專利名稱：一種從發(fā)酵液中純化提取冠菌素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液中純化提取冠菌素的方法。
背景技術：
冠菌素(Coronatine，簡稱C0R) 20世紀70年代末發(fā)現(xiàn)的由植物病原菌丁香假單胞菌的幾個致病變種產生的一種非寄主?；远舅?Bender et al.，1999 ；Palmer et al.， 1993)，它是茉莉酸甲酯(MeJA)的環(huán)戊烷結構和功能類似物。COR具有多種生理功能，它的活性是JA類物質的100-10000倍左右，在抗脅迫方面尤其顯著，可作為一種新型的植物生長調節(jié)劑。冠菌素的高效制備具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種從發(fā)酵液中提取純化冠菌素的方法。本發(fā)明所提供的從發(fā)酵液中提取純化冠菌素的方法，包括如下步驟1)取發(fā)酵液的上清液；2)將步驟1)得到的上清液用大孔吸附樹脂柱進行分離，得到粗提冠菌素；3)將粗提冠菌素用硅膠柱進行分離，得到純化的冠菌素；所述發(fā)酵液為發(fā)酵菌制備冠菌素時產生的發(fā)酵液，所述發(fā)酵液為發(fā)酵容器內的所有物質。上述方法中，所述步驟2)中，所述分離方法包括如下步驟將所述上清液流過大孔吸附樹脂柱以進行吸附，再用洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液；其中，所述上清液的速度為10升/小時-15升/小時；上述任一方法中，所述步驟；3)中，所述分離方法包括如下步驟將所述粗提冠菌素流過硅膠柱以進行吸附，再用洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液；其中，所述洗脫緩沖液的流速為0. 5ml/min。上述任一方法中，所述步驟幻中，所述洗脫緩沖液的速度為8升/小時-12升/ 小時；上述任一方法中，所述步驟3)中，所述粗提冠菌素的流速為0. 5ml/min。上述任一方法中，所述步驟2)中，所述洗脫緩沖液為如下中的至少一種乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、正己烷和乙酸乙酯；上述任一方法中，所述步驟幻中，所述洗脫緩沖液為由乙酸乙酯甲醇水乙酸=10 2 0.5 0.5的體積比組成的混合物。上述任一方法中，所述步驟2、中，所述洗脫緩沖液的體積用量為所述大孔吸附樹脂柱體積的3-6倍；上述任一方法中，所述步驟3)中，所述粗提冠菌素與硅膠的體積配比為 1 (30-50)。上述任一方法中，所述步驟2、中，所述大孔吸附樹脂為非極性的大孔吸附樹脂，所述大孔吸附樹脂的比表面積為500-920m2. g—1 ；上述任一方法中，所述步驟3)中，所述硅膠的粒徑為100-300目或100-200目或 200-300 目。上述任一方法中，所述步驟2)中，所述大孔吸附樹脂為HPD系列的大孔吸附樹脂、 YPRII型大孔吸附樹脂或HZ系列的大孔吸附樹脂；所述HPD系列的大孔吸附樹脂為HPD100型大孔吸附樹脂、HPD200型大孔吸附樹脂或HPD300型大孔吸附樹脂；所述HZ系列的大孔吸附樹脂為HZ802型大孔吸附樹脂、HZ803型大孔吸附樹脂或 HZ818型大孔吸附樹脂。上述任一方法中，所述步驟幻中，洗脫緩沖液的量3倍柱體積，收集第2個柱體積的洗脫液。上述任一方法中，在所述步驟2)前，包括將所述上清液的pH值調至2. 5-5. 5的步
馬聚ο上述任一方法中，所述步驟1)中，所述取發(fā)酵液的上清液的方法包括如下步驟 將所述發(fā)酵液靜置放置5-10分鐘，以使菌體沉淀，再取上清液。上述任一方法中，所述步驟幻中，所述硅膠柱的柱高30. 5cm ；柱外徑3. 2cm,內徑 2. 6cm。所述發(fā)酵液無需高速離心和加熱(可能引起COR降解)去除菌體，只需靜置10分鐘即可，從而省去高級儀器設備的配置和復雜工藝引起的人力和物力，也避免了 COR降解。硅膠柱層析所用洗脫液可以徹底將COR和發(fā)酵液中的雜質分開。本發(fā)明方法采用的大孔吸附樹脂對COR的選擇性良好、吸附快、解析也快、吸附容量較大、生產周期短；且大孔樹脂物理化學穩(wěn)定性高、機械強度好、再生容易；工藝簡單，操作十分簡便，溶劑皆可回收利用，成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)生產。本發(fā)明省去大量發(fā)酵液離心去除菌體的步驟，從而使本提取工藝在沒有大量超速離心機的情況下可以實施，同時靜置10分鐘左右后菌體自動沉積于容器底部，既不影響 COR的性質，同時使得盡可能少的菌體量通過柱子，使大孔樹脂更充分地吸附C0R，同時也使洗脫變得簡單，高效。本發(fā)明方法工藝簡單，收率高，生產成本低，對COR的結構和活性沒有任何影響， 而且耗能低，污染小，完全適應工業(yè)化生產的要求。


