專利名稱：一種制備生長抑素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多肽領(lǐng)域，具體涉及一種制備生長抑素的方法。
背景技術(shù)：
生長抑素，即生長激素釋放抑制因子，是人體內(nèi)存在的一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)激素，對多種生理功能具有廣泛的抑制作用。生長抑素英文名 Somatostatin,分子式為=C76Hltl4N18O19S2，分子量1637. 89。氨基酸結(jié)構(gòu)簡寫為
Al a- GI y- C y S- Ly S-As ri- P h e- P h e-Trp-Ly s-Th r- P h e-Th r- Ser-Cys 其分子結(jié)構(gòu)式如下
生長抑素是由下丘腦的正中隆起和胰島的S細(xì)胞合成的，1973年由德國的Guillemin 博士從綿羊的下丘腦分離得到并闡明其結(jié)構(gòu)。Guillemin博士因此獲得1977年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。生長抑素化學(xué)結(jié)構(gòu)為分子內(nèi)帶有一對二硫鍵的十四肽，在人體中主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍器官(如胃，腸，胰，皮膚等)，最大濃度見以下丘腦，但以消化道含量最大。生長抑素生物功能可抑制腺體釋放生長激素、抑制促甲狀腺和腎上腺皮質(zhì)激素、 抑制胰腺的內(nèi)分泌與外分泌、抑制胃粘膜釋放胃泌素、抑制腸粘膜釋放腸促胰激素和腎臟釋放腎素，降低門靜脈壓力、松馳膽道口擴(kuò)約肌、刺激單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)而減輕內(nèi)毒素血癥，抑制血小板活化因子的釋放，直接或間接調(diào)節(jié)細(xì)胞因子鏈產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用，并可增強(qiáng)抗癌藥物的抗增殖作用。臨床常應(yīng)用于嚴(yán)重急性食管靜脈曲張破裂出血，嚴(yán)重急性胃、十二指腸潰瘍出血，急性糜爛性胃炎或出血性胃炎，胰、膽和腸屢的輔助治療，糖尿病酮癥酸中毒的輔助治療。其他一些作用和用途正隨著其基礎(chǔ)研究和臨床的深入而不斷被發(fā)現(xiàn)。因此生長抑素的應(yīng)用前景廣闊，市場需求量正逐年增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備生長抑素的方法，該方法首先對還原型生長抑素粗肽采用高效液相色譜法進(jìn)行純化得到還原型生長抑素精肽，然后對還原型生長抑素精肽進(jìn)行液相氧化得到氧化型生長抑素，然后再采用高效液相色譜法純化得到高純度生長抑
ο本發(fā)明的目的是這樣來實現(xiàn)的，其方法步驟為
1)將固相合成所得還原型生長抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以三氟醋酸水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集還原型精肽溶液。2)將第一步所得還原型精肽溶液用純化水稀釋至約Ig肽/IL純化水，用稀氨水調(diào)節(jié)PH至6-8之間，加入適量的H2A氧化，得到氧化型粗肽溶液。
3)將氧化型粗肽溶液濃縮至一定體積，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以磷酸三乙胺溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集氧化型精肽溶液。4)將氧化型精肽溶液轉(zhuǎn)換成醋酸鹽。純化規(guī)模包括以下規(guī)格的色譜柱2CMX 25CM(直徑X長度)、5CMX 25CM、 15CMX25CM
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本方法制得的產(chǎn)品純度高、收率高、操作簡便，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式下面以實例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明 實施例一
1)將固相合成所得還原型生長抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，色譜柱規(guī)格為2CMX25CM(直徑X長度)；以0. 05%_0.洲三氟醋酸水溶液為A 相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化。流速15-20ml/min。檢測波長220nm。梯度 B%:15%-35% 40-60mino上樣量為120_150mg。收集還原型精肽溶液。2)將第一步所得還原型精肽用純化水稀釋至約Ig肽/IL純化水，用稀氨水調(diào)節(jié) PH至6-8之間，加入0. 01%-1· 5% (ν/ν)的H2O2氧化1-3小時，得到氧化型粗肽溶液備用。3)將氧化型粗肽溶液在35°C以下減壓旋蒸濃縮至10_15ml。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，色譜柱規(guī)格為2CMX25CM (直徑X長度)；以PH2. 5-3. 5磷酸三乙胺溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化。流速15-20ml/min。檢測波長220nm。梯度B%:10%-30% 60-80min。上樣量為90_130mg。收集氧化型精肽溶液。4)將氧化型精肽溶液轉(zhuǎn)換成醋酸鹽，取15_20g陰離子交換樹脂置于合適大小的砂芯漏斗中，用超純水沖洗至中性后加入氧化型精肽溶液，充分?jǐn)嚢韬鬁p壓抽濾并收集濾液，再向樹脂中加入純化水洗一至兩遍，減壓抽濾收集濾液，合并所有濾液在35°C以下減壓旋蒸濃縮至10-15ml。轉(zhuǎn)移至50ml西林瓶中，冷凍干燥可得到純度大于99. 5%高純度生長抑素。實施例二
