專利名稱:一種制備山荷葉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于中藥有效活性成分提取制備領(lǐng)域,涉及一種制備山荷葉素的方法。
背景技術(shù):
山荷葉素(diphyllin)是近期所發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤活性的新結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物,分子式=C21H16O7,分子量380. 353,屬于4-苯代-2,3-萘內(nèi)酯類。主要從爵床科、小檗科、蕓香科等多種植物中提取分離得到。藥理研究表明,Diphyllin具有較好的抗腫瘤活性,對(duì)于人鼻咽癌細(xì)胞(KB)的Ε050<3μπιΟ1/ιΛ。研究發(fā)現(xiàn)Diphyllin類化合物能夠作用于細(xì)胞分裂周期的S期,Gl期,使細(xì)胞分裂停留在Gl期,對(duì)于S期有很強(qiáng)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明,用于 HCTl 16細(xì)胞時(shí),在24小時(shí)內(nèi),能夠使S期的細(xì)胞的比率從70%下降到41 %,而使Gl期細(xì)胞所占比重由21%增加到42%,對(duì)MCF-7細(xì)胞也有類似的結(jié)果。Diphyllin類化合物具有廣泛的生理活性,已引起許多藥學(xué)家、化學(xué)家的廣泛關(guān)注。國內(nèi)有關(guān)制備山荷葉素的方法報(bào)道較少,張永利采用醇提、溶劑萃取及各種柱色譜反復(fù)分離純化得到各單體成分,操作繁瑣、樣品損失嚴(yán)重,不適合工業(yè)生產(chǎn)制備。中國專利(申請(qǐng)?zhí)?01010535341.0)公開了一種乙醇熱回流、乙酸乙酯-水混合溶劑多級(jí)逆流萃取、大孔樹脂柱層析、丙酮結(jié)晶的方法制備山荷葉素,該方法萃取率低、工藝不穩(wěn)定?,F(xiàn)有技術(shù)中,尚無采用高速逆流色譜法分離純化山荷葉素的工藝報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用凝膠柱色譜和高速逆流色譜技術(shù)結(jié)合的方法分離制備山荷葉素,該方法制備量大、生產(chǎn)周期短、工藝穩(wěn)定、溶劑消耗少、產(chǎn)品純度高。為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用下列技術(shù)方案
取南方山荷葉或爵床的醇提物用95%乙醇溶解后上凝膠柱層析,收集含山荷葉素的流分,回收溶劑得山荷葉素粗提物,將山荷葉素粗提物用高速逆流色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離純化, 最終得到高純度的山荷葉素單體成分。所述南方山荷葉或爵床的醇提物是以乙醇或甲醇為溶媒,采用加熱回流、超聲、微波等常用的現(xiàn)有技術(shù)提取得到的醇提物。所述凝膠柱層析洗脫條件為二氯甲烷-甲醇10:1-2:1梯度洗脫。高速逆流色譜分離的溶劑體系為烷烴_脂肪酸酯_脂肪醇_水組成的溶劑體系, 其中烷烴是正己烷、正庚烷或石油醚,脂肪酸值是乙酸乙酯,脂肪醇是甲醇或乙醇,其配比為 1 :(0· 4-0.9) 1 (0. 4-0. 9),以下相為流動(dòng)相。采用本發(fā)明方法制備山荷葉素,制備量大、生產(chǎn)周期短、工藝穩(wěn)定、溶劑消耗少、產(chǎn)品純度高。下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述,但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:
取南方山荷葉醇提物用95%乙醇溶解,上S印hadex LH-20凝膠柱層析,并用二氯甲烷-甲醇混合溶劑梯度洗脫,即用二氯甲烷-甲醇體積比分別為10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶劑進(jìn)行洗脫,收集含有山荷葉素的洗脫部分減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,得濃縮液,然后采用高速逆流色譜分離濃縮液,在室溫下將溶劑系統(tǒng)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水按體積比1:0. 5:1:0. 7置于分液漏斗中振搖,放置,分別取上、下相,將上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相,將固定相泵入色譜柱中,使柱中充滿固定相后,再讓儀器以SOOrpm轉(zhuǎn)動(dòng),同時(shí)將流動(dòng)相以2. 3ml/min的流速泵入,待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后, 將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中,同時(shí)在出液端接紫外檢測(cè)器,在215nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測(cè),與山荷葉素標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng),收集并蒸除溶劑,干燥,得產(chǎn)品,經(jīng)HPLC檢測(cè),其純度為 97. 5%ο實(shí)施例2:
取南方山荷葉醇提物用95%乙醇溶解,上S印hadex LH-20凝膠柱層析,并用二氯甲烷-甲醇混合溶劑梯度洗脫,即用二氯甲烷-甲醇體積比分別為10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶劑進(jìn)行洗脫,收集含有山荷葉素的洗脫部分減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,得濃縮液,然后采用高速逆流色譜分離濃縮液,在室溫下將溶劑系統(tǒng)正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水按體積比1:0. 7:1:0. 7置于分液漏斗中振搖,放置,分別取上、下相,將上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相,將固定相泵入色譜柱中,使柱中充滿固定相后,再讓儀器以SOOrpm轉(zhuǎn)動(dòng),同時(shí)將流動(dòng)相以1. 8ml/min的流速泵入,待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后, 將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中,同時(shí)在出液端接紫外檢測(cè)器,在215nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測(cè),與山荷葉素標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng),收集并蒸除溶劑,干燥,得產(chǎn)品,經(jīng)HPLC檢測(cè),其純度為 97. 7%ο實(shí)施例3:
