專利名稱：用于預(yù)防和治療敗血癥的方法與組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明概言之涉及用于預(yù)防和治療敗血癥的方法和組合物，且具體而言，本發(fā)明涉及補體抑制劑和CD14途徑抑制劑的組合在預(yù)防或治療敗血癥中的用途。
背景技術(shù)：
補體免疫系統(tǒng)可保護身體免受病原細菌、病毒、寄生蟲和其他有害生物體的侵害。免疫系統(tǒng)分為兩個部分體液系統(tǒng)和細胞系統(tǒng)。一般而言，體液系統(tǒng)包括補體系統(tǒng)和可防御病原體的抗體的產(chǎn)生。補體系統(tǒng)或簡言為補體涉及可協(xié)助抗體進行宿主防御的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。 補體是包括至少30個表面結(jié)合可溶蛋白的一組蛋白。通過在56 °C下加熱血清30分鐘會破壞某些可溶蛋白的活性。補體蛋白參與用于吞噬作用的微生物調(diào)理作用、通過裂解來直接殺滅微生物、白細胞對于炎癥位點的趨化吸引、白細胞的激活和免疫復(fù)合體的加工。補體蛋白可在一連鎖反應(yīng)中發(fā)揮作用，其中一蛋白質(zhì)的結(jié)合可促進該連鎖反應(yīng)中下一蛋白質(zhì)的結(jié)合。連鎖反應(yīng)的激活會引起釋放可促成炎癥反應(yīng)的被稱作過敏毒素(C3a、 Wa及最有效的C5a)的生物活性小肽，并最終形成一可裂解靶細胞的膜攻擊復(fù)合體(rab-9 或MAC)。不同的補體分子可由不同細胞類型合成，例如，成纖維細胞和腸上皮細胞可生成 Cl，而大部分組成是在肝中合成。補體系統(tǒng)的組成和機制已為人們所熟知?；旧希嬖谌齻€補體途徑傳統(tǒng)途徑、 凝集素途徑和旁路途徑。傳統(tǒng)途徑主要由含有抗原和IgG或IgM的免疫復(fù)合體觸發(fā)，但也可由例如C-反應(yīng)性蛋白等其他作用劑觸發(fā)。凝集素途徑通過甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)或纖維膠凝蛋白結(jié)合到異質(zhì)表面上的碳水化合物結(jié)構(gòu)(例如，甘露聚糖)上來觸發(fā)。旁路途徑主要由重復(fù)多糖和其他聚合體結(jié)構(gòu)(諸如發(fā)現(xiàn)于細菌上的那些聚合體結(jié)構(gòu))來觸發(fā)。當(dāng)Clq(Clqrs復(fù)合體的一部分)的球形結(jié)構(gòu)域結(jié)合到IgM或多個IgG分子的Fc 片段上時，傳統(tǒng)途徑得到激活。在鈣離子存在下，此結(jié)合會引起兩個Clr分子的自身催化激活。Clr分子可激活兩個Cls分子。Cls是一可使C4a自C4b解離的絲氨酸蛋白酶。C4b 立即結(jié)合到靶細胞表面上的鄰近蛋白質(zhì)或碳水化合物上，且隨后在鎂離子存在下結(jié)合到C2 上。Cls可使C2b從此復(fù)合體上解離下來，生成傳統(tǒng)途徑的C3轉(zhuǎn)化酶，C4b2a0 C3轉(zhuǎn)化酶可使許多C3分子解離成C3a和C3b。一些Ob分子返回結(jié)合到C4bh上以生成傳統(tǒng)途徑的 C5轉(zhuǎn)化酶，C4b2a3b0 C5轉(zhuǎn)化酶可將C5解離成Cfe和C5b。C5b可結(jié)合至細胞表面從而引發(fā)MAC的形成。C3a、C4a和Cfe皆是過敏毒素。C3a和Cfe也是化學(xué)吸引劑。C3a和Cfe具有結(jié)合肥大細胞和嗜堿性粒細胞的能力。Cfe也是一嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和巨嗜細胞的有效激活劑并可引起對血管內(nèi)皮細胞上的黏附分子的誘導(dǎo)。Cfe也可下調(diào)嗜中性粒細胞和單核細胞。當(dāng)C3a和⑶a將其受體結(jié)合到肥大細胞與嗜堿性粒細胞上時，這些細胞會向血液和組織中釋放組胺及其他高活性肽。這些肽可增加血管壁的滲透性以使嗜中性粒細胞遷移至所述區(qū)域中。嗜中性粒細胞可進一步因C5a的有效趨化(吸引劑)作用受到激勵而遷移至補體激活位點。嗜中性粒細胞可吞噬入侵的病原體，且也可釋放能夠?qū)⒕奘杉毎礁腥疚稽c的介質(zhì)。這些細胞還能夠吞噬入侵細胞并進一步促發(fā)炎癥反應(yīng)及有效消除大量感染微生物。“凝集素途徑”除了由結(jié)合到細菌表面末端甘露糖基團的鈣相依凝集素MBL引發(fā)外皆與傳統(tǒng)途徑類似。MBL類似于Clq。當(dāng)MBL結(jié)合到其靶標(biāo)上時，其會釋放并因此激活已知為MASPl、MASP2和MASP3 (與甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)的絲氨酸蛋白酶)的三個相關(guān)絲氨酸蛋白酶，其類似于Clr和ClS。其中，MASP2在使C4解離成C4b和Wa及使C2解離成 C2b和C2a的過程中發(fā)揮重要作用。C4和C2激活之后，凝集素途徑與傳統(tǒng)途徑相同。旁路補體途徑涉及一利用由傳統(tǒng)途徑產(chǎn)生的C3b的放大環(huán)路。一些由傳統(tǒng)途徑 C3轉(zhuǎn)化酶生成的Ob分子集中到旁路途徑中。表面結(jié)合的Ob可結(jié)合B因子以生成C!3bB， C3bB可成為D因子的底物。D因子是一可解離Ba片段的絲氨酸蛋白酶，其中C3bm3仍結(jié)合至靶細胞表面上。Obrn3通過備解素(P)得到穩(wěn)定，形成可作為旁路途徑C3轉(zhuǎn)化酶的復(fù)合體C3bBbP。同傳統(tǒng)途徑中一樣，此C3轉(zhuǎn)化酶參與一放大環(huán)路以解離許多C3分子，從而引起 C3b分子在靶細胞上的沉積。一些此等C!3b分子返回結(jié)合到CIBbm3上從而形成C3bBb3b，即旁路途徑C5轉(zhuǎn)化酶。C5轉(zhuǎn)化酶可將C5解離成Cfe*C5b。rab結(jié)合到細胞表面以引發(fā)膜攻擊復(fù)合體的形成。傳統(tǒng)、凝集素和旁路途徑皆隨著C5轉(zhuǎn)化酶的形成而結(jié)束。C5轉(zhuǎn)化酶可經(jīng)由裂解途徑引起MAC的組裝。組分C5至C8以串聯(lián)形式相互連接，并促進一或多個C9單體插入至靶細胞的脂雙層中。此插入會導(dǎo)致可引起鈣流入的孔的形成及隨后的有核細胞的細胞激活或者如果攻擊足夠強會引起細胞解離及死亡。CD14 途徑⑶14是一 53kD的經(jīng)糖磷脂酰肌醇(PI)連接的糖蛋白并可作為單核細胞、巨噬細胞和粒細胞表面上的高親和性內(nèi)毒素(LPQ受體來發(fā)揮作用。由于CD14是一經(jīng)GPI連接的蛋白質(zhì)，因此其不具有可傳遞信號的跨膜或細胞內(nèi)部分。CD14也可以可溶形式存在于人類血清和其他體液中?？扇蹸D14(sCD14)可直接分泌或衍生自膜結(jié)合分子的蛋白酶相依性排毒。s⑶14會與膜結(jié)合⑶14(mCD14)競爭結(jié)合LPS，并能夠中和LPS誘發(fā)的活體外和活體內(nèi)反應(yīng)。s⑶14可調(diào)介由LPS誘發(fā)的不表達⑶14的內(nèi)皮、表皮和平滑肌細胞的激活。LBP(脂多糖結(jié)合蛋白)是一 58kD急性期糖蛋白并可以高親和性結(jié)合到LPS的脂質(zhì)A部分，并可催化LPS導(dǎo)致的⑶14相依性細胞激活。MD2是一分泌型附屬蛋白，其很可能通過穩(wěn)定TLR4 二聚體來結(jié)合toll樣受體TLR4的胞外結(jié)構(gòu)域并可促進LPS反應(yīng)性。⑶14/MD2/TLR4復(fù)合體似乎是分離自大部分革蘭氏陰性生物體的LPS的主要且可能是唯一的受體。已知⑶14途徑在預(yù)防和治療敗血癥方面起重要作用，且已知抗⑶14抗體可通過 CD14 途徑減輕敗血癥，例如，Leturcq DJ, J Clin Invest 1996 Oct 1 ；98 (7) :1533-8 和美國專利第6，495，332號與第6，四7，049號中所述。⑶14途徑包括若干步驟。一般而言， 來自革蘭氏陰性細菌外膜的LPS可通過與血漿中LPS結(jié)合蛋白(LBP)形成一復(fù)合體來啟
