專利名稱：一種含有NAD⁺或NADH的穩(wěn)定的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及了一種含有NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，以及增加NAD+或NADH穩(wěn)定性的方法。
背景技術(shù)：
煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,簡稱為 NAD),是一種轉(zhuǎn)遞電子的輔酶，它出現(xiàn)在細(xì)胞很多新陳代謝反應(yīng)中。NADH是它的還原形式。NAD是脫氫酶的輔酶，如乙醇脫氫酶(ADH)，用于氧化乙醇。它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。中間產(chǎn)物會(huì)將脫下的氫遞給NAD，使之成為NADH。而NADH則會(huì)作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學(xué)滲透偶聯(lián)的方式，合成ATP。
在吸光方面，NADH在260nm和340nm處各有一吸收峰，而NAD則只有260nm —處吸收峰，這是區(qū)別兩者的重要屬性。這同時(shí)也是很多代謝試驗(yàn)中，測量代謝率的物理依據(jù)。NAD在260nm的吸光系數(shù)為I. 78X IOL /(moI .cm)，而NADH在340nm的吸光系數(shù)為6. 2X IOL/(mo I · cm)。NAD在體外診斷試劑配方上有很多應(yīng)用比如乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶試齊U、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素試劑盒、α-羥丁酸脫氫酶等。因此本保護(hù)劑有較廣泛的應(yīng)用。NAD和NADH輔酶是不穩(wěn)定的。NAD是堿不穩(wěn)定的分子，還原形式的NADH對酸不穩(wěn)定，如差向異構(gòu)化是已知的降解途徑。在現(xiàn)有技術(shù)中，穩(wěn)定NAD和NADH的手段有(1)如CN200680027359. I所公開的(
公開日2008-07-30)，通過制備衍生物的方法使之穩(wěn)定，或?qū)Υ姝h(huán)境的特殊要求，如冷卻或者干燥儲存增加其穩(wěn)定性。(2)如CN200680027359. I所公開的(
公開日2008-07-30)，采用穩(wěn)定劑，如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白形成聚合物網(wǎng)絡(luò)而增加NAD或NADH的穩(wěn)定性。(3)如CN87100939所公開的(
公開日1987-11-04)，以堿性水溶液環(huán)境、多羥基烷基溶劑(20-90%V/V)如丙二醇、硼酸增加其穩(wěn)定性。(4)如CN200410043900. O所公開的(
公開日2005-05-18)，采用表面活性劑如O. I 2ml吐溫-20增加其穩(wěn)定性。發(fā)明人注意到，即使在并不劇烈的條件下(比如含水溶液中)，輔酶NAD和NADH僅僅通過環(huán)境濕度進(jìn)行水解也會(huì)導(dǎo)致測量結(jié)果不精確。因此，發(fā)明人意識到提高NAD+和NADH在體外溶解狀態(tài)時(shí)的穩(wěn)定性將對提高測量結(jié)果的精確性具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，本發(fā)明組合物可提高NAD+和NADH在體外溶解狀態(tài)時(shí)的穩(wěn)定性。本發(fā)明的另一目的在于提供一種穩(wěn)定NAD+或NADH的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含海藻糖、甘油、緩沖液和表面活性劑的組合物及其用途，即用于增加NAD+或NADH的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)通過使用將海藻糖、甘油、緩沖液、表面活性劑混合組成一定的溶液，然后再將NAD+和/或NADH溶解其中。上述物質(zhì)組合在本發(fā)明中稱為穩(wěn)定劑，通過研究發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高溶解狀態(tài)的NAD+和/或NADH的穩(wěn)定性。具體來說，本發(fā)明含有NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物包括NAD+或NADH以及所述的穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包括海藻糖、甘油、緩沖液和表面活性劑。NAD+或NADH在組合物中的含量為 3-40g/l。本發(fā)明通過使用穩(wěn)定劑提高NAD+和/或NADH在溶解狀態(tài)的穩(wěn)定性，穩(wěn)定劑可以由以下物質(zhì)按照不同比例組合
