專利名稱：一種重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法及其在重組人胰島素下游純化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組人胰島素下游純化，更具體的，本發(fā)明涉及重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法及其在重組人胰島素下游純化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是僅次于腫瘤和心血管疾病的世界第三大致死疾病，現(xiàn)今世界上已經(jīng)有超過2億人的糖尿病患者，胰島素是治療糖尿病的特效藥，尤其是治療I型糖尿病和II型糖尿病晚期患者時(shí)還沒有其他的藥物能夠代替。胰島素在臨床應(yīng)用上已經(jīng)有80多年的歷史，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，重組人胰島素已經(jīng)逐漸取代了動(dòng)物胰島素。能夠在重組人胰島素生產(chǎn)中提高生產(chǎn)效率，提高產(chǎn)品質(zhì)量也就有了現(xiàn)實(shí)的意義。分離純化是基因工程藥物生產(chǎn)中極其重要的一環(huán)，在重組人胰島素的基因工程生產(chǎn)中同樣面臨著下游純化工藝處理復(fù)雜的問題，目前基因重組人胰島素的生產(chǎn)通常有兩種，一種是通過大腸桿菌表達(dá)胰島素原包含 體，純化經(jīng)過胰島素原純化，復(fù)性，酶切轉(zhuǎn)化，HPLC純化來得到最后的天然人胰島素。另外一種方式是通過酵母分泌表達(dá)胰島素原，純化過程首先是胰島素原純化，純化后利用胰蛋白酶轉(zhuǎn)肽，轉(zhuǎn)肽后去保護(hù)利用RP-HPLC純化得到最終的天然胰島素。胰島素原轉(zhuǎn)換成天然的胰島素，也就是轉(zhuǎn)肽過程已經(jīng)有很多報(bào)導(dǎo)，例如Chandrasekhar Gurramkonda等在文章中報(bào)導(dǎo)利用胰蛋白酶，叔丁醚蘇氨酸叔丁酯，和氯化鈣進(jìn)行轉(zhuǎn)肽，12度24小時(shí)反應(yīng)，轉(zhuǎn)肽率接近90% (Gurramkonda et al. Application of simple fed-batch technique to high-levelsecretory production of insulin precursor using Pichia pastoris with subsequentpurification and conversion to human insulin Microbial Cell Factories 2010,9 31)。但由于轉(zhuǎn)肽反應(yīng)比較復(fù)雜，時(shí)間比較長，通常轉(zhuǎn)肽過程會(huì)帶來一些難以去除的副產(chǎn)物，主要副產(chǎn)物是轉(zhuǎn)肽過程中酶切下來的Thr (B30)(胰島素B鏈上的第30個(gè)氨基酸蘇氨酸)，這樣就會(huì)增加胰島素純化的難度?，F(xiàn)有的重組人胰島素在分離純化過程中轉(zhuǎn)肽反應(yīng)時(shí)間長，副產(chǎn)物多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中重組人胰島素在分離純化過程中轉(zhuǎn)肽反應(yīng)時(shí)間長，副產(chǎn)物多的缺陷，提供一種轉(zhuǎn)肽反應(yīng)時(shí)間短，轉(zhuǎn)肽率高，副產(chǎn)物少的重組人胰島素下游純化方法。本發(fā)明一方面提供了一種重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法，為將純化的重組人胰島素原經(jīng)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)生成重組人胰島素，其中，所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)體系包括重組人胰島素原10-30g/L，二甲基亞砜(DMSO) 100-200ml/L、叔丁醚蘇氨酸叔丁酯 63_103g/L、1，4- 丁二醇600-800ml/L、胰蛋白酶2-6g/L、Ca2+0. 2-100mmol/l 優(yōu)選2-10mmol/l、Mg2+0. 2-100mmol/l 優(yōu)選2-lOmmol/l和水，pH為6. 5-7. O ;所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度27_47°C，最適溫度為37°C，攪拌反應(yīng)2-10小時(shí)，較佳為2-5小時(shí)。