1)將固相合成所得還原型生長抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，色譜柱規(guī)格為5CMX25CM(直徑X長度)；以0. 05%_0.洲三氟醋酸水溶液為A相、 色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化。流速80-120ml/min。檢測波長220nm。梯度 B%:15%-35% 40-60mino上樣量為1200_1500mg。收集還原型精肽溶液。2)將第一步所得還原型精肽溶液用純化水稀釋至約Ig肽/IL純化水，用稀氨水調(diào)節(jié)PH至6-8之間，加入0. 01%-1· 5% (ν/ν)的H2O2氧化1-3小時，得到氧化型粗肽溶液備用。3)將氧化型粗肽溶液在35°C以下減壓旋蒸濃縮至30_50ml。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，色譜柱規(guī)格為5CMX25CM (直徑X長度)；以PH2. 5-3. 5磷酸三乙胺溶液為 A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化。流速80-120ml/min。檢測波長220nm。梯度B%:10%-30% 60-80min。上樣量為l_2g。收集氧化型精肽溶液。4)將氧化型精肽溶液轉(zhuǎn)換成醋酸鹽，取40_50g陰離子交換樹脂置于合適大小的
4砂芯漏斗中，用超純水沖洗至中性后加入氧化型精肽溶液，充分?jǐn)嚢韬鬁p壓抽濾并收集濾液，再向樹脂中加入純化水洗一至兩遍，減壓抽濾收集濾液，合并所有濾液在35°C以下減壓旋蒸濃縮至10-15ml。轉(zhuǎn)移至50ml西林瓶中，冷凍干燥后即可得到純度大于99. 5%高純度生長抑素。實施例三
1)將固相合成所得還原型生長抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，色譜柱規(guī)格為15CMX25CM(直徑X長度)；以0. 05%-0.洲三氟醋酸水溶液為A相、 色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化。流速400-500ml/min。檢測波長220nm。梯度 B%:15%-35% 40-60min。上樣量為20_30g。收集還原型精肽溶液。2)將第一步所得還原型精肽溶液用純化水稀釋至約Ig肽/IL純化水，用稀氨水調(diào)節(jié)PH至6-8之間，加入0. 01%-1· 5% (ν/ν)的H2O2氧化1-3小時，得到氧化型粗肽溶液備用。3)將氧化型粗肽溶液在35°C以下減壓旋蒸濃縮至80_120ml。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，色譜柱規(guī)格為15CMX25CM(直徑X長度)；以PH2. 5-3. 5磷酸三乙胺溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化。流速400-500ml/min。檢測波長220nm。 梯度B%:10%-30% 60-80min。上樣量為16_25g。收集氧化型精肽溶液。4)將氧化型精肽溶液轉(zhuǎn)換成醋酸鹽，取250_300g陰離子交換樹脂置于合適大小的砂芯漏斗中，用超純水沖洗至中性后加入氧化型精肽溶液，充分?jǐn)嚢韬鬁p壓抽濾并收集濾液，再向樹脂中加入純化水洗一至兩遍，減壓抽濾收集濾液，合并所有濾液在35°C以下減壓旋蒸濃縮至150-200ml。轉(zhuǎn)移至50ml西林瓶中，每瓶15_20ml，冷凍干燥后即可得到純度大于99. 5%高純度生長抑素。
權(quán)利要求
1.一種制備生長抑素的方法，其特征在于方法步驟為1)將固相合成所得還原型生長抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以三氟醋酸水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集還原型精肽溶液；2)將第一步所得還原型精肽溶液用純化水稀釋至約Ig肽/IL純化水，用稀氨水調(diào)節(jié) PH至6-8之間，加入適量的H2A氧化，得到氧化型粗肽溶液；3)將氧化型粗肽溶液濃縮至一定體積，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以磷酸三乙胺溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集氧化型精肽溶液；4)將氧化型精肽溶液轉(zhuǎn)換成醋酸鹽，取陰離子交換樹脂置于砂芯漏斗中，用超純水沖洗至中性后加入氧化型精肽溶液，充分?jǐn)嚢韬鬁p壓抽濾并收集濾液，再向樹脂中加入純化水洗一至兩遍，減壓抽濾收集濾液，合并所有濾液，在35°C以下減壓旋蒸濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至西林瓶中，冷凍干燥后即可得到純度大于99. 5%高純度生長抑素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備生長抑素的方法，其特征是所述步驟1)A相三氟醋酸水溶液濃度為0. 05%-0. m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備生長抑素的方法，其特征是所述步驟2)氧化PH值范圍為 6-8，H2O2 濃度為 0. 01%-1. 5%ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備生長抑素的方法，其特征是所述步驟3)磷酸三乙胺溶液PH值為2. 5-3.5。
全文摘要
一種制備生長抑素的方法，它包括如下步驟1)將固相合成所得還原型生長抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以三氟醋酸水溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集還原型精肽溶液；2)將第一步所得還原型精肽溶液用純化水稀釋至約1g肽/1L純化水，用稀氨水調(diào)節(jié)PH至6-8之間，加入適量的H2O2氧化，得到氧化型粗肽溶液；3)將氧化型粗肽溶液濃縮至一定體積，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以磷酸三乙胺溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集氧化型精肽溶液；4)將氧化型精肽溶液轉(zhuǎn)換成醋酸鹽。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于產(chǎn)品純度高、收率高、操作簡便、達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求，利于推廣。
文檔編號C07K7/08GK102268073SQ20111020080
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者楊麗琴, 胡小光, 黃文華 申請人:南昌佰泰生物科技有限公司