專利名稱：滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展，組織工程(Tissue Engineering, TE)術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床的各個(gè)領(lǐng)域，包括骨組織、軟骨、神經(jīng)、血管、皮膚以及胃腸道和泌尿生殖系統(tǒng)的再生和修復(fù)。在組織工程的發(fā)展過(guò)程中，針對(duì)各種組織的支架的不斷改進(jìn)和更新是關(guān)鍵，包括材料的更新、制作方法的改進(jìn)以及構(gòu)建理念的不斷創(chuàng)新。而近期組織工程學(xué)另一個(gè)比較明顯的理念上的轉(zhuǎn)變，就是“化繁為簡(jiǎn)”，即與其在體外通過(guò)各種復(fù)雜的手段和技術(shù)來(lái)盡可能地去模擬正常組織的組成，然后再植入體內(nèi)，不如為人體提供一個(gè)自我修復(fù)的支架，讓人體這個(gè)天然的“生物反應(yīng)器”依附這個(gè)支架來(lái)進(jìn)行自我修復(fù)。因?yàn)槿梭w內(nèi)環(huán)境是十分復(fù)雜的，所以才會(huì)導(dǎo)致很多實(shí)驗(yàn)設(shè)想與結(jié)果相差很大，并且支架植入步驟的繁復(fù)也會(huì)限制其在臨床上的推廣和應(yīng)用。但這樣的支架就要求根據(jù)需要來(lái)進(jìn)行特定的修飾，從而起到誘導(dǎo)特定細(xì)胞粘附、 增殖和分化的作用。正常組織中，細(xì)胞周圍基質(zhì)對(duì)細(xì)胞的生物功能具有重要的意義，通過(guò)基質(zhì)中的蛋白或多肽分子的功能結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞的基因表達(dá)、粘附、遷移、增殖以及分化等生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)控，而這些功能域也許僅僅只有幾個(gè)氨基酸片段的長(zhǎng)度。這種調(diào)控方式，為我們構(gòu)建活性多肽序列，對(duì)組織工程支架進(jìn)行表面修飾，以模擬細(xì)胞周圍基質(zhì)對(duì)細(xì)胞本身的調(diào)控功能提供了理論依據(jù)。采用不同類型的多肽對(duì)支架進(jìn)行修飾，也賦予支架不同的生物功能。有研究表明，采用細(xì)胞周圍基質(zhì)蛋白對(duì)人工支架進(jìn)行表面修飾，可提高細(xì)胞對(duì)支架的貼附率和增殖率，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在這些細(xì)胞周圍基質(zhì)蛋白中，纖粘連蛋白(fibronectin)是促進(jìn)細(xì)胞貼附、遷移的主要成分。實(shí)際上，真正影響細(xì)胞生物功能的只是纖粘連蛋白中幾個(gè)氨基酸片段構(gòu)成的功能域。例如，采用 RGD多肽對(duì)支架進(jìn)行修飾，即可提高肌細(xì)胞對(duì)支架的貼附率，也提高了細(xì)胞的增殖效率，說(shuō)明僅需三個(gè)氨基酸片段長(zhǎng)度的結(jié)構(gòu)域就能對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生顯著影響。Duan等4人也有類似的發(fā)現(xiàn)，利用角膜細(xì)胞特異親和性多肽序列對(duì)支架進(jìn)行修飾后，可提高角膜上皮細(xì)胞對(duì)支架的貼附率，并誘導(dǎo)角膜細(xì)胞在支架上分層排列，出現(xiàn)類似于生理情況下的組織結(jié)構(gòu)。同時(shí)，利用多肽對(duì)支架進(jìn)行修飾，也可調(diào)控蛋白分子在組織工程支架上的聚集，Ryadnov等人利用多種多肽片段構(gòu)建的小分子蛋白對(duì)支架進(jìn)行修飾，利用多肽對(duì)特定蛋白分子表現(xiàn)出的親和性，賦予支架捕獲這些蛋白分子的功能，使蛋白分子在支架周圍富集，進(jìn)而調(diào)控支架內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)功能。Siah等人利用TGF-β高度親和的多肽序列對(duì)多肽兼性分子納米支架 (PA)進(jìn)行修飾，極大提高了支架對(duì)軟骨缺損的修復(fù)效果，這種支架對(duì)干細(xì)胞向軟骨定向分化的誘導(dǎo)能力大大增強(qiáng)，粘多糖的表達(dá)程度也顯著提高。說(shuō)明多肽修飾后的支架，可裝載、 保護(hù)，并緩釋生長(zhǎng)因子，這種緩釋作用，與支架的降解時(shí)間以及親和多肽對(duì)支架的修飾程度密切相關(guān)，當(dāng)修飾程度為5%-10%時(shí)，植入體內(nèi)第4周后，支架仍能發(fā)揮優(yōu)良的生長(zhǎng)因子緩釋功能。而且最關(guān)鍵的是，裝載外源性TGF-β和沒(méi)有轉(zhuǎn)載外源性TGF-β的支架對(duì)軟骨缺損的最終修復(fù)效果沒(méi)有顯著差別，這說(shuō)明這種TGF-β親和多肽修飾后的支架，在沒(méi)有裝載外源性生長(zhǎng)因子的情況下，可大量富集內(nèi)源性的TGF-β生長(zhǎng)因子，改善支架內(nèi)的微環(huán)境， 實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨分化的功能?；らg充質(zhì)干細(xì)胞(SMSC)作為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)家族中的新成員，最早由De Bariet al.