專利名稱：抗胸腺素α原多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗胸腺素α原多克隆抗體，尤其是涉及一種抗胸腺素α原多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第9位，是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤。在美國(guó)，膀胱癌發(fā)病率居男性惡性腫瘤的第4位，位列前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌之后，在女性惡性腫瘤位居第9位。在我國(guó)占男性惡性腫瘤的第7位，女性居第10位，發(fā)病率約為7. 4/10 萬(wàn)。膀胱癌的惡性度不很高，早期診治的5年存活率為93%，但若不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)確診治療， 晚期病人的5年存活率僅為6%，死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于惡性度高于膀胱癌的其它腫瘤。膀胱癌腫瘤細(xì)胞易于種植轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，術(shù)后5年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，因此，定期隨訪并早期發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)在膀胱癌的治療中占有重要地位(許斌(綜述)華立新(審校)膀胱癌流行病學(xué)進(jìn)展，國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志，2007 (4) :469-476)。膀胱癌的診斷以尿液脫落細(xì)胞檢查和膀胱鏡活檢為金標(biāo)準(zhǔn)。但是尿液細(xì)胞學(xué)檢查，操作復(fù)雜，存在著樣品收集次數(shù)多、量大、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。檢查結(jié)果受主觀因素影響較大，陽(yáng)性率低，對(duì)于I，II期病人陽(yáng)性率不足50%。膀胱鏡比前兩者診斷率高，但是這種方法為侵入性創(chuàng)傷性檢測(cè)，給病人帶來(lái)痛苦，并且技術(shù)設(shè)備要求高， 同時(shí)有增加泌尿系統(tǒng)感染的機(jī)會(huì)，患者不易接受。而CT、B超和核磁共振用于早期診斷，在臨床上主要用于腫瘤出現(xiàn)形態(tài)變化之后，當(dāng)腫瘤較小時(shí)，容易漏檢，且腫瘤的性質(zhì)不容易判斷。如核磁共振只有在病灶大于Icm時(shí)才能顯示。而且設(shè)備昂貴，操作專業(yè)性強(qiáng)，不適于推廣普及。腎腫瘤在我國(guó)泌尿外科腫瘤中占第二位，僅次于膀胱腫瘤，大約占惡性腫瘤的 2% 3%，但在小兒惡性腫瘤中達(dá)20%，是兒科常見的惡性腫瘤之一.我國(guó)各地區(qū)腎癌的發(fā)病率及死亡率差異也較大①腎癌的發(fā)病率和死亡率均有上升趨勢(shì)。②男女比例約為2 1。③城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)，二者最高相差43倍.發(fā)達(dá)國(guó)冢發(fā)病率高于發(fā)展中國(guó)家。20%初診時(shí)既已發(fā)生轉(zhuǎn)移，30%術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移。對(duì)放化療不敏感，晚期預(yù)后較差。臨床診斷主要是通過(guò)影像學(xué)如B超、CT檢查發(fā)現(xiàn)。目前多數(shù)是在健康查體時(shí)B超偶爾發(fā)現(xiàn)， 即所謂偶發(fā)癌，患者無(wú)任何自覺癥狀。但對(duì)于小于2cm的腫瘤診斷有時(shí)較困難，與良性腎腫物如囊腫、腺瘤、嗜酸性細(xì)胞瘤等鑒別較困難。腎腫瘤標(biāo)記物對(duì)于腎癌的早期診斷、觀察評(píng)價(jià)治療效果及判斷預(yù)后和復(fù)發(fā)具有重要意義。如核基質(zhì)蛋白(NMP-2》已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)有組織特異性和腫瘤特異性，并且與RCC相關(guān)的特異性NMP已經(jīng)被確認(rèn)。Y -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (Gamma-glutamy !transferase, Y-GGT)在疾病狀態(tài)下，由于參與糖鏈代謝酶類的活力改變，引起糖鏈結(jié)構(gòu)異常，這些糖鏈結(jié)構(gòu)的異常如能反映在體液中，就有可能利用這一異常來(lái)診斷疾病。GGT是一種細(xì)胞膜上的糖蛋白，主要存在于腎臟和小腸等組織。