專利名稱：一種硫酸粘桿菌素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及多肽類抗生素的制備，具體是一種硫酸粘桿菌素的制備方法。
背景技術(shù)：
粘桿菌素(colistin)是一種對(duì)多重耐藥性革蘭氏陰性致病菌(如銅綠假單胞菌， Pseudomonas ae/T^i/^m )具有特效抗性的多肽類抗生素，粘桿菌素含有二氨基丁酸，存在游離氨基，因此呈堿性，在臨床上常制成鹽使用，目前商品化以兩種形式存在，硫酸粘桿菌素(colistin sulphate，CS)是其中一種形式。硫酸粘桿菌素可用于豬、禽、牛和羊等動(dòng)物， 由于其抗菌作用強(qiáng)、殘留低，不易產(chǎn)生耐藥性，中國、美國、歐盟和日本等許多國家批準(zhǔn)作為飼料添加劑或獸藥?？芍委煻喾N病菌引起的動(dòng)物飼養(yǎng)疾病，并能促進(jìn)動(dòng)物生物和提高飼料的利用率。目前從發(fā)酵液中分離粘桿菌素主要有離子交換法、泡沫分離法。采用離子交換法，此方法分離步驟長、設(shè)備多、收率低，而且?guī)泶罅繌U水，嚴(yán)重污染環(huán)境；采用泡沫分離法分離硫酸粘桿菌素，中國專利申請(qǐng)?zhí)?00510122187. 3發(fā)明公開了一種泡沫分離法制備硫酸粘桿菌素的方法，在起泡過程中，其他肽類物質(zhì)和蛋白會(huì)跟產(chǎn)品同時(shí)起泡，帶入產(chǎn)品中，影響產(chǎn)品純度，專一性不強(qiáng)，而且起泡用到溶劑，給環(huán)境帶來污染，且成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種提高硫酸粘桿菌素的收率和品質(zhì)的制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的
一種硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于，它依次包括如下步驟
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理將含有粘桿菌素的發(fā)酵液用酸調(diào)PH為2.(Γ3. 5，邊攪拌邊加入廣5%wt的助濾劑后過濾，得到一次濾液；
(2)減壓濃縮將一次濾液在-0.095 -0. 098Mpa下濃縮，溫度為5(T90°C，濃縮后得到液相含量為2500(T35000ug/ml的濃縮液；
(3)加熱將濃縮液邊攪拌邊加熱至溫度為8(T10(TC，保溫l(T30min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；
(4)抽濾按每IOOml渾濁液取0.5 lg助濾劑，將助濾劑加入純水中，攪拌后進(jìn)行抽濾形成濾餅層，再利用濾餅層對(duì)步驟(3)所得渾濁液進(jìn)行抽濾，得到二次濾液；
(5)沉淀分離將二次濾液用堿調(diào)pH為10.(Γ12. 0，攪拌0. 5^4 h，在(TlO°C條件下靜止2、h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2 3次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至PH為3. (Γ7. 0，得到酸化液；
(6)噴霧干燥將酸化液噴霧干燥后得到硫酸粘桿菌素，噴霧干燥時(shí)進(jìn)風(fēng)溫度為 140^2200C，出風(fēng)溫度為70 120°C。
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種制備硫酸粘桿菌素的新工藝。其特點(diǎn)在于，它不僅提高了硫酸粘桿菌素的收率和品質(zhì)，而且更加綠色環(huán)保，對(duì)硫酸粘桿菌素的生產(chǎn)具有可持續(xù)發(fā)展的意義。本發(fā)明采用先過濾除去發(fā)酵液中的菌體，再濃縮濾液、加熱除去濃縮液中的雜蛋白，然后沉淀分離，最后噴霧干燥，得到硫酸粘桿菌素。具有專一性強(qiáng)、工序短、設(shè)備投資少、收率高、成本低，而且整個(gè)過程不采用溶劑，減少環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。具體來說，本發(fā)明先除去菌體，再進(jìn)行分離純化。由于粘桿菌素是一種多肽類物質(zhì)，發(fā)酵液濾液中的雜蛋白與粘桿菌素的性質(zhì)有類似之處，在沉淀分離過程中會(huì)同時(shí)沉淀出來，影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此，本發(fā)明采用加熱使雜蛋白變性然后過濾的方法除去雜蛋白，制備的硫酸粘桿菌素純度高、產(chǎn)品質(zhì)量好。濃縮濾液的目的在于提高濾液的濃度，雜蛋白和粘桿菌素的含量同時(shí)會(huì)提高，這樣會(huì)使加熱除去雜蛋白更加徹底，同時(shí)也能提高粘桿菌素沉淀分離時(shí)的收率，對(duì)整個(gè)工藝具有重要作用。沉淀分離是在一定的條件下將粘桿菌素以某種形式沉淀出來，雜質(zhì)溶解在溶質(zhì)中，過濾后得到固體，再將固體用硫酸酸化溶解，得到高純度的硫酸粘桿菌素溶液，起到分離純化的效果，專一性強(qiáng)，產(chǎn)品質(zhì)量好。作為優(yōu)選，步驟(1)所述的酸為草酸、硫酸、鹽酸、磷酸的一種或多種。作為優(yōu)選，所述的助濾劑為珍珠巖、硅藻土、纖維素、酸性白土、活性炭、石棉的一種或多種。作為優(yōu)選，步驟(2)所述溫度為6(T70°C。作為優(yōu)選，步驟(3)所述保溫時(shí)間為15 20min。作為優(yōu)選，步驟(5)所述堿為氫氧化鈉、氨水、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉的一種或多種。作為優(yōu)選，步驟(5)所述用堿調(diào)pH為10. 5 11. 5。作為優(yōu)選，步驟(5)所述用稀硫酸調(diào)pH為6. (Γ7. 0。作為優(yōu)選，步驟(6)所述的進(jìn)風(fēng)溫度為17(Tl80°C。作為優(yōu)選，步驟(6)所述的出風(fēng)溫度為9(Tl00°C。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是與離子交換法相比工序短、設(shè)備投資少、廢水少、污染少、收率高，達(dá)75、5%，與現(xiàn)有技術(shù)中泡沫分離法相比專一性強(qiáng)、成本低，而且整個(gè)過程不采用溶劑，減少環(huán)境污染。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所述粘桿菌素發(fā)酵液，由多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的含有粘桿菌素的發(fā)酵液。實(shí)施例1