在2001年首次從滑膜組織中成功提取出來(lái)，經(jīng)過(guò)了近十年的研究，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有與間充質(zhì)干細(xì)胞類似的多向分化潛能已經(jīng)被眾多的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，并且滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞相較其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖活性，其多向分化潛能受供體年齡、傳代次數(shù)以及保存保存方式的影響也相對(duì)較小，取材部位也較為寬泛，更為重要的是大量研究結(jié)果顯示，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞相較于其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的向軟骨細(xì)胞分化的潛能。在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下間題現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有一種滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的篩選方法，該方法能夠提高生物材料對(duì)于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性親和能力，在組織工程軟骨修復(fù)領(lǐng)域里有著深遠(yuǎn)的意義和廣泛的應(yīng)用前
旦
ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種能夠提高生物材料對(duì)于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性親和能力的滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的篩選方法。本發(fā)明另一目的提供滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的氨基酸序列。本發(fā)明又一目的提供滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種利用改進(jìn)的噬菌體展示技術(shù)篩選能夠提高生物材料對(duì)于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性親和能力的滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的方法，包括以下步驟(1)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞以及人成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)通過(guò)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)并傳一代，獲得陽(yáng)性篩選細(xì)胞；通過(guò)人成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)并傳十代以上，獲得陰性篩選細(xì)胞；(2)陰性篩選在陰性篩選細(xì)胞中加入噬菌體文庫(kù)，去除噬菌體文庫(kù)中與PlO代 ACL成纖維細(xì)胞結(jié)合的多肽片段；(3)陽(yáng)性篩選在陽(yáng)性篩選細(xì)胞中加入步驟⑵中陰性篩選后得到的噬菌體多肽文庫(kù)菌液，獲得經(jīng)陽(yáng)性篩選后的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，該細(xì)胞結(jié)合了噬菌體文庫(kù)中與其特異性結(jié)合的親和多肽片段；(4)噬菌體擴(kuò)增提取步驟3所得滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液，對(duì)其內(nèi)的噬菌體滴度進(jìn)行擴(kuò)增；(5)測(cè)量擴(kuò)增后的噬菌體提取液的滴度，4°C保存；以上(1) ( 步驟重復(fù)4輪，第1輪篩選加入噬菌體文庫(kù)原液，以后每輪加入前輪細(xì)胞裂解液擴(kuò)增后的噬菌體提取液；
(6)提取每一輪所得的和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性親和的噬菌體DNA片段，進(jìn)行測(cè)序，篩選出對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度親和性的多肽序列即序列表中的SEQ ID NO. 1 :LTHPRWP，其 DNA 序列如序列表中的 SEQ ID NO. 2 所示CTTACGCATCCTCGTTGGCCT。本發(fā)明的另一技術(shù)方案是滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽修飾植入人體支架的應(yīng)用及其修飾方法，包括以下步驟將選出的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞親和多肽的3’ C末端，連接一個(gè)半胱氨酸(C)，利用該半胱氨酸(C)殘基與聚己內(nèi)酯(PCL)電紡絲膜經(jīng)氨化后的表面-NH2 共價(jià)耦聯(lián)，使得PCL納米纖維膜支架具有特異性富集滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的性能。