6動所述途徑的順序。所述LPS-LBP復(fù)合體可將LPS單體傳遞給吞噬細胞細胞膜中的CD14。 ⑶14和MD2可促進LPS與可向細胞內(nèi)傳導(dǎo)信號的TLR4的結(jié)合。LPS與TLR4的結(jié)合可將銜接分子MyD88募集到受體胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上，且隨后MyD88可結(jié)合至腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TRAF6)。TRAF6可結(jié)合絲氨酸-蘇氨酸激酶IRAK。據(jù)信，TRAF6/IRAK復(fù)合體可激活 NFkB激酶(NIK)兩個亞基的磷酸化，并使其形成異二聚體——I κ B激酶(IKK)。隨后IKK 二聚體使I κ B磷酸化并使其從NF κ B上解離下來。隨后NF κ B可遷移至細胞核中、結(jié)合至 DNA上并激活編碼炎癥介質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄。敗血癥敗血癥是一種其特征為對感染產(chǎn)生強烈全身性炎癥反應(yīng)的疾病。細菌性敗血癥是一種由血液中具侵害性細菌感染引起的復(fù)雜的全身性炎性綜合癥。敗血癥可在人類和其他動物中引起高發(fā)病率和死亡率。在美國，敗血癥是造成人類醫(yī)院死亡(尤其在重癥監(jiān)護室中)和幼畜及其他動物感染死亡的主要原因。每年均可在人類中診斷出超過700，000的敗血癥新病例。外推至全球群體，這表明每年全世界范圍有數(shù)百萬例嚴(yán)重敗血癥。死亡率在自約20至30%范圍內(nèi)，且表明每年美國至少有150，000例死亡。敗血癥可歸因于許多原因，但通常由諸如肺炎、外傷、外科手術(shù)和燒傷等事件或由諸如癌癥或AIDS等病癥引發(fā)。敗血癥開始時通常伴有顫抖、發(fā)燒、血壓下降(敗血性休克)、 呼吸急促、心率加快和皮膚損傷。數(shù)小時內(nèi)，敗血癥可在血管內(nèi)引發(fā)自發(fā)凝血、嚴(yán)重低血壓、 多器官衰竭、休克并最終導(dǎo)致死亡。通常，這些癥狀由宿主防御機制(諸如細胞因子、白細胞和補體)的過度或不受控激活所致。敗血癥通常由細菌感染(革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌)引起但也可由其他病原體(諸如真菌、病毒和寄生蟲)和非感染性刺激(諸如超級抗原)所引起。然而敗血癥最常由革蘭氏陰性細菌感染引起。然而，可歸因于敗血癥的損傷和癥狀不僅可由細菌引起也可由已知為內(nèi)毒素或脂多糖(LPS)的細菌細胞壁組分所引起。LPS分子是普遍存在于所有革蘭氏陰性細菌外膜中的糖脂。雖然已知的LPS分子化學(xué)結(jié)構(gòu)是復(fù)雜并多樣化的，但其共同特征是具有脂質(zhì)A區(qū)。對高度保守的脂質(zhì)A LPS區(qū)的識別可引發(fā)許多(如果不是全部的話)可導(dǎo)致敗血癥的事件。當(dāng)免疫系統(tǒng)摧毀入侵細菌時會釋放LPS。釋放的LPS可結(jié)合單核細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞，并觸發(fā)諸如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白介素(IL_1、 IL-6及IL-8)等各種介質(zhì)的生成。TNF-a、IL_1、IL_6和IL-8的過度生成是敗血癥的主要原因。用于治療敗血癥的已知方法包括抗菌劑、抗體、小分子及肽、蛋白質(zhì)C、使用氧氣的輔助療法、靜脈輸液和可提高血壓的藥物。例如，美國專利申請案第20030021783號中揭示使用抗IL-8抗體來治療敗血癥；美國專利申請案第20030008822號中揭示使用抗IL-18 抗體來治療敗血癥；美國專利申請案第20020165138號中揭示在動物中使用抗Cfe抗體和 C-末端經(jīng)平截的Cfe肽來預(yù)防和治療敗血癥；美國專利申請案第20020155094號中揭示使用趨化因子及趨化因子片段來治療敗血癥；美國專利申請案第200200449 號中揭示使用蛋白質(zhì)C和BPI蛋白質(zhì)的組合來治療敗血癥；美國專利申請案第20020034509號中揭示使用抗⑶14抗體來治療敗血癥；以及美國專利申請案第20020006915號中揭示使用C0X-2抑制劑來治療敗血癥。同樣，美國專利第6，534，648號中揭示使用海藻脂多糖來抗擊敗血癥； 美國專利第6，495，332號和第6，297, 049號中揭示使用抗⑶14抗體來治療敗血癥；美國專利第6，489，296號中揭示使用蛋白質(zhì)C來降低患有嚴(yán)重敗血癥的人類患者中的死亡率；美國專利第6，344，197號中揭示使用組合蛋白質(zhì)C和BPI的協(xié)同組合療法來治療敗血癥。所述專利并未揭示使用來自補體和CD14途徑二者的化合物組合；美國專利第6，315，999號揭示使用一針對腫瘤壞死因子的抗體(抗TNF α)及一針對細菌脂多糖的抗體(抗LPS) 共同來治療敗血癥。所述專利并未揭示使用來自補體和CD14途徑二者的化合物組合，美國專利第6，063，764號揭示一種使用脂蛋白相關(guān)凝血抑制劑進行敗血癥或敗血性休克的預(yù)防性或治療性治療的方法；美國專利第6，042，821號中揭示一種使用趨化因子來預(yù)防和治療敗血癥的方法；美國專利第5，354，771號中揭示一種使用支鏈氨基酸的酮類似物治療敗血癥的方法，以及美國專利第5，093，117號中揭示可用來治療或預(yù)防敗血癥的醫(yī)藥組合物，其包括針對革蘭氏陰性細菌的多克隆免疫球蛋白和一血液凝塊溶解有效量的蛋白質(zhì)C。然而，盡管過去數(shù)十年間已在嚴(yán)重感染的治療中取得重大進展，但敗血癥發(fā)病率和歸因于敗血癥的死亡率仍持續(xù)增長。因此，需要新方法和組合物來預(yù)防和治療敗血癥。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一目的是提供用于預(yù)防和治療敗血癥的方法與組合物。本發(fā)明的另一目的是降低由敗血癥引起的發(fā)病率和死亡率。本發(fā)明的又一目的是提供一種可用于預(yù)防和治療敗血癥的試劑盒。使用一種用于預(yù)防或治療敗血癥的新穎方法可達成這些及其他目的，所述方法包括向一可能形成或正患有敗血癥的患者聯(lián)合施用一敗血癥預(yù)防或治療量的補體抑制劑和一敗血癥預(yù)防或治療量的CD14途徑抑制劑。所述補體抑制劑可以是任何已知的補體抑制劑，但較佳是一可結(jié)合至并抑制補體組分的抗體或其功能等效片段。所述CD14途徑抑制劑可以是任何已知的CD14途徑抑制劑，但較佳是一可結(jié)合至并抑制CD14的抗體或其功能等效片段。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員將易知本發(fā)明的其它及進一步的目的、特征及優(yōu)點。