(I)海藻糖，含量為10g/l 60 g/Ι，進(jìn)一步優(yōu)選為30g/l 40 g/1。(2)甘油含量為5g/l 30g/l，進(jìn)一步優(yōu)選為15g/l 20g/l。 (3)緩沖液可為tris鹽緩沖液、goods鹽緩沖液、磷酸鹽緩鹽沖液、碳酸鹽緩沖液或這些緩沖液的組合。所述Tris緩沖液中，Tris的含量為50mmol/l 100mmol/l。所述磷酸鹽緩沖液中磷元素的含量為50mmol/l lmol/1。(4)表面活性劑可為吐溫20、吐溫80、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、SDS或者這幾種物質(zhì)的混合物，其中，所述吐溫20含量為llg/Ι 10g/l，吐溫80含量為lg/Ι 10g/l，聚氧乙烯月桂醚含量為lg/Ι 10g/l。聚乙二醇含量為lOmmol/1 500mmol/l，SDS含量為 lg/Ι 10g/lo如上所述的穩(wěn)定劑用于增加NAD+或NADH穩(wěn)定性的用途。所述穩(wěn)定劑可用于乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶試劑、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素試劑盒的配制。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種穩(wěn)定NAD+或NADH的方法，包括將NAD+或NADH溶解于含有海藻糖、甘油、緩沖液、表面活性劑的溶液中。所述溶液中，海藻糖含量為10g/l 60 g/I，甘油含量為5g/l 30g/l，緩沖液可為tris鹽緩沖液、goods鹽緩沖液、磷酸鹽緩鹽沖液、碳酸鹽緩沖液或這些緩沖液的組合，所述Tris緩沖液中，Tris的含量為50mmol/l lOOmmol/1，所述磷酸鹽緩沖液中磷元素的含量為50mmol/l lmol/1 ;表面活性劑可為吐溫20、吐溫80、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、SDS或者這幾種物質(zhì)的混合物，其中，所述吐溫20含量為llg/Ι 10g/l，吐溫80含量為lg/Ι 10g/l，聚氧乙烯月桂醚含量為lg/Ι 10g/l。聚乙二醇含量為 10mmol/l SOOmmol / I, SDS 含量為 lg/Ι 10g/l。本發(fā)明通過將海藻糖、甘油、緩沖液、表面活性劑應(yīng)用于提高NAD+或NADH的穩(wěn)定性，顯著提高了 NAD+和NADH在體外溶解狀態(tài)時(shí)的穩(wěn)定性，在常規(guī)的儲存條件下保持期可達(dá)到十八個(gè)月。發(fā)明人通過對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未采用本穩(wěn)定劑時(shí)，在相同儲存條件下保持期一般為十二個(gè)月。本發(fā)明可以應(yīng)用到乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶試劑、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試齊U、尿素試劑盒、α -羥丁酸脫氫酶等試劑盒的配制過程，因此具有較廣的應(yīng)用價(jià)值。以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，具體實(shí)施方式
僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
本發(fā)明在乳酸脫氫酶試劑盒中的應(yīng)用首先配制試劑盒試劑I :乳酸40mmol/l, 100mmol/l Tris溶液,使用lmol/1鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9. 2。再配制試劑盒試劑2 :含有海藻糖10g/l，甘油lg/1，Tris O. lmol/1，吐溫20
O.lg/Ι的溶液,然后使用lmol/1鹽酸或氫氧化鈉將其pH調(diào)至7. O,再稱取若干NAD+溶解到IOml上述保護(hù)劑中，使其濃度達(dá)到20g/l，攪拌 均勻。上述試劑I和試劑2組成乳酸脫氫酶試劑盒，本試劑盒在2 8 °C保持期可達(dá)到十八個(gè)月。通過對比試驗(yàn)，未加穩(wěn)定劑的乳酸脫氫酶試劑盒在相同條件下僅可保持十二個(gè)月。實(shí)施例2
本發(fā)明在在α-羥丁酸脫氫酶試劑盒的應(yīng)用
首先配制試劑盒試劑I :含有海藻糖5g/l，甘油10g/l ,Tris O. lmol/1，吐溫20 O. 5g/I的溶液，然后將其PH調(diào)至7. 0，再稱取IOmg NAD溶解到IOml上述保護(hù)劑中，攪拌均勻。再配制試劑盒試劑2 :硝酸50mmol/l溶液，α -氧絡(luò)丁酸3mmol/l。調(diào)節(jié)pH至
7.5。上述試劑I和試劑2組成α -羥丁酸脫氫酶試劑盒，本試劑盒在2 8°C保持期可達(dá)到十八個(gè)月。通過對比試驗(yàn)，未加穩(wěn)定劑的乳酸脫氫酶試劑盒在相同條件下僅可保持十二個(gè)月。
權(quán)利要求
1.含有NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，含有NAD+或NADH以及穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包括海藻糖、甘油、緩沖液、表面活性劑。
