專(zhuān)利名稱(chēng)：高分子量谷蛋白亞基優(yōu)異等位變異g330e的鑒定及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明涉及HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E基因的編碼序列、該基因編碼的蛋白質(zhì)與其在改良小麥加工品質(zhì)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)俏覈?guó)最主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和消費(fèi)量均居世界首位。小麥面粉加水后具有特殊的制面特性，面團(tuán)既具有彈性又具有延展性，可以被用來(lái)加工成各種食品，如面包、面條、餅干和糕點(diǎn)，因此關(guān)于小麥加工品質(zhì)的研究一直備受各國(guó)研究者的重視。目前的研究已顯示小麥籽粒中蛋白的含量及其組成對(duì)品質(zhì)有著非常重要的影響。小麥籽粒蛋白主要包括兩部分與代謝相關(guān)的清蛋白和球蛋白，與品質(zhì)密切相關(guān)的面筋蛋白(gluten)。根據(jù)在不同溶液中溶解性的差異和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，面筋蛋白又分為醇溶蛋白、高分 子量谷蛋白亞基和低分子量谷蛋白亞基。醇溶蛋白主要影響面團(tuán)的延展性，而谷蛋白亞基主要影響面團(tuán)的彈性，同時(shí)對(duì)延展性也有影響(Payne，1987 ；Shewry等，1992，1995)。其中高分子量谷蛋白亞基的類(lèi)型和組成對(duì)品質(zhì)的作用最大，因此世界各國(guó)關(guān)于其遺傳學(xué)和功能學(xué)的研究也最多，并且取得了很大的進(jìn)展。在普通小麥(2n = 6x = 42)中，高分子量谷蛋白亞基由位于第一染色體組長(zhǎng)臂上的Glu-Al，Glu-Bl和Glu-Dl三個(gè)位點(diǎn)編碼，每個(gè)位點(diǎn)內(nèi)存在兩個(gè)基因，一個(gè)編碼分子量較小的I—型亞基，另一個(gè)則編碼分子量較大的X-型亞基(Payne，1987)。由于等位基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生，在普通小麥中往往只有4-5個(gè)表達(dá)。根據(jù)在SDS-PAGE上蛋白遷移率的不同，許多高分子量谷蛋白亞基的等位變異被分離和鑒定出來(lái)，并且根據(jù)其對(duì)品質(zhì)的作用進(jìn)行了評(píng)分。例如，Glu-Dl位點(diǎn)的lDx5+lDylO亞基組合對(duì)面筋的強(qiáng)度和面團(tuán)的彈性具有很大的正向作用，被認(rèn)為是最優(yōu)異的亞基組合之一(Payne, 1987 ；ffieser and Zimmermann, 2000),在歐美國(guó)家優(yōu)質(zhì)小麥品種中的出現(xiàn)頻率很高。同時(shí)Glu-Al位點(diǎn)的IAxl (Wang等2010)和1Ax2*(Payne等，1987)也被證明對(duì)品質(zhì)有明顯的正向影響，Glu-Bl位點(diǎn)的lBxl4+lByl5和1Βχ17+1Βγ18對(duì)面團(tuán)的延展性和彈性有積極作用(Li等，2004 ；Xu等，2006 ；Branlard等，2001，劉麗等，2003)。這些已經(jīng)被證明的HMW-GS的優(yōu)異等位變異，其中的一部分已經(jīng)被申請(qǐng)了專(zhuān)利保護(hù)。為了擴(kuò)展HMW-GS編碼基因的遺傳資源，國(guó)內(nèi)外的很多研究者從小麥的各種近緣種中也分離和克隆了許多HMW-GS的等位基因，但是由于小麥遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的困難，這些推測(cè)對(duì)品質(zhì)具有正向作用的亞基并不能很快的應(yīng)用到小麥育種中。在提高小麥品質(zhì)的研究方面，國(guó)內(nèi)外仍存在著優(yōu)異等位變異稀少的困境。我國(guó)小麥的品質(zhì)改良起步于上世紀(jì)80年代末,較國(guó)外的研究明顯落后,經(jīng)過(guò)近20年的研究，已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。例如制定了小麥品質(zhì)區(qū)化方案，明確了各區(qū)優(yōu)質(zhì)麥的方向，并培育出了許多含有優(yōu)良亞基組合和較好生產(chǎn)適應(yīng)性的優(yōu)質(zhì)品種(何中虎等，2005)。強(qiáng)筋和強(qiáng)中筋小麥小偃系列的小偃54和小偃81，含有l(wèi)Bxl4+lByl5優(yōu)質(zhì)亞基組合；濟(jì)麥20，含有l(wèi)Bxl3+lByl6優(yōu)質(zhì)亞基組合，藁優(yōu)9409和中優(yōu)9507則含有l(wèi)Dx5+lDylO優(yōu)質(zhì)亞基組合(吳學(xué)旭等，2009 ;劉鳳云等，2007)。