在正常人尿中 GGT來(lái)源于腎臟，其N-糖鏈全部帶有平分型N-乙酰氨基葡萄糖，而腎細(xì)胞癌患者尿中該型明顯減少，使GGT和ConA的親和力增高，因而可用于腎癌的診斷。Yoshida等研究發(fā)現(xiàn)在腎癌組織中GGT的糖鏈結(jié)構(gòu)和正常腎皮質(zhì)中的不同，且在RCC組織的活性顯著增加。GGT的糖鏈結(jié)構(gòu)在腎癌中的變異有待人們更深入的研究，可能成為診斷腎癌的一種有用的工具。此外，還有神經(jīng)特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)和丙酮酸激酶M2型同工酶 (M2-PK)，粘多糖(Glycosaminoglycan，GAG)和脂類相關(guān)唾液酸(Lipid-Associated sialic Acid, LASA)等被用于腎腫瘤標(biāo)記物的研究，但是迄今為止，還沒有理想的特異性標(biāo)記物用于腎癌的早期診斷。前列腺癌(prostatecancenPCa)在歐美男性癌癥中列第2位，腫瘤致死的原因中列第3位。我國(guó)男性中PCa發(fā)病率也逐年升高，1979年Wang等從前列腺組織中分離出前列腺特異抗原(prostatespecificantigen，PSA)，1982年證實(shí)與7_Sin在免疫學(xué)上一致，但二者相對(duì)分子質(zhì)量不同，PSA為33000 34000 ；7-Sin為23000。經(jīng)過(guò)10年左右的臨床應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)PSA篩查PCa顯著優(yōu)于PAP或PAP與PSA的聯(lián)合應(yīng)用。因此，自上世紀(jì)90年代以來(lái)，PSA被認(rèn)為是PCa最重要的血清學(xué)標(biāo)志物。隨著科技的發(fā)展，前列腺癌的腫瘤標(biāo)記物研究取得一定的進(jìn)展，從基因表達(dá)水平，蛋白水平發(fā)現(xiàn)包括E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-⑶)， P27，MMPS，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子fVEGF)，環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，C0X)以及新技術(shù)篩檢 GSTPl基因有沒有高度甲烷化的情形。90%前列腺癌患者都會(huì)有這種初期的基因變化。等標(biāo)記物在前列腺癌中有高表達(dá)，但是目前尚不能確定出單一的，足夠敏感和特異的標(biāo)志物， 以PSA為例，其前列腺癌的陽(yáng)性預(yù)示值只有37%，并且這些因子的檢查都需要從血液或特殊儀器設(shè)備。尋找從尿液中發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)記物聯(lián)合現(xiàn)有技術(shù)手段和標(biāo)記物對(duì)于增加檢出率， 簡(jiǎn)化檢查方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。與上述泌尿系統(tǒng)腫瘤檢測(cè)方法相比，尿液腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)無(wú)創(chuàng)傷，檢測(cè)速度快， 成本低，操作簡(jiǎn)便快捷，適用于泌尿系統(tǒng)癌的流行病學(xué)調(diào)查及病人經(jīng)過(guò)藥物、手術(shù)治療后的動(dòng)態(tài)和療效監(jiān)測(cè)，同時(shí)為臨床醫(yī)生篩選泌尿鏡檢查適應(yīng)人群，即應(yīng)用該方法找出高度可疑的腫瘤癌患者。胸腺素α原G^oTa)是一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在的小分子量酸性蛋白， 它除了具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能外，另一個(gè)重要功能是提高細(xì)胞的增殖能力，ProT α RNA只有在快速增值的細(xì)胞中大量出現(xiàn)。免疫組化研究結(jié)果證明，ftOTa在增值的細(xì)胞中高表達(dá)， 而在相對(duì)靜止的細(xì)胞中則表達(dá)很少，ProT α可作為腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指征。α的表達(dá)受到原癌基因C-myc編碼的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用，是C-myc作用的靶基因之一(Sasaki H， et al, Cancer Lett. 2001)。ProT α在乳癌組織中較非癌組織高17倍，增高的α蛋白水平提示有更高的淋巴轉(zhuǎn)移、易于復(fù)發(fā)及預(yù)后不良傾向。