具體實施例方式定義術(shù)語“患者”表示一可能形成或正患有敗血癥的人類或其他動物，包括牛、豬、犬、 貓、馬、禽和羊等動物。較佳地，所述患者是人類。術(shù)語“聯(lián)合”表示大約同時向一患者施用補體抑制劑和⑶14途徑抑制劑(1)分別使用相同或不同施用途徑以相同或不同頻率來施用，或( 共同以一醫(yī)藥上可接受的組合物形式施用，或C3)共同作為一雙特異性抗體或其片段的一部分施用，尤其是那些具有一個補體組分結(jié)合位點和另一個CD14途徑組分結(jié)合位點的雙特異性抗體?！按蠹s同時”通常表示所述抑制劑可同時或彼此間隔約72小時內(nèi)施用。術(shù)語“非經(jīng)腸地”表示經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹腔內(nèi)注射施用。術(shù)語“功能等效片段”表示能夠以與完整抗體實質(zhì)相同的方式結(jié)合至補體系統(tǒng)或 CD14途徑組分上并抑制補體激活或CD14途徑功能的抗體片段。術(shù)語“拮抗劑”表示任何可阻斷、防止、抑制或中和一補體組分或⑶14途徑組分正常功能的分子。一類拮抗劑是可干擾CD14與其LPS配體間相互作用的分子，包括抗體或抗體片段。本發(fā)明并不限于本文所述的特定方法、方案和試劑，因為這些皆會發(fā)生改變。此外，本文所用術(shù)語僅用于闡述具體實施例的目的而不擬對本發(fā)明范疇加以限定。除非上下文中另有明確說明，否則，本文和隨附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“所述” 皆包括其復(fù)數(shù)指代，例如，當(dāng)提及“一宿主細胞”時包括復(fù)數(shù)個所述宿主細胞。除非另有定義，否則，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語以及任何簡稱皆具有熟習(xí)本發(fā)明領(lǐng)域的普通技術(shù)者所普遍理解的相同含義。本文闡述了較佳的方法、裝置和材料，但亦可使用任何與本文所述者相似或等效的方法和材料來實施本發(fā)明。本文提及的所有專利案及公開案皆在法律允許的范圍內(nèi)以引用方式并入本文中， 以便于闡述并揭示其中報告的可用于本發(fā)明的化合物和方法。然而，不應(yīng)將本文所述理解為認可本發(fā)明無權(quán)早于先前發(fā)明所揭示的此等揭示內(nèi)容。本發(fā)明一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和治療敗血癥的方法。所述方法包括聯(lián)合向一患者施用一或多種敗血癥預(yù)防或治療量的補體抑制劑和一或多種敗血癥預(yù)防或治療量的 ⑶14途徑抑制劑。本發(fā)明基于下述新穎發(fā)現(xiàn)，即免疫系統(tǒng)補體組分和⑶14途徑二者在敗血癥形成過程中發(fā)揮重要作用以及用來抑制或防止補體激活的方法和組合物必須與用來抑制CD14途徑的方法和組合物聯(lián)合使用從而有效預(yù)防或治療敗血癥。單獨使用補體抑制劑或CD14途徑抑制劑不會有效預(yù)防或治療所述疾病。所述方法和組合物可用于降低易患或正患有敗血癥的患者的發(fā)病率和死亡率。本發(fā)明補體抑制劑是已知可于一患者中抑制補體激活的任何分子。一般而言，補體抑制劑是有機小分子、肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段或可作為補體抑制劑發(fā)揮作用的其他分子。可用補體抑制劑包括補體抑制素及其功能類似物(可抑制C3)、Clq抑制劑、Cl抑制劑(可共價結(jié)合Clr和Cls)、Clr抑制劑(可結(jié)合并抑制Clr)、Cls抑制劑(可結(jié)合并抑制 Cls)、sCRl及其類似物(可解離所有C3轉(zhuǎn)化酶)、抗C5抗體(可阻斷C5激活)、抗Cfe和抗Cfe受體的抗體及小分子藥物(可抑制Cfe信號傳導(dǎo)途徑)、抗C3a和抗C3a受體的抗體及小分子藥物(可抑制C3a信號傳導(dǎo)途徑)、抗C6、7、8或9抗體(可抑制MAC的形成或功能)、抗D因子抗體(可抑制D因子與B因子的解離)、抗備解素抗體(使旁路途徑中的C3 和C5轉(zhuǎn)化酶去穩(wěn)定)、膜輔因子蛋白(MCP) (I因子調(diào)介的Ob和C4b解離的輔因子)、衰變加速因子(DAF)(加速所有C3轉(zhuǎn)化酶的衰變)和MCP-DAF融合蛋白(CAB-2)。其他可用抑制劑包括C4bp (可加速傳統(tǒng)途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C4t32a)的衰變)、H因子(可加速旁路途徑C3 轉(zhuǎn)化酶(Obm3)的衰變)、1因子(可以蛋白水解方式使C4b和Ob解離并失活(需要輔因子))、羧肽酶N(從C3a、Wa及Cfe上去除末端精氨酸殘基)、玻璃粘連蛋白(S蛋白)和群集素(可結(jié)合(恥-7復(fù)合體并可防止膜插入)以及CD59 (可抑制旁觀者細胞的裂解)。較佳地，所述補體抑制劑是可結(jié)合至或抑制一或多種在補體連鎖反應(yīng)中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)(例如Cl、C2、C4、C3、C3a、C5、C5a、D因子、B因子、備解素、MBL或其組分、MASP 或其組分、蛋白酶解離產(chǎn)物和受體)的抗體或其功能等效片段。當(dāng)一患者處于形成敗血癥的風(fēng)險中時所述抗體可結(jié)合至該補體連鎖反應(yīng)中的所選補體蛋白質(zhì)且可抑制或防止補體激活。在一實施例中，所述補體抑制劑是一可結(jié)合到C5上并在補體連鎖反應(yīng)中抑制Cfe和 CS3形成的抗C5抗體或其功能等效片段。所述抗體還可以是一可結(jié)合到這些蛋白質(zhì)上并抑制其在補體連鎖反應(yīng)中的作用的抗Cfe或抗(: 抗體。所述補體抑制劑最佳是一可結(jié)合到 C5a上并抑制其在補體連鎖反應(yīng)中的作用的抗Cfe抗體或其功能等效片段。所述抗體可以是多克隆或單克隆抗體，但較佳是單克隆抗體。在該較佳實施例中，補體抑制劑是可抑制補體連鎖反應(yīng)中過敏毒素(尤其為C5a) 的化合物。所述抑制劑包括抗C3a抗體及其功能等效片段、抗Wa抗體及其功能等效片段和抗Cfe抗體及其功能等效片段。在另一實施例中，補體抑制劑是Cfe受體拮抗劑。這些拮抗劑會干擾Cfe與其受體間的相互作用并抑制補體途徑功能。Cfe受體拮抗劑包括但不限于F-[oPdChaWR] (Haynes DR 等人，Biochem Pharmacol 2000 ；60 :729-33 ；Huber-Lang MS 等人，F(xiàn)ASEB J 2002 ；16 1567-74)和那些于 W00249993A2 和 W00249993A3 中闡述者。本發(fā)明⑶14途徑抑制劑是已知可在一患者中抑制⑶14途徑的任何分子。一般而言，CD14途徑抑制劑是有機小分子、肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段或可作為CD14途徑抑制劑發(fā)揮作用的其他分子?？捎肅D14途徑抑制劑包括可干擾CD14途徑功能和炎癥介質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄的CD14途徑拮抗劑。所述抑制劑包括但不限于可抑制CD14途徑組分作用的抗CD14 途徑組分抗體(諸如抗⑶14抗體和抗LPS抗體)、可結(jié)合至LPS并干擾其結(jié)合至⑶14的LPS 拮抗劑、可結(jié)合至LBP并干擾其將LPS轉(zhuǎn)移至⑶14的能力的LBP拮抗劑、可干擾⑶14產(chǎn)生的⑶14反義核苷酸、可干擾⑶14產(chǎn)生的⑶14 siRNA以及可干擾⑶14產(chǎn)生的⑶14 RNAi。在一實施例中，⑶14途徑抑制劑是可結(jié)合至并抑制一或多種在⑶14途徑中發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)(例如，LPS、脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)(LBP)、⑶14、TLR4和MD2(對于革蘭氏陰性敗血癥)及⑶14、TLR2和TLR6(對于革蘭氏陽性敗血癥))的抗體或其功能等效片段?？