此外還有弱筋優(yōu)質(zhì)小麥揚(yáng)麥13、揚(yáng)麥14和豫麥50等，這些適用于制作餅干和糕點(diǎn)。但是與國(guó)外的優(yōu)質(zhì)品種相比，我國(guó)優(yōu)質(zhì)小麥的仍存在如下差距優(yōu)質(zhì)亞基組合的含量相對(duì)較低，如IA位點(diǎn)IAxl和1Αχ2*等；蛋白含量和濕面筋含量雖然較高，但是面粉的面團(tuán)質(zhì)量相對(duì)較差；在面包品質(zhì)上，面團(tuán)烘烤體積小、彈性差、質(zhì)地不夠理想(魏益民等，2004 ;吳學(xué)旭等，2009)。因此改良小麥的HMW-GS亞基組成，在提升小麥品質(zhì)和促進(jìn)小麥遺傳改良的進(jìn)步是非常必要的。目前國(guó)內(nèi)外的研究者已經(jīng)申請(qǐng)了一些利用高分子量麥谷蛋白亞基基因改良小麥面粉加工面包性能的專(zhuān)利。如國(guó)外的專(zhuān)利W09725419，專(zhuān)利W09807747，專(zhuān)利W09808607和專(zhuān)利W09903985，這4項(xiàng)專(zhuān)利均是采用遺傳轉(zhuǎn)化的手段把優(yōu)質(zhì)亞基(lAx，1Dx5或IDylO等)導(dǎo)入到普通小麥中或非麥類(lèi)植物中，達(dá)到改良小麥面粉的面包的烘烤品質(zhì)和面團(tuán)的彈性或者改良非麥類(lèi)植物籽粒的終用途。國(guó)內(nèi)專(zhuān)利，如公開(kāi)號(hào)為CN 1428351A專(zhuān)利，該專(zhuān)利涉及小偃54中HMW-GS 1Βχ14的編碼區(qū)、啟動(dòng)子和特異性分子標(biāo)記；公開(kāi)號(hào)為CN1621412的專(zhuān)利涉及小偃54中HMW-GS IBy 15及其編碼基因與應(yīng)用。目前為止還沒(méi)有通過(guò)EMS化學(xué)誘變的方法使HMW-GS IAxl發(fā)生點(diǎn)突變，從中選擇優(yōu)異等位變異，提高HMW-GS亞基對(duì)品質(zhì)的正向作 用，并近而提高加工小麥品質(zhì)的專(zhuān)利申請(qǐng)。參考文獻(xiàn)胡學(xué)旭，周桂英，吳麗娜，陸偉，武力，李靜梅，王爽，宋敬可，楊秀蘭，王步(2009)中國(guó)主產(chǎn)區(qū)小麥在品質(zhì)區(qū)域間的差異作物學(xué)報(bào)35 :1167-1172。何中虎和晏月明(2005):中國(guó)小麥品種品質(zhì)評(píng)價(jià)體系的建立與分子改良技術(shù)研究。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社。劉鳳云，黃世全，張大樂(lè)，李玉閣，李鎖平(2007):我國(guó)部分優(yōu)質(zhì)小麥高分子量谷蛋白亞基組成分析。揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)28:47-51。劉麗，何中虎，于亞雄，楊金華，程耿，胡銀星(2003):小麥谷蛋白研究進(jìn)展。西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)16 :54_61。魏益民(2004):中國(guó)優(yōu)質(zhì)小麥生產(chǎn)的現(xiàn)狀與問(wèn)題分析。麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)24 :95_96。Branlard G, Dardevet M, Saccomano R, Lagoutte F, Gourdon J(2001) Geneticdiversity of wheat storage proteins and bread wheat quality. Euphyticall9 59-67.Li ff, Wan Y, Liu Z, Liu K, Liu X，Li B, Li Z, Zhang X，Dong Y, Wang D (2004)Molecular characterization of HMff glutenin subunit allele 1Bx14 furtherinsights into the evolution of Glu-Bl-I alleles in wheat and related speciesTheor Appl Genet 109 :1093-1104.Payne PI (1987) Genetics of wheat storage proteins and the effect ofallelic variation on bread-making quality. Plant Physiol 38:141-153.Shewery PR, Tatham AS, Barro P, Lazzeri P (1995) !Biotechnology ofbread-making unraveling and manipulating the multiprotein