利用免疫組化方法檢測(cè)到I^roTa 的表達(dá)量在結(jié)腸癌、乳腺癌(Magdalena C, et al. Tumour prothymosin alpha content, a potential prognostic marker for primary breast cancer[J]. Br J Cancer,2000, 82(3) :584-590) IiLMiM^R (Wu C G，et al. Overexpression of hepatic prothymosin alpha, a novel marker for human hepatocellular carcinoma[J]. Br JCancer,1997, 76(9) :1199-1204)禾口神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Sasaki H, et al. Expression of the prothymosin aIphamRNA correlated with that of N_myc in neuroblastoma[J]. Cancer Lett,2001, 168(2) :191_195)，肺癌(Sasaki H, et al. Expression of the prothymosin-a gene as a prognostic factor in lung cancer [J]. Surg Today, 2001,1 (10) :936-938)，甲狀腺瘤組織中均較臨近正常組織中明顯升高。正由于ftOTa沒有二級(jí)結(jié)構(gòu)，抗原性很弱，因此制備相應(yīng)的抗體比較困難，以往
4常常采用與載體蛋白KLC等偶聯(lián)后免疫動(dòng)物，如兔子。此外，還有免疫雞后再?gòu)碾u蛋中分離獲得相應(yīng)的抗體 IG-Y(Persefoni Klimentzou a, Development and immunochemical evaluation of antibodiesY for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha, peptides27(2006) 183-193)。斑點(diǎn)雜交技術(shù)屬于免疫反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)范疇，它是應(yīng)用把檢測(cè)的樣品及抗原抗體反應(yīng)在硝酸纖維素膜上進(jìn)行，硝酸纖維素膜對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能優(yōu)于聚苯乙烯，可檢出 IngProT α蛋白；檢出抗原的敏感性較常規(guī)ELISA法高6 8倍；試劑用量少，比ELISA法至少節(jié)約10倍；操作簡(jiǎn)便快速，不需要特殊設(shè)備條件，適合基層單位使用；并可郵寄供現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查使用；檢測(cè)結(jié)果可長(zhǎng)期保存，便于復(fù)查。該方法具有特異性強(qiáng)，假陽(yáng)性較少； 敏感性高的特點(diǎn)。本申請(qǐng)人在中國(guó)專利200710009083. 0中公開了一種抗腫瘤融合蛋白的制備方法
及其應(yīng)用。目前，有關(guān)ftOTa多克隆抗體采用該方法制備還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗胸腺素α原多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。所述抗胸腺素α原多克隆抗體為采用GST-ProT α融合表達(dá)制備的融合蛋白免疫新西蘭大白兔子后獲得的多克隆抗GST-ProT α抗血清。所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法包括以下步驟1)制備融合蛋白GST-ProTa 2)制備抗體。在步驟1)中，所述制備融合蛋白GST-ProTa可采用以下方法(1)根據(jù)的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物Pl和下游引物P2，將上游引物Pl引入BamHI酶切位點(diǎn)，將下游引物P2引入EcoRI酶切位點(diǎn)；(2)采用RT-PCR方法獲得前胸腺素α原全長(zhǎng)基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與 PMD18-T Vector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定的陽(yáng)性菌液測(cè)序；(3)用EcoRI和BamHI雙酶切ftx)TaPCR產(chǎn)物，將ftx)Ta基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)， 加入IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，沸水浴后離心取上清，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，獲得GST-Pro α融合蛋白；(4)將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因BL21菌株超聲破碎后，離心所獲得的上清中含有可溶性的融合蛋白GST-Proa ；(5)將上清經(jīng)過(guò)GST親和層析柱分離純化獲得高純度的GST-Pro α融合蛋白。