圖1為HPLC測定COR標樣㈧、COR粗提樣品⑶及純化后的COR樣品(C)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所用的非極性大孔吸附樹脂HPD300、HZ818或YPRII分別購自滄州寶恩吸附材料有限公司，上海華震科技有限公司，上海勁凱樹脂有限公司。硅膠(型號ZCX. II，粒徑100-200目)購自青島海洋化工廠。硅膠(型號ZCX. II，粒徑200-300目)購自青島海洋化工廠。可用現(xiàn)有方法發(fā)酵菌制備冠菌素，從而得到含有冠菌素的發(fā)酵液。下述實施例1-4 中所述發(fā)酵液均按照現(xiàn)有的實施例5中所述方法制備得到。本發(fā)明方法的基本步驟如下1、收集上清液將發(fā)酵液在室溫條件下靜置數(shù)分鐘，待大量菌體自動沉積于盛發(fā)酵液的容器底部，收集上清液；并將容器底部的大約1-2L的含有大量菌體的發(fā)酵液4000rpm離心2分鐘， 收集所有上清液。2、大孔吸附樹脂柱層析分離(1)大孔吸附樹脂的預處理方法將大孔吸附樹脂用乙醇充分浸泡Mh，待樹脂充分溶脹后用蒸餾水洗滌至無乙醇，裝入吸附柱中，用3倍柱體積的3-5%的鹽酸水溶液以 IOL/小時的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至ph = 7 ；用3-5%的NaOH水溶液以IOL/ 小時的速度通過柱子，并浸泡池，用水平衡至Ph = 7.0 ；用蒸餾水浸泡樹脂備用。(2)分離步驟如下將上述所得上清液加入吸附柱中進行吸附，吸附完畢后用蒸餾水沖洗吸附柱，用大量水沖洗至流出液無色后，改用有機溶劑(即洗脫緩沖液)洗脫C0R， 收集洗脫液。其中，吸附和分離均在室溫下進行。(3)分離結果將洗脫液減壓濃縮(在30°C _45°C、真空度0. 08-0. 09MPA下減壓蒸發(fā))，得浸膏， 干燥，得到COR粗品，HPLC檢測，計算產品收率和純度。產品收率=大孔樹脂純化后樣品中冠菌素量/發(fā)酵液中冠菌素量；純度=大孔樹脂純化后樣品中冠菌素峰含量/大孔樹脂純化后樣品總量。3、硅膠柱層析分離將COR粗品用洗脫緩沖液溶解，再流過硅膠柱以進行吸附，再用洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，得到目的產物。HPLC檢測，計算得率和純度。其中，吸附和分離均在室溫下進行。純度=硅膠純化后樣品中冠菌素含量/硅膠純化后樣品總量。得率=硅膠純化后樣品中冠菌素量/硅膠純化前樣品中冠菌素量。HPLC檢測冠菌素COR含量的方法如下將純化后的樣品干燥后用色譜級甲醇溶解，再進行HPLC檢測。HPLC條件如下色譜柱為Kromasil 5μπι 100Α的150 X 4. 60_ C8色譜柱，流動相為80%的甲醇溶液。檢測波長為208nm、流速2mL/min、進樣量20 μ L、樣品保留lOmin。COR標準品購自s i gma公司。本發(fā)明方法的具體工藝條件如下實施例所述。實施例1、分離COR1、收集上清液發(fā)酵液10L，靜置5分鐘，收集上清液。2、大孔吸附樹脂柱層析分離大孔吸附樹脂型號HPD300，非極性，孔徑5-5. 5nm,比表面積800_870m2. g—1 ；吸附條件10cmX 1. 5m玻璃柱；樣品的流速10升/小時；樣品的pH值2. 5 ；樣品的量IOL發(fā)酵液，發(fā)酵液中冠菌素濃度為180-200mg/L ；大孔吸附樹脂的量IOOg ；樣品與大孔吸附樹脂的配比IOmg冠菌素/g大孔樹脂；洗脫條件洗脫緩沖液的流速8升/小時；洗脫緩沖液的組成無水乙醇；洗脫緩沖液的量3倍柱體積；收集全部洗脫液。產品收率為98%，純度85%。3、硅膠柱層析分離硅膠型號ZCX. II，粒徑 100-200 目。吸附條件柱高30. 5cm ；柱外徑3. 2cm,內徑2. 6cm ；樣品的流速0. 5ml/min ；樣品濃度lg/ml ；硅膠的量180g ；上樣量與硅膠的體積配比1 30 ；洗脫條件洗脫緩沖液的流速0. 5ml/min ；洗脫緩沖液的組成乙酸乙酯甲醇 水乙酸=10 2 0.5 0.5的體積比混合；洗脫緩沖液的量3倍柱體積；收集第2個柱體積處的樣品，得到目的產物。