本發(fā)明的關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)肽條件的優(yōu)化，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，2價(jià)金屬離子鎂離子與鈣離子的復(fù)合作用能夠提高了胰蛋白酶的酶切反應(yīng)速度和專一性，大大縮短轉(zhuǎn)肽時(shí)間，轉(zhuǎn)肽時(shí)間縮短到2個(gè)小時(shí)以內(nèi)，轉(zhuǎn)肽的副產(chǎn)物(主要為Thr(B30))的相對(duì)減少，這樣可以提高重組人胰島素生產(chǎn)的效率和胰島素的質(zhì)量。在本發(fā)明所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)體系中，所述的水為超純水。超純水是指將水中的導(dǎo)電介質(zhì)幾乎完全去除，又將水中不離解的膠體物質(zhì)、氣體及有機(jī)物均去除至很低程度的水，電阻率大于18MQ*cm，或接近18. 3MQ*cm極限值。
在本發(fā)明所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)體系中，Ca2+和Mg2+可來源于鈣或鎂的無機(jī)鹽(如氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸鈣)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)肽方法可應(yīng)用于酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素的下游純化。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種重組人胰島素的下游純化方法，包括下列步驟I)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化重組人胰島素原；2)利用前述轉(zhuǎn)肽方法將純化的重組人胰島素原經(jīng)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)獲得轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物；3)轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物經(jīng)脫脂反應(yīng)去除叔丁醚蘇氨酸叔丁酯保護(hù)基團(tuán)后純化得到胰島素成品;本發(fā)明的步驟I)及步驟3)均可利用現(xiàn)有技術(shù)完成。步驟I)中，所述發(fā)酵產(chǎn)物為分泌表達(dá)重組人胰島素原的酵母工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物，如分泌表達(dá)胰島素原的畢赤酵母的發(fā)酵產(chǎn)物。分泌表達(dá)重組人胰島素原的酵母工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵均為現(xiàn)有技術(shù)。較佳的，步驟I)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化重組人胰島素原的方法包括下列步驟A.將發(fā)酵產(chǎn)物離心收集上清；B.陽離子交換層析純化重組人胰島素原；C.將經(jīng)步驟B純化的產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠層析脫鹽獲得純化的重組人胰島素原。進(jìn)一步的，陽離子交換層析采用SP陽離子交換層析柱；葡聚糖凝膠層析采用G25凝膠層析柱。較佳的，步驟3)所述轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物脫脂反應(yīng)去除叔丁醚蘇氨酸叔丁酯保護(hù)基團(tuán)后純化得到胰島素成品包括下列步驟I、轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物用反相柱層析純化；II、將步驟I獲得的純化產(chǎn)物凍干后采用三氟乙酸(TFA)與轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物反應(yīng)脫脂去除叔丁醚蘇氨酸叔丁酯保護(hù)基團(tuán)；III、脫脂產(chǎn)物凍干后，再經(jīng)反相柱層析純化得到胰島素成品。所述反相柱層析可采用C18反相制備柱進(jìn)行HPLC純化。所述胰島素成品具有天然胰島素的結(jié)構(gòu)和功能。進(jìn)一步的，純化后的胰島素成品還可進(jìn)一步凍干以獲得胰島素凍干粉?，F(xiàn)有的重組人胰島素生產(chǎn)技術(shù)在轉(zhuǎn)肽過程中時(shí)間一般較長，文獻(xiàn)報(bào)道中未發(fā)現(xiàn)有低于8個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，而且一般的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)都未考慮過副產(chǎn)物Thr (B30)的產(chǎn)生，而該副產(chǎn)物在一般的純化過程難以除去，與天然的胰島素不同，對(duì)人體用藥可能會(huì)有未知的影響。本發(fā)明的純化方法，通過轉(zhuǎn)肽過程中加入二價(jià)金屬離子鈣和鎂復(fù)合作用不僅縮短了轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的時(shí)間，從10小時(shí)縮短到2小時(shí)，提高了生產(chǎn)效率，而且還能減少副產(chǎn)物Thr (B30)的產(chǎn)生，解決了現(xiàn)有重組人胰島素生產(chǎn)中轉(zhuǎn)肽反應(yīng)時(shí)間長，副產(chǎn)物多的缺點(diǎn)。


