受。藥代動力學(xué)表現(xiàn)為藥物進(jìn)入全身循環(huán)后，被組織中的肽酶或蛋白酶降解為多肽片段和游離氨基酸，極少量隨尿液排泄。副作用表現(xiàn)為劑量依賴性的心血管系統(tǒng)反應(yīng)，如心率緩慢和直立性低血壓；中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)，眩暈、眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)、興奮、幻覺、鎮(zhèn)靜和昏迷等，在停用藥物幾天后消失。不存在耐受和成癮現(xiàn)象，是非阿片類鎮(zhèn)痛藥物。齊考諾肽是ω -芋螺毒素MVIIA的合成形式，天然型存在于海螺(Conus magus) 體內(nèi)，是由25個氨基酸組成的陽離子多肽，包括3對二硫鍵連接的6個半胱氨酸殘基(這是此肽合成的主要難點(diǎn))，分子量為沈39. 12。它是特異性/選擇性的N型電壓敏感性鈣通 M (N-type voltage-sensitive calcium channels, N-type VSCCs) [fill 齊[J，)(寸
尤其是阿片受體沒有明顯的親和力。上述齊考諾肽的一條合成路線[1]如下該方法使用經(jīng)典的Fmoc-固相合成法，以Fmoc-Rink Amide-MBHA樹脂為固相載體，以HOBt和N，N, - 二異丙基碳二亞胺為縮合劑依次將側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸連到樹脂上，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2. 5小時反應(yīng)得到含25個氨基酸的線性全保護(hù)肽樹脂，其中形成二硫鍵的三組 Cys分別由Trt、Acm、Mob保護(hù)，不同組Cys由不同的保護(hù)基保護(hù)，同組Cys由同一種保護(hù)基保護(hù)。將線性全保護(hù)肽樹脂溶于的三氟乙酸/ 二氯甲烷室溫反應(yīng)20分鐘脫去Trt保護(hù)基，過濾后加入水/己腈/DMSO (體積比10 15 1)，用稀氨水調(diào)節(jié)pH至8，室溫下攪拌反應(yīng)一小時，得到齊考諾肽一環(huán)肽樹脂。在得到的一環(huán)肽樹脂中加入0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液，室溫反應(yīng)2小時，洗滌過濾得到齊考諾肽二環(huán)肽樹脂。將得到的二環(huán)肽樹脂溶于溶于三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇(體積比80 :8:8: 4)混合溶液中， 室溫反應(yīng)3小時，過濾后溶于水中，調(diào)pH至8，雙氧水存在下室溫反應(yīng)一小時，冷乙醚沉淀得到粗肽，HPLC制備純化得到齊考諾肽。整個合成過程反應(yīng)流程如

圖1所示。上述合成路線具有合成步驟繁瑣的缺點(diǎn)。而且該技術(shù)是在固相條件下完成前兩個二硫鍵的氧化，重復(fù)難度很大。
齊考諾肽的合成路線11[2]該方法以氨基樹脂為固相載體，用HATU、HOAt, TMP為縮合劑與Fmoc-Cys (Acm)縮合得到Fmoc-Cys (Acm)-氨基樹脂。該樹脂肽與F-moc氨基酸在H0Bt、DIC作用下生成全保護(hù)的線性全保護(hù)肽，其中全部Cys側(cè)鏈均用Acm保護(hù)。使用TFA/苯甲醚/苯甲硫醚/乙二硫醇(90 :5:3:幻切下樹脂，得到Cys側(cè)鏈含有Acm的齊考諾肽線性粗肽。將粗肽脫鹽，然后用TFA-anisole溶解，加入TI (TFA) 3反應(yīng)得到不含保護(hù)基的線性齊考諾肽。酸性條件下空氣氧化得到齊考諾肽，純化得到精肽，總收率在30%以上。整個合成過程反應(yīng)式如圖2所示。齊考諾肽的合成路線II具有二硫鍵的連接準(zhǔn)確率低、產(chǎn)率低的缺點(diǎn)，總產(chǎn)率僅為 30%。最后的分離純化也有很大難度。參考文獻(xiàn)[1]路楊，李新宇·齊考諾肽的固相合成方法中國，200710301598. 8[P]· 2009-04-22.[2]宓鵬程，李紅玲，馬亞平，袁建成.一種齊考諾肽制備的方法中國， 200910188686. 0[P], 2010-05-19.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種步驟精簡且收率高的齊考諾肽的固相合成方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種齊考諾肽的固相合成方法，該方法包括如下步驟(1)以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，從C端到N端依次縮合反應(yīng)連接25個側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸，得到25個氨基酸的線性全保護(hù)肽樹脂，其中，形成二硫鍵的三組Cys(l-16、 8-20、15-25)分別連接Trt、Acm或tBu保護(hù)基，同組的Cys連接相同保護(hù)基，不同組的Cys 連接不同的保護(hù)基；(2)將步驟(1)得到的線性全保護(hù)肽樹脂中的樹脂進(jìn)行切割，切割的同時脫去除 Cys (Acm)和Cys (tBu)的其它所有氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的線性肽；(3)氧化步驟(2)得到的線性肽形成第一對二硫鍵，同時脫除Cys(Acm)中的Acm 保護(hù)基并形成第二對二硫鍵，得到二環(huán)肽；(4)脫除步驟(3)得到的二環(huán)肽中的Cys(tBu)的tBu保護(hù)基，同時環(huán)化形成第三對二硫鍵，得到含三對二硫鍵的齊考諾肽。