在步驟1)的(1)中，所述上游引物Pl和下游引物P2分別為上游引物P1 5，-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3，，下游引物P2 5，-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3，。在步驟1)的(3)中，所述用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度可為37°C，所述誘導(dǎo)表達(dá)的溫度可為37"C。
在步驟幻中，所述制備抗體的具體步驟可為(1)融合蛋白與福氏完全佐劑混合后，分3次脊柱兩旁皮下注射，后5次用不完全福氏佐劑同樣位置注射；(2)最后一次注射結(jié)束后測(cè)效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到50000以上時(shí)，取血分離血清，得抗胸腺素α原多克隆抗體，分裝后保存。在步驟2)的(1)中，所述分3次脊柱兩旁皮下注射，每次間隔可為7天；所述后5 次用不完全福氏佐劑同樣位置注射，每次間隔可為7天。在步驟2、的O)中，所述最后一次注射結(jié)束后測(cè)效價(jià)可在最后一次注射結(jié)束后7 天測(cè)效價(jià)；所述分裝后保存可保存在-20°C冰箱。所述抗胸腺素α原多克隆抗體可用于膀胱癌病人的診斷。本發(fā)明效價(jià)高、特異性強(qiáng)、能用于進(jìn)行各種含α成分的樣品及細(xì)胞，組織內(nèi)源ftx)Ta的免疫印跡、ELISA免疫分析。將該抗體應(yīng)用檢測(cè)尿液中的α水平可以進(jìn)行膀胱癌，腎癌和前列腺癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤的診斷。采用該方法獲得的抗體，效價(jià)高，特異性強(qiáng)。能檢測(cè)含I^oTa的各種樣品。應(yīng)用該方法制備的抗體，以尿液中胸腺素α原為腫瘤標(biāo)記物，采用斑點(diǎn)雜交方法進(jìn)行泌尿系統(tǒng)癌診斷。所有反應(yīng)在一張硝酸纖維素膜上進(jìn)行，硝酸纖維素膜事先用鉛筆將膜劃分為若干個(gè)小方格，經(jīng)過(guò)點(diǎn)樣，固定，一抗，二抗反應(yīng)后顯色。 總過(guò)程不超過(guò)4h。樣品需要量小，只要1 μ 1，樣品在-20°C冰箱可以長(zhǎng)期保存，檢測(cè)結(jié)果不受影響，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果可以長(zhǎng)期保存，便于復(fù)查。該方法敏感性好，特異性與準(zhǔn)確性高，無(wú)創(chuàng)傷，成本低，所需時(shí)間適中，在4h之內(nèi)，一次檢測(cè)數(shù)量可以根據(jù)實(shí)際樣品數(shù)量增加或減少。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下1.本發(fā)明采用在載體中與GST融合表達(dá)后，分離純化融合蛋白GST-ProTa與佐劑混合后，免疫兔子，其中前3次采用完全福氏佐劑，后5次采用不完全福氏佐劑的方法，脊柱兩旁皮下多點(diǎn)注射的方法，獲得效價(jià)高，特異性強(qiáng)，靈敏度好的兔抗多克隆抗體。目前采用該方法制備抗胸腺素α原多克隆抗體還未見報(bào)道。2.本發(fā)明采用病人尿液為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，快速，容易操作，樣品需要量少，緊需要 μ 1的尿液，對(duì)人體無(wú)任何危害。3.檢出率高，對(duì)經(jīng)過(guò)3甲醫(yī)院診斷確診為膀胱癌的早期和晚期病人共17例，其中 1例早期，腎癌13例，前列腺癌2例。經(jīng)過(guò)本發(fā)明方法檢測(cè)全部為陽(yáng)性。檢出率為100%。4.特異性高，對(duì)經(jīng)過(guò)3甲醫(yī)院體檢證明正常人尿液共60例，其中正常的53例，隱血的病人7例。結(jié)果均為陰性。5.經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)證明可以檢測(cè)到納克級(jí)，靈敏度高。與常規(guī)ELISA相比高6 8 倍，而且檢測(cè)結(jié)果可以長(zhǎng)期保存，便于復(fù)查。操作簡(jiǎn)便快速，不需要特殊設(shè)備條件，適合基層單位使用；并可郵寄供現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查使用。6.應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計(jì)的方法所制備的抗體，采用斑點(diǎn)雜交的方法以尿液中ftOTa 作為腫瘤標(biāo)記物，用于診斷膀胱癌病人，該方法敏感性好，特異性與準(zhǔn)確性高，無(wú)創(chuàng)傷，成本低，所需時(shí)間適中，在4h之內(nèi)，一次檢測(cè)數(shù)量可以根據(jù)實(shí)際樣品數(shù)量增加或減少。