gluten complex. Bio/technoI 13 :1185-1190.Shewry PR, Halford NG, Tatham AS(1992) The high molecular weightsubunits of wheat glutenin. J Cereal Sci 15:105-120.Wang Y, Li Y, Zhang L, Gao X，Miao Y, Wang C, Yang G, Shewry PR, HeG (2010)Expression of the IAxl transgene in an elite Chinese wheat variety and itseffect on functional properties. J Sci Food Agric. 90 (I) :106-11.Wieser，H and Zimmermann,G (2000) Importance of amounts and proportionsof high molecular weight subunits of glutenin for wheat quality. Eur. Food Res.Technol. 210 :324-330.Xu T，Zhang XY, Dong YS(2006) !Expression Analysis of HMW-GSlBxl4 andlByl5 in Wheat Varieties and Transgenic Research of lByl5 Gene. Sci. Agric. Sin. 5 725-735。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中我們以?xún)?yōu)質(zhì)小麥品種小偃54 (HMW-GS組成IAxl，1Βχ14+1Βχ15,lDx2+lDyl2)為材料，采用一定濃度的EMS進(jìn)行化學(xué)誘變，然后采用SDS-PAGE分析誘變后代 的HMW-GS組成，獲得一個(gè)IAxl亞基分子量變大的突變體。本發(fā)明利用分子克隆技術(shù)，從突變體的基因組中得到了該編碼基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，與野生型IAxl亞基的核酸序列相比，發(fā)現(xiàn)僅在989bp處核苷酸G突變?yōu)榱?A，從而導(dǎo)致推導(dǎo)的蛋白序列中第330位的氨基酸由甘氨酸(G)變?yōu)楣劝彼?E)，我們由此命名為G330E。本發(fā)明為了證明該突變位點(diǎn)確實(shí)能夠造成亞基的遷移率變慢，利用DNA重組技術(shù)，采用原核表達(dá)的方法，將該突變體的成熟編碼蛋白表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)其遷移率與突變體種子中的IAxl亞基一致，明顯慢于野生型IAxl亞基。本發(fā)明還將突變體與野生型回交4代，然后自交3代后，得到了遺傳背景一致，但只有IAxl亞基不同的遺傳材料BC4F3 (普通小麥，Triticum aestivum),該材料已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期為2011年6月21日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4973。通過(guò)測(cè)定突變體和野生型連續(xù)3年的面粉蛋白特性、粉質(zhì)儀參數(shù)和拉伸儀參數(shù)，發(fā)現(xiàn)突變體G330E的品質(zhì)參數(shù)明顯優(yōu)于野生型，烘烤的面包體積也明顯變大。本發(fā)明達(dá)到了使優(yōu)質(zhì)小麥小偃54品質(zhì)更優(yōu)的目的。因此，本發(fā)明一方面涉及一種HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO 2o本發(fā)明另一方面涉及一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求I所述HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)蛋白的氨基酸序列以及目的宿主細(xì)胞的密碼子偏好性設(shè)計(jì)多核苷酸的編碼序列。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白的多核苷酸序列可以是如SEQID NO 1所示的序列。本發(fā)明又一方面涉及HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白或其編碼多核苷酸在制作具有改良品質(zhì)的食品中的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要方便地表達(dá)本發(fā)明的蛋白并將其用于制作具有改良品質(zhì)的食品。例如，本發(fā)明的蛋白可通過(guò)原核宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以用本發(fā)明的多核苷酸產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，例如小麥轉(zhuǎn)基因植物，并從中收獲種子，進(jìn)而制作具有改良品質(zhì)的食品。