圖I本發(fā)明純化重組人胰島素的工藝流程2實(shí)施例I轉(zhuǎn)肽前HPLC監(jiān)測圖譜 圖3實(shí)施例I轉(zhuǎn)肽2小時(shí)后HPLC監(jiān)測圖譜圖4實(shí)施例I沒有添加鈣、鎂離子的轉(zhuǎn)肽分析圖譜圖5實(shí)施例1F3峰液相檢測結(jié)果圖6實(shí)施例I脫酯反應(yīng)檢測圖譜
具體實(shí)施例方式以下列舉具體實(shí)施例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明實(shí)施例采用的胰島素純化工藝主要物料來源出自畢赤酵母分泌表達(dá)胰島素原，對(duì)胰島素原純化后優(yōu)化了轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，轉(zhuǎn)肽過程中添加了二價(jià)金屬離子鎂離子與鈣離子共同作用提高了胰蛋白酶的酶切反應(yīng)速度和專一性，轉(zhuǎn)肽時(shí)間大大縮短，減少了副產(chǎn)物產(chǎn)生，之后繼續(xù)利用RP-HPLC純化天然胰島素，得到合格的胰島素產(chǎn)品。實(shí)施例純化重組人胰島素的工藝流程圖如圖I所示。實(shí)施例I重組人胰島素的純化工藝步驟A，SP陽離子交換層析純化畢赤酵母表達(dá)的胰島素原重組人胰島素原酵母發(fā)酵液4升(參考Kjeldsen T, Pettersson AF, Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris.Biotechnol Appl Biochem 1999，29 :79-86 記載的方法制備獲得)，7000RPM 離心后收集上清液。SP Sepharose FF (GE公司購買)裝柱XK50/30層析柱200毫升，首先SP柱經(jīng)過25mmol醋酸-醋酸納PH3. 5緩沖液平衡5個(gè)柱體積，平衡后調(diào)節(jié)離心上清液PH至3. 5上樣，上樣結(jié)束后，利用平衡液清洗柱子到基線，大概3個(gè)柱體積。洗脫采用pH7. 4的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液且添加IM氯化納洗脫，收集洗脫峰大約150毫升即為胰島素原，準(zhǔn)備下一步脫鹽。B, G25脫鹽層析G25凝膠(GE公司)50ml裝填26 X 10柱，先用去離子水洗滌5倍柱體積，后用I. OMNaOH洗滌兩個(gè)柱體積，再用去離子水洗滌5倍柱體積，最后用O. IM碳酸氫銨溶液(pH8. O)平衡5個(gè)柱體積。SP洗脫液上樣G25脫鹽柱，上樣量10毫升，多次上樣收集洗脫峰。C，轉(zhuǎn)肽反應(yīng)稱取脫鹽后的胰島素原200mg,依次加入I. 5ml 二甲基亞砜(DMSO)、叔丁醚蘇氨酸叔丁酯O. 83g、l,4-丁二醇7ml、胰蛋白酶40mg,2. 2mg無水氯化隹丐(2mmol/l)和I. 9mg無水氯化鎂(2mmol/l)調(diào)節(jié)pH6. 5-7. 0，用超純水定容至10ml，在小燒杯中利用攪拌子低速攪拌，37度下反應(yīng)2h,反應(yīng)結(jié)束后8000rpm,離心5min。轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物經(jīng)過HPLC分析發(fā)現(xiàn)2小時(shí)后轉(zhuǎn)肽基本完成，轉(zhuǎn)肽率超過90%。
轉(zhuǎn)肽分析的條件和結(jié)果如下分析型HPLC監(jiān)測轉(zhuǎn)肽反應(yīng)A相0· 15% TFA+超純水。超聲脫氣20min。B相0. 125% TFA+60%乙腈+超純水。超聲脫氣20min。上樣量皆為10 μ 1，檢測波長為280nm，柱溫30°C。
權(quán)利要求
1.一種重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法，為將純化的重組人胰島素原經(jīng)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)生成重組人胰島素，其特征在于，所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)體系包括重組人胰島素原10-30g/L、二甲基亞砜(DMS0) 100-200ml/L、叔丁醚蘇氨酸叔丁酯 63-103g/L、l，4-丁二醇 600-800ml/L、胰蛋白酶 2-6g/L、Ca2+0. 2-100mmol/l,Mg2+O. 2-100mmol/l 和水，pH 為 6· 5-7. O ;所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度27-47°C，攪拌反應(yīng)2-10小時(shí)。
2.如權(quán)利要求I所述重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)體系中，Ca2+ 為 2-10mmol/l、Mg2+ 為 2-1 Ommol / I。