圖1為中國(guó)人外周血淋巴總RNA電泳圖。在圖1中，55，185，觀3代表不同沉降系數(shù)的RNA。圖2為本發(fā)明實(shí)施例檢測(cè)RT-PCR獲得的產(chǎn)物。在圖2中，2000bp，IOOObp，750bp， 500bp, 300bp, 250bp, IOObp 分別代表 DNA 大小，M 代表標(biāo)準(zhǔn) DNA。圖3為α的PCR擴(kuò)增結(jié)果。在圖3中，1為PCR產(chǎn)物，M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA。圖4為質(zhì)粒PUCT-α限制性酶切分析。圖5為質(zhì)粒pGEX-ProT α的PCR鑒定結(jié)果。圖6為質(zhì)粒pGEX-α限制性酶切分析。圖7為表達(dá)載體pGEX- α構(gòu)建流程圖。圖8為融合蛋白表達(dá)SDS-PAGE。圖9為融合蛋白表達(dá)純化的SDS-PAGE分析。圖10為抗胸腺素α原多克隆抗體的鑒定，抗原梯度的斑點(diǎn)雜交。圖11為斑點(diǎn)雜交檢測(cè)膀胱癌病人尿液中的a。圖12為斑點(diǎn)雜交檢測(cè)腎癌病人尿液中的a。圖13為斑點(diǎn)雜交檢測(cè)前列腺癌病人尿液中的a。圖14為正常人和臨床診斷為隱血的病人的尿液。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法包括以下步驟DGST-ProTa融合蛋白的制備(1)根據(jù)的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物Pl和下游引物P2，上游引物Pl和下游引物P2分別為上游引物P1 5，-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3，，下游引物P2 5，-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3，，將上游引物P1引入BamHI酶切位點(diǎn)，將下游引物P2引入EcoRI酶切位點(diǎn)。(2)采用RT-PCR方法獲得前胸腺素α原全長(zhǎng)基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與 PMD18-T Vector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定的陽(yáng)性菌液測(cè)序。(3)用EcoRI和BamHI雙酶切I^roT α PCR產(chǎn)物，將I^roT α基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)， 加入IPTG，37°C誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，沸水浴后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲得GST-Pro α融合蛋白。(4)將4經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因BL21菌株超聲破碎后，離心所獲得的上清中含有可溶性的融合蛋白GST-Proa。(5)將上清經(jīng)過(guò)GST親和層析柱分離純化獲得高純度的GST-Pro α融合蛋白。2)抗體的制備如下(1)融合蛋白與福氏完全佐劑混合后，分3次脊柱兩旁皮下注射，每次間隔7天，后 5次用不完全福氏佐劑同樣位置注射，間隔時(shí)間與前面相同。(2)最后一次注射結(jié)束后7天測(cè)效價(jià)，效價(jià)達(dá)到50000以上，取血分離血清，分裝后
7保存在_20°C冰箱待用。以下給出所述抗胸腺素α原多克隆抗體的鑒定1)硝酸纖維素膜用鉛筆畫IcmX Icm的網(wǎng)格。2)將標(biāo)準(zhǔn)ftOT α蛋白按1 μ g/mL, 5 μ g/mL和10 μ g/mL梯度用包被液稀釋，微量加樣于硝酸纖維素膜網(wǎng)格上，置于37V經(jīng)20min，邊上分別設(shè)置空白對(duì)照和陰性對(duì)照，干燥孵育。3)將膜浸于封閉液中，37°C封閉lh。4)0. 05% Tween-20，用磷酸緩沖液配制，洗滌3次，每次5min。5)加一抗血清，37°C，lh。6)洗滌 3 次。7)加用PBS稀釋的羊抗兔-HRP標(biāo)記二抗，37°C封閉lh。8)洗滌4次，加DAB顯色劑顯色5到lOmin，水洗終止反應(yīng)，晾干后拍照，即完成對(duì)所述抗胸腺素α原多克隆抗體的鑒定。