所合成的齊考諾肽具有如下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，從C端到N端依次縮合反應(yīng)連接25個側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸，得到25個氨基酸的線性全保護(hù)肽樹脂，其中，形成二硫鍵的三組Cys分別連接Trt、 Acm或tBu保護(hù)基，同組的Cys連接相同保護(hù)基，不同組的Cys連接不同的保護(hù)基；(2)將步驟(1)得到的線性全保護(hù)肽樹脂中的樹脂進(jìn)行切割，切割的同時脫去除 Cys (Acm)和Cys (tBu)的其它所有氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，得到含Cys (Acm)和Cys (tBu)的線性肽；(3)氧化步驟(2)得到的線性肽形成第一對二硫鍵，同時脫除Cys(Acm)中的Acm保護(hù)基并形成第二對二硫鍵，得到二環(huán)肽；(4)脫除步驟(3)得到的二環(huán)肽中的Cys(tBu)的tBu保護(hù)基，同時環(huán)化形成第三對二硫鍵，得到含三對二硫鍵的齊考諾肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(1)中， 所述的氨基樹脂為Rink-Amide-MBHA樹脂、Rink-Amide樹脂、Rink-Amide-BHA樹月旨、 Rink-Amide-AM 樹脂或 Sieber 樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟⑴中，25個氨基酸的線性全保護(hù)肽樹脂為H-Cys(tBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Arg( pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp (OtBu)-Cys(Trt)-Cys(tBu)-Thr-Gly-Ser(tBu)-Cys(Acm)-A rg (pbf) -Ser (tBu) -Gly-Lys (Boc) -Cys (Trt)-氨基樹脂
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(1) 中，按1 (1 5) (1 5) (1 5) 0 10)的摩爾比分別稱取溶脹后的氨基樹脂、Rnoc保護(hù)氨基酸、HoBt, HBTU和DIPEA，將Rnoc保護(hù)氨基酸、HoBt, HBTU和DIPEA溶于二甲基甲酰胺，預(yù)活化，然后加入溶脹后的氨基樹脂，室溫震蕩反應(yīng)0. 5 3小時連接Fmoc 保護(hù)氨基酸，連接下一個氨基酸之前Fmoc的脫除用哌啶的N，N 二甲基甲酰胺溶液脫Fmoc 保護(hù)基2次，時間分別為3-5分鐘和15-25分鐘，每次連接上一個氨基酸和脫除Fmoc保護(hù)基后用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗滌3-10次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(2)中，將三氟乙酸、苯甲硫醚、二巰基乙烷和苯甲醚按90 5 2.5 2.5的體積比混合，或者，將三氟乙酸、甲醇、水和三異丙基硅烷按體積比88 :5:5: 2混合，將步驟(1)得到線性全保護(hù)肽樹脂加入上述兩種混合液中的任意一種中，震蕩反應(yīng)0. 5 3小時后，將反應(yīng)液注入冷乙醚中，沉淀，離心后收集沉淀，得到含Cys(Acm)和Cys (tBu)的線性肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟(3)中，將步驟 (2)得到的線性肽溶于乙酸，加入10倍摩爾量的12，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時，然后加入水，反應(yīng)完全后，加入抗壞血酸直到溶液變?yōu)闊o色，反應(yīng)混合液凍干，得到二環(huán)肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于，步驟中，將二甲基亞砜和苯甲醚溶于三氟乙酸配制成氧化溶液，將步驟C3)得到的二環(huán)肽加入上述氧化溶液中，室溫震蕩反應(yīng)3-7小時，加水稀釋后凍干，純化后得到齊考諾肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種齊考諾肽的固相合成方法，以Fmoc-氨基樹脂為固相載體，依次縮合反應(yīng)連接25個保護(hù)的氨基酸，得到線性全保護(hù)肽樹脂，形成二硫鍵的三組Cys分別連接Trt、Acm或tBu保護(hù)基；切割樹脂，同時脫去除Acm和tBu的其它所有氨基酸的保護(hù)基，得到含Acm和tBu的線性肽；氧化線性肽形成第一對二硫鍵，同時脫除Acm并形成第二對二硫鍵，得到二環(huán)肽樹脂；脫除二環(huán)肽樹脂中的tBu，同時環(huán)化形成第三對二硫鍵，得到齊考諾肽。本發(fā)明巧妙選用了Trt、Acm、tBu來分別保護(hù)三組Cys，提高了二硫鍵形成的準(zhǔn)確率，然而切除樹脂后僅僅通過兩步反應(yīng)完成了三對二硫鍵的依次形成，精簡步驟的同時提高了產(chǎn)率。
文檔編號C07K1/02GK102268082SQ20111013966
公開日2011年12月7日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者李梅興, 董守良 申請人:江蘇江神藥物化學(xué)有限公司