具體包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜置于異丙醇配置的10% w/v的1，6_己二胺中，37°C，放置 lh；2)通過(guò)交聯(lián)齊[J (4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (sulfo-SM CC) )4-[N-馬來(lái)酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧基磺基琥珀酰亞胺將PCL納米纖維膜表面的氨基和親和多肽相連接。更具體的步驟為1)將PCL納米纖維膜修剪成與M孔板的孔面積相等的圓形，然后將其放入M孔板的孔內(nèi)，每孔加入500 μ 1的10% w/v的1，6_己二胺/異丙醇溶液，37°C，放置Ih ；2)去離子水漂洗3 5遍，雙蒸水漂洗3 5遍，PBS (0. 01M, pH 7. 4)沖洗3遍；3)每孔加入400 μ 1的交聯(lián)劑4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷羧酸_3_磺基琥珀酰亞胺酯(lmg/ml SMCC, Thermo公司)，室溫下放置Ih ；4)用含 EDTA 的緩沖液(500ml 0. 01M/pH 7. 4 的 PBS+18. 612gEDTA，pH 7. 2 7. 5) 沖洗3遍5)加入0. lmg/ml的多肽溶液(用上述含EDTA的緩沖液配置)，每孔400 μ 1,4°C 過(guò)夜；6)去離子水漂洗3遍，-20°C預(yù)凍，真空凍干后4°C保存。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是1、通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性的親和多肽片段，使之能夠靶向性地和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞高度親合。2、通過(guò)將親和多肽片段與PCL電紡絲膜進(jìn)行共價(jià)耦聯(lián)，從而對(duì)PCL納米纖維膜表面進(jìn)行修飾，使之能夠特異性地富集滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，使得該材料作為支架在體內(nèi)進(jìn)行軟骨再生修復(fù)的時(shí)候，能夠持續(xù)性地粘附滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，并產(chǎn)生正常細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)，從而達(dá)到更好的修復(fù)效果。3、在對(duì)該多肽進(jìn)行種屬特異性鑒定的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該多肽并無(wú)明顯的種屬特異性， 所以該親和多肽序列還可廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，作為一種篩選滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的親和載體，可以更加高效地篩選、純化滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中提供的人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果圖；圖2a、圖2b和圖2c是本發(fā)明實(shí)施例1的噬菌體滴度測(cè)定中提供的噬菌體藍(lán)斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果；將倍比稀釋后的噬菌體10 μ 1加入200 μ 1大腸桿菌菌液中孵育1-5分鐘，加入頂層培養(yǎng)基迅速混勻，平鋪四環(huán)素抗性的LB-tet培養(yǎng)板上，37°C，5% CO2過(guò)夜，計(jì)算平板上的噬菌體藍(lán)斑數(shù)。然后用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10 μ 1噬菌體的空斑形成單位(pfu) 滴度。并挑取單個(gè)藍(lán)斑在LB/大腸桿菌培養(yǎng)液中擴(kuò)增，提取噬菌體DNA測(cè)序。圖加藍(lán)斑數(shù)量10° ；圖2b、藍(lán)斑數(shù)量IO1 ；圖2c 藍(lán)斑數(shù)量IO20圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的噬菌體親和多肽篩選中提供的四輪篩選的噬菌體的回收率；圖如是本發(fā)明實(shí)施例2提供的人的MSC親和多肽的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖；圖4b是針對(duì)圖如的的熒光強(qiáng)度的定量分析結(jié)果圖；參見圖如和圖4b，InM的FITC熒光標(biāo)記的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞親和多肽 (SMSC-affinity peptide sequence)和錯(cuò)配多肽(Scramble peptide)分別與滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞孵育1小時(shí)后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析；由圖4b可見，F(xiàn)ITC標(biāo)記的錯(cuò)配多肽與滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育，平均熒光強(qiáng)度為5 ；FITC標(biāo)記的親和多肽與滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育，平均熒光強(qiáng)度為174，親和多肽組的熒光強(qiáng)度(174)遠(yuǎn)高于錯(cuò)配多肽組的熒光強(qiáng)度 (5)；圖fe是是本發(fā)明實(shí)施例2提供的大鼠的MSC親和多肽的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖；圖恥是針對(duì)圖fe的的熒光強(qiáng)度的定量分析結(jié)果圖；圖5c是是本發(fā)明實(shí)施例2提供的家兔的MSC親和多肽的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖；圖5d是針對(duì)圖5c的的熒光強(qiáng)度的定量分析結(jié)果圖；參見圖fe和圖恥，大鼠(Rat) :FITC標(biāo)記的錯(cuò)配多肽與大鼠滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育，平均熒光強(qiáng)度為4 ；FITC標(biāo)記的親和多肽與大鼠滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育，平均熒光強(qiáng)度為99，親和多肽組的熒光強(qiáng)度(99)遠(yuǎn)高于錯(cuò)配多肽組的熒光強(qiáng)度；參見圖5c和5d，家兔(Rabbit) =FITC標(biāo)記的錯(cuò)配多肽與家兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育，平均熒光強(qiáng)度為5 ；FITC標(biāo)記的親和多肽與家兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育，平均熒光強(qiáng)度為92，親和多肽組的熒光強(qiáng)度(9 遠(yuǎn)高于錯(cuò)配多肽組的熒光強(qiáng)度(5)；其中，圖如、圖fe和圖5c中，左邊的峰代表的是錯(cuò)配多肽，右邊的峰代表的是親和多肽。圖6是本發(fā)明實(shí)施例2提供的激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果；標(biāo)記FITC的親和多肽和錯(cuò)配多肽分別與滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞共同孵育lh，鬼筆環(huán)肽復(fù)染細(xì)胞骨架，hochest復(fù)染胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞與多肽結(jié)合情況；結(jié)果顯示親和多肽序列(LTHPRWP)對(duì)于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的親和力顯著高于錯(cuò)配多肽(PRHLPTW)；圖7是本發(fā)明實(shí)施例3提供的利用共價(jià)結(jié)合方式，將親和多肽片段連接到聚己內(nèi)酯(PCL)納米電紡絲纖維膜表面的示意圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例3提供的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性多肽修飾的PCL納米電紡絲纖維膜在激光共聚焦顯微鏡下觀察的多肽連接；圖中顯示連接了 FITC標(biāo)記的親和多肽片段(LTHPRWP)的聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維，可見綠色熒光強(qiáng)度較高，提示較高的連接效率；圖9a和圖9b是本發(fā)明實(shí)施例3提供的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性多肽修飾PCL納米電紡絲支架的效果；圖9a為連接了滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞親和多肽片段；圖9b為連接了錯(cuò)配多肽片段；
分別將連接了滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞親和多肽片段(LTHPRWP)和錯(cuò)配多肽片段 (PRHLPTff)的聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維膜置于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞懸液中，共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示連接了親和多肽的PCL納米纖維膜相較連接錯(cuò)配多肽的PCL納米纖維膜更有利于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)。(藍(lán)色1 :h0CheSt-胞核；綠色2 連接多肽的PCL納米纖維膜；紅色3 鬼筆環(huán)肽-細(xì)胞骨架)。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。實(shí)施例1噬菌體展示技術(shù)篩選滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞親和多肽序列(1)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞以及人成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)a.人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代從接受全膝關(guān)節(jié)置換(TKA)的患者手術(shù)過(guò)程中獲取膝關(guān)節(jié)髕上囊中的滑膜組織， 放入PBS(0. 01M，pH 7. 4)中洗滌2次，將滑膜組織用眼科剪剪碎，加入胰酶，37°C消化30min 去除膜性組織；離心，PBS(0. 01M，pH 7. 