3.如權(quán)利要求I所述重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的溫度為37。。。
4.如權(quán)利要求I所述重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的時(shí)間為2-5小時(shí)。
5.如權(quán)利要求I所述重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法，其特征在于，所述Ca2+來源于氯化鈣或硫酸鈣，所述Mg2+來源于氯化鎂或硫酸鎂。
6.如權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法的用途，為將所述轉(zhuǎn)肽方法應(yīng)用于酵母發(fā)酵生產(chǎn)的重組人胰島素的下游純化。
7.一種重組人胰島素的下游純化方法，包括下列步驟 1)從分泌表達(dá)重組人胰島素原的酵母發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化重組人胰島素原； 2)利用權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法將純化的重組人胰島素原經(jīng)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)獲得轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物； 3)轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物經(jīng)脫脂反應(yīng)去除叔丁醚蘇氨酸叔丁酯保護(hù)基團(tuán)后純化得到胰島素成品；
8.如權(quán)利要求7所述重組人胰島素的下游純化方法，其特征在于，步驟I)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化重組人胰島素原的方法包括下列步驟 A.將發(fā)酵產(chǎn)物離心收集上清； B.陽離子交換層析純化重組人胰島素原； C.將經(jīng)步驟B純化的產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠層析脫鹽獲得純化的重組人胰島素原；
9.如權(quán)利要求7所述重組人胰島素的下游純化方法，其特征在于，步驟3)所述轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物脫脂反應(yīng)去除叔丁醚蘇氨酸叔丁酯保護(hù)基團(tuán)后純化得到胰島素成品包括下列步驟 I、轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物用反相柱層析純化； II、將步驟I獲得的純化產(chǎn)物凍干后采用三氟乙酸(TFA)與轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物反應(yīng)脫脂去除叔丁醚蘇氨酸叔丁酯保護(hù)基團(tuán)； III、脫脂產(chǎn)物凍干后，再經(jīng)反相柱層析純化得到胰島素成品。
10.如權(quán)利要求7所述重組人胰島素的下游純化方法，其特征在于，將步驟3)獲得的胰島素成品經(jīng)凍干獲得胰島素凍干粉。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法及其在重組人胰島素下游純化中的應(yīng)用，本發(fā)明的重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法為將純化的重組人胰島素原經(jīng)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)生成重組人胰島素，其中，轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)體系包括重組人胰島素原10-30g/L、二甲基亞砜(DMSO)100-200ml/L、叔丁醚蘇氨酸叔丁酯63-103g/L、1,4-丁二醇600-800ml/L、胰蛋白酶2-6g/L、Ca2+0.2-100mmol/l、Mg2+0.2-100mmol/l和水,pH為6.5-7.0；轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度27-47℃，攪拌反應(yīng)2-10小時(shí)。本發(fā)明的重組人胰島素原轉(zhuǎn)肽方法可用于重組人胰島素的下游純化。本發(fā)明的轉(zhuǎn)肽方法不僅縮短了轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的時(shí)間、提高了生產(chǎn)效率，還能減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102864198SQ20111018694
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者郭頎然, 許必雄 申請(qǐng)人:上海泰龍生物醫(yī)藥科技有限公司