耿?4 中和單克隆抗體包括但不限于由Tasaka SI (Am J Respir Cell Mol Biol ；2003 Mar 14， 在印刷之前在線公布)闡述的抗體4C1和由Axtelle T(J Endotoxin Res 2001 ；7 :310-4) 闡述的抗體IC14。所述抗體可結(jié)合至該途徑中一所選蛋白質(zhì)并抑制或防止可導(dǎo)致產(chǎn)生不期望細胞因子的膜信號傳導(dǎo)和基因激活。較佳地，所述抗體選自由抗LPS抗體、抗LPB抗體、 抗CD14抗體、抗TLR4抗體、抗MD2抗體、抗TLR2抗體、抗TLR6抗體及其功能等效片段所組成的群組。最佳地，所述⑶14途徑抑制劑是一可結(jié)合至⑶14并抑制膜信號傳導(dǎo)和細胞因子基因激活的抗⑶14抗體或其功能等效片段，或一可結(jié)合至LPS并防止LPS結(jié)合⑶14的抗LPS抗體。所述抗體可以是一多克隆或單克隆抗體，但較佳是單克隆抗體。在另一實施例中，所述CD14途徑抑制劑是在抗CD14抗體恒定區(qū)、較佳在CH2和 CH3區(qū)且最佳在Fc區(qū)中具有氨基酸序列改變的抗⑶14抗體。這些“變體”抗⑶14抗體的氨基酸序列中有一或多個氨基酸不同于其天然對應(yīng)物，包括修飾、取代、插入和刪除。這些變體具有可改變抗體Fc區(qū)效應(yīng)器功能(例如，結(jié)合補體、結(jié)合到巨噬細胞和單核細胞上的細胞受體，及諸如此類)的經(jīng)改變氨基酸序列。較佳地，所述變體抗體具有降低的結(jié)合Fc 受體及/或激活補體的能力。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已熟知用于產(chǎn)生抗體(包括多克隆抗體、單克隆抗體、 單價抗體、人源化抗體、人類抗體、雙特異性抗體和雜共軛抗體)及其功能等效片段的方法。多克隆抗體可在一哺乳動物中通過單獨注射一免疫原或注射一免疫原與一佐劑的組合來產(chǎn)生多克隆抗體。通常，使用一或多次皮下或腹腔內(nèi)注射將免疫原注射于所述哺乳動物中。 免疫原可包括感興趣的多肽或一包含所述多肽和另一已知可在所述接受免疫的哺乳動物中產(chǎn)生免疫作用的多肽的融合蛋白。所述免疫原也可包括表達一重組受體或表達一含有所述受體基因的DNA表達載體的細胞。所述免疫原蛋白的實例包括但不限于鑰孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。佐劑實例包括但不限于弗氏 (Freund' s)完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰脂質(zhì)A、合成的海藻糖二棒分枝菌酸酯)。 所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員無需進行過多實驗即可選擇出免疫方案。單克隆抗體使用雜交瘤方法(例如，Kohler和Milstein闡述于Nature，256 :495(1975)中的那些方法)可產(chǎn)生單克隆抗體。在一雜交瘤方法中，使用一免疫原免疫一小鼠、大鼠或其他適宜宿主哺乳動物來誘發(fā)出可產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合于所述免疫原上的抗體的淋巴細胞。或者，可在活體外對淋巴細胞進行免疫。免疫原通常包括感興趣的多肽或一含這種多肽的融合蛋白。一般而言，如果需要人類來源的細胞，則使用外周血淋巴細胞(“PBL”)。 如果需要非人類哺乳動物來源的細胞，則使用脾細胞或淋巴結(jié)細胞。隨后使用一適宜融合劑(例如，聚乙二醇)使淋巴細胞與一永久細胞系融合，以形成一雜交瘤細胞(Goding， Monoclonal Antibodies Principles and Practice,第59頁-第 103頁(Academic Press, 1986))。永久細胞系通常是經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，尤其為嚙齒類動物、牛或人類的骨髓瘤細胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。雜交瘤細胞可在一適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中較佳包含一或多種可抑制未融合永久細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)，則用于所述雜交瘤的培養(yǎng)基通常將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)。所述HAT培養(yǎng)基可防止HGPRT缺陷細胞的生長。較佳的永久細胞系是那些可有效融合、支持所選抗體產(chǎn)生細胞對抗體的穩(wěn)定高水平表達且對諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的細胞系。更佳的永久細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，諸如那些可從沙克學(xué)院細胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA)購得的衍生自M0PC-21和MPC-Il小鼠腫瘤的細胞系，和可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA.)獲得的 SP2/0或)(63-Ag8-653細胞。有人也已闡述了可使用人類骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細胞系來產(chǎn)生人類單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol. 133 :3001(1984) ；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 51 頁-第 63 頁(Marcel Dekker 公司，New York，1987))。也可使用小鼠骨髓瘤細胞系NSO (歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心 (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire UK)。另夕卜，也可使用業(yè)內(nèi)熟知的人類骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細胞系來產(chǎn)生人類單克隆抗體。然后，可分析用于培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基是否存在針對感興趣多肽的單克隆抗體。較佳地，由雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性可通過免疫沉淀或通過活體外結(jié)合分析(例如，放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA))來測定。這些技術(shù)和分析為業(yè)內(nèi)熟知。例如，單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過Munson和Pollard，Anal. Biochem.，107 :220(1980)的 Scatchard 分析來測定。在鑒別所需雜交瘤細胞后，所述細胞純系可通過有限稀釋法來進一步亞克隆并可通過標(biāo)準(zhǔn)方法使其生長。適用于此目的的適宜培養(yǎng)基包括杜貝克氏改良鷹氏培養(yǎng)基(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium)和 RPMI-1640 培養(yǎng)基?；蛘?，雜交瘤細胞可在諸如一哺乳動物體內(nèi)的腹水中于活體內(nèi)生長。