4)洗滌，棄上清液，加入0.2% I型膠原酶37°C消化 2小時(shí)；離心，PBS(0. 01M，pH 7.4)洗滌2遍，加入含10% FBS的DMEM(LG)完全培養(yǎng)基，2 3天換一次培養(yǎng)液，并傳一代，作為陽(yáng)性篩選細(xì)胞(參見圖1)。其中DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基。b.人成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代從接受全膝關(guān)節(jié)置換(TKA)的患者手術(shù)過(guò)程中獲取ACL(人前交叉韌帶)組織， PBS (0. 01M, pH 7.4)沖洗，去除表面的膜性組織及血凝塊，用眼科剪將其剪碎，37°C下用胰酶消化30min去除雜質(zhì)，加入完全培養(yǎng)基中止消化，PBS (0. 01M, pH 7. 4)洗滌2次，再加入 0. 2% I型膠原酶(用DMEM配制)，37°C消化2-3小時(shí)，每小時(shí)置37°C恒溫振蕩箱振蕩5min， 直到組織塊大部分呈肉眼可見的絮狀物，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞大部分分離后，以彎頭吸管輕輕吹打，加入等體積的完全培養(yǎng)基以中和膠原酶，消化后的細(xì)胞懸液經(jīng)離心，棄上清液后，用完全培養(yǎng)基重懸、鋪板，并傳十代以上。作為陰性篩選細(xì)胞。(2)陰性篩選(去除與PlO代ACL成纖維細(xì)胞結(jié)合的多肽片段)a.取一皿PlO代ACL成纖維細(xì)胞，用胰酶消化、PBS (0. 01M, pH 7. 4)洗滌2 3 遍；加入 blocking buffer (封閉緩沖液，0. IM NaCO3 (ρΗ8· 6)，5mg/ml BSA, 0. 02% NaN3)重懸于ImlEP管中，4°C封閉lh，減少非特異性結(jié)合；b.離心(1500rpm,5min)，棄上清液，加入0. 5ml的無(wú)血清DMEM(HG)，細(xì)胞計(jì)數(shù) (2 X IO6)；c.加入 Ιμ 的噬菌體文庫(kù)(PH.D.-7TM PHage Display Library, NEB) (1 X 10nPFU/10 μ 1 噬菌體原液，100 μ 1)，室溫放置 30min ；d.離心(lOOOOrpm，5min)，吸取上清液，得到陰性篩選后的噬菌體多肽文庫(kù)菌液， 移至新EP管中備用；(3)陽(yáng)性篩選a.取一皿Pl代人來(lái)源SMSC(滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞)，用胰酶消化，PBS (0. 01M, pH7.4)洗滌2 3遍；加入blocking buffer重懸于Iml EP管中，4°C封閉lh，減少非特異性
結(jié)合；b.離心，棄上清液，加入0. 5ml的無(wú)血清DMEM(HG)，細(xì)胞計(jì)數(shù)(2 X IO6)；c.加入步驟( 所得陰性篩選后的噬菌體多肽文庫(kù)菌液，室溫放置30min ；d.離心，棄上清液，PBS洗滌2 3遍，得到陽(yáng)性篩選后的細(xì)胞；(4)噬菌體擴(kuò)增(參見 PH. D.-7TM PHage Display Peptide Library Kit 操作手冊(cè))a.將步驟( 所得陽(yáng)性篩選后的細(xì)胞制備細(xì)胞裂解液，對(duì)其內(nèi)的噬菌體滴度進(jìn)行擴(kuò)增將細(xì)胞裂解提取液加入20ml ER2738培養(yǎng)液中(處于early-log)，在37°C搖晃，孵育 4. 5小時(shí)；b.將步驟1)中的培養(yǎng)液加入離心管中，4°C下，10，OOOrpm離心10分鐘，將上清移入新管中，再次離心(10, OOOrpm, IOmin)；c.抽取80%上清，移到新離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，讓噬菌體在4°C下沉淀過(guò)夜；d.次日，10，OOOrpm, 4 °C下，將噬菌體菌液離心，15分鐘，棄上清，再次離心 (10，OOOrpm, IOmin)，棄上清液；e 用 Iml TBS (50mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)，150mM NaCl)重新懸浮噬菌體沉淀，4°C下， 離心5分鐘。f.將上清移到新離心管中，用1/6體積的PEG/NaCl再次沉淀。在冰上孵育60分鐘。4°C，10，OOOrpm離心10分鐘，棄上清液，重新短暫離心，再次棄上清。g.用200 μ 1的TBS (ρΗ7. 5，含0. 02% NaN3)重新懸浮沉淀，離心1分鐘，將上清移到新離心管中。此即為擴(kuò)增后的噬菌體提取液。(5)噬菌體滴度測(cè)定(參見 PH. D.-7ΤΜ PHage Display Peptide Library Kit 操作手冊(cè))a.接種ER2738單菌落于5-10ml LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm搖床孵育至對(duì)數(shù)中期 (OD600 0. 5)。b.微波爐加熱融化上層瓊脂，分成:3ml/份分裝到滅菌試管中，每個(gè)稀釋度的噬菌體一管。保存于45°C備用。c. 37°C預(yù)溫LB/IPTG/Xgal平板，每個(gè)噬菌體稀釋梯度取一個(gè)平板備用。d.用LB培養(yǎng)液對(duì)噬菌體進(jìn)行10倍比列稀釋。建議稀釋范圍擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)物上清=IO8-IO11 ；未擴(kuò)增的淘選洗脫物-.IO1-IO4O每個(gè)稀釋度換一新鮮吸頭，建議使用帶濾芯吸頭以避免交叉污染。e當(dāng)大腸桿菌菌液達(dá)對(duì)數(shù)中期，分成200 μ 1/等份于微量離心管中，每個(gè)噬菌體稀