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH為2. 5，邊攪拌邊加入l%wt的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液；板框過濾收率為95% ；
(2)減壓濃縮
將一次濾液進(jìn)行減壓濃縮，溫度為78 °C，真空度為-0. 095MPa,濃縮至液相含量為 32300ug/ml，得到濃縮液；濃縮收率為98% ；
(3)加熱
4將濃縮液邊攪拌邊加熱至88°C，保溫lOmin，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；
(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取0. 7g珍珠巖，將珍珠巖助濾劑加入純水中，攪拌后進(jìn)行抽濾形成濾餅層，再利用濾餅層對(duì)步驟(3)所得渾濁液進(jìn)行抽濾，得到二次濾液；
(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為10. 6，攪拌1 h，在4°C條件下靜止3. 5 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH為 3，得到酸化液；沉淀分離收率為86. 5% ；
(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為140°C，出風(fēng)溫度為105°C，得到硫酸粘桿菌素；噴霧干燥收率為98%，硫酸粘桿菌素含量為79. 5%，生物效價(jià)為19986U/mg。實(shí)施例2
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH為3. 0，邊攪拌邊加入3. 5%wt的硅藻土助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液。板框過濾收率為96. 5% ；
(2)減壓濃縮
將一次濾液進(jìn)行減壓濃縮，溫度為80°C，真空度為-0. 098MPa，濃縮至液相含量為 31040ug/ml，得到濃縮液；濃縮收率為99% ；
(3)加熱
將濃縮液邊攪拌邊加熱至92°C，保溫25min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；
(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取0. 6g硅藻土，將硅藻土助濾劑加入純水中，攪拌后進(jìn)行抽濾形成濾餅層，再利用濾餅層對(duì)步驟(3)所得渾濁液進(jìn)行抽濾，得到二次濾液；
(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為10，攪拌3 h，在10°C條件下靜止2 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅3次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH為6. 4， 得到酸化液；沉淀分離收率為87% ；
(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為210°C，出風(fēng)溫度為120°C，得到硫酸粘桿菌素；噴霧干燥收率為98. 5%，硫酸粘桿菌素含量為82%，生物效價(jià)為22139U/mg。實(shí)施例3
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH為2. 8，邊攪拌邊加入2. 5%wt的硅藻土助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液；板框過濾收率為94% ；
(2)減壓濃縮
將一次濾液進(jìn)行減壓濃縮，溫度為75 °C，真空度為-0. 096MPa,濃縮至液相含量為 30800ug/ml，得到濃縮液；濃縮收率為98. 5% ；
(3)加熱
將濃縮液邊攪拌邊加熱至93°C，保溫25min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取0. 5g硅藻土，將硅藻土助濾劑加入純水中，攪拌后進(jìn)行抽濾形成濾餅層，再利用濾餅層對(duì)步驟(3)所得渾濁液進(jìn)行抽濾，得到二次濾液；
(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為10. 4，攪拌4 h，在8°C條件下靜止3 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅3次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH為6. 5 ； 得到酸化液，沉淀分離收率為85% ；
(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為200°C，出風(fēng)溫度為110°C，得到硫酸粘桿菌素；噴霧干燥收率為98%，硫酸粘桿菌素含量為80%，生物效價(jià)為21074U/mg。實(shí)施例4
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH為2，邊攪拌邊加入4%wt的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液；板框過濾收率為90% ；
(2)減壓濃縮
將一次濾液進(jìn)行減壓濃縮，溫度為50°C，真空度為-0. 098MPa,濃縮至液相含量為 25000ug/ml，得到濃縮液；濃縮收率為90% ；
(3)加熱