本發(fā)明又一方面涉及一種獲得HMW-GS優(yōu)異等位變異蛋白的方法，其中包括用EMS處理小麥種子的步驟。優(yōu)選地，該方法還包括測(cè)量IAxl亞基遷移率的步驟。優(yōu)選地，該方法包括鑒定并獲得IAxl亞基遷移率變慢的突變體，進(jìn)而通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行分析，從而獲得HMW-GS優(yōu)異等位變異蛋白，例如G330E蛋白。本發(fā)明又一方面涉及一種小麥面粉，其含有本發(fā)明的HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白。本發(fā)明還涉及用這樣的小麥面粉制作的食品。本發(fā)明的優(yōu)異等位變異G330E的品質(zhì)在多方面具有顯著改善，例如蛋白含量、粉質(zhì)儀、拉伸儀參數(shù)和烘烤的面包體積等方面。


圖I :G330E編碼基因特異的PCR擴(kuò)增。圖2 G330E原核表達(dá)載體圖譜。
圖3 :G330E原核表達(dá)蛋白和種子中麥谷蛋白亞基的SDS-PAGE，其中1.小偃54種子麥谷蛋白；2. G330E種子麥谷蛋白；3. G330E基因非誘導(dǎo)對(duì)照；4. G330E基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。附表說(shuō)明表I :G330E編碼基因序列六次克隆與野生型IAxl亞基的比較結(jié)果。表2 G330E優(yōu)異等位變異與野生型小麥小偃54品質(zhì)性狀的分析。序列說(shuō)明SEQ ID NO. I :G330E編碼基因的全長(zhǎng)序列。SEQ ID NO. 2 G330E 的蛋白序列。生物材料的保藏信息通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的G330E的BC4F3種子G330E-BC4F3 (普通小麥，Triticumaestivum)已經(jīng)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期為2011年6月21日，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4973，該保藏單位的地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，下述實(shí)施例僅是用于舉例說(shuō)明的目的，并非限制本發(fā)明。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所界定。實(shí)施例I :EMS化學(xué)誘變獲得IAxl亞基突變體G330EEMS化學(xué)誘變可以產(chǎn)生較高頻率的點(diǎn)突變，而染色體畸變相對(duì)較少，可以對(duì)作物的某一種特殊性狀進(jìn)行改良。以純合的小偃54自交一粒傳種子為材料，種子室溫吸脹7小時(shí)后，采用O. 4%的EMS 18°C黑暗處理16個(gè)小時(shí)，然后水洗7小時(shí)，共誘變處理1000粒種子，最后得到475株可結(jié)實(shí)的Ml單株，自交后得到M2種子。每個(gè)Ml單株取10粒M2種子，采用SDS-PAGE分析HMW-GS的組成，從中發(fā)現(xiàn)了 I粒IAxl亞基遷移率變慢的突變體G330E，把該粒種子套袋自交繁殖后，得到了較多的突變材料。實(shí)施例2 G330E亞基編碼基因全長(zhǎng)序列的分子克隆和測(cè)序?yàn)榱说玫絀Axl亞基變大突變體G330E基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的IAxl亞基的核酸序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異擴(kuò)增IAxl亞基的引物AX-I -ATGACTAAGCGGTTGGTTCTT-和 AX-2 -TGCAGATAGTTCTATCACTGG-,以突變體種子的基因組DNA為模板用高保真的Tag酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了預(yù)期大小的約2. 5kb的特異的目的條帶，如圖I所示。將特異的擴(kuò)增條帶切膠后，采用凝膠回收試劑盒(Promega公司，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)回收純化。