亞克隆細胞系所分泌的單克隆抗體可通過常規(guī)的免疫球蛋白純化方法(諸如蛋白質(zhì)G-瓊脂糖凝膠、蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法)自培養(yǎng)基或腹水液體中進行分離或純化。單克隆抗體也可通過重組DNA方法來產(chǎn)生，例如，美國專利第4，816，567號中所述的方法。編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)方法分離和測序，例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針(Innis M.等人，“PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications" , Academic, San Diego, CA(1990)； Sanger, F. S 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. 74 :5463-5467 (1977))。本文所述的雜交瘤細胞可作為這種DNA的較佳來源。一旦得到分離，就可將所述DNA置于表達載體中。然后，將該等載體轉(zhuǎn)染至不會以其他方式產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞中，例如，猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞。所述重組宿主細胞可用于產(chǎn)生所需的單克隆抗體。也可通過(例如)用人類重鏈及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列來代替同源鼠類序列，或通過將免疫球蛋白編碼序列共價結(jié)合于一非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列，來對DNA進行修飾。此一非免疫球蛋白多肽可替代一抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或可替代一抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生一嵌合雙價抗體。單價抗體可使用免疫球蛋白輕鏈和經(jīng)修飾重鏈的重組表達來產(chǎn)生。一般而言，可在Fc區(qū)域的任何一點將重鏈切斷，以防止重鏈交聯(lián)。或者，以另一氨基酸殘基來替代相關(guān)的半胱氨酸殘基或刪除相關(guān)的半胱氨酸殘基以防止交聯(lián)。同樣，亦可使用活體外方法來產(chǎn)生單價抗體。可使用已知方法利用抗體消化來產(chǎn)生抗體片段，較佳為Fab片段?？贵w及抗體片段可使用采用McCafferty等人在Nature 348 :552-5 (1990)中闡述的技術(shù)生成的抗體噬菌體文庫產(chǎn)生。Clackson等人及Marks等人分別在Nature 352 624-628(1991)中和J. Mol. Biol. 222 :581-597(1991)中闡述了使用噬菌體文庫進行鼠類及人類抗體的分離。隨后的出版物闡述了通過鏈改組(Marks等人，Bio/Technology 10: 779-783(1992))以及作為一用于構(gòu)建相當(dāng)大的噬菌體文庫的策略的組合感染和活體內(nèi)重組(Waterhouse 等人，Nuc. Acids. Res. 21 :2265-2266(1993))來產(chǎn)生高親和性(nM 范圍) 人類抗體。因此，這些技術(shù)相對于用來分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)而言是更具優(yōu)勢的替代方案。此外，也可通過(例如)用人類重鏈及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列來替代同源鼠類序列(美國專利第4，816，567號；Morrison等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81 :6851(1984)),或通過將免疫球蛋白編碼序列共價結(jié)合于一非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列，來對DNA進行修飾。通常，這些非免疫球蛋白多肽可替代一抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或其可替代一抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生一嵌合雙價抗體，所述雙價抗體包括一個對一抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點和另一個對一不同抗原具有特異性的抗原結(jié)合位點。也可使用電融合而非化學(xué)融合的方法來形成雜交瘤進而產(chǎn)生抗體。這種技術(shù)已得到良好發(fā)展。人們也可不采用融合而使用(例如)EB病毒或轉(zhuǎn)化基因來轉(zhuǎn)化B-細胞以使其成為永久細胞(“Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity，，，Zurawaki，V. R.等人，于 Kennett R. H.等人編輯的"Monoclonal Antibodies, ” Plenum Press, N. Y. 1980，第 19 頁-第 33 頁中)。人源化抗體人源化抗體可使用Winter in Jones 等人在 Nature，321 :522-525 (1986)中、 Riechmann 等人在 Nature，332 :323-327(1988)中以及 Verhoeyen 等人在 Science，239 1534-1536(1988)中所述的方法來產(chǎn)生。人源化過程通過以嚙齒類互補決定區(qū)(“⑶R”)或 CDR序列來代替相應(yīng)的人類抗體序列來完成。一般而言，一人源化抗體具有從一非人類來源引入其內(nèi)的一或多個氨基酸。這些“人源化”抗體為嵌合抗體，其中，實質(zhì)上少于一個完好人類可變結(jié)構(gòu)域的部分已由來自一非人類物種的相應(yīng)序列替代。實際上，人源化抗體通常為人類抗體，其中某些CDR殘基及可能某些構(gòu)架(“FR”)殘基被來自嚙齒類動物抗體中類似位點的殘基取代。非人類(例如，鼠類或牛類)抗體的人源化形式可為嵌合免疫球蛋白、 免疫球蛋白鏈或諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2等免疫球蛋白片段、或含衍生自非人類免疫球蛋白的最小序列的抗體的其它抗原結(jié)合子序列。人源化抗體包括人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自所述受體的一互補決定區(qū)域(CDR)的殘基由來自一諸如小鼠、大鼠或兔等非人類物種(供體抗體)的CDR且具有期望特異性、親和性及能力的殘基所替代。有時，人類免疫球蛋白的Fv骨架殘基由對應(yīng)的非人類殘基所替代。人源化抗體也包含既未見于受體抗體亦未見于引入⑶R或骨架序列中的殘基。一般而言，人源化抗體包含至少一個且通常為兩個可變結(jié)構(gòu)域的實質(zhì)全部部分，其中CDR區(qū)域的全部或?qū)嵸|(zhì)全部部分對應(yīng)于一非人類免疫球蛋白的那些部分，且FR區(qū)域的全部或?qū)嵸|(zhì)全部部分為一人類免疫球蛋白一致序列的那些部分。人源化抗體最優(yōu)至少包括一免疫球蛋白恒定區(qū)域(Fe)(通常為一人類免疫球蛋白恒定區(qū)域)的一部分。人類抗體人類抗體可使用業(yè)內(nèi)已知的各種技術(shù)來產(chǎn)生，例如，Hoogenboom和Winter在 J. Mol. Biol.