結(jié)果見圖1?？剐叵偎卅猎嗫寺】贵w在診斷膀胱癌病人中的應(yīng)用如下。以下給出膀胱癌病人，臨床診斷為隱血的病人尿液和正常人尿液α檢測(cè)方法1)硝酸纖維素膜用鉛筆畫IcmX Icm的網(wǎng)格。2)將待測(cè)樣品，膀胱癌病人尿液，健康人尿液和隱血病人尿液用包被液稀釋，微量加樣于硝酸纖維素膜網(wǎng)格上，置于37°C經(jīng)20min，干燥孵育。3)將膜浸于封閉液中，37°C封閉Ih。4) PBST 洗滌 3 次，每次 5min。5)加兔抗 ProT α 抗體，37 °C，Ih。6)洗滌 3 次。7)加用PBS稀釋的羊抗兔-HRP標(biāo)記二抗，37°C封閉lh。8)洗滌4次，加DAB顯色劑顯色5到lOmin，水洗終止反應(yīng)，晾干后拍照，即完成膀胱癌病人，臨床診斷為隱血的病人尿液和正常人尿液α檢測(cè)。結(jié)果見圖2和3。質(zhì)粒PUCT- α限制性酶切分析參見圖4。在圖4中，1 =PUCT- α /BamHI+EcoRI雙酶切結(jié)果 O.6Kb，300bp) ；Μ:標(biāo)準(zhǔn) DNA DL2000 (bp) ；2 :pMD18-T_Vector 質(zhì)粒。質(zhì)粒pGEX-ProTa的PCR鑒定結(jié)果參見圖5。在圖5中，1、2 :PCR產(chǎn)物(300bp)， 3 陰性對(duì)照，M =M代表標(biāo)準(zhǔn)DNA，DL2000 (bp)。質(zhì)粒pGEX-a限制性酶切分析參見圖6。在圖6中，1、2 :pGEX_a/ BamHI+EcoRI (4. 9kb, 300bp)，M 代表標(biāo)準(zhǔn) DNA，DL2000 (bp)。表達(dá)載體pGEX-α構(gòu)建流程圖參見圖7。在圖7中，將proT基因克隆到質(zhì)粒pUCT 載體中，并用EcoRI和BamHI雙酶切，同時(shí)用與之相同的兩種酶雙酶切載體pEGX6p_l，在 T4連接酶作用下連接構(gòu)建成表達(dá)載體，連接產(chǎn)物在Amp+抗性板篩選陽(yáng)性克隆子。EcoRI， BamHI, XhoI, NotI, SmaI, Sail等代表多克隆酶切位點(diǎn)。融合蛋白表達(dá)SDS-PAGE參見圖8。在圖8中，1.沉淀；2.上清；3.全蛋白；4誘導(dǎo)前對(duì)照；5.空載體誘導(dǎo)后；6.空載體誘導(dǎo)前；M蛋白標(biāo)準(zhǔn)；116KDa，66. 2KDa，45. OKDa, 37KDa, 35. OKDa, 26KDa, 25. OKDa, 18. 8KDa, 14. 4KDa分別代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
融合蛋白表達(dá)純化的SDS-PAGE分析參見圖9。在圖9中，1和3為純化的蛋白；2 為空載體誘導(dǎo)前；4為重組載體誘導(dǎo)后上清；97. 2，66. 4，44. 3，35，25代表不同分子量大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白?？剐叵偎卅猎嗫寺】贵w的鑒定，抗原梯度的斑點(diǎn)雜交參見圖10。在圖10中， 1為陰性對(duì)照(以陰性兔血清作為一抗)；2為空白對(duì)照(以PBS代替ftOTa) ；3為標(biāo)準(zhǔn) ProT α (1 μ g/mL) ；4 為標(biāo)準(zhǔn) ProT α (5 μ g/mL) ；5 為標(biāo)準(zhǔn) ProT α (10 μ g/mL)。斑點(diǎn)雜交檢測(cè)膀胱癌病人尿液中的α參見圖11。在圖11中，1為膀胱癌病人(晚期)尿液；2為膀胱癌病人(早期)尿液；3為健康人尿液。斑點(diǎn)雜交檢測(cè)腎癌病人尿液中的α參見圖12。斑點(diǎn)雜交檢測(cè)前列腺癌病人尿液中的α參見圖13。正常人和臨床診斷為隱血的病人的尿液參見圖14。在圖14中，第1、2排為正常人尿液，第3排為臨床診斷為隱血的病人尿液。
權(quán)利要求
1.抗胸腺素α原多克隆抗體，其特征在于為采用GST-ProTα融合表達(dá)制備的融合蛋白免疫新西蘭大白兔子后獲得的多克隆抗GST-ProT α抗血清。
2.如權(quán)利要求1所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)制備融合蛋白GST-ProTa2)制備抗體。