COR 得率為 88 %，COR 純度為 96 %。實施例1中HPLC測定COR標樣㈧、COR粗提樣品⑶及硅膠純化后的COR樣品 (C)的圖譜如圖1所示。實施例2、分離COR1、收集上清液發(fā)酵液16L，靜置10分鐘，收集上清液。2、大孔吸附樹脂柱層析分離大孔吸附樹脂型號HZ818，非極性，孔徑7-8nm，比表面積880_920m2. g—1。吸附條件樣品的流速12升/小時；樣品的pH值3. 5 ；樣品的量16L發(fā)酵液，大孔吸附樹脂的量160g，樣品與大孔吸附樹脂的配比15mg冠菌素/g大孔樹脂；其余與實施例1 中所述相同。洗脫條件洗脫緩沖液的流速10升/小時；洗脫緩沖液的組成無水乙醇；洗脫緩沖液的量4倍柱體積，收集全部洗脫液。其余與實施例1中所述相同。產品收率為99%，純度83. 5%。3、硅膠柱層析分離硅膠型號ZCX. II，粒徑 200-300 目。吸附條件上樣量與硅膠的體積配比1 35;其余均與實施例1中相同。洗脫條件均與實施例1中相同。得率為89%，純度為97%。實施例3、分離COR1、收集上清液發(fā)酵液16L，靜置7分鐘，收集上清液。2、大孔吸附樹脂柱層析分離大孔吸附樹脂型號YPRII，非極性，粒度0. 315-1. 25mm,比表面積500_550m2/g ；吸附條件樣品的流速14升/小時；樣品的pH值4. 5 ；其余與實施例1中所述相同。洗脫條件洗脫緩沖液的流速10升/小時；洗脫緩沖液的組成丙酮；洗脫緩沖液的量4倍柱體積；其余與實施例1中所述相同。產品收率為99%，純度84%。3、硅膠柱層析分離硅膠型號及粒徑與實施例2中相同。吸附條件上樣量與硅膠的體積配比1 50;其余均與實施例1中相同。洗脫條件均與實施例1中相同。得率為90%，純度為98%。實施例4、分離COR1、收集上清液發(fā)酵液60L，靜置8分鐘。2、大孔吸附樹脂柱層析分離大孔吸附樹脂與實施例2中所述相同。吸附條件樣品的流速15升/小時；樣品的pH值5. 5 ；樣品的量60L發(fā)酵液，大孔吸附樹脂的量600g ；樣品與大孔吸附樹脂的配比20mg冠菌素/g大孔樹脂；洗脫條件洗脫緩沖液的流速12升/小時；洗脫緩沖液的組成無水乙醇；洗脫緩沖液的量6倍柱體積，收集全部洗脫液。其余與實施例1中所述相同。產品收率為99%，純度85%。3、硅膠柱層析分離硅膠型號及與粒徑實施例2中所述相同。吸附條件與實施例1中相同；洗脫條件與實施例1中相同；得率為92%，純度為98%。上述實施例1-4中，收集流過大孔吸附樹脂柱后的發(fā)酵液，并將其用有機溶劑萃取法提取COR，HPLC檢測COR含量，幾乎沒有檢測到，說明COR全被吸附。用蒸餾水沖洗吸附COR后的大孔吸附樹脂柱，并收集洗脫下來的液體，有機溶劑萃取法提取COR，HPLC檢測 COR含量，也檢測不到C0R，說明吸附穩(wěn)定。實施例5、發(fā)酵制備COR挑取冷凍保存的丁香假單胞菌大豆致病變種MW123 CGMCC 2533(記載在中國專利200810119153.2中)于斜面培養(yǎng)基(溶質為甘露醇1%，L-谷氨酸鈉0.2%，KH2PO4 0. 05%,NaCl 0. 02%,MgSO4 ·7Η20 0. 02%，1. 3%的瓊脂粉，溶劑為水；該培養(yǎng)基的 pH 7.0) 上，28°C培養(yǎng)48-60h使其活化，然后挑取一環(huán)活化好的菌體，接入含有l(wèi)Oug/ml的卡那霉素和30ug/ml的鏈霉素的液體培養(yǎng)基(含有甘露醇1%，L-谷氨酸鈉0.2%，ΚΗ2Ρ04 0 . 05%, NaCl 0. 02%, MgSO4 ‘ 7H20 0.02%，pH 7. O ;121°C滅菌 30min)中，28°C培養(yǎng) 36_48h，到對數(shù)期時，取培養(yǎng)菌液按2% (體積比)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(該發(fā)酵培養(yǎng)基由A液和B 液混合而成。A 液氯化銨 1. Og, KH2PO4 4. lg, K2HPO4 3. 6g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，KNO3 0. 3g， 2mM FeCl3 10ml，蒸餾水890ml，pH 6. 8 ;B液葡萄糖20g，蒸餾水IOOml。A、B液分開進行 115°C滅菌20min，接種前混合)中，在溫度為18°C _M°C、轉速為^Orpm/min的條件下發(fā)酵 7天，即得到成熟發(fā)酵液，經高效液相色譜法檢測冠菌素產量達到180-200mg/L發(fā)酵液。