，227 :381 (1991)中及 Marks 等人在 J. Mol. Biol.，222 :581 (1991)中所闡述的噬菌體展示文庫。人類單克隆抗體可使用Cole等人在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss，第 77 頁(1985)中及 Boemer 等人在 J. Immunol.，147(1) 86-95(1991)中闡述的技術(shù)來產(chǎn)生。或者，可使用在免疫后可于不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白的情況下產(chǎn)生整組人類抗體的轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)。這些轉(zhuǎn)基因小鼠可自Abgenix 公司(Fremont, California)及 Medarex 公司(Annandale, New Jersey)購得。有人曾闡述，嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈結(jié)合區(qū)域(JH)基因的純合缺失會引起對內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)入這些種系突變小鼠中可在受到抗原攻擊后引起人類抗體的產(chǎn)生。參見(例如Uakobovits等人在Natl. Acad. ki. USA 90 :2551(1993)中、Jakobovits 等人在 Nature 362 :255-258(1993)中、Bruggermann 等人在 Year in Immunol. 7 :33 (1993)中以及 Duchosal 等人在 Nature 355 :258(1992) 中的闡述。人類抗體也可衍生自噬菌體展示文庫(Hoogenboom等人，J. Mol. Biol. 227 381 (1991) ；Marks 等人，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991) ；Vaughan 等人，Nature Biotech 14 :309(1996))。雙特異性抗體雙特異性抗體可由兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的重組共表達產(chǎn)生，其中所述兩個重鏈具有不同的特異性。雙特異性抗體是單克隆抗體，較佳為對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的人類或人源化抗體。在本發(fā)明中，一種結(jié)合特異性是針對補體組分的結(jié)合特異性，而另一種結(jié)合特異性是針對CD14途徑組分的結(jié)合特異性。一般而言，本發(fā)明的補體抑制劑是一雙特異性抗體上的一抗補體組分結(jié)合位點，而本發(fā)明的CD14途徑抑制劑是一雙特異性抗體上的一抗⑶14組分結(jié)合位點。較佳地，雙特異性抗體具有一種對Cfe的結(jié)合特異性及另一種對⑶14的結(jié)合特異性，但多種其他組合也涵蓋作為本發(fā)明的一部分。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，因此，這些雜交瘤會產(chǎn)生一由10種不同抗體構(gòu)成的潛在混合物。然而，這些抗體中僅有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的回收和純化通常通過親和層析法來完成。具有期望結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點)可融合到免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列中。所述融合體較佳具有一包含鉸合區(qū)域、CH2區(qū)域和CH3區(qū)域中至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。較佳地，至少所述融合體之一中具有包含輕鏈結(jié)合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)域(CHI)。將編碼免疫球蛋白重鏈及(若需要)免疫球蛋白輕鏈的DNA插入到單獨表達載體中，并共轉(zhuǎn)染至一適宜宿主生物體中。Suresh等人在Methods in Enzymology,121 :210(1986)中闡述了用于產(chǎn)生雙特異性抗體的適宜技術(shù)。雜共軛抗體雜共軛抗體可使用已知的蛋白融合方法(例如，通過將一抗體的胺基偶接至另一抗體或其他多肽的一硫醇基上)來產(chǎn)生。若需要，可使用已知方法引入一硫醇基。例如，可使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成一硫醚鍵來產(chǎn)生包含一抗體或抗體片段和一多肽毒素的免疫毒素。適用于此目的的適宜試劑實例包括亞胺基硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰亞胺酯 (mercaptobutyrimidate)。這些抗體可用來靶向免疫補體組分并用來預(yù)防或治療敗血癥?？赏ㄟ^能夠使抑制劑到達靶細胞的任何方法將補體抑制劑和CD14途徑抑制劑施用給患者。這些方法包括但不限于經(jīng)口、直腸、經(jīng)鼻、外敷、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)和腹腔內(nèi)施用方式。在一實施例中，可通過將抑制劑直接置于肺中(通常通過吸入或氣管滴注)來施用所述抑制劑。較佳采用非經(jīng)腸注射，這是由于非經(jīng)腸注射可允許精確控制投藥所用時間和劑量水平。對于非經(jīng)腸施用而言，可將補體抑制劑與一生理上可接受的非經(jīng)腸媒劑一起調(diào)配成(例如)溶液、懸浮液、乳劑或凍干粉劑。這些媒劑的實例為水、鹽水、林格氏(Ringer's)溶液、葡萄糖溶液和5%人體血清白蛋白。也可使用脂質(zhì)體和諸如固定油等非水性媒劑。媒劑或凍干粉劑可包含維持等滲性的添加劑(例如，氯化鈉、甘露醇)和維持化學(xué)穩(wěn)定性的添加劑(例如，緩沖劑和防腐劑)。所述調(diào)配物可使用常用技術(shù)滅菌。例如，通過將1. 5重量％的有效成分溶于0. 9%的氯化鈉溶液中可制備一適于經(jīng)注射施用的非經(jīng)腸組合物。另一方面，本發(fā)明提供一種可用來預(yù)防和治療敗血癥的組合物，所述組合物包括一或多種補體抑制劑、一或多種CD14途徑抑制劑，且較佳還包括一或多種醫(yī)藥上可接受的佐劑、載劑、賦形劑及/或稀釋劑。用于制造醫(yī)藥組合物的可接受佐劑、載劑、賦形劑及/或稀釋劑為所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，例如，Hoover, John Ε.，Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing ^li], Easton, Pennsylvania 1975。 調(diào)配物的另一論述可參見 Liberman，H. Α.禾口 Lachman，L.編輯的 Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York，N. Y.，1980。最佳地，所述抑制劑與醫(yī)藥上可接受的載劑混合以形成一可使得劑量制備和施用容易進行的組合物。由不含非揮發(fā)性致熱原的水、無菌水以及抑菌水制備而成且含至少0. 025M諸如磷酸鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉等緩沖鹽的水性媒劑也適合于形成可注射的補體抑制劑溶液。