釋度用一管。f.每管大腸桿菌菌液中分別加入10 μ 1不同稀釋倍數(shù)的噬菌體，快速震蕩混勻， 室溫溫育l-5min。g.將噬菌體感染的大腸桿菌菌液加入45°C預(yù)溫的頂層瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管， 快速混勻，立即傾注于37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當(dāng)傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開。
h.待平板冷卻5min后，倒置于37°C孵箱，培養(yǎng)過(guò)夜。i檢查平板，計(jì)數(shù)有 IO2個(gè)噬菌斑的平板上的斑數(shù)(參見圖2a、圖2b和圖2c)。 然后，用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10μ 1噬菌體的空斑形成單位(Pfu)滴度。以上(1) ( 步驟重復(fù)4輪，然后對(duì)每一輪的噬菌體提取液進(jìn)行測(cè)序。(6)噬菌體多肽片段測(cè)序(參見PH.D. -7TM PHage Display Peptide Library Kit 操作手冊(cè))a.噬菌斑的擴(kuò)增將大腸桿菌擴(kuò)增菌液(0D 0. 5)按1 100用LB培養(yǎng)液稀釋， 每個(gè)待測(cè)序的噬菌斑克隆分裝一管，Iml/管；b.用滅菌牙簽或吸頭，在菌斑數(shù)在10-100之間的平皿內(nèi)挑取單克隆藍(lán)色菌斑，放入上述Iml培養(yǎng)管中。共挑取20個(gè)單克隆。c. 37 "C，250rpm 搖床，孵育 4. 5_5h ；d.孵育后的噬菌體菌液轉(zhuǎn)入離心管中，離心30秒。上清移入新管，再離心。吸取 80%上清液轉(zhuǎn)入新離心管，此即為擴(kuò)增噬菌體貯液，可以4°C貯存幾個(gè)星期而對(duì)滴度影響不大。長(zhǎng)期貯存應(yīng)用滅菌甘油1 1稀釋后，-20°C貯存；e.從上述擴(kuò)增的單克隆噬菌體菌液中，吸取500 μ 1到新離心管中；f.加 200ul PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置 IOmin ；g.離心lOmin，棄上清液，再次短暫離心(lOOOOrpm，30sec)吸去殘余上清液；h.噬菌體沉淀徹底重懸于100 μ 1碘化物緩沖液中，加入250 μ 1乙醇。室溫孵育 IOmini.離心lOmin，棄上清液。用70%的乙醇洗沉淀，短暫真空干燥；j.沉淀重懸于20 μ 1雙蒸水中，即為噬菌體模版DNA溶液；k.測(cè)序，經(jīng)過(guò)四輪篩選，得到一組對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度親和性的多肽序列。本發(fā)明實(shí)施例試驗(yàn)結(jié)果a、噬菌體親和多肽篩選利用噬菌體展示文庫(kù)(PHD. -7TM PHage Display Peptide LibraryKit ；New England Biolabs)，一共進(jìn)行了 4輪篩選，每次篩選后，測(cè)定獲取噬菌體滴度，乘以菌液總體積，即為篩選后回收的噬菌體總量，同時(shí)，將篩選后的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，采用擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行下一輪篩選。第一輪篩選加入1 μ 1的噬菌體原液(滴度1X1013PFU/I0l·! 1)，裂解細(xì)胞后，提取噬菌體滴度為1X103PFU/I0y 1，將提取的噬菌體擴(kuò)增后，噬菌體滴度為lXlO^PFU/lOy 1 ；第二輪篩選加入擴(kuò)增后的噬菌體10 μ 1，篩選后，回收噬菌體滴度為5.3X104PFU/10y 1，擴(kuò)增后滴度為1 X 10"PFU/10 μ 1 ；第三輪篩選 篩選后，回收噬菌體滴度為1. 2X106PFU/10 μ 1，擴(kuò)增后滴度為6.0X1010PFU/10 μ 1 ；第四輪篩選篩選后，回收噬菌體滴度為9.0X105PFU/10l·! 1。Table 1 噬菌體回收率
權(quán)利要求
1.一種滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列為序列表中的SEQ ID NO. 1。
2.一種如權(quán)利要求1所述的滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽氨基酸序列的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟采用噬菌體展示技術(shù)分別進(jìn)行人成纖維細(xì)胞的陰性篩選和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的陽(yáng)性篩選；篩選之后，提取滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，裂解細(xì)胞，再提取和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性親和的噬菌體DNA片段，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，即可獲取對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度親和性的多肽氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的篩選方法，其特征在于，具體包括以下步驟(1)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞以及人成