將濃縮液邊攪拌邊加熱至100°C，保溫30min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；
(4)抽濾
按每IOOml渾濁液取1. Og珍珠巖，將硅藻土珍珠巖助濾劑加入純水中，攪拌后進(jìn)行抽濾形成濾餅層，再利用濾餅層對(duì)步驟(3)所得渾濁液進(jìn)行抽濾，得到二次濾液；
(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為10. 7，攪拌2. 5 h，在6°C條件下靜止4 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH為 6. 2，得到酸化液；沉淀分離收率為86. 5% ；
(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為200°C，出風(fēng)溫度為105°C，得到硫酸粘桿菌素；噴霧干燥收率為97%，硫酸粘桿菌素含量為79. 5%，生物效價(jià)為19569U/mg。實(shí)施例5
(1)發(fā)酵液的預(yù)處理
將發(fā)酵液用硫酸調(diào)PH3. 5，邊攪拌邊加入5%wt的珍珠巖助濾劑，通過板框過濾，至無濾液滴出為止，得到一次濾液；板框過濾收率為95% ；
(2)減壓濃縮
將一次濾液進(jìn)行減壓濃縮，溫度為90°C，真空度為-0. 097MPa，濃縮至液相含量為 35000ug/ml，得到濃縮液。濃縮收率為93% ；
(3)加熱
將濃縮液邊攪拌邊加熱至80°C，保溫^min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；
(4)抽濾按每IOOml渾濁液取0. 8g硅藻土，將硅藻土助濾劑加入純水中，攪拌后進(jìn)行抽濾形成濾餅層，再利用濾餅層對(duì)步驟(3)所得渾濁液進(jìn)行抽濾，得到二次濾液；
(5)沉淀分離
將二次濾液用氨水調(diào)PH為12，攪拌0. 5h，在0°C條件下靜止3. 5 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅3次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH為7， 得到酸化液；沉淀分離收率為86. 5% ；
(6)噴霧干燥
將酸化液用噴霧干燥器進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為220°C，出風(fēng)溫度為70°C，得到硫酸粘桿菌素；噴霧干燥收率為98%，硫酸粘桿菌素含量為79. 5%，生物效價(jià)為19M5U/mg。
權(quán)利要求
1.一種硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于所述方法依次包括如下步驟(1)發(fā)酵液的預(yù)處理將含有粘桿菌素的發(fā)酵液用酸調(diào)PH為2.0 3. 5，邊攪拌邊加入 1 5%wt的助濾劑后過濾，得到一次濾液；(2)減壓濃縮將一次濾液在-0.095 -0. 098Mpa下濃縮，溫度為50 90°C，濃縮后得到液相含量為25000 35000ug/ml的濃縮液；(3)加熱將濃縮液邊攪拌邊加熱至溫度為80 100°C，保溫10 30min，然后冷卻至室溫，得到渾濁液；(4)抽濾按每IOOml渾濁液取0.5 Ig助濾劑，將助濾劑加入純水中，攪拌后進(jìn)行抽濾形成濾餅層，再利用濾餅層對(duì)步驟(3)所得渾濁液進(jìn)行抽濾，得到二次濾液；(5)沉淀分離將二次濾液用堿調(diào)pH為10.0 12. 0，攪拌0. 5 4 h，在0 10°C條件下靜止2 4 h，將沉淀后的二次濾液抽濾，得到濾餅，用純水洗滌濾餅2 3次，向洗滌后的濾餅中邊攪拌邊加入稀硫酸至pH為3. 0 7. 0，得到酸化液；(6)噴霧干燥將酸化液噴霧干燥，得到硫酸粘桿菌素；噴霧干燥時(shí)進(jìn)風(fēng)溫度為140 220°C，出風(fēng)溫度為70 120°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的酸為草酸、硫酸、鹽酸、磷酸的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(1)和(3)所述的助濾劑為珍珠巖、硅藻土、纖維素、酸性白土、活性炭、石棉的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(2)所述溫度為 60 70 。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(3)所述保溫時(shí)間為15 20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(5)所述堿為氫氧化鈉、氨水、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(5)所述用堿調(diào) pH 為 10. 5 11. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(5)所述用稀硫酸調(diào)pH為6. 0 7. 0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(6)所述的進(jìn)風(fēng)溫度為170 180°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸粘桿菌素的制備方法，其特征在于步驟(6)所述的出風(fēng)溫度為90 100°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種硫酸粘桿菌素的制備方法。該方法通過發(fā)酵液預(yù)處理、減壓濃縮、加熱、沉淀分離和噴霧干燥，從發(fā)酵液中提取粘桿菌素，制備硫酸粘桿菌素。其總收率高達(dá)75~85%。本發(fā)明的制備方法專一性強(qiáng)、收率高、工序短、設(shè)備投資少、成本低，而且整個(gè)過程不采用溶劑，減少環(huán)境污染。
文檔編號(hào)C07K7/62GK102250220SQ201110192839
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者余煒, 儲(chǔ)消和, 孫振華, 熊莉, 趙祖亮 申請(qǐng)人:浙江升華拜克生物股份有限公司