純化后的產(chǎn)物與PGEM-Teasy載體(Promega公司)連接，連接體系10μ 1，連接酶為T(mén)4-DNAligase(Promega公司)，4°C連接過(guò)夜，然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB的感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen公司)，37°C培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)后，得到陽(yáng)性克隆，采用質(zhì)粒提取試劑盒(北京博大泰克公司)提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA，并用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI酶切鑒定，酶切正確的克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。由于X型HMW-GS編碼基因的分子量較大，而且中間的重復(fù)序列較多，采用一般的引物步移法測(cè)序，很難拿到基因的全長(zhǎng)序列，因此我們采用如下方法首先從中挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆，以T7和SP6通用引物先進(jìn)行末端測(cè)序，序列比較確定為IAxl亞基后，然后用限制性?xún)?nèi)切酶Hindlll+BstXI雙酶切陽(yáng)性克隆，回收中間片段亞克隆到pEASY-blunt載體(北京全式金生物技術(shù)公司)上，再對(duì)中間片段進(jìn)行測(cè)序，最后得到亞基編碼基因的全序列。為了保證實(shí)驗(yàn)的客觀性，我們對(duì)該編碼基因進(jìn)行了 6次分子克隆。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示與野生型小偃54中的IAxl亞基相比，在989bp處核苷酸G突變?yōu)榱?A，從而導(dǎo)致推導(dǎo)的蛋白序列中第330位的氨基酸由甘氨酸(G)變?yōu)楣劝彼?E)，如表I所示。 表I. G330E編碼基因序列六次克隆與野生型IAxl亞基的比較結(jié)果
突變位點(diǎn)
野生型一突變型基因長(zhǎng)度(bp)
核酸序列(989bp) 氨基酸序列(330 AA)
IG^AG^E24962G—AG—E2496
3G—AG—E2496
4G—AG—E2496
5G—AG—E2496
6G—AG—E2496實(shí)施例3 G330E亞基成熟蛋白的體外表達(dá)X型HMW-GS的蛋白結(jié)構(gòu)顯示，前21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，蛋白正確折疊后，會(huì)被切除。為了得到與成熟種子中蛋白亞基G330E遷移率一致的體外表達(dá)蛋白，我們?cè)O(shè)計(jì)了一對(duì)表達(dá)引物Ax-NdeI -ACCCATATGGAAGGTGAGGCCTCTGGGCAACT- ;Ax_XhoI -CTCTCTCGAGTTACTGGCTGGCCAACAATGCGTC-。以上述實(shí)施例2中得到的正確克隆為模板，采用Clontech公司的高保真的Tag酶和GCbufTer I進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到除信號(hào)肽外的全長(zhǎng)序列，PCR片段回收純化后(采用Promega公司回收試劑盒),與PGEM-Teasy載體(Promega公司)連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DHlOB感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen公司)，挑選陽(yáng)性克隆采用實(shí)施例2中的技術(shù)進(jìn)行DNA測(cè)序。選取測(cè)序正確的克隆和原核表達(dá)載體PET-30a (Novagen公司)，分別用NdeI和XhoI (NEB公司)37°C酶切4小時(shí)，酶切產(chǎn)物凝膠回收后(Promega公司)，采用T4-DNAligase (Promega公司)16°C連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL-21感受態(tài)細(xì)胞(Merck公司),得到了 G330E的原核表達(dá)載體pET-30a-G330E(如圖2所示)。陽(yáng)性克隆接種5ml的LB培養(yǎng)基(含有50 μ g/ml卡那霉素，34 μ g/ml氯霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)，0D600值達(dá)到O. 5-0. 6時(shí)，加入終濃度ImM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后取I. 5ml菌體12000rpm離心IOmin 收集菌體蛋白。加入 120 μ I 蛋白裂解液(4% SDS, O. 125M(pH 6. 8) Tris-Hcl，30%甘油，5%巰基乙醇和O. 005%溴酚藍(lán))，100°C煮沸5min, 12000rpm離心IOmin,取10 μ I進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)果顯示G330E亞基的體外表達(dá)蛋白的遷移率與種子中的蛋白一致，均比野生型IAxl亞基遷移率慢(圖3)，這表明我們確實(shí)從小偃54突變體材料中拿到了 G330E亞基正確的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列。