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)通過(guò)人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)并傳一代，獲得陽(yáng)性篩選細(xì)胞；通過(guò)人成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)并傳十代以上，獲得陰性篩選細(xì)胞；(2)陰性篩選在陰性篩選細(xì)胞中加入噬菌體文庫(kù)，去除噬菌體文庫(kù)中與PlO代ACL細(xì)胞結(jié)合的多肽片段；(3)陽(yáng)性篩選在陽(yáng)性篩選細(xì)胞中加入步驟O)中陰性篩選后得到的噬菌體多肽文庫(kù)菌液，獲得陽(yáng)性篩選后的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，該細(xì)胞結(jié)合了噬菌體文庫(kù)中與其特異性結(jié)合的親和多肽片段；(4)噬菌體擴(kuò)增提取步驟C3)所得滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液，對(duì)其內(nèi)的噬菌體滴度進(jìn)行擴(kuò)增；(5)測(cè)量擴(kuò)增后的噬菌體提取液的滴度，4°C保存；以上(1) ( 步驟重復(fù)4輪，第1輪篩選加入噬菌體文庫(kù)原液，以后每輪加入前一輪細(xì)胞裂解液擴(kuò)增后的噬菌體提取液；(6)提取每一輪所得的和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性親和的噬菌體DNA片段，進(jìn)行測(cè)序， 篩選出對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度親和性的多肽序列LTHPRWP。
4.一種如權(quán)利要求1所述的滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽用于修飾植入人體支架的應(yīng)用。
5.一種用如權(quán)利要求1所述的滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽修飾植入人體支架的方法，其特征在于，包括以下步驟將選出的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞親和多肽的3’ C末端，連接一個(gè)半胱氨酸(C)，利用該半胱氨酸(C)殘基與聚己內(nèi)酯(PCL)電紡絲膜經(jīng)氨化后的表面-NH2 共價(jià)耦聯(lián)，使得PCL納米纖維膜支架具有特異性富集滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的性能。
6.一種權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜置于異丙醇配置的10%w/v的1，6_己二胺中，37°C，放置Ih ；2)通過(guò)交聯(lián)劑4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯將 PCL納米纖維膜表面的氨基和親和多肽相連接。
7.—種權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將PCL納米纖維膜修剪成與M孔板的孔面積相等的圓形，然后將其放入M孔板的孔內(nèi)，每孔加入500 μ 1的10% w/v的1，6_己二胺/異丙醇溶液，37°C，放置Ih ；2)去離子水漂洗3 5遍，雙蒸水漂洗3 5遍，PBS沖洗3遍；3)每孔加入400μ 1的交聯(lián)劑4-(Ν-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯，室溫下放置Ih;4)PBS沖洗3遍;5)加入0.lmg/ml的多肽溶液，每孔400 μ 1，4°C過(guò)夜；6)去離子水漂洗3遍，-20°C預(yù)凍，真空凍干后4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種滑膜間充質(zhì)親干細(xì)胞親和多肽的氨基酸序列、篩選方法及應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。所述篩選方法包括以下步驟采用噬菌體展示技術(shù)分別進(jìn)行人成纖維細(xì)胞陰性篩選和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的陽(yáng)性篩選；篩選之后，提取滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，裂解細(xì)胞，再提取和滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性親和的噬菌體片段，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，即可獲取對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度親和性的多肽片段。本發(fā)明能夠提高生物材料對(duì)于滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞特異性親和能力，在組織工程軟骨修復(fù)領(lǐng)域里有著深遠(yuǎn)的意義和廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102229647SQ20111015363
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者周春燕, 張辛, 敖英芳, 皮彥斌, 邵振興 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院