除了這些緩沖液外，也可使用若干其他水性媒劑。這些水性媒劑包括能夠滅菌的等滲注射組合物，諸如氯化鈉、林格氏溶液、葡萄糖、 葡萄糖和氯化鈉、以及乳酸林格氏溶液。添加諸如甲醇、乙醇或丙二醇等與水混溶的溶劑通常會增加所述抑制劑在這些媒劑中的溶解度和穩(wěn)定性。此外，亦可采用諸如棉籽油、芝麻油或花生油和酯類(例如，肉豆蔻酸異丙酯)等非水性媒劑作為所述抑制劑的懸浮媒劑。另外，還可添加各種能夠增強組合物的穩(wěn)定性、無菌性和等滲性的添加劑，包括抗菌防腐劑、 抗氧化劑、螯合劑以及緩沖劑。然而，所用的任何媒劑、稀釋劑或添加劑皆必須具有生物相容性并可與本發(fā)明的抑制劑相容。當(dāng)補體抑制劑或CD14途徑抑制劑是抗體或抗體片段時，所述調(diào)配物是任何已知適合用于向患者施用抗體的調(diào)配物，例如，諸如于美國專利申請案第20020136719號中所揭示的那些固體抗體調(diào)配物、諸如于美國專利第6，267, 958號中所揭示的那些重構(gòu)成凍干調(diào)配物、或諸如于美國專利第6，171，586號中所揭示的水性調(diào)配物。施用給患者的補體抑制劑或CD14途徑抑制劑的數(shù)量或劑量根據(jù)患者類型、患者年齡、患者個頭、抑制劑類型、治療頻率、施用目的(治療或預(yù)防)以及敗血癥嚴(yán)重程度而有所變化。一般而言，補體抑制劑按每天每公斤體重約1至50毫克的劑量(mg/kg)施用給患者，較佳約5至30mg/kg/天。當(dāng)通過吸入或氣管滴注施用時，補體抑制劑按約0. 5至20mg/ kg的劑量每天2次施用給患者。一般而言，⑶14途徑抑制劑按每天每公斤體重約10至200 毫克的劑量(mg/kg)施用給患者，較佳約25至100mg/kg/天。當(dāng)通過吸入或氣管滴注施用時，⑶14途徑抑制劑按約1至40mg/kg的劑量每天2次施用給患者。所述補體抑制劑可按一次劑量施用，或可將該劑量分成較小劑量以更頻繁的頻次施用。在一較佳實施例中，每天向患者施用抗Cfe抗體和抗⑶14抗體的混合物(含約 25mg/kg抗Cfe抗體和約40mg/kg抗⑶14抗體)以預(yù)防或治療敗血癥。同樣，此混合物可包含約40mg/kg抗LPS抗體來代替抗⑶14抗體。由于補體抑制劑和⑶14途徑抑制劑可分開施用，因此本發(fā)明另一方面還提供一種用于向患者施用敗血癥預(yù)防或治療用組合物的呈試劑盒形式的制造物件，其包括置于單獨容器中呈單一包裝形式的補體抑制劑和CDl4途徑抑制劑。所述試劑盒包含當(dāng)施用給患者時足以提供約25mg/kg/天補體抑制劑的補體抑制劑量和足以提供約40mg/kg/天CD14 途徑抑制劑的CD14途徑抑制劑量。實例可通過本發(fā)明較佳實施例的下述實例來進一步闡明本發(fā)明，但應(yīng)了解，除非特別說明，否則，提供這些實例僅為闡明目的而并非意欲限制本發(fā)明范圍。材料與方法設(shè)備根據(jù)制造商提供的信息，所有使用的設(shè)備和溶液均無內(nèi)毒素。使用聚丙烯管以得到補體的低背景激活。試劑無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)從Life Technologies (Paisley, UK)購得， Lepirudin (Refludan ) JA Hoechst (Frankfurt am Main， Germany)Ι 白勺力腸桿菌(IX IO9 個細菌/mL)從 ORPEGEN Pharma(Heidelberg, Germany)購得；當(dāng)使用鱟魚阿米巴狀細胞裂解物分析(limulus amebocyte lysate assay)進行分析時，大腸桿菌懸浮液中內(nèi)毒素總濃度是Tyg/mL。小鼠抗人類mAb 137-26 (純化的IgGl)由 Tanox 公司(Houston，TX)生產(chǎn)。小鼠抗人類 CD14 mAb 18D11 (純化的 IgGl)從 Diatec AS(0slo，Norway)購得且通過胃蛋白酶消化來制備其F(ab' )2。眼鏡蛇毒因子(CVF)從 Quidel購得。細菌脂多糖(LPS)從Hoechst購得。小鼠抗人類CDllb PE共軛物從Becton Dickinson (San Jose，CA)購得。細胞核染料 LDS-751 從 Molecular Probes (Eugene, OR) 購得。實例1人類全血炎癥模型中由大腸桿菌而非LPS誘發(fā)的補體激活本研究使用人類全血模型，如先前在(Mollnes TE等人，Blood 2002 ； 100 1869-1877)中的詳述。從健康志愿者采集血液并用來匹盧定(1印irudin)作抗凝處理。經(jīng)測試來匹盧定并不干擾補體激活。測試本系統(tǒng)中大腸桿菌(IX 108/mL)、經(jīng)超聲波處理的大腸桿菌(IXlO8AiL)和LPS(0.5yg/mL)對補體激活的影響。使用CVF(5U/mL)作為流體相補體激活的對照。所有培育皆在37°C下進行。通過酶聯(lián)免疫分析(ELISA)來測定由補體激活形成的血漿末端sC5b-9復(fù)合體(TCC)，如在(Mollnes TE等人，Scand. J. Immunol. 1985 ； 22:197-202)中詳述者。在本分析中，將對TCC具有特異性的mAb涂布于微量測試板中各孔表面上。樣品經(jīng)培育后，通過針對人類C6的生物素化小鼠mAb來檢測固定化的TCC。然后添加結(jié)合有鏈霉抗生物素的辣根過氧化物酶以對底物顯色。用ELISA板讀數(shù)器在450nm 處讀取反應(yīng)產(chǎn)物的光密度(OD)。結(jié)果示于表1中。表 1由大腸桿菌而非LPS誘發(fā)的TCC在人類全血中的形成(任意單位/mL)
權(quán)利要求
1.一種可用于預(yù)防或治療敗血癥的組合物，其包括一或多種補體抑制劑和一或多種 ⑶14途徑抑制劑，其中所述一或多種補體抑制劑包括抗Cl抗體或其結(jié)合片段、抗C2抗體或其結(jié)合片段、抗C3抗體或其結(jié)合片段、抗C4抗體或其結(jié)合片段、抗Wa抗體或其結(jié)合片段、抗rab抗體或其結(jié)合片段、Cfe受體拮抗劑、抗B因子抗體或其結(jié)合片段、抗MBL抗體或其結(jié)合片段、 或抗MASP抗體或其結(jié)合片段。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述補體抑制劑包括抗C2抗體或其結(jié)合片段。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述補體抑制劑進一步包括抗D因子抗體或其結(jié)合片段。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述CD14途徑抑制劑包括LPS拮抗劑，LBP拮抗劑，CD14 反義核酸序列、CD14 siRNA，或 CD14 RNAi。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗體或其結(jié)合片段。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗LPS抗體或其結(jié)合片段、抗LBP抗體或其結(jié)合片段、抗CD14抗體或其結(jié)合片段、抗MD2抗體或其結(jié)合片段、抗 TLR2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR4抗體或其結(jié)合片段、或抗TLR6抗體或其結(jié)合片段。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗CD14抗體或其結(jié)合片段。