2.如權(quán)利要求I所述的含有NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，所述海藻糖含量為 10g/l 60 g/1。
3.如權(quán)利要求I所述NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，所述甘油含量為5g/I 30g/l。
4.如權(quán)利要求I所述NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，所述緩沖液可為Tris緩沖液、goods鹽緩沖液、磷酸鹽緩鹽沖液、碳酸鹽緩沖液或這些緩沖液的組合。
5.如權(quán)利要求4所述的NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，所述Tris緩沖液中，Tris 的含量為 SOmmol/ I 100mmol/l。
6.如權(quán)利要求4所述的NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液中磷元素的含量為50mmol/l lmol/1。
7.如權(quán)利要求I所述的NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，所述表面活性劑可為吐溫20、吐溫80、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、SDS或者這幾種物質(zhì)的混合物，其中，所述吐溫20含量為llg/Ι 10g/l，吐溫80含量為lg/Ι 10g/l，聚氧乙烯月桂醚含量為Ig/I 10g/l，聚乙二醇含量為 10mmol/l SOOmmol/ I, SDS 含量為 lg/Ι 10g/l。
8.如權(quán)利要求I所述的NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，所述pH值為5.0_7· O ο
9.如權(quán)利要求I所述的NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，其特征在于，所述穩(wěn)定劑包括海藻糖，含量為10g/l 60 g/Ι ;甘油，含量為5g/l 30g/l ；Tris鹽緩沖液，以Tris的含量計(jì)，為50mmol/l 100mmol/l ;吐溫20，含量為llg/Ι 10g/l。
10.如權(quán)利要求I至9任一所述的穩(wěn)定劑的用途，其特征在于，用于增加NAD+或NADH穩(wěn)定性的用途。
11.如權(quán)利要求I至9任一所述的穩(wěn)定劑的用途，其特征在于，所述穩(wěn)定劑用于乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶試劑、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素試劑盒的配制。
12.一種穩(wěn)定NAD+或NADH的方法，其特征在于，將NAD+或NADH溶解于含有海藻糖、甘油、緩沖液和表面活性劑的混合溶液中，混合溶液的PH為5. 0-7. O。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述溶液中，海藻糖含量為10g/l 60g/Ι，甘油含量為5g/l 30g/l，緩沖液可為Tris鹽緩沖液、goods鹽緩沖液、磷酸鹽緩鹽沖液、碳酸鹽緩沖液或這些緩沖液的組合，所述Tris緩沖液中，Tris的含量為50mmol/l lOOmmol/1，所述磷酸鹽緩沖液中磷元素的含量為50mmol/l lmol/1 ;表面活性劑可為吐溫20、吐溫80、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、SDS或者這幾種物質(zhì)的混合物，其中，所述吐溫20含量為llg/Ι 10g/l，吐溫80含量為lg/Ι 10g/l，聚氧乙烯月桂醚含量為lg/Ι 10g/l，聚乙二醇含量為 10mmol / I SOOmmol / I , SDS 含量為 I g/Ι 10g/l。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有NAD+或NADH的穩(wěn)定的組合物，可使NAD+和NADH長期穩(wěn)定保持其生物活性。本發(fā)明通過使用包括海藻糖、甘油、緩沖液、表面活性劑的穩(wěn)定劑而提高NAD+和NADH溶解狀態(tài)穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供一種穩(wěn)定NAD+或NADH的方法，以及提供海藻糖、甘油、緩沖液、表面活性劑和PH值調(diào)整劑組合物用于增加NAD+或NADH的穩(wěn)定性的用途。本發(fā)明可用于乳酸脫氫酶試劑、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶試劑、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素試劑盒等，具有廣泛的用途。
文檔編號C07H21/02GK102863495SQ201110188028
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者王輝, 王軍峰, 吳靜, 孟菲, 王宇飛 申請人:上海執(zhí)誠生物科技股份有限公司