權利要求
1.一種從發(fā)酵液中提取純化冠菌素的方法，包括如下步驟1)取發(fā)酵液的上清液；2)將步驟1)得到的上清液用大孔吸附樹脂柱進行分離，得到粗提冠菌素；3)將粗提冠菌素用硅膠柱進行分離，得到純化的冠菌素；所述發(fā)酵液為發(fā)酵菌制備冠菌素時產生的發(fā)酵液，所述發(fā)酵液為發(fā)酵容器內的所有物質。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述分離方法包括如下步驟將所述上清液流過大孔吸附樹脂柱以進行吸附，再用洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液；其中，所述上清液的速度為10升/小時-15升/小時；所述步驟幻中，所述分離方法包括如下步驟將所述粗提冠菌素流過硅膠柱以進行吸附，再用洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫液；其中，所述洗脫緩沖液的流速為0. 5ml/min。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述洗脫緩沖液的速度為8升/小時-12升/小時； 所述步驟3)中，所述粗提冠菌素的流速為0. 5ml/min。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述洗脫緩沖液為如下中的至少一種乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、正己烷和乙酸乙酯；所述步驟幻中，所述洗脫緩沖液為由乙酸乙酯甲醇水乙酸= 10 2 0. 5 0.5的體積比組成的混合物。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟2、中，所述洗脫緩沖液的體積用量為所述大孔吸附樹脂柱體積的3-6倍； 所述步驟幻中，所述粗提冠菌素與硅膠的體積配比為1 (30-50)。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述大孔吸附樹脂為非極性的大孔吸附樹脂，所述大孔吸附樹脂的比表面積為 500-920m2. g"1 ；所述步驟3)中，所述硅膠的粒徑為100-300目或100-200目或200-300目。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述大孔吸附樹脂為HPD系列的大孔吸附樹脂、YPRII型大孔吸附樹脂或HZ系列的大孔吸附樹脂；所述步驟幻中，洗脫緩沖液的量3倍柱體積，收集第2個柱體積的洗脫液。
8.根據(jù)權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于在所述步驟2、前，包括將所述上清液的PH值調至2. 5-5. 5的步驟。
9.根據(jù)權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述取發(fā)酵液的上清液的方法包括如下步驟將所述發(fā)酵液靜置放置5-10分鐘，以使菌體沉淀，再取上清液。
10.根據(jù)權利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述步驟；3)中，所述硅膠柱的柱高30. 5cm ；柱外徑3. 2cm,內徑2. 6cm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從發(fā)酵液中純化提取冠菌素的方法。本發(fā)明所提供的從發(fā)酵液中提取純化冠菌素的方法，包括如下步驟1)取發(fā)酵液的上清液；2)將步驟1)得到的上清液用大孔吸附樹脂柱進行分離，得到粗提冠菌素；3)將粗提冠菌素用硅膠柱進行分離，得到純化的冠菌素；所述發(fā)酵液為發(fā)酵菌制備冠菌素時產生的發(fā)酵液，所述發(fā)酵液為發(fā)酵容器內的所有物質。本發(fā)明方法工藝簡單，收率高，生產成本低，對COR的結構和活性沒有任何影響，而且耗能低，污染小，完全適應工業(yè)化生產的要求。
文檔編號C07C235/82GK102229543SQ20111015057
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權日2011年6月7日
發(fā)明者吳慧玲, 岳躍森, 張博, 李召虎, 李茂營, 段留生, 譚偉明, 陳保樺 申請人:中國農業(yè)大學