取南方山荷葉醇提物用95%乙醇溶解,上S印hadex LH-20凝膠柱層析,并用二氯甲烷-甲醇混合溶劑梯度洗脫,即用二氯甲烷-甲醇體積比分別為10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶劑進(jìn)行洗脫,收集含有山荷葉素的洗脫部分減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,得濃縮液,然后采用高速逆流色譜分離濃縮液,在室溫下將溶劑系統(tǒng)正庚烷_乙酸乙酯_乙醇_水按體積比1:0. 6:1:0. 9置于分液漏斗中振搖,放置,分別取上、下相,將上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相,將固定相泵入色譜柱中,使柱中充滿固定相后,再讓儀器以850rpm轉(zhuǎn)動(dòng),同時(shí)將流動(dòng)相以2. 5ml/min的流速泵入,待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后, 將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中,同時(shí)在出液端接紫外檢測(cè)器,在215nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測(cè),與山荷葉素標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng),收集并蒸除溶劑,干燥,得產(chǎn)品,經(jīng)HPLC檢測(cè),其純度為 97. 3%ο實(shí)施例4:
取南方山荷葉醇提物用95%乙醇溶解,上S印hadex LH-20凝膠柱層析,并用二氯甲烷-甲醇混合溶劑梯度洗脫,即用二氯甲烷-甲醇體積比分別為10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶劑進(jìn)行洗脫,收集含有山荷葉素的洗脫部分減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,得濃縮液,然后采用高速逆流色譜分離濃縮液,在室溫下將溶劑系統(tǒng)正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水按體積比1:0. 4:1:0. 4置于分液漏斗中振搖,放置,分別取上、下相,將上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相,將固定相泵入色譜柱中,使柱中充滿固定相后,再讓儀器以850rpm轉(zhuǎn)動(dòng),同時(shí)將流動(dòng)相以3. Oml/min的流速泵入,待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后, 將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中,同時(shí)在出液端接紫外檢測(cè)器,在215nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測(cè),與山荷葉素標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng),收集并蒸除溶劑,干燥,得產(chǎn)品,經(jīng)HPLC檢測(cè),其純度為 97. 4%ο 實(shí)施例5:
取南方山荷葉醇提物用95%乙醇溶解,上S印hadex LH-20凝膠柱層析,并用二氯甲烷-甲醇混合溶劑梯度洗脫,即用二氯甲烷-甲醇體積比分別為10:1、8:11、6:1、4:1、2:1 的混合溶劑進(jìn)行洗脫,收集含有山荷葉素的洗脫部分減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,得濃縮液,然后采用高速逆流色譜分離濃縮液,在室溫下將溶劑系統(tǒng)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水按體積比1:0. 8:1:0. 8置于分液漏斗中振搖,放置,分別取上、下相,將上相作為固定相,下相作為流動(dòng)相,將固定相泵入色譜柱中,使柱中充滿固定相后,再讓儀器以SOOrpm轉(zhuǎn)動(dòng),同時(shí)將流動(dòng)相以2. 2ml/min的流速泵入,待流動(dòng)相從出液端流出且兩相在色譜中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后, 將樣品溶液注入色譜系統(tǒng)中,同時(shí)在出液端接紫外檢測(cè)器,在215nm波長處對(duì)流出液連續(xù)檢測(cè),與山荷葉素標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng),收集并蒸除溶劑,干燥,得產(chǎn)品,經(jīng)HPLC檢測(cè),其純度為 97. 2%ο
權(quán)利要求
1.一種制備山荷葉素的方法,其特征在于包括以下步驟取南方山荷葉或爵床的醇提物用95%乙醇溶解后上凝膠柱層析,收集含山荷葉素的流分,回收溶劑得山荷葉素粗提物, 將山荷葉素粗提物用高速逆流色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離純化,最終得到高純度的山荷葉素單體成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備山荷葉素的方法,其特征在于所述南方山荷葉或爵床的醇提物是以乙醇或甲醇為溶媒,采用加熱回流、超聲、微波等常用的現(xiàn)有技術(shù)提取得到的醇提物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備山荷葉素的方法,其特征在于所述凝膠柱層析洗脫條件為二氯甲烷-甲醇10:1-2:1梯度洗脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備山荷葉素的方法,其特征在于高速逆流色譜分離的溶劑體系為烷烴-脂肪酸酯-脂肪醇-水組成的溶劑體系,其中烷烴是正己烷、正庚烷或石油醚,脂肪酸值是乙酸乙酯,脂肪醇是甲醇或乙醇,其配比為1 :(0. 4-0.9) 1 (0. 4-0. 9),以下相為流動(dòng)相。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備山荷葉素的方法。采用凝膠柱層析和高速逆流色譜法相結(jié)合,從南方山荷葉或爵床的醇提物中分離制備山荷葉素。該方法得到的山荷葉素含量可達(dá)97%以上,具有制備量大、溶劑消耗少、產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07D407/04GK102304123SQ20111018792
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者劉東鋒, 郭琴 申請(qǐng)人:南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司