實(shí)施例4 G330E優(yōu)異等位變異與野生型小麥小偃54面粉品質(zhì)特性的測(cè)定為了得到與野生型遺傳背景一致，但只有IAxl亞基差異的純合G330E遺傳材料，我們用實(shí)施例I中得到的突變材料與野生型小偃54回交4代然后自交3代，獲得了 G330E的BC4F3純合種子。G330E BC4F3與小偃54純合的種子收獲并晾干后，采用BUHLER試驗(yàn)?zāi)グ凑誑Y/T1094. 1-2006的方法實(shí)驗(yàn)制粉。面粉制好以后，分別測(cè)定蛋白質(zhì)品質(zhì)、粉質(zhì)儀參數(shù)、拉伸儀參數(shù)和面包品質(zhì)，結(jié)果如表2所示。其中蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用PertOn7200型近 紅外分析儀，按照AACC 39-10方法測(cè)定；面粉濕面筋含量采用Pertonl500面筋儀，按GB/T14608-1993方法測(cè)定；Zeleny沉降值按NY/T1095-2006方法測(cè)定；面粉粉質(zhì)儀參數(shù)用Brebender公司生產(chǎn)的810106002型粉質(zhì)儀，按照GB/T14614-2006方法測(cè)定；面粉拉伸儀參數(shù)用Brebender公司生產(chǎn)的860033002型拉伸儀，按照GB/T14614-2006方法測(cè)定；面包烘焙品質(zhì)實(shí)驗(yàn)參照 AACC 10-09(1999)、AACC 10_10B(1999)和 GB/T 14612-2008 進(jìn)行。從表2可以明顯的看出G300E等位變異與野生型小偃54相比，面團(tuán)的形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間明顯變長(zhǎng)；而拉伸面積、抗延阻力、最大抗延阻力和延展性都得到很大的提高，并且達(dá)到了極顯著水平；烘烤的面包體積也明顯變大，較對(duì)照達(dá)到了顯著差異水平。由上可見(jiàn)G330E等位變異是一種優(yōu)異的等位變異，對(duì)近一步提高優(yōu)質(zhì)麥小偃54的品質(zhì)有著顯著的作用。表2. G330E優(yōu)異等位變異與野生型小偃54品質(zhì)性狀的分析
權(quán)利要求
1.一種HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDNO :2。
2.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求I所述HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其序列為SEQID NO :1。
4.一種表達(dá)載體,其包含權(quán)利要求2或3的多核苷酸。
5.權(quán)利要求I的HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白或權(quán)利要求2的多核苷酸在制作具有改良品質(zhì)的食品中的應(yīng)用。
6.一種獲得HMW-GS優(yōu)異等位變異蛋白的方法，其中包括用EMS處理小麥種子的步驟。
7.權(quán)利要求6的獲得HMW-GS優(yōu)異等位變異蛋白的方法，還包括測(cè)量IAxl亞基遷移率的步驟。
8.權(quán)利要求6或7的獲得HMW-GS優(yōu)異等位變異蛋白的方法，其中所述HMW-GS優(yōu)異等位變異蛋白為G330E蛋白。
9.一種小麥面粉，其含有權(quán)利要求I的HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白。
10.一種食品，其通過(guò)權(quán)利要求9的小麥面粉制作。
全文摘要
本發(fā)明涉及高分子量谷蛋白亞基優(yōu)異等位變異G330E的鑒定及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及氨基酸序列為SEQ ID NO2的HMW-GS優(yōu)異等位變異G330E蛋白、其獲得方法、其全長(zhǎng)編碼區(qū)序列及其應(yīng)用。本發(fā)明還測(cè)定了G330E對(duì)面粉加工品質(zhì)的影響作用，測(cè)定結(jié)果顯示G330E對(duì)面粉的加工品質(zhì)具有明顯的正向作用。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102863521SQ201110185720
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者王道文, 李義文, 安學(xué)麗, 劉昕, 秦?zé)ň?申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所