8.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗LPS抗體或其結(jié)合片 段。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述補體抑制劑包括Cfe受體拮抗劑，且所述 CD14途徑抑制劑包括抗CD14抗體或其結(jié)合片段。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述補體抑制劑包括Cfe受體拮抗劑，且所述 CD14途徑抑制劑包括抗LPS抗體或其結(jié)合片段。
11.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗CD14抗體或其結(jié)合片段。
12.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗LPS抗體或其結(jié)合片段。
13.如權(quán)利要求1或6所述的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述抗體是人類抗體或人源化抗體。
15.如權(quán)利要求1或6所述的組合物，其中所述組合物包括具有改變的效應(yīng)子功能的抗體。
16.一種組合物，包括雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包括 第一結(jié)合片段，其為補體抑制劑，和第二結(jié)合片段，其為CD14途徑抑制劑，其中所述補體抑制劑包括抗Cl抗體或其結(jié)合片段、抗C2抗體或其結(jié)合片段、抗C3抗體或其結(jié)合片段、抗C4抗體或其結(jié)合片段、抗Wa抗體或其結(jié)合片段、抗rab抗體或其結(jié)合片段、⑶a受體拮抗劑、抗B因子抗體或其結(jié)合片段、抗MBL抗體或其結(jié)合片段、或抗MASP抗體或其結(jié)合片段；且其中所述⑶14途徑抑制劑包括LPS拮抗劑，LBP拮抗劑，⑶14反義核酸序列、⑶14siRNA,⑶14 RNAi、抗LPS抗體或其結(jié)合片段、抗LBP抗體或其結(jié)合片段、抗⑶14抗體或其結(jié)合片段、抗MD2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR4抗體或其結(jié)合片段、或抗TLR6抗體或其結(jié)合片段。
17.如權(quán)利要求1或16所述的組合物，其進一步包括一或多種醫(yī)藥上可接受的佐劑、載劑、賦形劑、和/或稀釋劑。
18.如權(quán)利要求1或16所述的組合物，其中所述組合物采用經(jīng)口、非經(jīng)腸、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、局部、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、或腹腔內(nèi)的施用方式。
19.一種包括如權(quán)利要求1所述的組合物的試劑盒。
20.一種試劑盒，用于敗血癥的預(yù)防或治療，包括置于各自容器中的一或多種補體抑制劑和一或多種⑶14途徑抑制劑組合物，其中所述一或多種補體抑制劑包括抗Cl抗體或其結(jié)合片段、抗C2抗體或其結(jié)合片段、 抗C3抗體或其結(jié)合片段、抗C4抗體或其結(jié)合片段、抗Wa抗體或其結(jié)合片段、抗rab抗體或其結(jié)合片段、Cfe受體拮抗劑、抗B因子抗體或其結(jié)合片段、抗MBL抗體或其結(jié)合片段、或抗MASP抗體或其結(jié)合片段。
21.如權(quán)利要求19或20所述的試劑盒，其中所述一或多種補體抑制劑包括Cfe受體拮抗劑。
22.如權(quán)利要求19或20所述的試劑盒，其中所述補體抑制劑包括抗C2抗體。
23.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，進一步包括抗D因子抗體。
24.如權(quán)利要求19或20所述的試劑盒，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗LPS抗體或其結(jié)合片段、抗LBP抗體或其結(jié)合片段、抗CD14抗體或其結(jié)合片段、CD14反義核酸序列、 ⑶14 siRNA,⑶14 RNAi、抗MD2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR4抗體或其結(jié)合片段、或抗TLR6抗體或其結(jié)合片段。
25.如權(quán)利要求M所述的試劑盒，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗CD14抗體。
26.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述CD14途徑抑制劑包括抗CD14抗體。
27.如權(quán)利要求19或20所述的試劑盒，其中所述一或多種補體抑制劑或CD14途徑抑制劑的量足以提供每kg體重每天約1至約200mg的劑量。
28.如權(quán)利要求1-18中任一權(quán)利要求所述的組合物的用途，其用于制備預(yù)防或治療敗血癥的藥物。
29.—種補體抑制劑，用于與CD14途徑抑制劑協(xié)同使用以治療或預(yù)防敗血癥，其中所述補體抑制劑包括抗Cl抗體或其結(jié)合片段、抗C2抗體或其結(jié)合片段、抗C3抗體或其結(jié)合片段、抗C4抗體或其結(jié)合片段、抗Wa抗體或其結(jié)合片段、抗rab抗體或其結(jié)合片段、⑶a受體拮抗劑，抗B因子抗體或其結(jié)合片段，抗MBL抗體或其結(jié)合片段，或抗MASP抗體或其結(jié)合片段；且其中所述⑶14途徑抑制劑包括LPS拮抗劑，LBP拮抗劑，⑶14反義核酸序列、⑶14 siRNA,⑶14 RNAi、抗LPS抗體或其結(jié)合片段、抗LBP抗體或其結(jié)合片段、抗⑶14抗體或其結(jié)合片段、抗MD2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR4抗體或其結(jié)合片段、或抗TLR6抗體或其結(jié)合片段。
30.一種CD14途徑抑制劑，用于與補體抑制劑協(xié)同使用以治療或預(yù)防敗血癥，其中所述⑶14途徑抑制劑包括LPS拮抗劑，LBP拮抗劑，⑶14反義核酸序列、⑶14siRNA,⑶14 RNAi、抗LPS抗體或其結(jié)合片段、抗LBP抗體或其結(jié)合片段、抗⑶14抗體或其結(jié)合片段、抗MD2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR2抗體或其結(jié)合片段、抗TLR4抗體或其結(jié)合片段、或抗TLR6抗體或其結(jié)合片段，其中所述補體抑制劑包括抗Cl抗體或其結(jié)合片段、抗C2抗體或其結(jié)合片段、抗C3抗體或其結(jié)合片段、抗C4抗體或其結(jié)合片段、抗Wa抗體或其結(jié)合片段、抗rab抗體或其結(jié)合片段、⑶a受體拮抗劑，抗B因子抗體或其結(jié)合片段，抗MBL抗體或其結(jié)合片段，或抗MASP抗體或其結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過向患者聯(lián)合施用敗血癥預(yù)防或治療量的一或多種補體抑制劑和敗血癥預(yù)防或治療量的一或多種CD14途徑抑制劑來預(yù)防或治療敗血癥的方法。所述補體抑制劑較佳是可結(jié)合至并抑制諸如C5a等補體蛋白的抗體，且所述CD14途徑抑制劑較佳是可結(jié)合至并抑制諸如CD14和LPS等CD14途徑組分的抗體。
文檔編號C07K16/28GK102258784SQ201110169068
公開日2011年11月30日 申請日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者豐錫中, 湯姆·埃里克·莫爾內(nèi)斯 申請人:唐納士公司, 梅迪諾瓦公司