3.如權(quán)利要求2所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法，其特征在于在步驟1)中， 所述制備融合蛋白GST-ProTa采用以下方法(1)根據(jù)I^roTa的基因序列，設(shè)計(jì)上游引物Pl和下游引物P2，將上游引物Pl引入 BamHI酶切位點(diǎn)，將下游引物P2引入EcoRI酶切位點(diǎn)；(2)采用RT-PCR方法獲得前胸腺素α原全長(zhǎng)基因cDNA，將PCR產(chǎn)物純化后與pMD18_T Vector連接，重組載體命名為TP，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定的陽(yáng)性菌液測(cè)序；(3)用EcoRI和BamHI雙酶切ftx)TaPCR產(chǎn)物，將ftx)Ta基因片斷插入經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX 6P-1中，命名為PP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入IPTG， 誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后的沉淀用上樣緩沖液溶解，沸水浴后離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，獲得GST-Pro α融合蛋白；(4)將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因BL21菌株超聲破碎后，離心所獲得的上清中含有可溶性的融合蛋白GST-Pro α ；(5)將上清經(jīng)過(guò)GST親和層析柱分離純化獲得高純度的GST-Proα融合蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法，其特征在于在步驟1)的 (1)中，所述上游引物Pl和下游引物P2分別為上游引物 Pl :5’ -GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3，， 下游引物 P2 :5，-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3，。
5.如權(quán)利要求3所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法，其特征在于在步驟1)的 (3)中，所述用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度為37°C，所述誘導(dǎo)表達(dá)的溫度為37°C。
6.如權(quán)利要求3所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法，其特征在于在步驟2)中， 所述制備抗體的具體步驟為(1)融合蛋白與福氏完全佐劑混合后，分3次脊柱兩旁皮下注射，后5次用不完全福氏佐劑同樣位置注射；(2)最后一次注射結(jié)束后測(cè)效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到50000以上時(shí)，取血分離血清，得抗胸腺素α原多克隆抗體，分裝后保存。
7.如權(quán)利要求6所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法，其特征在于在步驟2)的(1)中，所述分3次脊柱兩旁皮下注射，每次間隔為7天；所述后5次用不完全福氏佐劑同樣位置注射，每次間隔為7天。
8.如權(quán)利要求6所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法，其特征在于在步驟2)的(2)中，所述最后一次注射結(jié)束后測(cè)效價(jià)是在最后一次注射結(jié)束后7天測(cè)效價(jià)。
9.如權(quán)利要求6所述抗胸腺素α原多克隆抗體的制備方法，其特征在于在步驟2)的 (2)中，所述分裝后保存是保存在-20°C冰箱。
10.如權(quán)利要求1所述抗胸腺素α原多克隆抗體在膀胱癌病診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
抗胸腺素α原多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，涉及一種抗胸腺素α原多克隆抗體。所述抗胸腺素α原多克隆抗體為采用GST-ProTα融合表達(dá)制備的融合蛋白免疫新西蘭大白兔子后獲得的多克隆抗GST-ProTα抗血清。先制備融合蛋白GST-ProTα，后制備抗體。能用于進(jìn)行各種含ProTα成分的樣品及細(xì)胞，組織內(nèi)源ProTα的免疫印跡、ELISA免疫分析。將該抗體應(yīng)用檢測(cè)尿液中的ProTα水平可以進(jìn)行膀胱癌，腎癌和前列腺癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤的診斷?？贵w的效價(jià)高，特異性強(qiáng)。能檢測(cè)含ProTα的各種樣品。以尿液中胸腺素α原為腫瘤標(biāo)記物，進(jìn)行泌尿系統(tǒng)癌診斷?？傔^(guò)程不超過(guò)4h，樣品需要量小。
文檔編號(hào)C07K16/26GK102295701SQ20111020067
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者劉升發(fā), 吳漢洲, 周克夫, 張亭, 張長(zhǎng)弓, 李偉, 楊彩霞, 王世媛, 邢金春, 韓偉, 高吉青 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)